L’inflammation joue un rôle clé dans de nombreuses pathologies, telles que les maladies inflammatoires chroniques, les désordres métaboliques et le cancer. L’un de ses médiateurs le plus puissant est l’interleukine-1β (IL-1β), qui est une cytokine pro-inflammatoire participant à tous les stades de l’inflammation et de l’immunité. Son activation est régulée par un complexe multi-protéique nommé inflammasome, dont la caspase-1 active en découlant est responsable du clivage et de la maturation de l’IL-1β. Huit types d’inflammasomes activant et clivant la pro-caspase-1 ont été identifiés et contiennent tous la protéine ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD). Les inflammasomes partagent un signal intracellulaire commun et le mécanisme menant à leur assemblage et leur activation n’est pas totalement élucidé. L’utilisation de la lignée cellulaire humaine monocytaire, THP-1, différenciée en macrophages grâce à un ester de phorbol, le TPA, a permis la mise en place d’un modèle d’étude de modulateurs de l’inflammasome en conditions stériles. Ce modèle a permis l’étude des mécanismes impliqués suite à des signaux issus de l’inflammation chronique, tels que l’ATP et les espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ce travail montre qu’il existe une synergie entre ATP et ROS, qui agissent grâce à une boucle d’activation impliquant probablement plusieurs inflammasomes, dont NLRP3. Des donneurs de NO connus (trinitrine et isosorbide dinitrate) ou nouveau (dérivé de purine) ont montré une activité anti-inflammatoire. D’autres composés ont été identifiés comme de potentiels inhibiteurs d’inflammasome (extraits de dattes et dérivé de purine portant un acide lipoïque) / Inflammation has a pivotal role in several disorders, such as chronic inflammatory diseases, metabolic disorders and cancer. Interleukin-1β (IL-1β) is one of the most powerful mediators in this mechanism. IL-1β is a pro-inflammatory cytokine which is implicated in every step of inflammation and immunity. IL-1β is regulated by a multi-protein complex named inflammasome, in which active caspase-1 is responsible for IL-1β processing and maturation. Eight inflammasomes processing and activating pro-caspase-1 has been identified and all contain the adaptor protein ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD). Inflammasomes share a common intracellular signal and the mechanism for their structural assembly and activation is not totally clear. The human monocytic cell line, THP-1, has been used and cells have been differentiated in macrophages by the phorbol ester, TPA. Based on this, a cellular pattern has been established for studying inflammasome modulators under sterile conditions. This pattern allowed the study of implicated mechanisms in chronic inflammatory signals, such as ATP and reactive oxygen species (ROS). This study shows that ATP and ROS synergize for activating inflammasomes and NLRP3 and act in an autocrine loop. Stimulation with others natural or synthetic compounds has been realized for characterization of their inflammatory activity. Therapeutic NO donors (trinitrin and isosorbide dinitrate) and a new NO donor (purine nitrate ester) have been characterized for their anti-inflammatory activity. Others compounds from a new category of inflammasome inhibitors have been identified (date fruit extracts and lipoic acid purine derivative)

Monocytes and macrophages are mediator cells of cartilage and bone erosion in the synovia of rheumatoid arthritis (RA) patients due to secretion of the inflammatory cytokine Interleukin-1β (IL-1β). Calcium, phosphate and fetuin are liberated from the affected bone matrix, and the formation of calciproteinparticles (CPPs) is likely. IL-1β production in monocytes in vitro is stimulated by high concentrations of extracellular calcium. Additionally, the rise of extracellular calcium concentrations leads to increased macropinocytosis in mononuclear phagocytes. Flow cytometry analyses in this study show that peripheral blood monocytes from patients with RA perform more calcium stimulated macropinocytosis of the fluorescent dye calcein than monocytes from healthy donors. Stimulation of monocytes with calcium and preformed CPPs leads to more IL-1β production, quantified using ELISA, by monocytes from RA patients. Experiments with macrophages show similar results. Furthermore calcium-stimulated macropinocytosis and IL-1β secretion are significantly positively correlated. However, there was no connection of in vitro findings and the severity of RA in patients.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Rheumatoide Arthritis 1 1.1.1 Epidemiologie und Klinik der rheumatoiden Arthritis 1 1.1.2 Ätiopathogenese der rheumatoiden Arthritis 1 1.2 Monozyten und Makrophagen 3 1.2.1 Inflammasomaktivierung und Interleukin-1β-Sekretion in Monozyten und Makrophagen 4 1.2.2 Makropinozytose in Monozyten und Makrophagen 6 1.2.3 Beitrag der Monozyten und Makrophagen zur rheumatoiden Arthritis 7 1.3 Kalzium – lokale Dysregulation trotz systemischer Regulation 9 1.3.1 Entstehung von Kalziumproteinpartikeln 10 1.3.2 Kurzportrait des G-Protein-gekoppelten Kalziumrezeptors CaSR 11 2 Fragestellungen 13 3 Forschungsdesign, Material und Methoden 15 3.1 Forschungsdesign 15 3.2 Materialien 15 3.2.1 Laborgeräte 16 3.2.2 Verbrauchsmaterialien 17 3.2.3 Materialien und Chemikalien 17 3.2.4 Medien, Lösungen und Puffer 19 3.2.5 Stimulanzien und Inhibitoren 20 3.2.6 Fluoreszenzfarbstoffe 20 3.2.7 Software 20 3.3 Methoden 21 3.3.1 Separation von PBMCs mittels Ficolldichtegradientenzentrifugation 21 3.3.2 Separation von Monozyten mittels negativer Magnetseparation 22 3.3.3 Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen in Zellkulturbeuteln 23 3.3.4 Makropinozytose von Monozyten und Makrophagen in der Durchflusszytometrie 23 3.3.4.1 Makropinozytose von Calcein in Monozyten 24 3.3.4.2 Makropinozytose fluoreszenzgefärbter Kalziumproteinpartikel in Monozyten und Makrophagen 25 3.3.4.3 Inhibition der Makropinozytose in Monozyten 26 3.3.4.4 Auswertung der am Durchflusszytometer generierten Rohdaten mit FlowJo 26 3.3.5 Makropinozytose von Monozyten in der Fluoreszenzmikroskopie 28 3.3.6 Bestimmung der Interleukin-1β-Produktion von Monozyten und Makrophagen mittels ELISA 29 3.3.7 Erhebung des DAS28 33 3.3.8 Bestimmung von Laborparametern 33 3.4 Statistische Auswertung 33 4 Ergebnisse 35 4.1 Charakterisierung der Kohorten 35 4.2 Vorversuche zur Auswahl eines geeigneten Fluoreszenzfarbstoffes für die Detektion der Makropinozytose 37 4.3 Stimulation von Monozyten mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion 39 4.3.1 Kalziumstimulierte Calceinaufnahme von Monozyten 39 4.3.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion von Monozyten 44 4.4 Stimulation von Monozyten mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion unter Zugabe von Kalziumproteinpartikeln 47 4.4.1 Kalziumstimulierte Aufnahme fluoreszierender Kalziumproteinpartikel 47 4.4.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion in Monozyten unter Zugabe von Kalziumproteinpartikeln 51 4.5 Stimulation von Makrophagen mit Kalzium zur Makropinozytose und Interleukin-1β-Produktion 53 4.5.1 Kalziumstimulierte Makropinozytose von fluoreszierenden Kalziumproteinpartikeln in Makrophagen 53 4.5.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Produktion mit und ohne Zugabe von Kalziumproteinpartikeln in Makrophagen 54 4.5.3. Visualisierung von Monozyten und Makrophagen nach 16 Stunden Inkubation 57 4.6 Korrelation zwischen kalziumstimulierter Makropinozytose und Interleukin-1β-Sekretion 59 5 Diskussion 61 5.1 Kalziumstimulierte Makropinozytoseaktivität von Monozyten und Makrophagen 61 5.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen 64 5.2.1 Auswirkung der Phosphatkonzentration im Zellkulturmedium auf die kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen 65 5.2.2 Kalziumstimulierte Interleukin-1β-Sekretion von Monozyten und Makrophagen von RA-Patienten und Kontrollprobanden 66 5.3 Zusammenhang von kalziumstimulierter Makropinozytose und Interleukin-1β-Sekretion in Monozyten und Makrophagen von RA-Patienten und Kontrollprobanden 70 5.4 Ausblick und offene Fragen 71 6 Zusammenfassung der Arbeit 73 8 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 88 9 Danksagung 89

Le développement d'un cancer chez un individu immunocompétent témoigne del'inefficacité de ses défenses immunitaires naturelles à entraver la progression tumorale. Larestauration ou l'induction de réponses immunitaires anti-tumorales efficaces sont des enjeuxmajeurs des stratégies thérapeutiques actuelles. En plus des immunothérapies classiques,visant à activer le système immunitaire des patients contre leurs tumeurs, les thérapiesconventionnelles, telles que les chimiothérapies et la radiothérapie, peuvent avoir des effetsimmunostimulants, en parallèle de leur effet directement cytotoxique sur les cellulestumorales. Parmi celles-ci, les anthracyclines, l'oxaliplatine et la radiothérapie sontnotamment capables d'induire une mort cellulaire immunogène. L'efficacité thérapeutique deces traitements dépend de l'activation de lymphocytes T (LT) CD8 anti-tumoraux,producteurs d'interféron-gamma (IFN-γ). En utilisant des modèles murins de tumeurstransplantées, nous montrons que le traitement des cellules tumorales par des droguesimmunogènes induit la libération d'adénosine triphosphate (ATP) dans le milieu extracellulaire.Ce signal de danger endogène se lie à son récepteur P2RX7 sur les cellulesdendritiques et permet la formation de l'inflammasome NLRP3/ASC/pro-caspase 1,conduisant à l'activation protéolytique de la caspase 1, qui active la pro-interleukine-1β (pro-IL-1β) en interleukine-1β (IL-1β). L'IL-1β peut directement agir sur les LT CD8 pourfaciliter leur polarisation vers un phénotype de lymphocytes T cytotoxiques de type 1 (Tc1).De plus, le traitement de tumeurs établies par des drogues immunogènes induit uneproduction d'IL-17A (IL-17) dans le lit tumoral, au cours de la première semaine suivant letraitement. Les LT gamma delta (LTγδ) sont les principaux producteurs de cette cytokinedans nos modèles. Ces cellules s'accumulent transitoirement dans la tumeur dès le troisièmejour suivant le traitement et leur taux est parfaitement corrélé à celui des LT CD8 producteursd'IFN-γ tumoraux. Comme l'IFN-γ, l'IL-17 et les LTγδ sont nécessaires à l'efficacitéthérapeutique des drogues immunogènes. L'IL-1β produite par les cellules dendritiquesexposées à des corps apoptotiques immunogènes stimule directement la production d'IL-17par les LTγδ. Ces travaux ont contribué à identifier l'ATP extra-cellulaire comme undéterminant moléculaire de l'immunogénicité des cellules tumorales exposées à certainesthérapies anti-cancéreuses conventionnelles. De plus, nous montrons que les traitementscytotoxiques classiques peuvent moduler l'environnement immunitaire dans le lit tumoral, etcontribuer à remplacer une inflammation chronique et immunosuppressive en uneinflammation aigüe et immunogène. L'étude des interactions entre le système immunitaire etles thérapies anti-cancéreuses conventionnelles est nécessaire pour utiliser ces traitements demanière plus rationnelle, en les combinant par exemple à des immunothérapies plusclassiques.

Hyperhomocysteinemia (hHcys) is a widely known pathogenic factor in the progression of end-stage renal disease (ESRD) and it is also associated with an increased risk for injurious cardiovascular pathologies during ESRD. HHcys is linked to the formation and activation of the NOD-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome, characterized as a critical early mechanism initiating the inflammatory response. NADPH oxidase (NOX)-derived reactive oxygen species (ROS) mediate the activation of the NLRP3 inflammasome in podocytes in response to elevated levels of homocysteine (Hcys) in vitro and in vivo. However, it remains unknown how NLRP3 inflammasome activation is triggered by NOX. The aim of the present study sought to determine the signaling cascade that triggers glomerular injury and sclerosis during hHcys mediated by Vav2, a guanine nucleotide exchange factor (GNEF). Using both genetic and pharmacological interventions of Vav2, we first tested whether this GNEF is involved in hHcys-induced NLRP3 inflammasome activation in podocytes by its role in activation of the Rac-1-NOX complex. Further, we explored whether pharmacological targeting of Vav2 activation may regulate NLRP3 inflammasome signaling pathway during hHcys-induced glomerular injury. We found that mice with hHcys (on the FF diet) or oncoVav2 (a constitutively active form of Vav2) transfection in the kidney exhibited increased colocalization of NLRP3 with apoptosis-associated speck-like protein (ASC) or caspase-1 and elevated IL-1β levels in glomeruli, indicating the formation and activation of the NLRP3 inflammasome. This glomerular NLRP3 inflammasome activation was accompanied by podocyte dysfunction and glomerular injury, even sclerosis. Local transfection of Vav2 shRNA plasmids significantly attenuated hHcys-induced NLRP3 inflammasome activation, podocyte injury, and glomerular sclerosis. In cultured podocytes, Hcys treatment and oncoVav2 transfection increased NLRP3 inflammasome formation and activation. This NLRP3 activation was inhibited by Vav2 shRNA, associated with reduction of Rac-1 activity and ROS production. Administration of NSC23766, a Rac-1 inhibitor substantially attenuated inflammasome formation, desmin expression and decreased podocin expression in glomeruli of hHcys mice. These results suggest that elevated Hcys levels activate Vav2 and thereby increase NOX activity, leading to ROS production. ROS trigger NLRP3 inflammasome activation, podocyte dysfunction and glomerular injury. Therefore, the present study defines a novel mechanism underlying hHcys-induced NLRP3 inflammasome activation and its progression to ESRD.

Inflammation is a biological defence mechanism applied by living organisms against foreign invaders. In the response to DAMPs and PAMPs, organisms use inflammatory multi-protein complexes to fight the attackers. The most studied inflammasome proteins are NLRP3, ASC and Caspase-1. This study is aimed at understanding the role of NEK7 protein in the NLRP3 inflammasome’s activation, using CRISPR/Cas9 system. To determine the effect of CRISPR/Cas9 and transfection, mRNA expression was analyzed. The results obtained suggest that neither the transfection nor the NEK7 protein knockout have sufficiently worked. This study could not experimentally establish that NEK7 triggers NLRP3 inflammasome activation because ELISA was not conducted to verify the levels of cytokines emitted, due to there being no statistical differences between the samples. Above all, the research question in this thesis project was not answered because the instability of the ACTB reference gene negatively influenced the results. However, previous related studies conclude that NEK7 plays a crucial role in the activation of the NLRP3 inflammasome.

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La granulomatose septique chronique (CGD) est un syndrome rare causé par une déficience des sous-unités du complexe de la NADPH oxydase 2 phagocytaire. Deux tiers des cas de CGD sont causés par des mutations de perte de fonction dans le gène CYBB, qui code pour la protéine gp91phox ou NOX2. Une susceptibilité accrue aux infections est le phénotype le plus évident observé chez les patients atteints de la CGD. Cependant, les individus déficients en NOX2 présentent également une activation accrue de l'inflammasome NLRP3, qui est la cause de manifestations auto-inflammatoires. Des données préliminaires suggèrent que ce phénomène est lié à une production défectueuse de ROS cytosoliques. L'objectif de ce projet est d’étudier la dysfonction de la réponse inflammatoire au cours du déficit en NOX2 en utilisant une lignée cellulaire de monocytes/macrophages THP-1 génétiquement modifiées par CRISPR pour abroger l’expression de NOX2. En utilisant cette lignée NOX2-deficient, j'ai ainsi pu démontrer que les phagocytes déficients en NOX2 présentent un priming accru de l'inflammasome NLRP3, comme en témoigne la transcription élevée des gènes NLRP3 et IL1B via une hyperactivation de la voie de signalisation NF-κB dépendante de l’IL-1β. Au niveau post-traductionnel, l’absence de NOX2 provoque une libération excessive d'ADN mitochondrial en raison de dommages mitochondriaux, activant ainsi l'inflammasome NLRP3. De plus, la pyroptose dépendante de NLRP3 dans les phagocytes déficients en NOX2 amplifie l'activation de l’inflammasome NLRP3. L’utilisation de ce modèle cellulaire offrira de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de CGD présentant des manifestations inflammatoires de manière plus ciblée. / Chronic Granulomatous Disease (CGD) is a rare syndrome caused by a deficiency of either NOX2 or any of the NADPH oxidase complex 2 subunits in phagocytes. Two-thirds of CGD cases are caused by loss-of-function mutations in the CYBB gene, which codes for the gp91phox protein, also called NOX2. Increased susceptibility to infections is the most obvious phenotype observed in CGD patients; however, NOX2-deficient individuals also experience increased NLRP3 inflammasome activation, which is the cause of autoinflammatory manifestations. Preliminary data suggest this phenomenon could be due to defective cytosolic ROS production. This project aims to examine the role of NOX2 in the regulation of the NLRP3 inflammasome using CRISPR-engineered THP-1 monocytes knock-out for CYBB gene encoding NOX2. Using this THP-1 cell line, I have successfully demonstrated that NOX2-deficient phagocytes exhibit enhanced priming of the NLRP3 inflammasome at the transcriptional level, as demonstrated by elevated transcription of the NLRP3 and IL1B gene via hyperactivation of the NF-κB pathway dependent on IL-1β. Post-translationally, decreased NOX2 causes excessive release of mitochondrial DNA due to mitochondrial damage, activating the NLRP3 inflammasome. Additionally, NLRP3-driven pyroptosis in NOX2-deficient phagocytes amplifies NLRP3 activation. Using this cell model, will provide the opportunity to treat CGD patients with inflammatory manifestations in a more focused manner.

The calcium-sensing receptor (CaSR) is expressed in many cell types - including immune cells and in particular circulating monocytes. Here, the receptor plays an important physiological role as a regulator of constitutive macropinocytosis. This review article provides an overview of the literature on the role of the calcium sensing receptor in the context of inflammatory processes. Special emphasis is laid upon the importance for monocytes in the context of rheumatoid arthritis. We have shown previously, that stimulation of the receptor by increased extracellular Ca2+ ([Ca2+]ex) triggers a pro-inflammatory response due to NLRP3 inflammasome assembly and interleukin (IL)-1β release. The underlying mechanism includes macropinocytosis of calciprotein particles (CPPs), which are taken up in a [Ca2+]ex-induced, CaSR dependent manner, and leads to strong IL-1β release. In rheumatoid arthritis (RA), this uptake and the resulting IL-1β release is significantly increased due to increased expression of the receptor. Moreover, increased [Ca2+]ex-induced CPP uptake and IL-1β release is associated with more active disease, while CaSR overexpression has been reported to be associated with cardiovascular complications of RA. Most importantly, however, in animal experiments with arthritic mice, increased local calcium concentrations are present, which in combination with release of fetuin-A from eroded bone could contribute to formation of CPPs. We propose, that increased [Ca2+]ex, CPPs and pro-inflammatory cytokines drive a vicious cycle of inflammation and bone destruction which in turn offers new potential therapeutic approaches.

The inflammasome complex is a multiprotein complex that may play a role in the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD) by secreting the inflammatory cytokines interleukin (IL)-1β and IL-18, and inducing pyroptosis, as a response to signals through several inflammasome sensors. This study looked at the expression of several inflammasome components in the ileum and colon of patients suffering from IBD. The inflammasome sensors NLRP1, NLRP3, AIM2 and pyrin were upregulated in whole intestinal tissue of IBD patients, particularly in the colon. NLRP6 expression was increased in the colon of Crohn's disease patients, but not ulcerative colitis patients relative to colon of controls, and was reduced in the ileum of Crohn's disease patients compared to control ileum. Expression of caspase-1 and IL-1β, but not IL-18, were also increased in ileum and colon tissue from Crohn's patients. To identify the cell type where inflammasome expression was altered in Crohn’s disease, transcription of inflammasome subunits in intestinal tissue enriched for epithelial cells or lamina propria (LP) cells was analysed. These analyses indicated that LP cells have greater expression of the inflammasome sensors NLRP1, NLRP3, AIM2 and pyrin relative to epithelial cells, both during disease and in control tissue. Moreover, LP cells from Crohn’s patients have higher expression level of NLRP1, AIM2 and pyrin than LP cells from controls. In contrast the inflammasome sensor NLRP6 was more highly expressed by epithelial cells relative to LP cells in general, and NLRP6 expression in LP cells from IBD patients was lower than that observed in LP cells from controls. The observed differential expression of inflammasome components in controls versus IBD intestine and in different cellular fractions of intestinal tissue highlight the importance of understanding the role of the inflammasome in IBD and hints at the possibility of targeting the inflammasome pathway as a future treatment strategy.

L'inflammation joue un rôle clé dans de nombreuses pathologies, telles que les maladies inflammatoires chroniques, les désordres métaboliques et le cancer. L'un de ses médiateurs le plus puissant est l'interleukine-1β (IL-1β), qui est une cytokine pro-inflammatoire participant à tous les stades de l'inflammation et de l'immunité. Son activation est régulée par un complexe multi-protéique nommé inflammasome, dont la caspase-1 active en découlant est responsable du clivage et de la maturation de l'IL-1β. Huit types d'inflammasomes activant et clivant la pro-caspase-1 ont été identifiés et contiennent tous la protéine ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD). Les inflammasomes partagent un signal intracellulaire commun et le mécanisme menant à leur assemblage et leur activation n'est pas totalement élucidé. L'utilisation de la lignée cellulaire humaine monocytaire, THP-1, différenciée en macrophages grâce à un ester de phorbol, le TPA, a permis la mise en place d'un modèle d'étude de modulateurs de l'inflammasome en conditions stériles. Ce modèle a permis l'étude des mécanismes impliqués suite à des signaux issus de l'inflammation chronique, tels que l'ATP et les espèces réactives de l'oxygène (ROS). Ce travail montre qu'il existe une synergie entre ATP et ROS, qui agissent grâce à une boucle d'activation impliquant probablement plusieurs inflammasomes, dont NLRP3. Des donneurs de NO connus (trinitrine et isosorbide dinitrate) ou nouveau (dérivé de purine) ont montré une activité anti-inflammatoire. D'autres composés ont été identifiés comme de potentiels inhibiteurs d'inflammasome (extraits de dattes et dérivé de purine portant un acide lipoïque)