O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico encontrado em diversos tipos celulares como células endoteliais, neurônios e macrófagos. A síntese do NO é realizada pela ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS). Um dos mecanismos de ação do NO é dado pela ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), resultando na produção de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), um mensageiro secundário nessa via de sinalização celular. O GMPc por sua vez é capaz de modular a atividade de algumas fosfodiesterases (PDEs), enzimas responsáveis pela degradação do GMPc e de outro nucleotídeo cíclico, o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc). O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da elevação dos níveis de NO por meio do doador de óxido nítrico (SNAP) e o uso de inibidores de diferentes isoformas de fosfodiesterases no meio de cultivo durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos sobre a retomada da meiose, concentração de NO e níveis de GMPc e AMPc. Deste modo, os complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos foram cultivados por até 9 horas com o doador de NO (SNAP - 10-7 M) associado ou não ao inibidor de GCs (ODQ - 10-5 M) e associado ou não aos inibidores das fosfodiesterases, PDE5 (Sildenafil - 10µM), PDE3 (Cilostamide - 20µM) e PDE8 (Dipiridamole - 50µM). As amostras foram avaliadas quanto a taxa de retomada da meiose, níveis de NO (9h de MIV) e níveis dos nucleotídeos cíclicos GMPc e AMPc (0, 1, 2 e 3h de MIV). O SNAP retardou o rompimento da vesícula germinativa com 9horas de cultivo (P<0,05) e quando o SNAP foi associado ao ODQ o efeito foi revertido (P>0,05). A inclusão de SNAP no cultivo, os níveis de NO foram elevados (P<0,05). Os níveis de GMPc só foram influenciados positivamente pelo SNAP com 1 hora de cultivo (P<0,05) e após 2 e 3 horas, esta influência não persistiu (P>0,05), visto que o ODQ aboliu o efeito. A influência do SNAP foi devido ao estímulo da GCs. Para os níveis de AMPc, o doador de NO não foi capaz de influenciar suas concentrações durante as 3 horas de cultivo (P>0,05). Quando o SNAP foi associado ao Sildenafil (SNAP+SIL) não houve diferença em relação ao grupo imaturo (P>0,05), porém, também não se diferiu do tratamento SNAP e controle (P>0,05). Para as taxas de retomada de meiose todos os tratamentos foram eficientes e conseguiram retardar a quebra da vesícula germinativa diante do grupo controle (P<0,05), sendo o grupo SNAP+CIL mais eficiente. Para os níveis de AMPc, nem mesmo com a utilização de inibidores das PDE3 e PDE8 foi possível atenuar a queda do nucleotídeo. Em conclusão, o SNAP exerceu influência na retomada da meiose, na concentração de NO e nos níveis de GMPc sendo que sua ação se deve à atividade da GCs. Não houve influência sobre os níveis de AMPc, quando o SNAP foi associado a inibidores específicos de fosfodiesterases, mesmo quando apresentaram efeito sobre a retomada da meiose. A via NO/GCs/GMPc não parecer atuar sobre a via PDE3/AMPc, sugerindo a ação de outras vias no controle da meiose. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger found in many cell types such as endothelial cells, neurons and macrophages. The synthesis of NO is made by the action of nitric oxide synthase (NOS). One of the mechanisms of action of NO is given by the activation of the enzyme soluble guanylate cyclase (sGC), resulting in the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), a secondary messenger in this pathway of cell signaling. The cGMP in turn is capable of modulating the activity of some phosphodiesterases (PDEs), enzymes responsible for degradation of cGMP and other cyclic nucleotide, cyclic adenosine monophosphate (cAMP). The objective of this study was to investigate the effects of elevated levels of NO via nitric oxide donor (SNAP) and the use of inhibitors of phosphodiesterase isoforms in the culture medium during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP and cAMP levels. Thus, the complexes cumulus-oocyte (COCs) were cultured for cattle up to 9 hours with the NO donor (SNAP - 10-7 M) with or without the inhibitor of sGC (ODQ - 10-5 M) and with or without to inhibitors of phosphodiesterase PDE5 (Sildenafil - 10µM), PDE3 (Cilostamide - 20µM) and PDE8 (Dipyridamole - 50µM). The samples were evaluated for the rate of resumption of meiosis, levels of NO (9h - IVM) and levels of cyclic nucleotides cGMP and cAMP (0, 1, 2 and 3h - IVM). The SNAP delayed with germinal vesicle breakdown of 9hours cultivation (P < 0.05) when SNAP was associated with ODQ was reversed the effect (P> 0.05). The inclusion of SNAP cultivation, NO levels were increased (P<0.05). cGMP levels were positively influenced only by the snap 1 hour in culture (P<0.05) and after 2 and 3 hours, this effect was not maintained (P<0.05), whereas ODQ abolished the effect. The influence of SNAP was due to stimulation of GCs. For cAMP levels, the NO donor was not able to influence their concentrations during the 3 h incubation (P>0.05). When SNAP was associated with Sildenafil (SIL+SNAP) there was no difference compared to the immature group (P>0.05), however, also did not differ from SNAP treatment and control (P>0.05). Rates for resumption of meiosis all treatments were efficient and able delay before germinal vesicle breakdown in the control group (P<0.05), with SNAP+CIL group more efficient. For cAMP levels, even with the use of inhibitors of PDE3 and PDE8 was possible to alleviate the decrease of the nucleotide. In conclusion, SNAP exerted influence on the resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP levels and that its action is due to a GCs activity. There was no effect on cAMP levels, when SNAP was associated with specific phosphodiesterase inhibitors, even when presented effect on the resumption of meiosis. The pathway NO/sGC/cGMP seem not act on the pathway PDE3/AMPc, suggesting the action of other pathways in the control of meiosis.

Ao longo dos últimos anos, o radical livre gasoso óxido nítrico (NO) vem ganhando destaque como uma importante molécula sinalizadora em respostas fotomorfogênicas em plantas. Sua produção e dagradação parecem incluir uma diversificada gama de rotas bioquímicas, entretanto, a importância relativa de cada um dos sistemas capazes de regular sua disponibilidade e toxidade nos tecidos vegetais ainda permanece pouco compreendida. Dentre as possíveis rotas de conjugação e degradação do NO em tecidos vegetais, postula-se que a glutationa (GSH) desempenhe um papel de destaque no armazenamento desse radical livre por meio da formação reversível da S-nitrosoglutationa (GSNO), sendo possível sua subsequente degradação através da ação da enzima S-nitrosoglutationa redutase (GSNOR). No presente trabalho investigamos a influência da luz sobre o metabolismo de NO em duas etapas de desenvolvimento vegetal caracterizados pela ocorrência de eventos de diferenciação plastidial: (I) o desestiolamento de plântulas e (II) o amadurecimento de frutos carnosos de tomateiro (Solanum lycopersicum). Além do genótipo selvagem Micro-Tom (MT), também foram utilizados os mutantes fotomorfogênicos aurea (au) e high pigment 1 e 2 (hp1 e hp2). Durante o desestiolamento das plântulas de tomateiro constatou-se um incremento progressivo tanto nos teores endógenos quando nas taxas de degradação de NO, bem como na atividade da enzima GSNOR. Sob condições luminosas similares, mutantes com respostas exageradas à luz apresentaram incrementos ainda mais evidentes nesses parâmetros do que aqueles observados no genótipo selvagem. A aplicação de inibidores de S-nitrosilação de proteínas, bem como a avaliação do conteúdo de espécies reativas de oxigênio (ROS) indicaram que tanto a formação de S-nitrosotiois quanto a interação do NO com ROS contribuíram para a determinação da capacidade de remoção de NO nos tecidos fotossinteticamente ativos de tomateiro. Em frutos, observou-se uma correlação positiva entre a atividade da enzima nitrato redutase (NR) e o padrão temporal de produção de NO, uma vez que ambos os parâmetros apresentaram maiores níveis em frutos imaturos. O amadurecimento desses frutos foi acompanhado por uma diminuição transitória dos conteúdos de NO ao passo que as taxas de degradação de NO mantiveram-se bastante reduzidas durante todo o processo de amadurecimento, sugerindo a existência de um estoque de NO na forma de GSNO ou algum outro S-nitrosotiol. A sinalização luminosa influenciou positivamente tanto a produção quanto a degradação de NO em frutos imaturos de tomateiro. Em conjunto, os resultados obtidos permitem concluir que o metabolismo do NO em tomateiro é fortemente controlado pela luz, a qual é capaz de modular conjuntamente as taxas de produção e degradação desse importante composto sinalizador. / In recent years, the gaseous free radical nitric oxide (NO) has emerged as an important signaling molecule in plant photomorphogenic response. NO production and degradation seems to include a wide range of biochemical routes; however, the relative importance of which one of the systems capable of regulating NO availability and toxicity in plant tissues remains elusive. Among all potential NO degradation and conjugation routes in plant tissues, it has been suggested that gluthathione (GSH) plays a key role in NO storage due to the formation of S-nitrosogluthathione (GSNO), being possible its subsequent degradation by the action of enzyme S-nitrosoglutathione reductase (GSNOR). In this work, we have investigated the light influence on NO metabolism during two plant developmental events characterized by the occurrence of plastidial differentiation: (I) seedling de-etiolation and (II) fruit ripening of tomato (Solanum lycopersicum). Besides the wild-type Micro-Tom (MT) genotype, the tomato photomorphogenic mutants aurea (au) and high pigment 1 and 2 (hp1 and hp2) were also employed in this study. During the de-etiolation of tomato seedlings, a progressive increment was observed in the NO endogenous levels and degradation rates as well as in the GSNOR activity. Under similar light conditions, light hypersensitive mutants exhibited more conspicuous increases in these parameters than those detected in the wild-type genotype. Feeding protein S-nitrosylation inhibitors and measurements of reactive oxygen species (ROS) production indicated that both S-nitrosothiols formation and NO interaction with ROS may to contribute for determining the NO removal capacity in photosynthetically active tissues of tomato. In fruits, a positive correlation was observed between nitrate reductase (NR) activity and the temporal pattern of NO production since both parameters exhibited increased levels in immature fruits. The ripening of theses fruits was accompanied by a transitory reduction in endogenous NO levels whereas its degradation rates were maintained reduced all over the ripening process, thereby suggesting the existence of a more stable NO reservoir such as GSNO or some other S-nitrosothiol. In general light signaling positively influenced both NO production and degradation in mature green tomato fruits. Altogether, the data obtained indicated that tomato NO metabolism is significantly influenced by light, which is able to simultaneous modulate both the production and degradation of this important signaling compound.

O presente estudo avaliou o efeito do exercício físico aeróbico na função vasomotora dependente do endotélio em aorta de ratos bem como os mecanismos envolvidos na regulação da biodisponibilidade do NO. Para tanto, um grupo de animais foi submetido a uma sessão de exercício (EX, n=17) enquanto o outro grupo permaneceu em repouso (CT, n=18). Imediatamente após o exercício, os ratos de ambos os grupos foram eutanasiados para a retirada da aorta torácica para análises funcionais e bioquímicas. Resultados: observamos que o grupo exercitado apresentou uma melhora no relaxamento dependente do endotélio com um efeito máximo de 12%, sendo esse efeito relacionado a um aumento na ativação da eNOS. Apesar de aumentar o NO, os animais do grupo EX apresentaram níveis aumentados de superóxido (28%), efeito que foi associado à maior ativação do complexo enzimático NAD(P)H oxidase. Além do superóxido, o peróxido de hidrogênio também foi aumentado nos animais exercitados porém a maior produção de espécies reativas de oxigênio não foi suficiente para causar um estresse oxidativo vascular. Esses resultados demonstram que uma única sessão de exercício físico aeróbico é capaz de melhorar a vasodilatação dependente do endotélio por aumentar a biodisponibilidade de NO e que a produção de espécies reativas oxigênio também aumenta porém em níveis controlados . / The present study evaluated the effect of aerobic physical exercise on endothelium-dependent vasomotor function of rat aorta as well the mechanisms involved in nitric oxide bioavalability control. One group of rats was submitted to one bout of exercise (EX, n=17) while the other one was placed on the treadmill without running (CT, n=18). Immediately after exercise both group were sacrificed and the thoracic aorta was removed for functional and biochemical analysis. Results: we observed that EX group showed an improvement on endothelium-dependent relaxation (12%) and it was related to increase on eNOS activation. Despite increased nitric oxide levels, EX group demonstrated higher superoxide production (28%) that was associated to NAD(P)H oxidase activation. Additionally, hydrogen peroxide also increased in EX group but the increase in reactive oxygen species was not enough to cause oxidative stress. Theses results demonstrate that one bout of aerobic exercise can improve endothelium-dependent vasodilation by increasing NO bioavalability, and that reactive oxygen species also increases but in a controlled fashion

O óxido nítrico (NO) tem se mostrado um sinalizador presente em muitas fases do desenvolvimento vegetal e elemento essencial nas respostas aos estresses bióticos e abióticos em plantas. Entretanto, poucos estudos correlacionam esse radical à organogênese vegetal. Folhas de Ananas comosus (Bromeliaceae) podem ser consideradas um modelo interessante para o estudo da organogênese, pois sua região basal possui um conjunto de células que, sob cultivo in vitro e balanço adequado de certos reguladores de crescimento, dá início à proliferação celular e formação de meristemas adventícios. Primeiramente, formam-se estruturas denominadas protuberâncias que, depois, se desenvolvem em novos eixos caulinares, sem formação intermediária de calos. A relação ótima dos reguladores de crescimento para a indução da organogênese adventícia é 0,53 uM de ácido naftalenoacético e 8,87 uM de benziladeninapurina e sabe-se que o balanço hormonal entre auxinas e citocininas endógenas é alterado nesses explantes, encontrando-se um pico desses hormônios no terceiro dia da indução. Esse trabalho teve como objetivo verificar se o NO participaria da cascata de sinalizações que leva à organogênese adventícia, utilizando bases foliares de abacaxizeiro cultivadas in vitro. A quantificação do NO foi determinada pela técnica de quimiluminescência durante um período de 7 dias a partir da obtenção dos explantes. Essa produção foi dosada em fluxo contínuo com medições feitas a cada 10 segundos. O tratamento indutor de organogênese mostrou um aumento significativo na produção de NO em comparação aos explantes incubados em meio de cultura sem reguladores de crescimento, indicando uma possível participação do óxido nítrico no processo da organogênese. Houve um pico de NO no primeiro dia logo nas primeiras horas de cultivo em meio indutor. Além disso, foi realizada a dosagem de peróxido de hidrogênio (H2O2) e foi encontrada uma correlação com a produção de óxido nítrico durante a fase clara do fotoperíodo. A produção de H2O2 aumentou em seguida ao incremento de NO no primeiro dia de cultivo no meio de cultura com reguladores de crescimento. Finalmente, o tratamento com L-NAME mostrou ser a enzima NOS uma possível rota de síntese de NO, já que reduziu significativamente o número de novos meristemas adventícios e, conseqüentemente, de novos eixos caulinares formados após 60 dias de cultivo em meio não indutor da organogênese. A localização in situ do NO pareceu indicar que o aumento da produção estaria mais relacionado com células do parênquima foliar e dos feixes vasculares. Assim, esta pesquisa permitiu incluir temporalmente dois novos possíveis sinalizadores (NO e H2O2) à cascata de sinalização da organogênese adventícia em folhas de abacaxizeiro. A sinalização parece iniciar-se com o NO e logo em seguida, ainda no primeiro dia, viria o aumento de H2O2 e dos hormônios auxinas e citocininas no terceiro dia (resultados anteriores do grupo) do período de indução. / The nitric oxide (NO) was shown to be an ubiquitous molecule for many phases of the development of a plant and an important element for biotic and abiotic stress responses. However, few studies correlate this radical with the organogenesis in plants. Ananas comosus> (Bromeliaceae) leaves can be considered an interesting model for the organogenesis studies, because the basal region have a set of cell which, under in vitro cultivation and fine growth regulators balance, start cell division and form adventitious meristems. Firstly, structures named protuberances are formed, which develop forming new buds, without the intermediary formation of callus. The optimum rate of the growth regulators for the induction to organogenesis is 0.53 uM of naphthalene acetic acid and 8.87 uM of benziladeninepurine. It is known that the endogenous hormonal balance between auxins and cytokinins is altered in these explants, and a peak of these hormones is found at the third day of induction. This work intended to verify whether the NO would participate on the signaling cascade that led to the adventitious organogenesis, using basal leaves of pineapple cultivated in vitro. The nitric oxide quantification was made by chemiluminescence for a period of 7 days after the explants obtainment. The production was dosed in continuous flow air with measurements made every 10 seconds. The inductive treatment to organogenesis showed a significant rise in NO production in comparison to the explants incubated in medium culture without growth regulators, indicating a possible participation of NO at the organogenesis process. There was a NO peak at the first day, soon at the first hours of cultivation at inductive medium. Besides, the dosage of hydrogen peroxide (H2O2) was done and a correlation was found to the NO production at the light phase of the photoperiod. The H2O2 production rose after the increase of NO at the first day of cultivation in medium containing growth regulators. Finally, the treatment with L-NAME showed the NOS enzyme as a possible pathway involved with the NO production, since the number of new adventitious meristems reduced significantly and subsequently, of new shoots after 60 days of cultivation in inductive to organogenesis medium. The in situ localization of NO seemed to indicate that the rise in production could be related to the cells of the leaf parenchyma and vascular tissues. Thus, this research permitted to include temporally two new possible signals (NO and H2O2) to the signalization cascade of the adventitious organogenesis in pineapple leaves. The signalization seems to initiate with NO followed by H2O2 at the first day and by the auxins and cytokinins hormones at the third day (previous results of the group) of the induction period.

O hormônio concentrador de melanina (MCH) foi inicialmente identificado em peixes teleósteos por regular a mudança de coloração, agregando os grânulos de pigmentos nas células pigmentares, levando ao clareamento dos animais. Possui dois receptores conhecidos: MCHR1, encontrado em todas as espécies, e o MCHR2, no SNC de alguns mamíferos e em outros tecidos de teleósteos. Devido a sua ampla distribuição, diversos estudos tem investigado o papel do MCH como um peptídeo que exerce diversas funções fisiológicas: regulação da ingestão de alimentos em mamíferos e peixes, regulação da resposta ao stress e à ansiedade, comportamento, locomoção, reprodução, sono, memória, inflamação. O objetivo desse trabalho foi investigar a possível participação do MCH na ativação das vias de sinalização para oxido nítrico em células de eritroforoma de Carassius auratus (GEM-81). Adicionalmente, incluímos o hormônio estimulador de melanócitos - ?-MSH no estudo, pois este é antagônico ao MCH nas mais diversas funções. Demonstramos que em GEM-81 ocorre a expressão da isoforma iNOS sem o estimulo de lipopolissacarídeos; e que com o tratamento de MCH e Soro Fetal Bovino (SFB) reduzido a 0,5%, sua expressão foi aumentada com o decorrer do tempo, com o máximo alcançado com 180 min e 360 min. Na produção de nitrito foi observado um aumento muito discreto nos mesmos tempos. O α-MSH não apresentou nenhuma diferença de expressão de iNOS e na produção de nitrito. Nossos dados apontam a existência da via do óxido nítrico em células de eritroforoma de Carassius auratus e sugerem que o MCH possa induzir a produção de oxido nítrico pelo aumento de expressão da iNOS / The melanin -concentrating hormone (MCH) was first identified in teleost fish by regulating the color change, aggregating the pigment granules in pigment cells, leading to bleaching of animals. It has two known receptors: MCHR1, found in all species, and MCHR2, in the CNS of mammals and some other tissues of teleosts. Because of their widespread distribution, various studies have investigated the role of MCH as a peptide that exerts various physiological functions: regulation of food intake in mammals and fish, regulation of stress responses and anxiety, behavior, locomotion, reproduction, sleep, memory and inflammation. The aim of this study was to investigate the possible involvement of MCH in the activation of signaling pathways for nitric oxide in cells of Carassius auratus eritroforoma (GEM -81). Additionally, we include the melanocyte stimulating hormone - α - MSH in the study, as this is antagonistic to MCH in various functions. We demonstrated that GEM -81 isoform expression of iNOS without lipopolysaccharide stimulation occurs, and the treatment with MCH and Fetal Bovine Serum (FBS) reduced to 0.5% increased the expression with the passage of time, the maximum reached at 180 min and 360 min. Regarding nitrite production, it was observed a very modest increase at the same time. The α-MSH showed no difference in the expression of iNOS or production of nitrite. Our data indicate the presence of the nitric oxide pathway in cells of eritroforoma Carassius auratus, suggesting that MCH could induce nitric oxide production by increasing the expression of iNOS .

A fisiopatologia da sepse se caracteriza por hipotensão acompanhada de aumento da secreção de vasopressina (AVP) na fase inicial e diminuição numa fase mais tardia. Essa hipotensão é em parte devido ao aumento da quantidade de óxido nítrico, que juntamente com outros mediadores tem sua produção aumentada durante a sepse. A óxido nítrico sintase (NOS) é responsável pela síntese deste mediador, e sua isoforma neuronal (nNOS) está presente no músculo esquelético, pulmões, testículos, próstata, pele e também nos neurônios vasopressinérgicos do hipotálamo. O presente trabalho avaliou a participação do óxido nítrico produzido pela isoforma neuronal de NOS sobre a secreção temporal de AVP durante a sepse experimental. Ratos Wistar receberam injeção i.p. de 7-nitroindazol (50mg/kg ou 80mg/kg), inibidor específico da NOS neuronal, ou DMSO 10% + óleo de gergelim na proporção 1:9 (veículo) e após 30 minutos foram submetidos ao estímulo séptico por ligadura e perfuração cecal (CLP) ou à operação fictícia (OF). Em um grupo de animais, a sobrevida foi avaliada durante 5 dias. Em outro grupo, os animais foram decapitados 0, 4, 6, 18 e 24 horas após a cirurgia e o sangue processado para determinação do hematócrito, sódio sérico, osmolalidade, proteínas, glicose, creatinina, nitrato sérico e AVP plasmática. A neurohipófise foi removida para a determinação do conteúdo de AVP, e o hipotálamo dissecado para a determinação da atividade da NOS total. A mortalidade observada após CLP não foi modificada com o pré-tratamento com 7-NI (50mg/kg), assim como os aumentos temporais de hematócrito, glicose e nitrato sérico observados. As proteínas plasmáticas e o sódio sérico apresentaram diminuição após CLP e o pré-tratamento com 7-NI antecipou a perda proteica e postergou a diminuição do sódio sérico. Os animais após CLP não apresentaram alterações de creatinina e osmolalidade, entretanto quando prétratados com 7-NI, apresentaram aumento em 6 e 18 horas e diminuição a partir de 4hs, respectivamente. A atividade da NOS total no hipotálamo aumentou nos tempos determinados de 4 e 24 horas após CLP e este aumento foi reduzido com o prétratamento com o 7-NI nas doses de 50 e 80mg/kg, respectivamente. O conteúdo neurohipofisário de AVP diminuiu em 4, 6 e 18 horas após CLP e o pré-tratamento com 7-NI reduziu os estoques apenas em 0 e 6 horas. As concentrações plasmáticas de vasopressina apresentaram-se aumentadas sómente 6 horas após CLP e o pré-tratamento não alterou essas concentrações. Esses resultados permitem concluir que o NO produzido pela NOS neuronal não teria uma tarefa substancial na secreção de vasopressina durante sepse experimental. / The pathophysiology of sepsis is caracterized by hypotension accompanied by increase of vasopressin secretion (AVP) in early phase and decrease during late phase. This hypotension is due, in part, to the increase of nitric oxide (NO) production, that, like other mediators, shows high production during sepsis. Nitric oxide synthase (NOS) is responsible by synthesis of NO. The neuronal isoform of NOS is present in skeletic muscle, testicles, prostate, skin and vasopressinergics neurons of hypothalamus. The present work evaluated the participation of nitric oxide produced by neuronal NOS in temporal vasopressin secretion during experimental sepsis. Rats Wistar received intraperitoneal injection of 7-nitroindazole (50 or 80 mg/kg), an inhibitor of neuronal nitric oxide synthase activity, or DMSO 10% + sesame oil in the proportion 1:9 (vehicle) and after 30 minutes, they were submited to septic stimulus by cecal ligation and puncture (CLP) or to sham operation. In one of the groups, the survival rate was evaluated during 5 days. In other group, the animals were decapited 0, 4, 6, 18 and 24 hours after CLP and the blood was processed to determinate haematocrit, serum sodium, osmolality, proteins, glucose, creatinine, serum nitrate, and plasma AVP. Neurohypophysis was removed to determination of vasopressin content, and hypotalamus was dissected to determinate total NOS activity. Mortality observed after CLP was not affected by periferal injection of 7-nitroindazole (50 mg/kg) as well as haematocrit, glucose and nitrate increase. Serum sodium and plasma protein decreased after CLP and the treatment antecipated the loss protein, and delayed serum sodium decrease. CLP animals didn\'t show creatinine and osmolality alterations, but when treated with 7-nitroindazole, showed increase 6 and 18 hours, and decrease 4 hours, respectively. NOS activity in hypothalamus increased 4 and 24 hours after CLP, and was reduced with 7-NI pretreatment (50 and 80 mg/kg respectively). AVP neurohypophysis content diminished 4, 6 and 18 hours after CLP and 7-NI reduced the content just at 0 and 6 hours. Vasopressin plasma concentration increased just 6 hours after CLP and 7-NI pretreatment didn\'t alter this parameter. We concluded that NO produced by neuronal NOS doesn\'t have a substantial role in vasopressin secretion during experimental sepsis.

As propriedades dos derivados nitrosilados de diferentes hemoproteínas em função da temperatura, da concentração de óxido nítrico (NO) e pH, foram investigadas utilizando a técnica de Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE). Nas hemoproteínas, o grupo heme está acomodado em um bolso: de um lado encontra-se a histidina proximal, de outro uma cavidade aberta onde pode ocorrer a ligação de O2 (ou outras moléculas, tais como H2O, NO, CO, etc.). Perto daí, encontra-se o sítio distal, que pode ou não estar ocupado por uma cadeia lateral de aminoácido, o qual pode influenciar a ligação do ligante. As proteínas estudadas, marcadas com NO, foram: mioglobinas de Cavalo de Cacgalote, que possuem o sítio distal ocupado por um resíduo de histidina, a mioglobina do molusco Aplysia brasiliana (Mb Apb) que não possue um resíduo de aminoácido no sítio distal e a eritrocruorina da minhoca Annelidae Glossoscolex paulistus (Ec AGp), cuja vizinhança do heme não está determinada. Os resultados obtidos com as soluções de mioglobinas de Cavalho e de Cachalote, preparadas a partir da proteína liofilizada (Sigma) mostram cerca de 13% de mioglobina está na forma oxi (MbA) e o restante na forma meta (MbB). A ligação de NO à Mba se faz por simples substituição da molécula de O2 por NO, mantendo o ferro em seu estado ferroso. Já para a MbB, a ligação ocorre em duas etapas: na primeira reduzindo o Fe3+ a Fe2+ e, numa segunda, cuja extensão depende da concentração de NO, o óxido nítrico liga-se ao Fe2+ produto da redução do ferro da MbB. Se a razão NO/Mb é igual ou maior que 2/1, o espectro da RPE é uma linha carga (tipo B), como tem sido identificado na literatura. Se a razão NO/b é da ordem de 0,2/1, o espectro de RPE (tipo A) apresenta um desdobramento hiperfino, similar ao da deoxiHb humana na conformação T. Se a razão NO/Mb varia entre 0,2 e 2, o espectro de RPE é uma mistura de dois tipos (AB). Os espectros tipo A e AB apresentam uma clara dependência com a temperatura, ao passo que o espectro tipo B não. Observa-se que também que a afinidade pelo NO da MbB depende do pH; quanto menor o pH, mais difícil fica se completar a reação do Fe3+ com o NO, mesmo se a razão NO/Mb é maior que 2. Os espectros de RPE da MbANO e da MbBNO são diferentes, porque o campo cristalino em torno do ferro apresenta pequenas variações, alterando a distância de N&#949-FE-NO. No caso da MbA isto dá origem a um espectro similar ao encontrado para o ferro pentacoordenado (tipo A); no caso da MbB, o espectro é do tipo encontrado para ferro hexacoordenado (tipo B). O estudo da dependência do espectro de RPE com a temperatura, no caso da EcNO AGp, mostra que existe um equilíbrio térmico entre duas espécies hexacoordenadas: a espécie I, que predomina à baixa temperatura e cujo espectro de RPE exibe desdobramento superhiperfino com 9 linhas; a espécie II, que predomina altas temperaturas e cujo espectro de RPE é uma linha larga. No intervalo de temperaturas estudado, pode ser observado que em temperaturas intermediárias, os espectros são uma mistura das duas espécies. Pode-se através de diferença espectral estudar o comportamento de cada espécie separadamente e o equilíbrio da mistura. Verificou-se que as duas espécies estão separadas por cerca de 2 kcal/mol. Com os resultados obtidos e comparando-os com os obtidos na literatura, é possível sugerir a existência de uma glutamina distal para a Ec AGP. Para a MbNO ApB, encontra-se um espectro de RE que apresenta desdobramento superhiperfino com 9 linhas. Os espectros a baixa e alta temperatura são similares apenas à alta temperatura e a resolução é menor. Observa-se ainda, a influenciado sítio distal (his E7 nas mioglobinas de Cavalo e de Cachalote) sobre a ligação Fe-N-O. Nas Mb de Cavalo e de Cachalote, em que o sítio distal é ocupado por uma histidina, o espectro da RPE da MbNO é uma linha larga que não varia significativamente com a temperatura. Na Ec AGp, em que o sítio distal está provavelmente ocupado por uma glutamina, o espectro de RPE apresenta uma dependência com a temperatura: a 309.3K, o espectro é uma linha larga, a 103.0K, o espectro apresenta desdobramento superhiperfino. Na Mb Apb, em que não há resíduo básico ocupando a posição distal, o espectro apresenta desdobramento superhiperfino em todo o intervalo de temperatura estudado (113,7K a 283,3K). / Using the Electron Paramagnetic Resonance (EPR) technique, the properties of several nitrosyl hemoproteins were investigated as a function of temperature, pH and nitric oxide (NO) concentration. In hemoproteins, the heme moiety is esconced in a pocket: in one side there is na open cavity where the bonding of different molecules, such as H2O, NO, CO, etc., may occur occupied or not by an aminoacid residue thus influencying in different ways the ligand bonding. The following nitrosyl hemoproteins were studied: horse and spermwhale myoglobins which have an histidine residue occupying the distal site, the myoglobin of the mollusk Aplysia brasiliana (Mb Apb) which has no aminoacid residue in the distal site and the erythrocruorin from the earthworn Annelidae Glossoscolex paulistus (Ec AGp) whose structure is no yet known. The results that were obtained with horse and spermwhale myoglobins solutions prepared using liofilized protein from Sigma, show that almost 13% of the myoglobins is in the oxi form (MbA) and the remaining 87% is in the meta form (MbB). The NO binding to MbA is done by simple substitution of the O2 molecule, remaining the iron atom in its ferrous state. With MbB we have a quite different situation and in this case, two steps are needed to obtain the nitric oxide derivative: first the Fe3+ is reduced to Fe Fe2+ and then the NO molecule bind to it, the extention to which this last step occurs, depends on the nitric oxide concentration. If the NO/Mb ratio is equal to or greater than 2/1, the EPR signal is a broad line (B type), as it has been already identified. If the NO/Mb ratio is around 0,2/1, the EPR spectrum (A type) is characterized by a hyperfine splitting similar to that of human deoxihemoglobin in the T conformation. Finally, in the NO/Mb ratio has a value between 0,2/1 and 2/1, the EPR signal observed is due to contributions from both species (AB). Variations in the EPR spectra with temperature is only observed for the A and AB types. Futhermore, it has also been observed that MbB affinity for NO is pH dependent, the lower the pH, more difficult is the completation of the Fe3+ reaction with NO, even IF the NO/Mb ratio is greater than 2/1. The difference between the EPR spectra of MbA and MbB is due to the small but significative differences in the crystal field around the iron atom, thus modifying the N&#949-FE-NO distance. In the MbA case, this gives rise to a spectrum similar to that find for pentacoordinated iron (A type), for MbB the spectrum shows a pattern similar to that find for a hexacoordinated iron atom (B type). The analysis of the EPR spectra of EcNO AGp at various temperatures showed that there is a thermal equilibrium between two hexacoordinated species: species I, which is predominant at a low temperatures and is characterized by a nine-line superhyperfine splitting, and species II, which is predominant at high temperatures, characterized by a broad line EPR spectrum . It was found that in the range of temperatures studied , the EPR signals are due to contributions from two species. The spectral difference made possible to learn about each species independently and the equilibrium. The two species differ in enthalpy by no more than about 2 kcal/mol. At the light of these findings, and compearing with the data found in the literature, it may be postulated the existence of a glutamine at the distal site in Ec AGp. For MbNO Apb, it was found an EPR spectrum exhibiting a nine-line superhyperfine splitting. The EPR spectra at low and high temperatures are similar, but the former are well resolved while in the latter, the superhyperfine splitting is something blurred. Futhermore, it has been possible to learn about the influence of the distal site on the Fe-N-O bond. For horse and spern whale myoglobins, where na histidine occupies the distal site, the EPR spectrum is a broad line which does not change significatively with temperature. For Ec AGp, where a glutamine probably occupies the distal site, the EPR spectra are temperature dependent: at 309.3K it is a broad line and at 103.0K it presents superhyperfine splitting. Finally, for Mb Apb where there is no basic residue occupying the distal site, the EPR spectra are characterized by a nine-line superhyperfine splitting all over the temperature range studied (113.7K to 283,3K).

A injeção de doses repetidas de lipopolissacarídeo (LPS) resulta em atenuação da resposta febril, que é chamada de tolerância a endotoxina. Esta resposta já foi caracterizada em ratos por meio de injeções sistêmicas. No presente estudo, nós testamos a hipótese que a tolerância a endotoxina ocorre localmente nos tecidos periodontais de proteção de ratos e que o óxido nítrico participa desta tolerância. Ratos machos Wistar foram injetados nos tecidos periodontais de proteção com solução salina ou LPS de Escherichia coli na dose de 100 μg/kg em 3 dias consecutivos com 24 horas de intervalo. A temperatura corporal (Tc) foi medida por meio de datalogger 1 h antes e 6 h após as injeções. Outro grupo experimental recebeu injeção intracerebroventricular (i.c.v.) de L-NMMA (500 μg/rato) 30 min antes da injeção de LPS no terceiro dia. Além disto, foi realizada a imunohistoquímica para proteína Fos para verificar a ativação neuronal na Área Pré-óptica do hipotálamo (POA) e no subnúcleo caudal do núcleo trigeminal espinhal no primeiro dia (animais não tolerantes) e terceiro dia (animais tolerantes) do tratamento com LPS, e também em animais que receberam L-NMMA ou salina i.c.v. no terceiro dia, antes do LPS. No dia, 1 após a injeção de LPS, foi observado uma resposta febril polifásica, no dia 2 houve uma alteração no padrão desta resposta e no dia 3 a resposta febril foi completamente abolida, caracterizando o desenvolvimento de tolerância a endotoxina na cavidade oral. Esta tolerância foi revertida com o pré-tratamento com L-NMMA no terceiro dia e os animais voltaram a apresentar febre. A imunohistoquímica detectou um aumento na expressão da proteina Fos no subnúcleo caudal do núcleo trigeminal espinhal e na POA no dia 1 em animais que receberam LPS, aumento este que foi abolido no dia 3 de tratamento com LPS. Da mesma forma que observamos a reversão do mecanismo de tolerância com o desenvolvimento da resposta febril no terceiro dia, o pré-tratamento com L-NMMA aumentou o número de células Fos positivas em ambas às áreas estudadas. Estes resultados indicam que ratos desenvolvem tolerância ao LPS nos tecidos periodontais e que o óxido nítrico participa desse mecanismo de tolerância induzido por LPS no periodonto de ratos. / Systemic injection of repeated doses of Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) results in attenuation of the febrile response, i.e. endotoxin tolerance, which has been well characterized systemically in rats. In the present study, we tested the hypothesis that endotoxin tolerance also occurs after repeated local injection of LPS into periodontal protection tissue of rats and that nitric oxide plays a role in this mechanism. Male Wistar rats were given a gingival injection of sterile saline or LPS at a dose of 100 μg/kg on three consecutive days with 24 hours break. Body core temperature (Tb) was measured with a miniature datalogger 1 hour before and 6 hours after the injections. Another group received L-NMMA (500 μg/rat) intracerebroventricular (i.c.v.), 30 minutes before LPS, in the third day. Besides it, was performed the Fos immunohistochemistry to verify the neuronal activation in the preoptic area of hypothalamus (POA) and in the subnucleus caudalis of spinal trigeminal nucleus in the first day (non-tolerant animals), in the third day of LPS treatment (tolerant animals) and in the animals that received L-NMMA or saline i.c.v. in the third day, before LPS. On day one we observed a polyphasic febrile response after LPS injection. On day two this response was sensitized and on day three the febrile response was completely abolished, characterizing the development of the endotoxin tolerance in the oral cavity. This tolerance was reverted with the pretreatment with L-NMMA in the third day and the animals develop the febrile response. The immunohistochemistry detected an increase in Fos protein expression in the subnucleus caudalis of spinal trigeminal nucleus and in the POA on day one in animals that received LPS and a reduction in Fos expression was observed on day three. Similarly to the reversion of the tolerance mechanism by the development of the febrile response in the third day, the pretreatment with L-NMMA, increased the number of Fos positive cells in both studied areas. These results indicate that rats develop endotoxin tolerance in periodontal tissues and that nitric oxide plays a role in this mechanism.

A pesquisa e o uso de produtos naturais como agentes terapêuticos tem crescido muito nos últimos anos. Os diterpenos são os principais constituintes de extratos de plantas que são usadas na medicina popular no tratamento da hipertensão arterial. Diterpenos da classe dos labdanos exercem atividade inibitória sobre a contração vascular e induzem relaxamento desses tecidos. Nesse sentido, o presente estudo foi delineado de forma a investigar os mecanismos envolvidos no efeito cardiovascular do labdano ácido ent-3-acetóxi-labda-8(17),13-dieno-15-óico (labda-15-óico) em ratos. Os resultados mostraram que o labdano exerce seu efeito inibitório máximo sobre a contração vascular induzida pelo KCl após 30 min de incubação. O efeito inibitório do labda-15-óico sobre a contração induzida por KCl foi totalmente revertido 60 e 120 minutos após a remoção do diterpeno das preparações em anéis sem endotélio (E-) e com endotélio (E+), respectivamente. Os valores de Emax para as curvas de fenilefrina e serotonina foram reduzidos na presença do labda-15-óico em anéis de aorta de rato E+ e E-. O labda-15-óico reduziu a contração induzida pelo CaCl2 em anéis E- nas concentrações de 10, 50 e 100 mol/L. O labda-15-óico não alterou a mobilização do Ca2+ intracelular induzida por fenilefrina ou cafeína. O labdano induziu relaxamento em artérias aorta E+ ou E- pré-contraídas com fenilefrina ou KCl. Em anéis de aorta E+ pré-contraídos com fenilefrina, os valores de Emax para o relaxamento foram reduzidos na presença de L-NAME, ODQ, hemoglobina, 7-nitroindazol, Rp-8-Br-Pet, tapsigargina e tetraetilamônio. Por outro lado, indometacina, wortmanin, LY294002, H-89, SQ22,536, atropina e propranolol não afetaram o relaxamento induzido pelo labdano. O labdano aumentou os níveis de nitrato e GMPc em anéis E+, mas não alterou os níveis de AMPc. O composto em estudo elevou ainda, a intensidade de fluorescência emitida por amostras de células endoteliais marcadas com DAF-2DA, indicando um aumento dos níveis de NO citosólico. Além disso, o labda-15-óico (3 mg/Kg) induziu hipotensão em ratos não anesteziados. O L-NAME reduziu a resposta hipotensora induzida pelo labdano. Concluímos que o labdano exerce um efeito vasorelaxante in vitro e hipotensor in vivo. O labda-15-óico age no músculo liso vascular, onde bloqueia canais para Ca2+ sensíveis a voltagem e operados por receptores, levando à redução do influxo de Ca2+ extracelular. A resposta de relaxamento é parcialmente dependente do endotélio onde o labda-15-óico ativa a via de sinalização do NO-GMPc e promove abertura de canais para K+ no músculo liso vascular. Os estudos in vivo confirmam a participação do NO na resposta cardiovascular induzida pelo labda-15-óico. / The research, development and use of natural compounds as therapeutic agents have been increasing in recent years. Diterpenoids are the main constituents of plant extracts that are used in folk medicine for the treatment of hypertension. Labdane-type diterpenes are described to exert antispasmodic and relaxant action in vascular tissues. The present investigation aimed to evaluate the mechanisms (in vitro and in vivo) underlying the cardiovascular effects displayed by the labdane ent-3-acetoxy-labda-8(17),13-dien-15-oic acid (labda-15-oic) in rats. Our findings show that labda-15-oic achieved its maximal inhibitory action on KCl-induced contraction at 30 min. The inhibitory effect on the the contraction induced KCl elicided by labda-15-oic was totally abolished 60 and 120 min after the removal of the labdane from the medium bath in endothelium-denuded (E-) rings and endothelium-intact (E+) rings. The Emax values for phenylephrine and serotonin in E+ and E- rings were reduced in the presence of labda-15-oic. The labda-15-oic inhibited the contraction induced CaCl2 in E- rings at 10, 50 and 100 mol/L. The labdane did not alter the intracellular Ca2+ mobilization induced by phenylephrine or caffeine. The labdane induced relaxation in E+ and E- rings pre-contracted with phenylephrine or KCl. In E+ rings pre-contracted with phenylephrine, labda-15-oic-induced relaxation was reduced in the presence of L-NAME, ODQ, haemoglobin and RP-8-Br-Pet. On the other hand, indomethacin, wortmannin, LY294002, H-89, SQ22,536, atropine, propranolol did not have a significant effect on the relaxation induced by the labdane. The labdane increased the levels of cGMP and nitrate but not cAMP in E+ rings. The compound studied also increased the intensity of fluorescence emitted by samples of endothelial cells labeled with DAF-2DA indicating an increase in the cytosolic levels of NO. Furthermore, labda-15-oic (3 mg/Kg) induced hypotension in unanesthezided rats and this effect was attenuated by L-NAME. Taken together, our results demonstrate that the labdane exerts a vasorelaxant effect in vitro and hypotensive effect in vivo. The labda-15-oic acts on vascular smooth muscle where it blocks Ca2+ influx through interference with both voltage and receptor-operated channels. The relaxant action of the labdane is also partly mediated by the activation of endothelial NO-cGMP pathway and the opening of K+ channels present in vascular smooth muscle. The studies in vivo confirm the role of NO in the cardiovascular response induced labda-15-oic acid.

Introdução: Os distúrbios ácido-básicos são comuns na prática médica e podem variar desde uma acidose ou alcalose simples até um distúrbio misto complexo e potencialmente fatal. A acidose metabólica ocorre por aumento na quantidade de ácidos não-voláteis sob condições como: insuficiência renal, sepse, diabetes grave, diarréia e outras. Há mais de um século tem-se conhecimento de que mudanças no pH promovem alterações no tônus vascular, o que afeta a circulação e controle da pressão sanguínea. Objetivos: 1) estabelecer um modelo eficiente de acidose metabólica crônica (AMC) em ratos; 2) avaliar os parâmetros ventilatórios durante a indução da AMC; 3) investigar os efeitos da AMC sobre a reatividade da aorta de ratos, bem como os mecanismos envolvidos nesta resposta. Metodologia: A AMC foi induzida com cloreto de amônio ad libitum 0,5 M + 0,02M por gavagem, durante 10 dias. Os parâmetros ventilatórios avaliados foram frequência respiratória (fR), volume corrente (Vc) e ventilação pulmonar (VE). No estudo de reatividade vascular foram realizadas curvas dose-resposta para acetilcolina (ACh), fenilefrina (Phe), endotelina 1 (ET-1) e angiotensina II (Ang II), em aorta com e sem endotélio, na ausência e presença do L-NAME. Resultados: A AMC induzida por cloreto de amônio (NH4Cl) reduziu o pH para 7.17 (controle 7.39), com níveis de bicarbonato (HCO3-) próximos a 9.8 mmol/L (controle 21.9 mmol/L). Quanto aos parâmetros ventilatórios, houve um aumento do Vc no segundo dia de tratamento, levando a um aumento na VE. Nos estudos de reatividade vascular, a AMC não alterou a resposta para a ACh e ET-1, entretanto reduziu a vasoconstrição induzida pela Ang II e Phe, sendo a resposta para Phe restaurada na presença de L-NAME. Conclusões: 1) a partir do protocolo empregado foi possível obter um modelo de AMC reprodutível; 2) houve alterações ventilatórias apenas no início do tratamento, associada à redução de pressão parcial de dióxido de carbono (pCO2), embora não significativa, mostrando uma resposta compensatória transitória; 3) o efeito da AMC sobre a reatividade vascular, parece ser agonista-seletiva e o óxido nítrico (NO) está envolvido nessa resposta. / Introduction: The acid-base disorders are common in the medical practice and can vary from an acidosis or simple alkalosis to a mixed, complex and potentially fatal disorder. The metabolic acidosis occurs because of the increase in the quantity of nonvolatile acids under conditions such as kidney disease, sepsis, serious diabetes, diarrhea, and so on. More than one century there is some knowledge that the extracellular pH has promoted changes in the vascular tonus, which affects the circulation and the blood pressure control. Objectives: 1) Develop an efficient model of chronic metabolic acidosis (CMA) in rats; 2) Evaluate the ventilatory parameters during the induction of the CMA; 3) to investigate the effects of the CMA on rat aorta reactivity as well as the mechanisms involved in this response. Methodology: The CMA was induced by NH4CI 0.5M ad libitum + 0.02M by gavage during 10 days. The assessed ventilatory parameters were respiratory frequency (fR), tidal volume (Vt) and pulmonary ventilation (VE). The studies of the vascular reactivity were carried out by dose-response curve to acetylcholine (ACh), phenylephrine (Phe), endotelina1 (ET-1) and angiotensin II (Ang II), in aorta with and without endothelium, in absence and presence of the L-NAME. Results: The acidosis induced by ammonium chloride (NH4Cl) reduced the pH to 7.17 (7.39 control), with levels of bicarbonate (HCO3-) about 9.8 mmol/L (21.9 control mmol/L). As for the ventilatory parameters, there was an increase of the Vt in the second day of the treatment, which lead to an increase in the VE. In the studies of the vascular reactivity, the CMA have not changed the response to the Ach and ET-1, however the vasoconstriction induced by Ang II and Phe were reduced after CMA, and this was restored by L-NAME. Conclusions: 1) From the used protocol, it was possible to obtain a model of reproducible CMA. 2) There were ventilatory alterations only in the beginning of the treatment, associated to the reduction of pCO2, although not significant, which showed a transitory compensatory response. 3) The effect of the CMA on the vascular reactivity seems to be agonist-selective and the nitric oxide (NO) is involved in this response.