A célula estromal pode influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário e secundário, mas pouco é conhecido sobre as características moleculares das células estromais presentes na medula óssea de pacientes com câncer de mama. Nosso objetivo foi avaliar a expressão gênica diferencial entre as células estromais oriundas de medula óssea na presença ou ausência de célula tumoral oculta. Coletamos dez aspirados de medula óssea das pacientes com câncer de mama. A classificação do comprometimento da medula por células tumorais ocultas foi realizada pela detecção da expressão de CK19 por Nested-RT-PCR e quatro entre dez pacientes apresentaram presença de célula tumoral na medula óssea. Estabelecemos culturas primárias de células estromais de todas as amostras e, selecionamos amostras originárias de duas pacientes contendo linfonodos comprometidos e presença de célula tumoral oculta em medula e também de duas pacientes que não apresentavam linfonodos comprometidos e nem célula tumoral oculta na medula. As pacientes selecionadas eram pós-menopausadas com diagnóstico de carcinoma ductal invasor e expressão imunohistoquímica positiva para receptor de estrógeno e progesterona. Realizamos avaliação do perfil de expressão gênica entre estes dois grupos, o que nos revelou 21 genes diferencialmente expressos dentre os 4.608 genes imobilizados em lâmina de cDNA microarray; nove genes hiperexpressos em célula estromal de medula comprometida (PTHLH, TLOC1, NCOA6, C17orf57, ANAPC11, MAST4, POLR3E, CPNE1 e B4GALT5) e doze genes hipoexpressos em célula estromal de medula comprometida (MRPL2, NAT10, DAP, RNF2, FLOT2, FKBP10, SLIT3, EBNA1BP2, SLC35B2, MICAL2, GPR3, TSPAN17). Nossos dados sugerem que apesar da expressão gênica de células estromais oriundas de medula óssea comprometida ou não por micrometástases ser semelhante, algumas diferenças podem ser identificadas. / Stromal cells may influence tumor development in primary and secundary sites, however, molecular characteristics of bone marrow stromal cells from breast cancer patients are almost unknown. Our aim was to evaluate the differential gene expression of bone marrow stromal cells from breast cancer patients in the presence or abscence of occult tumor cells. Bone marrow (BM) aspirates were obtained from 10 breast cancer patients. The presence of occult bone marrow disseminated tumor cells was detected by CK19 expression quantified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Presence of tumoral cell was detected in four of ten BM samples. Stromal cells primary cultures were established and samples from two patients with positive lymph nodes and presence of occult tumor cells in bone marrow and samples from two patients with negative lymph nodes and abscence of occult tumor cells in bone marrow were selected. All the included patients were postmenopausal with invasive ductal carcinoma and positive estrogen and progesterone receptors detected by immunohistochemical analysis. Gene profile evaluated in cDNA microarray slides containing 4.608 spotted genes revealed 21 differencially expressed genes, nine upregulated (PTHLH, TLOC1, NCOA6, C17orf57, ANAPC11, MAST4, POLR3E, CPNE1 e B4GALT5) and twelve downregulated (MRPL2, NAT10, DAP, RNF2, FLOT2, FKBP10, SLIT3, EBNA1BP2, SLC35B2, MICAL2, GPR3, TSPAN17) in stromal cell derived from bone marrow in the presence of tumor breast cancer cell. Our data suggest that gene expression from bone marrow derived stromall cells in the presence or abscence of occult tumor cells seems similar, however small differences may be identified.

INTRODUÇÃO: A cirurgia associada à radioterapia proporciona altas taxas de preservação de membros e de controle local em sarcomas de partes moles de extremidade de adultos, mas ainda apresenta elevadas taxas de complicações locais e de metástases à distância. O valor da quimioterapia adjuvante ou neoadjuvante ainda é controverso e objeto de investigações clínicas. A identificação de fatores moleculares preditivos de resposta à quimioterapia pode selecionar pacientes que se beneficiem ou não da sua aplicação. OBJETIVOS: identificar perfis de expressão gênica capazes de diferenciar tumores respondedores e não respondedores a quimioterapia neoadjuvante em sarcomas de partes moles. Analisar os resultados preliminares relativos à efetividade de um esquema de quimioterapia neoadjuvante em sarcomas de partes moles. MÉTODOS: amostras foram coletadas a partir de um ensaio clínico fase II não controlado que testa um esquema de quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina e ifosfamida em sarcomas de alto grau histológico, localizados em extremidades de pacientes adultos. O perfil de expressão gênica foi determinado pela análise de cDNA microarrays. RESULTADOS: 14 pacientes foram incluídos no estudo clínico e 6 amostras foram utilizadas para análise molecular. 222 seqüências diferentemente expressas entre respondedores e não respondedores foram identificadas. Entre os genes com maior diferença de expressão, foram observados genes envolvidos com via de sinalização de TGF, genes envolvidos com angiogênese, com degradação de matriz extracelular e com desenvolvimento. A taxa de resposta objetiva à quimioterapia neoadjuvante foi de 28,6%, a taxa de amputação foi de 7,1% e taxa de complicações relacionadas à ferida operatória foi de 23%. Complicações graus 3 e 4 ocorreram em 50% dos pacientes e nenhum deles faleceu ou teve a proposta cirúrgica suspensa em decorrência de complicações da quimioterapia. CONCLUSÕES: tumores respondedores a quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina e ifosfamida apresentaram um perfil de expressão gênica diferente dos não respondedores, particularmente em genes envolvidos na via de sinalização de TGF. O esquema terapêutico testado mostrou-se efetivo e seguro para ser investigado em um estudo fase III / INTRODUCTION: Surgery combined with adjuvant radiotherapy provides high rates of limb sparing and local control for adult extremity soft tissue sarcomas, but is still associated with high rates of local morbidity and distant recurrences. The role of adjuvant or neoadjuvant chemotherapy is still controversy and target of clinical investigations. The identification of molecular predictive factors of response to chemotherapy could select patients who have benefits or not with its use. OBJECTIVES: to identify gene expression profiles that discriminate tumors with respect to response to neoadjuvant chemotherapy. Analyze the preliminary results of a protocol of neoadjuvant chemotherapy in soft tissue sarcomas. METHODS: samples were collected from subjects of a single-arm prospective clinical trial that investigates the effectiveness of a neoadjuvant doxorubicin and ifosphamide-based chemotherapy regimen in high grade extremity soft tissue sarcomas in adults. Gene expression profiles were determined by the analysis of cDNA microarrays. RESULTS: 14 patients were included in the clinical trial and six samples were used in the molecular study. 222 sequences differentially expressed between responders and non responders were identified. Among the genes with higher differences in expression, we have identified genes involved with TGF signaling pathway, angiogenesis, extracelular matrix degradation and development. The objective response rate to neoadjuvant chemotherapy was 28,6%, the amputation rate was 7,1%, and the wound complication rate was 23%. Grades 3 and 4 complications have occurred in 50 % of the cases, but no deaths or modifications on surgical intent related to chemotherapy complications have occurred. CONCLUSIONS: tumors considered responders to neoadjuvant chemotherapy showed a gene expression profile significantly different from non responders, especially with respect to the TGF signaling pathway. The neoadjuvant regimen tested has showed to be effective and safe to be considering for a phase III clinical trial

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-06-21T13:51:59Z No. of bitstreams: 1 vivianhonoratobarletta.pdf: 2632443 bytes, checksum: c92921b16b55178bf7a44b922bd843ef (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-07T19:10:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vivianhonoratobarletta.pdf: 2632443 bytes, checksum: c92921b16b55178bf7a44b922bd843ef (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T19:10:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vivianhonoratobarletta.pdf: 2632443 bytes, checksum: c92921b16b55178bf7a44b922bd843ef (MD5) Previous issue date: 2011-02-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os norovírus (NoV) são importantes agentes etiológicos, responsáveis por surtos e casos esporádicos de doença diarréica aguda, que acometem indivíduos de todas as idades. A partícula viral não apresenta envelope e o material genético é constituído por uma molécula de RNA de fita simples, de polaridade positiva. Pertencem à família Caliciviridae, gênero Norovirus e estão classificados em cinco genogrupos (GI–V), sendo que os NoV humanos estão agrupados nos genogrupos I, II e IV e destes, os NoV do genogrupo II e genótipo 4 (GII.4) são os mais comumente encontrados, em todo o mundo. Apesar da associação destes vírus com a doença diarréica aguda estar bem documentada na literatura mundial, no Brasil, os trabalhos são escassos e restritos aos grandes centros e adjacências. Assim, considerando-se o pouco conhecimento sobre os norovírus e a inexistência de dados epidemiológicos na cidade de Juiz de Fora, MG, foi realizado o presente estudo, cujos objetivos foram a detecção e caracterização molecular de amostras de NoV, associadas a casos esporádicos de doença diarréica aguda infantil, bem como a avaliação da influência de fatores climáticos e demográficos na ocorrência destas infecções. De janeiro de 2008 a dezembro de 2009, 218 espécimes fecais foram analisados para a presença de NoV, por RT-PCR convencional, todos obtidos de crianças de 0 a 12 anos de idade, proveniente de atendimentos ambulatoriais (89,45%) e hospitalizados (10,55%). Foram detectadas 20 (9,17%) amostras positivas e observou-se uma tendência de sazonalidade das infecções no período da estação seca, no ano de 2008, fato que não se repetiu em 2009. A maioria das amostras positivas foi detectada em crianças na faixa de 0 a 36 meses e não houve correlação, estatisticamente significante, entre a ocorrência das infecções e o sexo. Das 20 amostras detectadas, 19 foram caracterizadas como NoV GII e 1 como NoV GI. O sequenciamento parcial do genoma e a análise filogenética das amostras selecionadas, revelou a presença de NoV dos genótipos GII.4 e GII.6, que cocircularam nos dois anos do estudo. As amostras NoV GII.4, detectadas em Juiz de Fora, apresentaram maior similaridade de nucleotídeos e de aminoácidos com aquelas que circularam no estado do Rio de Janeiro nos anos de 2006, 2007 e 2008. A análise filogenética das amostras NoV GII.6 detectadas em Juiz de Fora, associada à alta similaridade das sequências de nucleotídeos e aminoácidos, mostrou que estas foram mais proximamente relacionadas com a amostra NoV GII.6 (GU132461/2007), detectada no estado do Rio de Janeiro em 2007, fatos que, aliados à proximidade geográfica de ambas as cidades, sugerem uma possível linhagem comum entre as mesmas. Este levantamento epidemiológico permitiu constatar a presença e circulação de NoV na população infantil de Juiz de Fora, MG, demonstrando sua importante participação como agente etiológico das diarreias agudas, também nesta comunidade / Noroviruses (NoV) are important etiological agents responsible for outbreaks and sporadic cases of acute diarrhea in individuals of all ages. The viral particles are nonenveloped with and the genome is composed of a positive single-stranded RNA. Norovirus belongs to the Caliciviridae family, Norovirus genus and are classified into five genogroups (GI-V), with GI, GII and GIV being found in human and among them, the NoV GII genotype 4 (GII.4) are the most commonly found worldwide. In Brazil, norovirus surveys are realized mainly in research institutes, carried out in the biggest centers and surroundings. Thus, considering the little knowledge about these viruses and the lack of epidemiological data on this viral infection in the Juiz de Fora city, MG state, it was performed this study, which aimed to detect and characterize the NoV samples, associated with sporadic cases of acute infantile diarrhea, as well as asses the influence of climatic and demographic factors in the occurrence of these infections. Between January 2008 to December 2009, 218 fecal specimens were analyzed for the presence of NoV by conventional RT-PCR, all obtained from children 0-12 years of age, from outpatient (89.45%) and inpatients (10.55%). We detected 20 (9.17%) positive samples and there was a tendency for seasonal infections during the dry season in 2008, a fact which was not repeated in 2009. The biggest number of positive samples were detected in children aged 0 to 24 months and there was no statistically significant correlation between the occurrence of infections and sex. Of the 20 samples detected, 19 were characterized as NoV GII and 1 as NoV GI. The partial genome sequencing and phylogenetic analysis of selected samples revealed the presence of NoV genotypes GII.4 and GII.6, which co-circulated in the two years of study. Samples NoV GII.4 detected in Juiz de Fora, showed greater similarity of nucleotides and aminoacids with those that circulated in the state of Rio de Janeiro during 2006, 2007 and 2008. Phylogenetic analysis of the samples GII.6 NoV, detected in Juiz de Fora, associated with the high similarity of nucleotide and amino acid sequences showed that they were most closely related to the sample GII.6 NoV (GU132461/2007) detected in the state of Rio de Janeiro in 2007. This fact associated with the geographical proximity of both cities, suggesting a possible common lineage between them. This epidemiological survey revealed the presence and circulation of NoV in the infantile population of Juiz de Fora, MG, demonstrating its important role as an etiologic agent of acute diarrhea, also in this community.

Orientadores: Carmen Silvia Passos Lima, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T13:59:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lourenco_GustavoJacob_D.pdf: 4599367 bytes, checksum: 0a02bc7c2e5acd6b81b6cbb948444b69 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Alterações genéticas herdadas, como os polimorfismos gênicos de base única (SNPs) e as variações no número de cópias do DNA (CNVs), foram associadas com o risco de carcinoma de células escamosas (CEC) de base de língua (BL) em poucos estudos. O CEC de BL é um tumor que determina altas taxas de morbidade e mortalidade, no entanto, sua associação com polimorfismos genéticos não está estabelecida. Frente ao exposto, o objetivo deste estudo foi o de avaliar os papéis de SNPs e CNVs no CEC de BL. O DNA genômico foi obtido de amostras de sangue periférico de 49 pacientes com CEC de BL e de 49 controles. Cada amostra foi analisada por meio de lâminas com microarranjos de DNA contendo 500.568 SNPs e 420.000 CNVs (Affymetrix®). A digestão enzimática do DNA, a ligação de adaptadores, a amplificação, a fragmentação, a marcação, a hibridização, as lavagens e a leitura das intensidades dos sinais das sondas foram realizadas de acordo com instruções do fabricante. Os dados obtidos foram analisados utilizando o programa Bioconductor e o algoritmo crlmm. Para os SNPs, as diferenças entre os grupos foram analisadas por meio da regressão logística múltipla. Para as CNVs, os dados obtidos foram analisados por meio do programa Partek®. Regiões de ganhos ou perdas significativas de DNA foram determinadas pelo algoritmo cbs. Os genes de interesse foram escolhidos por meio do programa DAVID. Nós observamos que a frequência de 6.609 SNPs foi distinta entre pacientes com CEC de BL e controles (P< 0,01). Cinquenta e dois SNPs (0,8%) estiveram localizados nas regiões codificantes do DNA, 51 (0,8%) estiveram nas regiões 3' e 5' não traduzidas, 3.461 estiveram em regiões regulatórias de transcrição e 3.045 em íntrons. Os SNPs considerados de interesse estiveram localizados nos genes relacionados ao ciclo celular (ERP29, MCC e PTCH1), à transcrição (IKBKAP e ZNF415) e à adesão celular (COL22A1, LEF1 e LY6K). Nós identificamos regiões do DNA que apresentaram duplicações em genes relacionados com a proliferação celular (ADAM3A, ADAM5P e DDT), apoptose (FAM90A), mecanismo de defesa (DEFB) e metabolismo de carcinógenos (GSTs). Nós também observamos genes deletados relacionados à apoptose (BLC2) e aos receptores do olfato (ORs). Nossos resultados sugerem que SNPs e CNVs em genes relacionados com a origem e a progressão de tumores podem predispor indivíduos ao CEC de BL. No entanto, esses resultados devem ser validados por genotipagens de número maior de indivíduos e por análises funcionais de proteínas codificadas por alelos distintos de genes polimórficos / Abstract: Inherited genetic alterations, such as single nucleotide polymorphisms (SNPs) and copy number variations (CNVs), were described in association with base of tongue (BT) squamous cell carcinoma (SCC) risk in only few reports. BTSCC are tumours with high morbidity and mortality rates; however, the association of SNPs and CNVs and BTSCC risk is still not clarified and, therefore, this was the aim of the present study. DNA was extracted of the peripheral blood samples of 49 BTSCC patients and 49 controls. Each sample was genotyped using DNA high-resolution microarrays containing 500.568 SNPs and 420.000 CNVs (Affymetrix®). Further sample processing, including digestion, adaptor ligation, amplification, fragmentation, labelling, hybridization, washing and scanning was assayed according to the standard protocol. Genotype data were acquired by genotyping calling of samples using the crlmm algorithm provided by Bioconductor software, as per the recommended guidelines. For SNPs, the differences between groups were analysed by the logistic regression model. For CNVs, the patients' and controls' data files were imported into the Partek® Genomic Suite. Common aberration analysis was performed on all samples to identify genomic intervals that had statistically significant aberrations. Significantly different regions were determined using the segmentation algorithm. For SNPs, we observed 6.609 SNPs with distinct frequencies between BTSCC patients and controls (P< 0.01). Fifty two SNPs (0.8%) were located in coding sequence of amino acids, 51 (0.8%) in 3' and 5' untranslated regions, 3.461 (52.4%) in up or downstream regions and 3.045 (46.0%) in introns. The SNPs were clustered to their main function, evidencing those localized in genes related to cell cycle and apoptosis (ERP29, MCC and PTCH1), transcriptional process (IKBKAP and ZNF415) and cell adhesion and metastasis (COL22A1, LEF1 and LY6K). We also identified a consistent number of altered regions including duplicated genes, such as involved in cell proliferation and angiogenesis (ADAM3A, ADAM5P and DDT), apoptosis (FAM90A), defensins proteins (DEFB) and metabolism of carcinogens (GSTs); and deleted genes, such as in olfactory receptors (ORs) and apoptosis (BCL2). Our preliminary results suggest that SNPs and CNVs in genes involved in tumour origin and progression may predispose individuals to BTSCC. However, these results should be confirmed by functional studies of coded proteins and validated by genotyping in larger epidemiological studies / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Zur Behandlung von Tumorerkrankungen sind radioaktiv markierte Antikörper als hochaffine und selektive Radioimmuntherapeutika von zunehmender Bedeutung. Allerdings ist der Einsatz solcher radioaktiv markierter Antikörper bei der Behandlung strahlenresistenter solider Tumore limitiert, weil infolge ihrer hohen Blutverweildauer und nur langsamen Anreicherung im Zielgewebe, bedingt durch ihre Molekülgröße, der gesamte Organismus einer hohen Strahlenbelastung ausgesetzt wird. Eine Alternative dazu stellt die Strategie des Pretargeting von Tumoren dar. Die Intention dieses Prinzips besteht darin, mittels einer mehrstufigen Applikationsfolge die Injektion eines targetspezifischen Antikörper-Konjugates und einer kleinen radioaktiv markierten Verbindung zu trennen, welche zueinander ein komplementäres System bilden. Eine Substanzklasse die erstmals von Wissenschaftlern des Helmholtz-Zentrums Dresden-Rossendorf (HZDR) als potentielles komplementäres System für Tumor-Pretargeting-Anwendungen untersucht wurden ist, sind spiegelbildliche bzw. L konfigurierte Oligonukleotide. Aufgrund ihrer hohen metabolischen Stabilität, geringen Immunogenität und sehr geringen Spezifität zu natürlich vorkommenden potentiellen Bindungspartnern sind L-Oligonukleotide, im speziellen L-DNA-Derivate, das ideale System bzgl. der In-vivo-Hybridisierung zwischen einem tumorspezifischen Antikörper und der radioaktiv markierten Chelateinheit. Das verwendete Pretargeting-System besteht aus den Radionuklid markierbaren Komponenten NOTA-L-DNA-(0-20kDa)-PEG 6a-e sowie DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d und aus der targetspezifischen Antikörper-Einheit, deren Entwicklung eines der Aufgabengebiete der vorliegenden Arbeit darstellte. Als Antikörper wurde dabei der klinisch zugelassene chimäre monoklonale Antikörper Cetuximab (Handelsname Erbitux®, C225) verwendet, welcher mit sehr hoher Affinität an das Oberflächenprotein „Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor“ (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) bindet. Die Zielstellung dieser Arbeit beinhaltete vor allem die In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung des L-DNA basierenden Pretargeting-Systems im Hinblick darauf, ob das Internalisierungsverhalten von Cetuximab einen limitierenden Faktor für seine Anwendung in Pretargeting-Experimenten darstellt. Es konnten zwei mit der komplementären L-DNA (c-L-DNA) modifizierte Cetuximab-Derivate mit einem niedrigen (n = 1,5) und einem hohen (n = 5) Konjugationsgrad an c-L-DNA hergestellt werden. Zur radiopharmakologischen Charakterisierung wurden beide Konjugate zusätzlich mit NOTA funktionalisiert und entsprechende Verfahren zur Markierung mit dem Radiometallnuklid 64Cu erarbeitet. Die Reaktionsparameter sowohl bei der Synthese als auch bei der Radiomarkierung wurden hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und der mechanischen Beanspruchung so gewählt, dass einerseits der Affinitätsverlust in Bezug zum nativen Cetuximab möglichst gering gehalten wird und andererseits die erarbeiteten Protokolle sich perspektivisch auch auf andere Antikörper übertragen lassen. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit bestand darin, die Internalisierungsgeschwindigkeit der beiden Cetuximab-Konjugate NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 im Hinblick auf deren Eignung für In vivo-Pretargeting-Experimente zu bewerten. Dabei wurde festgestellt, dass bereits nach 24 h an A431- und FaDu-Zellen 50 - 70% des auf der Zelloberfläche gebundenen Antikörpers nicht mehr für die Bindung der radioaktiv markierten Komponente zur Verfügung stand. 72 h nach der Antikörperapplikation waren sogar 80 - 90% des extrazellulär gebundenen Antikörpers internalisiert. Besonders diese hohe Internalisierungsrate könnte im Hinblick auf In-vivo-Anwendungen problematisch sein und eine geringe Tumorakkumulation der radioaktiv markierten Komponente bewirken. Infolge der Konjugation von Cetuximab mit p-SCN-Bn-NOTA 3, GMBS 9 und 17mer-c-L-DNA 2 war eine Änderung der pharmakologischen Eigenschaften von Cetuximab nachweisbar. Insbesondere dadurch, dass die Antikörpermodifikation vorrangig an den Aminogruppen der Lysin-Einheiten erfolgte und durch das 17fach negativ geladene Phosphatrückgrat des Oligonukleotids, wurde eine starke Anionisierung der Oberflächenladung und damit eine Verringerung des isoelektrischen Punktes festgestellt. Dennoch bestätigten Kompetitionsbindungsstudien an A431- und FaDu-Gesamtzellhomogenat für alle untersuchten Antikörper-Derivate unabhängig vom Konjugationsgrad deren sehr hohe Affinität zum EGFR. Auch die an intakten Zellen berechneten KD-Werte unterstreichen dies. Einzig die Bindungskapazität weist dabei eine Abhängigkeit zum Konjugationsgrad auf, sodass trotz sehr guter Ki- und KD-Werte auf eine Verringerung der Affinität infolge der Antikörpermodifikation zu schließen ist. Interessant ist auch, dass nach einem Zeitraum > 4 h eine zweite Bindungsphase auftritt, welche möglicherweise durch eine Reexpression des EGFR aus intrazellulären Kompartimenten, infolge der Internalisierung des Rezeptor-Antikörperkomplexes, hervorgerufen wird. Außerdem wurde untersucht, inwieweit die unterschiedlichen und sterisch sehr anspruchsvollen PEG-Substituenten der 17mer-L-DNA die Hybridisierung am Antikörper sowie am Rezeptor-Antikörper-Komplex an A431- und FaDu-Zellen beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass die Hybridisierung am Immunkomplex in Abhängigkeit des PEGylierungsgrades vom nicht PEGylierten Konjugat [64Cu]Cu6a zum 20kDa-PEG-Derivat [64Cu]Cu6e sukzessive abnimmt. Hingegen scheint der PEGylierungsgrad bei der Hybridisierung am im Phosphatpuffer und im humanen Vollblut inkubierten Antikörper keinen Einfluss zu haben. Weiterhin wurde im Zellversuch gezeigt, dass am hoch modifizierten Cetuximab-Konjugat NOTA3-C225-(c L-DNA)5 in Abhängigkeit des Konjugationsgradunterschiedes zum niedrig modifizierten Derivat NOTA3-C225-(c L-DNA)1,5 ca. dreimal mehr Ligand hybridisiert. Erste In-vivo-Pretargeting-Untersuchungen bestätigten, dass NOTA-L-DNA-10kDa-PEG 6d der ideale „Kandidat“ für das Pretargeting-Konzept basierend auf L-konfigurierten Oligonukleotiden ist. Besonders die wesentlich höhere Tumorakkumulation von [68Ga]Ga6d (10kDa-PEG) im Vergleich zu den anderen untersuchten L-DNA-Konjugaten [68Ga]Ga 6a-c (0, 2, 5kDa PEG) und [68Ga]Ga6e (20kDa-PEG) ist dabei von besonderer Bedeutung. Zukünftige Pretargeting-Studien sollten demnach ausschließlich mit der 10kDa-PEG modifizierten 17mer-L-DNA durchgeführt werden. Die Substitution des bifunktionalen Chelators p-SCN-Bn-NOTA 3 durch DOTA-GA-Mal 7 ermöglicht den Einsatz eines breiten Spektrums therapeutisch relevanter Radionuklide wie beispielsweise 90Y, 177Lu oder auch 67Cu. Dies konnte anhand eines ersten Pretargeting-Experimentes mit NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG [177Lu]Lu8d bestätigt werden. Zusammenfassend muss aber festgestellt werden, dass Cetuximab als Antikörper für das Pretargeting aufgrund seiner Internalisierungscharakteristik nicht geeignet ist. Es zeigte sich zwar, dass nach 24 h mittels Pretargeting eine verringerte Leberakkumulation im Vergleich zum direkt markierten Cetuximab-Derivat [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 erzielt werden kann, allerdings fällt die Tumorakkumulation ebenfalls um ca. 40 – 70% niedriger aus und demnach wird eine deutlich geringere Dosis im Tumor angereichert. Dies lässt den Rückschluss zu, dass in vivo eine ähnlich hohe Internalisierung auftritt wie im In-vitro-Zellversuch ermittelt. Das Pretargeting-Intervall musste demnach auf 24 h festgesetzt werden, auch wenn zum Zeitpunkt der Applikation der radioaktiv markierten Komponente der Antikörper immer noch im vaskulären System zirkulierte. Kleintier-PET-Aufnahmen lassen allerdings vermuten, dass eine Applikation der radioaktiv markierten Komponente 48 h nach der Antikörper-Gabe bessere Verteilungsverhältnisse ergeben hätte. Der eigentliche Vorteil des Pretargetings, innerhalb weniger Stunden eine ähnlich hohe Tumorakkumulation zu erzielen, wie sie direkt markierte Antikörper erst nach mehreren Tagen aufweisen, konnte mit Cetuximab nicht verwirklicht werden.

Zur Behandlung von Tumorerkrankungen sind radioaktiv markierte Antikörper als hochaffine und selektive Radioimmuntherapeutika von zunehmender Bedeutung. Allerdings ist der Einsatz solcher radioaktiv markierter Antikörper bei der Behandlung strahlenresistenter solider Tumore limitiert, weil infolge ihrer hohen Blutverweildauer und nur langsamen Anreicherung im Zielgewebe, bedingt durch ihre Molekülgröße, der gesamte Organismus einer hohen Strahlenbelastung ausgesetzt wird. Eine Alternative dazu stellt die Strategie des Pretargeting von Tumoren dar. Die Intention dieses Prinzips besteht darin, mittels einer mehrstufigen Applikationsfolge die Injektion eines targetspezifischen Antikörper-Konjugates und einer kleinen radioaktiv markierten Verbindung zu trennen, welche zueinander ein komplementäres System bilden. Eine Substanzklasse die erstmals von Wissenschaftlern des Helmholtz-Zentrums Dresden-Rossendorf (HZDR) als potentielles komplementäres System für Tumor-Pretargeting-Anwendungen untersucht wurden ist, sind spiegelbildliche bzw. L konfigurierte Oligonukleotide. Aufgrund ihrer hohen metabolischen Stabilität, geringen Immunogenität und sehr geringen Spezifität zu natürlich vorkommenden potentiellen Bindungspartnern sind L-Oligonukleotide, im speziellen L-DNA-Derivate, das ideale System bzgl. der In-vivo-Hybridisierung zwischen einem tumorspezifischen Antikörper und der radioaktiv markierten Chelateinheit. Das verwendete Pretargeting-System besteht aus den Radionuklid markierbaren Komponenten NOTA-L-DNA-(0-20kDa)-PEG 6a-e sowie DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d und aus der targetspezifischen Antikörper-Einheit, deren Entwicklung eines der Aufgabengebiete der vorliegenden Arbeit darstellte. Als Antikörper wurde dabei der klinisch zugelassene chimäre monoklonale Antikörper Cetuximab (Handelsname Erbitux®, C225) verwendet, welcher mit sehr hoher Affinität an das Oberflächenprotein „Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor“ (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) bindet. Die Zielstellung dieser Arbeit beinhaltete vor allem die In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung des L-DNA basierenden Pretargeting-Systems im Hinblick darauf, ob das Internalisierungsverhalten von Cetuximab einen limitierenden Faktor für seine Anwendung in Pretargeting-Experimenten darstellt. Es konnten zwei mit der komplementären L-DNA (c-L-DNA) modifizierte Cetuximab-Derivate mit einem niedrigen (n = 1,5) und einem hohen (n = 5) Konjugationsgrad an c-L-DNA hergestellt werden. Zur radiopharmakologischen Charakterisierung wurden beide Konjugate zusätzlich mit NOTA funktionalisiert und entsprechende Verfahren zur Markierung mit dem Radiometallnuklid 64Cu erarbeitet. Die Reaktionsparameter sowohl bei der Synthese als auch bei der Radiomarkierung wurden hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und der mechanischen Beanspruchung so gewählt, dass einerseits der Affinitätsverlust in Bezug zum nativen Cetuximab möglichst gering gehalten wird und andererseits die erarbeiteten Protokolle sich perspektivisch auch auf andere Antikörper übertragen lassen. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit bestand darin, die Internalisierungsgeschwindigkeit der beiden Cetuximab-Konjugate NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 im Hinblick auf deren Eignung für In vivo-Pretargeting-Experimente zu bewerten. Dabei wurde festgestellt, dass bereits nach 24 h an A431- und FaDu-Zellen 50 - 70% des auf der Zelloberfläche gebundenen Antikörpers nicht mehr für die Bindung der radioaktiv markierten Komponente zur Verfügung stand. 72 h nach der Antikörperapplikation waren sogar 80 - 90% des extrazellulär gebundenen Antikörpers internalisiert. Besonders diese hohe Internalisierungsrate könnte im Hinblick auf In-vivo-Anwendungen problematisch sein und eine geringe Tumorakkumulation der radioaktiv markierten Komponente bewirken. Infolge der Konjugation von Cetuximab mit p-SCN-Bn-NOTA 3, GMBS 9 und 17mer-c-L-DNA 2 war eine Änderung der pharmakologischen Eigenschaften von Cetuximab nachweisbar. Insbesondere dadurch, dass die Antikörpermodifikation vorrangig an den Aminogruppen der Lysin-Einheiten erfolgte und durch das 17fach negativ geladene Phosphatrückgrat des Oligonukleotids, wurde eine starke Anionisierung der Oberflächenladung und damit eine Verringerung des isoelektrischen Punktes festgestellt. Dennoch bestätigten Kompetitionsbindungsstudien an A431- und FaDu-Gesamtzellhomogenat für alle untersuchten Antikörper-Derivate unabhängig vom Konjugationsgrad deren sehr hohe Affinität zum EGFR. Auch die an intakten Zellen berechneten KD-Werte unterstreichen dies. Einzig die Bindungskapazität weist dabei eine Abhängigkeit zum Konjugationsgrad auf, sodass trotz sehr guter Ki- und KD-Werte auf eine Verringerung der Affinität infolge der Antikörpermodifikation zu schließen ist. Interessant ist auch, dass nach einem Zeitraum > 4 h eine zweite Bindungsphase auftritt, welche möglicherweise durch eine Reexpression des EGFR aus intrazellulären Kompartimenten, infolge der Internalisierung des Rezeptor-Antikörperkomplexes, hervorgerufen wird. Außerdem wurde untersucht, inwieweit die unterschiedlichen und sterisch sehr anspruchsvollen PEG-Substituenten der 17mer-L-DNA die Hybridisierung am Antikörper sowie am Rezeptor-Antikörper-Komplex an A431- und FaDu-Zellen beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass die Hybridisierung am Immunkomplex in Abhängigkeit des PEGylierungsgrades vom nicht PEGylierten Konjugat [64Cu]Cu6a zum 20kDa-PEG-Derivat [64Cu]Cu6e sukzessive abnimmt. Hingegen scheint der PEGylierungsgrad bei der Hybridisierung am im Phosphatpuffer und im humanen Vollblut inkubierten Antikörper keinen Einfluss zu haben. Weiterhin wurde im Zellversuch gezeigt, dass am hoch modifizierten Cetuximab-Konjugat NOTA3-C225-(c L-DNA)5 in Abhängigkeit des Konjugationsgradunterschiedes zum niedrig modifizierten Derivat NOTA3-C225-(c L-DNA)1,5 ca. dreimal mehr Ligand hybridisiert. Erste In-vivo-Pretargeting-Untersuchungen bestätigten, dass NOTA-L-DNA-10kDa-PEG 6d der ideale „Kandidat“ für das Pretargeting-Konzept basierend auf L-konfigurierten Oligonukleotiden ist. Besonders die wesentlich höhere Tumorakkumulation von [68Ga]Ga6d (10kDa-PEG) im Vergleich zu den anderen untersuchten L-DNA-Konjugaten [68Ga]Ga 6a-c (0, 2, 5kDa PEG) und [68Ga]Ga6e (20kDa-PEG) ist dabei von besonderer Bedeutung. Zukünftige Pretargeting-Studien sollten demnach ausschließlich mit der 10kDa-PEG modifizierten 17mer-L-DNA durchgeführt werden. Die Substitution des bifunktionalen Chelators p-SCN-Bn-NOTA 3 durch DOTA-GA-Mal 7 ermöglicht den Einsatz eines breiten Spektrums therapeutisch relevanter Radionuklide wie beispielsweise 90Y, 177Lu oder auch 67Cu. Dies konnte anhand eines ersten Pretargeting-Experimentes mit NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG [177Lu]Lu8d bestätigt werden. Zusammenfassend muss aber festgestellt werden, dass Cetuximab als Antikörper für das Pretargeting aufgrund seiner Internalisierungscharakteristik nicht geeignet ist. Es zeigte sich zwar, dass nach 24 h mittels Pretargeting eine verringerte Leberakkumulation im Vergleich zum direkt markierten Cetuximab-Derivat [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 erzielt werden kann, allerdings fällt die Tumorakkumulation ebenfalls um ca. 40 – 70% niedriger aus und demnach wird eine deutlich geringere Dosis im Tumor angereichert. Dies lässt den Rückschluss zu, dass in vivo eine ähnlich hohe Internalisierung auftritt wie im In-vitro-Zellversuch ermittelt. Das Pretargeting-Intervall musste demnach auf 24 h festgesetzt werden, auch wenn zum Zeitpunkt der Applikation der radioaktiv markierten Komponente der Antikörper immer noch im vaskulären System zirkulierte. Kleintier-PET-Aufnahmen lassen allerdings vermuten, dass eine Applikation der radioaktiv markierten Komponente 48 h nach der Antikörper-Gabe bessere Verteilungsverhältnisse ergeben hätte. Der eigentliche Vorteil des Pretargetings, innerhalb weniger Stunden eine ähnlich hohe Tumorakkumulation zu erzielen, wie sie direkt markierte Antikörper erst nach mehreren Tagen aufweisen, konnte mit Cetuximab nicht verwirklicht werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Zielstellung 7 3 Theoretischer Teil 9 3.1 Monoklonale Antikörper 9 3.2 Endoradionuklidtherapie mit Hilfe radiomarkierter Antikörper 11 3.3 Pretargeting-Konzepte zur Anwendung in der Radioimmuntherapie 12 3.3.1 Kennzeichen des Tumor-Pretargeting 12 3.3.2 Pretargeting unter Nutzung bispezifischer monoklonaler Antikörper 13 3.3.3 Das (Strept)avidin/Biotin-System 16 3.3.4 Komplementäre Oligonukleotide 20 3.3.4.1 D-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als komplementäres System für Pretargeting-Anwendungen 20 3.3.4.2 L-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als potentielle und stabile Komponenten für das Pretargeting von Tumoren 23 3.3.4.3 Pretargeting-Konzept mit L-konfigurierten Oligonukleotiden – Bisherige Arbeiten im HZDR 24 3.4 Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) als potentielles Target für Pretargeting-Anwendungen 28 3.4.1 Die Biologie des EGFR und dessen Funktion in der Onkogenese 28 3.4.2 Der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab 30 3.4.3 Antikörper vermittelte Rezeptorinternalisierung - ein Ausschlusskriterium für das Pretargeting? 32 4 Ergebnisse und Diskussion 35 4.1 Verwendete komplementäre L-DNA-Leitstruktur, Chelatoren und Radionuklide 35 4.2 Darstellung der Radionuklid markierbaren Komponente des Pretargeting Systems 39 4.2.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 39 4.2.2 Konjugation von 17mer-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 1a-e mit NOTA-Bn-thioharnstoff-ethyl-maleinimid 5 und DOTA-GA-Mal 7 41 4.3 Darstellung der targetspezifischen Komponente – Funktionalisierung von Cetuximab mit komplementärer L-DNA 44 4.3.1 Synthesestrategie 44 4.3.2 NOTA-Funktionalisierung von Cetuximab 46 4.3.2.1 Syntheseplanung und Durchführung 46 4.3.2.2 Analytische Charakterisierung des Derivates 47 4.3.3 Maleinimid-Funktionalisierung von NOTA3-C225 51 4.3.3.1 Syntheseplanung und Durchführung 51 4.3.3.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 53 4.3.4 Konjugation von NOTA3-C225-Malk mit komplementärer 17mer-L-DNA 2 55 4.3.4.1 Syntheseplanung und Durchführung 55 4.3.4.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 56 4.4 Radiochemische Synthesen 61 4.4.1 68Ga-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 61 4.4.2 64Cu-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 63 4.4.3 64Cu-Markierung NOTA funktionalisierter Cetuximab-Derivate 65 4.4.3.1 Entwicklung einer Methode zur schonenden Radiomarkierung von Antikörpern mit 64Cu 65 4.4.3.2 Analytische Charakterisierung der 64Cu-markierten Cetuximab-Derivate mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 67 4.4.4 177Lu-Markierung von DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d 70 4.5 In-vitro-Charakterisierung und Bewertung des Pretargeting-Systems auf dessen Eignung für In-vivo-Anwendungen 72 4.5.1 Vorüberlegungen 72 4.5.2 Untersuchungen zur Oberflächenladung modifizierter Cetuximab- Derivate 74 4.5.3 Schmelzpunktbestimmung zur Bewertung der Hybridstabilität 77 4.5.3.1 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/c-L-DNA- Hybride 77 4.5.3.2 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 77 4.5.3.3 Die Schmelztemperatur der NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 78 4.5.4 Untersuchungen zur Bestimmung der Abhängigkeit von PEG-Substituenten unterschiedlicher Größe auf das Hybridisierungs- verhalten 79 4.5.4.1 Vorbetrachtung 79 4.5.4.2 Hybridisierungsuntersuchungen in Phosphatpuffer 79 4.5.4.3 Hybridisierungsuntersuchungen in humanem Vollblut 81 4.5.5 Kompetitionsbindungsstudien zur Bestimmung der Affinität von konjugierten Cetuximab-Derivaten 82 4.5.5.1 Vorbetrachtung 82 4.5.5.2 Kompetitionsbindungsstudien an A431-Zellhomogenaten 83 4.5.5.3 Kompetitionsbindungsstudien an FaDu-Zellhomogenaten 84 4.5.5.4 Schlussfolgerungen 85 4.5.6 Sättigungsbindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 87 4.5.6.1 Vorbetrachtung 87 4.5.6.2 Sättigungsbindungsstudien an A431-Zellen 88 4.5.6.3 Sättigungsbindungsstudien an FaDu-Zellen 91 4.5.6.4 Schlussfolgerungen 95 4.5.7 Pretargeting-Bindungsstudien von NOTA3-C225-(c-L-DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 mit [64Cu]Cu6a-e an A431- und FaDu-Zellen 98 4.5.7.1 Vorbetrachtung 98 4.5.7.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 99 4.5.7.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 101 4.5.7.4 Schlussfolgerungen 103 4.5.8 Internalisierungs-Bindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 103 4.5.8.1 Entwicklung eines geeigneten Internalisierungsassays basierend auf dem Pretargeting-Konzept 103 4.5.8.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 106 4.5.8.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 113 4.5.8.4 Schlussfolgerungen 119 4.6 In-vivo-Pretargeting-Studien 121 4.6.1 Untersuchung der In-vivo-Stabilität und Bluteliminierung von [64Cu]Cu-NOTA-L-DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) 121 4.6.2 Kleintier-PET-Untersuchung von [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 zur Ermittlung der Pretargeting-Wartezeit 123 4.6.3 Pretargeting-Kleintier-PET-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [68Ga]Ga-NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG ([68Ga]Ga6a-e) in Mäusen 125 4.6.4 Pretargeting-Studien von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [64Cu]Cu-NOTA-L DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) in Mäusen 129 4.6.4.1 Kleintier-PET-Untersuchungen an FaDu tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 129 4.6.4.2 Bioverteilung nach Pretargeting-Experimenten an A431 tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 132 4.6.5 Pretargeting-SPECT-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG ([177Lu]Lu8d) 134 4.7 Abschließende Bewertung von Cetuximab auf dessen Eignung als Antikörper für das Tumor-Pretargeting 135 5 Zusammenfassung und Ausblick 137 6 Experimenteller Teil 141 6.1 Material 141 6.1.1 Chemikalien 141 6.1.2 Puffergemische und Lösungen 143 6.1.3 Synthetische L-Oligonukleotide 146 6.1.4 Radionuklide 146 6.1.5 Zellkulturen 146 6.1.5.1 A431-Zelllinie 146 6.1.5.2 FaDu-Zelllinie 147 6.1.6 Tiermodelle 147 6.1.7 Geräte 148 6.2 Analytische Methoden 149 6.2.1 NMR-Spektroskopie 149 6.2.2 Massenspektrometrie 149 6.2.2.1 ESI-MS 149 6.2.2.2 Maldi-TOF 150 6.2.3 UV/Vis-Spektroskopie 150 6.2.4 Chromatographie 151 6.2.4.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 151 6.2.4.2 Hochleistungsflüssigchromatographie 151 6.3 Synthesevorschriften und analytische Daten 153 6.3.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 153 6.3.2 Synthese der NOTA und DOTA funktionalisierten 17mer-L-DNA- Verbindungen 154 6.3.3 Synthese konjugierter Cetuximab-Derivate 157 6.3.4 Radiochemische Synthesen 161 6.3.4.1 68Ga-Radiomarkierungen 161 6.3.4.2 64Cu-Radiomarkierungen 163 6.3.4.3 177Lu-Radiomarkierungen 167 6.4 Biologisch-chemische Methoden 168 6.4.1 Schmelzpunkt-Bestimmung Fehler! Textmarke nicht definiert. 6.4.2 Gelelektrophorese 168 6.4.2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 168 6.4.2.2 Agarosegelelektrophorese 169 6.4.2.3 Isoelektrische Fokussierung (IEF) 170 6.4.3 Zellkultur 170 6.4.3.1 Auftauen und Anzüchten von kryokonservierten Zellen 170 6.4.3.2 Kryokonservierung von Zelllinien 170 6.4.3.3 Subkultivierung 171 6.4.3.4 Zellzahlbestimmung 171 6.4.3.5 Herstellung von Zellhomogenat 172 6.4.4 Hybridisierungs- und Bindungsassays 172 6.4.4.1 In-vitro-Hybridisierungsuntersuchungen 172 6.4.4.2 Kompetitionsassay an Zellhomogenat 173 6.4.4.3 Sättigungsbindungsstudien an intakten Zellen 174 6.4.4.4 Pretargeting-Bindungsstudien 175 6.4.4.5 Internalisierungs-Bindungsstudien 176 6.4.4.6 Bicinchoninsäure-Assay (BCA) zur Proteinbestimmung 177 6.4.4.7 Gammacounter 177 6.4.5 Metabolitenanalytik 178 6.4.6 Bioverteilungsuntersuchungen 178 6.4.7 Positronen-Emissions-Tomographie (PET) 179 6.4.8 Single-Photonen-Emissions-Tomographie (SPECT) 179 7 Anhang 180 7.1 Originaldaten 180 7.1.1 Schmelzkurven 180 7.1.2 Gelelektrophorese und Autoradiographie 181 7.1.3 Bioverteilungsdaten 186 7.2 Übersicht der Substanzen 188 7.3 Abkürzungsverzeichnis 191 7.4 Literaturverzeichnis 194 7.5 Pubblikationen, Poster und Vorträge 209 7.6 Danksagung 212

[ES] El espectro de la luz solar está compuesto por una amplia gama de radiaciones electromagnéticas las cuales tienen diferentes impactos sobre la vida en la tierra. Entre ellas, las pertenecientes a la región ultravioleta toman un papel principal cuando nos referimos a la fotobiología, ya que pueden interactuar con las biomoléculas por medio de procesos tanto directos como fotosensibilizados. Como resultado, estas biomoléculas pueden sufrir modificaciones que no siempre tienen efectos beneficiosos. En este contexto, los daños fotoinducidos al ADN son de gran relevancia ya que están estrechamente relacionados con la creciente incidencia de cáncer de piel. Por ello, es necesario investigar tanto los mecanismos involucrados en dichos procesos como el desarrollo de nuevas estrategias para combatirlos. En la presente tesis se da respuesta a estas necesidades mediante el desarrollo y empleo de grupos protectores fotolábiles (PPG). En una primera parte se avanza en el desarrollo de nuevos PPG basados en filtros solares. Estos ofrecen la ventaja de actuar, una vez liberados, como un escudo protector frente a la radiación ultravioleta. En este contexto, en el Capítulo 3 se profundiza en las propiedades fotofísicas y fotoquímicas de los sistemas formados por la avobenzona como PPG de ácidos carboxílicos, más concretamente del ketoprofeno (KP) y del naproxeno (NPX). En este estudio se analiza por medio de modelado molecular y técnicas espectroscópicas la influencia que tiene la energía relativa del triplete de la avobenzona en su forma dicetónica, 3AB(K)*, respecto a la de los compuestos protegidos en el proceso de liberación. Siguiendo en esta misma línea de trabajo, en el Capítulo 4 se ha desarrollado un nuevo PPG capaz de liberar el filtro solar oxibenzona (OB) junto con compuestos carbonílicos. En una segunda parte, el foco de atención se ha puesto en el concepto de "Caballo de Troya", el cual establece que ciertas lesiones del ADN pueden actuar a su vez como fotosensibilizadores endógenos generando así nuevas lesiones en su entorno. En este contexto, en el Capítulo 5 se han estudiado, mediante métodos tanto experimentales como teóricos, las propiedades fotosensibilizantes de dos de los daños oxidativos del ADN, el 5-formiluracilo (ForU) y la 5-formilcitosina (ForC), poniendo especial énfasis en la capacidad de estos para poblar sus estados tripletes, así como de inducir la formación fotosensibilizada de dímeros ciclobutánicos de pirimidina (CPD). Por último, en el Capítulo 6 se ha desarrollado una nueva alternativa sintética para la incorporación del ForU en oligonucleótidos. Debido a la inestabilidad del grupo aldehído, esta síntesis se lleva a cabo generalmente mediante la incorporación de un precursor el cual es posteriormente convertido en el ForU mediante la acción de un agente oxidante. Por el contrario, en la nueva alternativa planteada el aldehído es protegido con un PPG, de manera que una vez insertado en el ODN, el aldehído es liberado de forma selectiva mediante el empleo de luz. Este trabajo supone un avance en el estudio de las propiedades fotosensibilizantes del ForU ofreciendo una nueva herramienta para la evaluación de las mismas en un entorno más cercano al del ADN. / [CA] L'espectre de la llum solar està compost per una àmplia gamma de radiacions electromagnètiques les quals tenen diferents impactes sobre la vida en la terra. Entre elles, les pertanyents a la regió ultraviolada prenen un paper principal quan ens referim a la fotobiologia, ja que poden interactuar amb les biomolècules per mitjà de processos tant directes com fotosensibilitzats. Com a resultat, aquestes biomolècules poden patir modificacions que no sempre tenen efectes beneficiosos. En este context, els danys fotoinduits a l'ADN són de gran rellevància ja que estan estretament relacionats amb la creixent incidència de càncer de pell. Per això, és necessari tant d'investigar els mecanismes involucrats en els processos com el desenvolupament de noves estratègies per a combatre'ls. En la present tesi es dóna resposta a aquestes necessitats per mitjà del desenvolupament i ús de grups protectors fotolàbils (PPG). En una primera part s'avança en el desenvolupament de nous PPG basats en filtres solars. Estos ofereixen l'avantatge d'actuar, una vegada alliberats, com un escut protector enfront de la radiació ultraviolada. En este context, en el capítol 3 s'aprofundeix en les propietats fotofísiques i fotoquímiques dels sistemes formats per l'avobenzona com PPG d'àcids carboxílics, més concretament del ketoprofé (KP) i del naproxé (NPX). En este estudi s'analitza per mitjà de modelatge molecular i tècniques espectroscòpiques la influència que té en el procés d'alliberament l'energia relativa del triplet de l'avobenzona en la seua forma dicetònica, 3AB(K)*, respecte a la dels compostos protegits. En esta mateixa línia de treball, en el capítol 4 s'ha desenvolupat un nou PPG capaç d'alliberar el filtre solar oxibenzona (OB) junt amb compostos carbonílics. En una segona part, el focus d'atenció s'ha posat en el concepte de "Cavall de Troia", el qual estableix que certes lesions de l'ADN poden actuar al seu torn com fotosensibilitzadors endògens generant així noves lesions en el seu entorn. En este context, en el capítol 5 s'han estudiat, per mitjà de mètodes tant experimentals com teòrics, les propietats fotosensibilitzants de dos dels danys oxidatius de l'ADN, el 5-formiluracil (ForU) i la 5-formilcitosina (ForC), posant especial èmfasi tant en la capacitat d'estos per a poblar els seus estats triplet, com d'induir la formació fotosensibilitzada de dímers ciclobutànics de pirimidina (CPD). Finalment, en el capítol 6 s'ha desenvolupat una nova alternativa sintètica per a la incorporació del ForU en oligonucleòtids. A causa de la inestabilitat del grup aldehid, esta síntesi es duu a terme generalment per mitjà de la incorporació d'un precursor el qual és posteriorment convertit en el ForU per mitjà de l'acció d'un agent oxidant. Al contrari, en la nova alternativa plantejada l'aldehid és protegit amb un PPG, de manera que una vegada inserit en l'oligonucleòtid, l'aldehid és alliberat de forma selectiva per mitjà de l'ús de llum. Este treball suposa un avanç en l'estudi de les propietats fotosensibilitzants del ForU i ofereix una nova ferramenta per a l'avaluació de les mateixes en un entorn més pròxim al de l'ADN. / [EN] The solar spectrum is composed of a wide range of electromagnetic radiations which have different impacts on life on earth. Among them, those belonging to the ultraviolet region are of utmost importance when we refer to photobiology, since they can interact with biomolecules through both direct and photosensitized processes. As a result, these biomolecules can undergo modifications that do not always have beneficial effects. In this context, photoinduced DNA damage is of great relevance as it is closely related to the increasing incidence of skin cancer. Therefore, it is necessary both to investigate the mechanisms involved in these processes and to develop new strategies to avoid them. In this Thesis these issues have been addressed through the development and use of photolabile protecting groups (PPG). The first part of this Thesis involves the development of new PPG based on solar filters. Once released, these PPG offer the advantage of acting as ultraviolet shields. In this context, Chapter 3 looks into the photophysical and photochemical properties of those systems formed by avobenzone as PPG of carboxylic acids, more specifically ketoprofen (KP) and naproxen (NPX). In this study, the influence on the photorelease process of the relative energetic location of the avobenzone triplet manifold in its diketo form, 3AB(K)*, with respect to that of its caged compound, is duly analyzed by means of molecular modeling and spectroscopic techniques. Following this same line of work, a new PPG capable of releasing oxybenzone (OB) solar filter along with carbonyl compounds has been developed in Chapter 4. The second part of this Thesis focuses on the "Trojan Horse" concept, which establishes that certain DNA lesions can act as endogenous photosensitizers, thus generating new lesions in their neighborhood. In this context, in Chapter 5 the photosensitizing properties of two oxidatively generated DNA damages, namely 5-formyluracil (ForU) and 5-formylcytosine (ForC), have been studied by means of experimental and theoretical approaches. Here, special emphasis has been placed on unraveling their capacity to photoinduce the formation of cyclobutane pyrimidine dimers (CPD). Finally, in Chapter 6 a new synthetic alternative for the incorporation of ForU into oligodeoxynucleotides (ODN) has been developed. Due to the instability of the aldehyde group, this synthesis is generally carried out by incorporating a precursor which is subsequently converted into ForU by the action of an oxidative agent. On the contrary, in the new approach, the aldehyde is protected with a PPG, so that once inserted into the ODN, the aldehyde is selectively released through the use of light. This work entails a step forward in the study of the photosensitizing properties of ForU, offering a new tool for their evaluation within the DNA environment. / Lineros Rosa, M. (2021). Photoremovable protecting groups for carbonyl compounds of biological interest [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167764 / TESIS

[ES] La presente tesis doctoral titulada "New nanostructured suports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest" se centra en el diseño y preparación de nuevos materiales híbridos orgánicos-inorgánicos constituidos por puertas moleculares soportadas sobre alúmina mesoporosa con el objetivo de desarrollar nuevos sistemas sensores con aplicaciones potenciales en el campo de la diagnosis y del control alimentario. En el primer capítulo de la tesis se introducen los conceptos en los que están basados los estudios realizados y los materiales preparados. A continuación, en el segundo capítulo se describen los objetivos generales de la tesis que serán abordados en los siguientes apartados. En el tercer capítulo se presenta el diseño y optimización de un nanodispositivo para la detección de la bacteria Mycoplasma fermentans. En primer lugar, los poros de una placa de alúmina mesoporosa se cargan con un indicador fluorescente (rodamina B). Seguidamente, la superficie es funcionalizada con una secuencia de ADN complementaria a una región altamente conservada de la subunidad ribosomal 16S de la bacteria Mycoplasma fermentans. El impedimento estérico generado por las secuencias de ADN ancladas al exterior de los poros impide la salida del indicador encapsulado. Únicamente en presencia de DNA de la bacteria Mycoplasma fermentans, se produce la apertura de los poros permitiéndose la difusión de la carga (rodamina B) que es posteriormente medida mediante espectroscopía de fluorescencia. En el capítulo cuatro se diseña de un nanodispositivo capaz de detectar de forma rápida, sensible y selectiva la bacteria Staphylococcus aureus. Para la preparación del material sensor, un soporte de alúmina mesoporosa es, en primer lugar, cargado con el indicador fluorescente rodamina B. A continuación, los poros del soporte son tapados mediante el anclaje de un aptámero que reconoce de forma específica la bacteria. Solamente en presencia de Staphylococcus aureus se produce la liberación del indicador encapsulado, que es posteriormente medido mediante espectroscopía de fluorescencia. Además, la respuesta obtenida es específica para Staphylococcus aureus. Este sistema ha sido ensayado en muestras reales. En el sexto capítulo, diseña un nanodispositivo híbrido orgánico-inorgánico consistente en un material de alúmina mesoporosa cubierto con una secuencia de ADN específica para la detección de ADN del hongo Pneumocystis jirovecii. En este caso, el soporte de alúmina cargado con rodamina B se recubre con una secuencia de ADN específica para el reconocimiento de este hongo. En presencia del organismo, la horquilla hibrida con el ADN del hongo, lo que resulta en una conformación triplex con elevada afinidad y estabilidad que induce, al mismo tiempo, el desplazamiento de este complejo de la superficie. Como consecuencia de este reconocimiento la carga se libera y es cuantificada mediante espectroscopía de fluorescencia. El sistema ha sido satisfactoriamente validado. En el séptimo capítulo, se diseña un sistema sensor con la capacidad de detectar gluten de forma rápida y sencilla en extractos de alimentos procesados y no procesados. Para ello, un soporte de alúmina mesoporosa se carga con rodamina B y los poros se recubren con un aptámero específicamente diseñado para la detección de la proteína gliadina, que constituye el 50 % del total del clúster de elementos que forman el gluten. La elevada afinidad y especificidad entre el aptámero y la proteína en cuestión hacen que en presencia de ésta se produzca un desplazamiento de la puerta molecular que permite la difusión del colorante encapsulado que es finalmente monitorizado mediante espectroscopía de fluorescencia. Finalmente, en el capítulo octavo se discuten de forma conjunta los resultados obtenidos en los capítulos anteriores y la potencial aplicación de los sistemas desarrollados en el actual sistem / [CA] La present tesi doctoral, titulada "New nanostructured supports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest", es centra en el disseny i preparació de nous materials híbrids orgànics-inorgànics constituïts per portes moleculars suportades sobre alúmina mesoporosa amb l'objectiu de desenvolupar nous sistemes sensors amb potencials aplicacions en el camp de la diagnosi i del control alimentari. En el primer capítol de la tesi s'introdueixen els conceptes en què estan basats els estudis realitzats i els materials preparats. A continuació, en el segon capítol es descriuen els objectius generals de la tesi que seran abordats en els següents apartats. En el tercer capítol es presenta el disseny i optimització d'un nanodispositiu per a la detecció de la bactèria Mycoplasma fermentans. Primerament, els porus d'una placa d'alúmina mesoporosa són carregats amb un indicador fluorescent (rodamina B). Seguidament, la superfície és funcionalitzada amb una seqüència d'ADN complementaria a una regió altament conservada de la subunitat ribosomal 16S de la bactèria Mycoplasma fermentans. L'impediment estèric generat per les seqüències d'ADN ancorades a l'exterior dels porus impedeix l'alliberament de l'indicador encapsulat. Únicament en presencia d'ADN de la bactèria Mycoplasma fermentans, es produeix l'obertura dels porus permetent la difusió de la càrrega (rodamina B) que és posteriorment mesurada mitjançant fluorescència. En el capítol quatre es dissenya un nanodispositiu capaç de detectar de forma ràpida, sensible i selectiva la bactèria Staphylococcus aureus. Per a la preparació del material sensor, el suport d'alúmina mesoporosa és, primerament, carregat amb l'indicador fluorescent rodamina B. A continuació, els porus del suport són tapats mitjançant l'ancoratge d'un aptàmer que reconeix de forma específica a la bactèria. Solament en presència de Staphylococcus aureus es produeix l'alliberament de l'indicador encapsulat, que és posteriorment mesurat mitjançant espectroscòpia de fluorescència. A més a més, la resposta obtinguda és específica per Staphylococcus aureus. Aquest sistema ha sigut validat amb mostres reals de pacients. En el sisè capítol, es dissenya un nanodispositiu híbrid orgànic-inorgànic consistent en un material d'alúmina mesoporosa cobert amb una seqüència d'ADN específica per a la detecció de l'ADN del fong Pneumocystis jirovecii. En aquest cas, el suport d'alúmina carregat amb l'indicador fluorescent rodamina B és recobert amb una seqüència d'ADN específica per al reconeixement d'aquest fong. En presència de l'organisme, la forquilla hibrida amb l'ADN del fong, resultant en una conformació triplex amb elevada afinitat i estabilitat, que indueix, al mateix temps, el desplaçament d'aquest complex de la superfície. Com a conseqüència d'aquest reconeixement la càrrega és alliberada i quantificada mitjançant espectroscòpia de fluorescència. El sistema ha sigut validat com a mètode diagnòstic mitjançant l'anàlisi de mostres reals de pacients. En el seté capítol, es dissenya un sistema sensor amb la capacitat de detectar gluten de forma ràpida i senzilla en extractes d'aliments processats i no processats. Per a això, un suport d'alúmina mesoporosa es carrega amb indicador fluorescent rodamina B i posteriorment és recobert amb un aptàmer específicament dissenyat per a la detecció de la proteïna gliadina, que constitueix el 50 % del total del clúster d'elements que formen el gluten. L'elevada afinitat i especificitat entre l'aptàmer i la proteïna en qüestió fa que en presència d'aquesta es produesca un desplaçament de la porta molecular que permet la difusió de la càrrega encapsulada i que serà finalment monitoritzada mitjançant espectroscòpia de fluorescència. Finalment, en el capítol vuité es discuteixen de manera conjunta els result / [EN] The PhD thesis hereby presented and entitled "New nanostructured supports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest", focuses in the design and preparation of new hybrid organic-inorganic materials constituted by molecular gates supported over mesoporous alumina with the aim of developing new sensor probes of potential applications in the fields of diagnosis and food control. In the first chapter, the concepts in which studies and prepared materials are based, are introduced. Next, the second chapter describes the general objectives of this thesis, which will be approached in the following sections. In the third chapter, it is presented in detail the design and optimization process of a nanodevice applied for the detection of Mycoplasma fermentans bacterium. First of all, mesoporous alumina porous films are charged with a fluorescent indicator (rhodamine B). Then, the surface is functionalized with a DNA sequence complementary to a highly conserved region of the 16S ribosomal subunit of the bacterium Mycoplasma fermentans. Steric hindrance generated by DNA sequences on the surface inhibits the release of the encapsulated indicator. Only in the presence of bacterium Mycoplasma fermentans DNA, molecular gates open, allowing payload diffusion to the solution, which is measured by fluorescence spectroscopy. In chapter four, it is carried out the design and optimization of a nanodevice able to detect Staphylococcus aureus bacterium in a fast, sensitive and selective way. For the sensor preparation, alumina mesoporous support is, first, loaded with the rhodamine B fluorescent dye. Then, the mesoporous are blocked through the attachment of an aptamer that recognises specifically this bacterium. Exclusively in the presence of Staphylococcus aureus it is accomplished the release of the encapsulated dye, which is later monitored by fluorescence spectroscopy. The response obtained is specific for Staphylococcus aureus. This system has been validated in real samples. In the sixth chapter, it is detailed the design and optimization process of a hybrid organic-inorganic nanodevice based on a capped mesoporous alumina material for the detection of Pneumocystis jirovecii fungus DNA. In this case, the mesoporous alumina support is loaded with a fluorescent dye and decorated with a specific oligonucleotide sequence designed for the recognition of Pneumocystis fungus. In the presence of the target organism, the fork-like oligonucleotide hybridises with the DNA of the fungus, which results in the adoption of a triplex conformation with high affinity and stability that induces, at the same time, the displacement of this complex from the surface. Consequently, the payload diffused to the solution is quantified through fluorescence spectroscopy. The system has been successfully validated. In the seventh chapter, it was developed a sensor system for gluten detection, in a quick and easy way, in processed and non-processed food extracts. For this, a mesoporous alumina support is loaded with the fluorescent dye rhodamine B, and later was functionalized with an aptamer specifically designed for the detection of gliadin, a protein that constitutes 50 % of average cluster elements that forms gluten. The protein-aptamer high affinity and specificity induce the displacement of the capping aptamer and cargo delivery, which is monitored through fluorescence spectroscopy. Finally, in the eighth chapter, the results obtained in the previous chapters and the potential application of the systems developed as health and food control system are discussed. / We thank the Spanish Government projects MAT2015-64139-C4-1-R, AGL2015-70235-C2-2-R, and TEC2015-71324-R (MINECO/FEDER, UE), the Generalitat Valenciana (project PROMETEOII/2014/047), the Catalan authority (project AGAUR 2014SGR1344), and ICREA under the 2014 ICREA Academia Award for support. This study was supported by the Spanish Government projects RTI2018-100910-B-C41 and SAF2017-82251-R (MCUI/AEI/FEDER, UE), the Generalitat Valenciana (project PROMETEO/2018/024), the Universitat Politècnica de València−Instituto de Investigación Sanitaria La Fe (B02-MIRSA project), CIBER-BBN (NANOPATH and valorization project CANDI-EYE) and co-financed by the EU through the Valencian Community ERDF PO 2014-2020. This research was funded by the Spanish Government, projects RTI2018-100910-B-C41 (MCUI/AEI/FEDER, UE) and CTQ2017-84415-R / Pla Blasco, L. (2021). New nanostructured supports with signal amplification features for the detection of molecules and biomolecules of interest [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/166500 / TESIS

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No / BMP signaling has a crucial role in skin development and homeostasis, whereas molecular mechanisms underlying its involvement in regulating gene expression programs in keratinocytes and fibroblasts remain largely unknown. We show here that several BMP ligands, all BMP receptors, and BMP-associated Smad1/5/8 are expressed in human primary epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. Treatment of both cell types by BMP-4 resulted in the activation of the BMP-Smad, but not BMP-MAPK pathways. Global microarray analysis revealed that BMP-4 treatment induces distinct and cell type-specific changes in gene expression programs in keratinocytes and fibroblasts, which are far more complex than the effects of BMPs on cell proliferation/differentiation described earlier. Furthermore, our data suggest that the potential modulation of cell adhesion, extracellular matrix remodeling, motility, metabolism, signaling, and transcription by BMP-4 in keratinocytes and fibroblasts is likely to be achieved by the distinct and cell-type-specific sets of molecules. Thus, these data provide an important basis for delineating mechanisms that underlie the distinct effects of the BMP pathway on different cell populations in the skin, and will be helpful in further establishing molecular signaling networks regulating skin homeostasis in health and disease.