As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas constantemente pelo metabolismo aeróbico. Em situações de estresse biótico ou abiótico, a produção é aumentada e a toxicidade das ERO pode conduzir a diversos danos celulares. As ERO atuam também como moléculas sinalizadoras regulando a expressão de genes de defesa a estresses, senescência, morte programada da célula, crescimento e desenvolvimento da planta, entre outros processos. Uma vez que as ERO são tóxicas e também participam de eventos de sinalização, as células vegetais requerem mecanismos que regulem finamente a concentração intracelular dessas moléculas. A ascorbato peroxidase (APx) é uma enzima fundamental do metabolismo antioxidante, catalisando a decomposição do peróxido de hidrogênio. Em arroz, a família APx é codificada por oito genes, cujas isoformas são caracterizadas por sua localização subcelular: citosólica, peroxissomal, mitocondrial ou cloroplastidial. Este trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente as ascorbato peroxidases citosólicas (APx1 e APx2) e peroxissomais (APx3 e APx4) de arroz, estudando o papel destas isoformas nos mecanismos de defesa das plantas. A estratégia utilizada foi a obtenção e caracterização de plantas silenciadas para diferentes genes por RNA de interferência (RNAi). O padrão de expressão global da planta silenciada para os genes de APx citosólicas, em comparação com a planta não-transformada, foi avaliado através de análises de microarranjo e proteômica. A análise das plantas silenciadas APx1/2s revelou a existência de um mecanismo de compensação, com alteração de parâmetros fotossintéticos, ativação de outras enzimas antioxidantes e aclimatação, possivelmente sinalizados pelos níveis mais elevados de peróxido de hidrogênio. As plantas silenciadas para os genes de APx peroxissomais apresentaram atraso no desenvolvimento da panícula e maior susceptibilidade à senescência. Os genes OsAPx3 e OsAPx4 são mais expressos em folhas. A isoforma APx4 apresentou expressão em folhas, raízes e panícula de arroz, principalmente nas regiões do sistema vascular. Estas análises mostram que as isoformas de APx de arroz possuem funções diferentes, relacionadas com o compartimento celular em que estão localizadas. As enzimas APx fazem parte do complexo sistema antioxidante vegetal e estes resultados visam contribuir para um melhor entendimento do papel de APx no metabolismo celular e na defesa da planta. / The reactive oxygen species (ROS) are produced constantly by aerobic metabolism. In abiotic and biotic stress, the production is increased and ROS toxicity can cause several cellular damages. ROS also act as signaling molecules in the regulation of defense gene expression, senescence, programmed cell death, plant growth and development and other processes. Since ROS are toxic and also participate of signaling events, plant cells require mechanisms that tightly regulate the intracellular concentration of these molecules. Ascorbate peroxidase (APx) is an antioxidant metabolism enzyme, which catalyzes the hydrogen peroxide scavenging. In rice, the APx family is formed by eight genes, which isoforms are characterized by their subcellular localization: cytosol, peroxisome, mitochondria and chloroplast. This work aimed to characterize at functional level the cytosolic (OsAPx1 and OsAPx2) and the peroxisomal (OsAPx3 and OsAPx4) ascorbate peroxidase encoding genes in rice, studying the role of their products in plant defense mechanisms. The general strategy used was to produce and to characterize plants silenced for different APx genes by RNA interference (RNAi). The global expression pattern of silenced plants for cytosolic APx, compared with the non-transformed plant, was analyzed by microarray and proteomics experiments. These revealed the existence of a compensatory mechanism, which include alterations in photosynthetic parameters, activation of other antioxidant enzymes and acclimation, possibly induced by higher levels of hydrogen peroxide. Plants silenced for peroxisomal APx genes showed a delay in panicle development and were more susceptible to senescence. The expression analyses revealed that OsAPx3 and OsAPx4 genes present higher expression in leaves. The APx4 isoform is expressed in leaves, roots and panicles of rice, mainly in the vascular system. These analyses showed that rice APx isoforms may play different functions related to the cellular compartment in which they are located. APx enzymes are part of the complex plant antioxidant system and these results may contribute to a better understanding of the APx role in the cellular metabolism and plant defense.

O arroz (Oryza sativa L.) é um dos alimentos mais importantes para a nutrição humana, sendo a base alimentar de mais de três bilhões de pessoas no mundo. O Brasil está entre os principais produtores mundiais de arroz e o estado do Rio Grande do Sul é o maior produtor brasileiro. O nitrogênio é considerado um nutriente limitante para a produção de arroz, o que provoca o intenso uso de fertilizantes químicos nessa cultura, uma prática altamente prejudicial ao meio ambiente. Neste contexto, têm-se procurado novas tecnologias que visam o aumento de produtividade, a melhoria da qualidade e a rentabilidade no cultivo dessa gramínea. Uma das alternativas para o aumento da produção é a utilização de bactérias promotoras do crescimento vegetal. Bactérias promotoras do crescimento vegetal (Plant growth-promoting bacteria, PGPB) são bactérias que podem promover o crescimento de plantas e induzir a tolerância para diferentes estresses, através de uma grande variedade de mecanismos. Os objetivos deste estudo foram isolar e caracterizar putativas PGPBs associadas ao solo rizosférico e raízes de arroz, cultivado em diferentes regiões produtoras do sul do Brasil, bem como de cultivares de arroz que apresentam diferentes níveis de tolerância ao excesso de ferro, cultivadas em duas regiões: Camaquã (solo com excesso de ferro) e Cachoeirinha (controle para o excesso de ferro). Os isolados bacterianos foram avaliados para a produção de compostos indólicos, sideróforos, ACC deaminase e solubilização de fosfato. A fixação biológica do nitrogênio in vitro foi avaliada para os isolados bacterianos usados em experimentos de inoculação em câmara de crescimento e a campo em Cachoeira do Sul e/ou Camaquã. Seiscentos e sessenta e cinco estirpes bacterianas foram seletivamente isoladas com base no seu desenvolvimento em meio seletivo e foram identificadas por análise parcial do gene 16S rRNA e metodologia de sequenciamento. Estirpes pertencentes aos gêneros Enterobacter e Burkholderia foram as mais abundantes entre os isolados Gram negativos, enquanto que aquelas pertencentes aos gêneros Paenibacillus e Bacillus foram as mais abundantes entre os isolados Gram positivos. Um grande número de PGPBs de diferentes gêneros bacterianos apresentou diferentes características promotoras de crescimento vegetal. Produtores de compostos indólicos foram os mais abundantes entre os isolados. Plantas de arroz inoculadas com os isolados Herbaspirillum sp. (AC32), Burkholderia sp. (AG15), Pseudacidovorax sp. (CA21) e Azospirillum sp. (UR51) em conjunto com a metade da dose de fertilizante nitrogenado (60 kg de ureia ha-1) atingiram resultados semelhantes àquelas tratadas com a dose total de fertilizante, sem inoculação (120 kg de ureia ha-1). Estirpes pertencentes aos gêneros Burkholderia, Chryseobacterium, e Paenibacillus apresentaram potencial para promover o crescimento da planta e a captação de nutrientes, em diferentes condições de ferro. Neste trabalho, a inoculação de arroz através da utilização de estirpes bacterianas confirmou o potencial dessas bactérias em interagir positivamente com o arroz. / Rice (Oryza sativa L.) is one of the most important crops for human nutrition been the food base for more than three billion of people in the world. Brazil is one of the top rice producers and Rio Grande do Sul state is the biggest producer in Brazil. Nitrogen is the most frequent limiting nutrient for rice production and the chemical fertilization usage is among agricultural practices that are most prejudicial to environment. New technologies are being search to increase productivity, to improve quality and profitability in the cultivation of this grass. One of the alternatives for the increase in rice production is the use of plant-growth-promoting bacteria. Plant growthpromoting bacteria (PGPB) are bacteria that can enhance plant growth and induce tolerance in plants under different stresses using a wide variety of mechanisms. The objectives of this study were to isolate and characterize putative PGPBs associated with rhizospheric soil and roots of rice plants cropped in different areas of southern Brazil, as well of rice cultivars that present distinct tolerance to iron toxicity grown in two areas: one with a well-established history of iron toxicity (Camaquã) and another without iron toxicity (Cachoeirinha). Bacterial isolates were evaluated for their ability to produce indolic compounds, siderophores, ACC deaminase, and solubilize phosphate. In vitro biological nitrogen fixation was evaluated for bacterial isolates used in the inoculation experiments in a growth chamber and under field conditions in Cachoeira do Sul and/or Camaquã. A total of 665 bacterial strains were selectively isolated based on their growth in selective media and were identified by analysis of the 16S rRNA gene and partial sequencing methodologies. Strains belonging to the Burkholderia and Enterobacter genera were the most abundant among all the Gram negative isolates whereas those belonging to Paenibacillus and Bacillus genera were the most abundant among the Gram positive isolates. A large number of PGPBs belonging to different bacterial genera presented several plant growth promotion traits. Indolic compounds producers were widely found among isolates. Plants inoculated with isolates Herbaspirillum sp. (AC32), Burkholderia sp. (AG15), Pseudacidovorax sp. (CA21), and Azospirillum sp. (UR51) together with half-fertilization level (60 kg of urea ha-1) achieved growth similar to those that received the full-fertilization level without inoculation (120 kg of urea ha-1). Strains belonging to Burkholderia, Chryseobacterium, and Paenibacillus genera presented the potential to promote the plant growth and nutrient uptake in different iron conditions. In this work, the rice inoculation through the utilization of bacterial strains confirmed the bacterial potential to positively interact with rice.

Diante das restrições socioambientais do cultivo do arroz irrigado é necessário maior incentivo no seu cultivo em sistema de terras altas, que sofre limitação da produção devido à deficiência hídrica. Para reverter tal situação é necessário adotar irrigação suplementar ou tornar a cultura mais tolerante à seca, através da identificação de características de tolerância à deficiência hídrica, talvez encontrada em genótipos tradicionais de arroz de terras altas. Assim sendo, o presente estudo teve como objetivos: 1 - avaliar a evapotranspiração potencial e calcular o coeficiente da cultura de dois genótipos de arroz de terras altas, moderno e tradicional, numa tentativa de verificar diferenças na tolerância à seca; 2 - com a mesma intensão, avaliar a relação do coeficiente da cultura dos genótipos com seus respectivos índices de área foliar; 3 - avaliar a deficiência hídrica em características morfológicas e bioquímicas dos genótipos; 4 - e avaliar a deficiência hídrica com posterior reidratação nas características produtivas. Os ensaios foram conduzidos em casa de vegetação, utilizando os genótipos: \'Batatais\', arroz tradicional, e \'BRS-Primavera\', arroz moderno. Foram realizados três experimentos. No experimento I avaliou-se a evapotranspiração potencial da cultura (ETc), o coeficiente da cultura (Kc), o índice de área foliar (IAFest) e a relação Kc x IAFest. No experimento II foram avaliadas as características morfológicas e bioquímicas dos genótipos submetidos aos tratamentos: AS - análises antes da suspensão da irrigação; CD - tratamento com deficiência hídrica após três dias de suspensão da irrigação; e SD - tratamento sem suspensão da irrigação. No experimento III avaliou-se as características produtivas dos genótipos submetidos aos tratamentos: CD - com deficiência hídrica após três dias de suspensão da irrigação, seguido de reidratação e com a irrigação mantida até o final do ciclo; e SD - tratamento sem deficiência, irrigado até o final do ciclo. O genótipo BRS-Primavera apresentou maior evapotranspiração por índice de área foliar. A deficiência hídrica não afetou a peroxidação de lipídeos em \'Batatais\', porém, aumentou em \'BRS-Primavera\', que teve maior esterilidade das espiguetas devido ao estresse hídrico, de tal forma que \'Batatais\' apresentou-se com maior tolerância à deficiência hídrica em relação ao \'BRS-Primavera\'. / Face to the sócio-environmental restrictions of irrigated rice cultivation a greater incentive is due to upland rice cultivation, which suffers productivity limitations caused by hydric defficiencies. To reverse this situation it is necessary to adopt supplementary irrigation, or better to identify characteristics of plant tolerance to hydric deficiency, which could be found in upland traditional rice genotypes. Based on this, the present study had as objectives: 1. Evaluate the potential evapotranspiration and calculate the crop coefficient of two highland rice genotypes, modern and traditional, in order to verify differences in relation to hydric resistence; 2. With the same intention, evaluate the relation between the crop coefficient and the respective foliar indices; 3. Evaluate hydric deficiency in morphologic and biochemical characteristics of the genotypes; and 4. Evaluate the effect of hydric deficiency after a later re-hydration on productivity characteristics. Essays were carried out in a greenhouse, using the genotypes: \'Batatais\', a tradicional rice variety, and \'BRS-Primavera\', a modern rice varity. Three experiments were made: I. evaluation of the crop potential evapotranspiration (ETc), of the crop coefficient (Kc), the foliar area index (IAFest) and the relation Kc x IAFest ; II evaluation of the morphologic and biochemical characteristics of the genotypes submitted to the treatments: AS - analysis before irrigation stop; CD - hydric deficieny after three days of irrigation stop; and SD - withour irrigation stop. Experimento III evaluated the productive characteristics of the genotypes submitted to: CD - with hydric defficiency after three days of irrigation stop, followed by re-hydration and with irrigation maintained up to the end of the cycle; and SD - without hydric deficiency, irrigated up to the end of the cycle. The genotype BRS-Primavera presented greater ETc and IAF. The hydric deficiency did not affect the peroxidation of lipids in \'Batatais\', increased however in \'BRS-Primavera\', that presented the greatest sterility of spikelets due to hydric stress, so that \'Batatais\' was the genotype that presented the best tolerance to hydric defficieny in relation to \'BRS-Primavera\'.

Diante das restrições socioambientais do cultivo do arroz irrigado é necessário maior incentivo no seu cultivo em sistema de terras altas, que sofre limitação da produção devido à deficiência hídrica. Para reverter tal situação é necessário adotar irrigação suplementar ou tornar a cultura mais tolerante à seca, através da identificação de características de tolerância à deficiência hídrica, talvez encontrada em genótipos tradicionais de arroz de terras altas. Assim sendo, o presente estudo teve como objetivos: 1 - avaliar a evapotranspiração potencial e calcular o coeficiente da cultura de dois genótipos de arroz de terras altas, moderno e tradicional, numa tentativa de verificar diferenças na tolerância à seca; 2 - com a mesma intensão, avaliar a relação do coeficiente da cultura dos genótipos com seus respectivos índices de área foliar; 3 - avaliar a deficiência hídrica em características morfológicas e bioquímicas dos genótipos; 4 - e avaliar a deficiência hídrica com posterior reidratação nas características produtivas. Os ensaios foram conduzidos em casa de vegetação, utilizando os genótipos: \'Batatais\', arroz tradicional, e \'BRS-Primavera\', arroz moderno. Foram realizados três experimentos. No experimento I avaliou-se a evapotranspiração potencial da cultura (ETc), o coeficiente da cultura (Kc), o índice de área foliar (IAFest) e a relação Kc x IAFest. No experimento II foram avaliadas as características morfológicas e bioquímicas dos genótipos submetidos aos tratamentos: AS - análises antes da suspensão da irrigação; CD - tratamento com deficiência hídrica após três dias de suspensão da irrigação; e SD - tratamento sem suspensão da irrigação. No experimento III avaliou-se as características produtivas dos genótipos submetidos aos tratamentos: CD - com deficiência hídrica após três dias de suspensão da irrigação, seguido de reidratação e com a irrigação mantida até o final do ciclo; e SD - tratamento sem deficiência, irrigado até o final do ciclo. O genótipo BRS-Primavera apresentou maior evapotranspiração por índice de área foliar. A deficiência hídrica não afetou a peroxidação de lipídeos em \'Batatais\', porém, aumentou em \'BRS-Primavera\', que teve maior esterilidade das espiguetas devido ao estresse hídrico, de tal forma que \'Batatais\' apresentou-se com maior tolerância à deficiência hídrica em relação ao \'BRS-Primavera\'. / Face to the sócio-environmental restrictions of irrigated rice cultivation a greater incentive is due to upland rice cultivation, which suffers productivity limitations caused by hydric defficiencies. To reverse this situation it is necessary to adopt supplementary irrigation, or better to identify characteristics of plant tolerance to hydric deficiency, which could be found in upland traditional rice genotypes. Based on this, the present study had as objectives: 1. Evaluate the potential evapotranspiration and calculate the crop coefficient of two highland rice genotypes, modern and traditional, in order to verify differences in relation to hydric resistence; 2. With the same intention, evaluate the relation between the crop coefficient and the respective foliar indices; 3. Evaluate hydric deficiency in morphologic and biochemical characteristics of the genotypes; and 4. Evaluate the effect of hydric deficiency after a later re-hydration on productivity characteristics. Essays were carried out in a greenhouse, using the genotypes: \'Batatais\', a tradicional rice variety, and \'BRS-Primavera\', a modern rice varity. Three experiments were made: I. evaluation of the crop potential evapotranspiration (ETc), of the crop coefficient (Kc), the foliar area index (IAFest) and the relation Kc x IAFest ; II evaluation of the morphologic and biochemical characteristics of the genotypes submitted to the treatments: AS - analysis before irrigation stop; CD - hydric deficieny after three days of irrigation stop; and SD - withour irrigation stop. Experimento III evaluated the productive characteristics of the genotypes submitted to: CD - with hydric defficiency after three days of irrigation stop, followed by re-hydration and with irrigation maintained up to the end of the cycle; and SD - without hydric deficiency, irrigated up to the end of the cycle. The genotype BRS-Primavera presented greater ETc and IAF. The hydric deficiency did not affect the peroxidation of lipids in \'Batatais\', increased however in \'BRS-Primavera\', that presented the greatest sterility of spikelets due to hydric stress, so that \'Batatais\' was the genotype that presented the best tolerance to hydric defficieny in relation to \'BRS-Primavera\'.

The weed red rice is a major problem in rice producing areas world wide. All of the red rice in commercial rice fields in the United States has traditionally been considered to be the same species as commercial rice, Oryza sativa. However, using DNA markers it was found that most of the red rice with black hulls was sufficiently divergent to be considered a separate species. This includes TX4, a red rice ecotype that has been reported to have considerable natural tolerance to the herbicide glufosinate. TX4 is closely related to samples that have been classified as Oryza rufipogon. However, it was shown that both the TX4-like red rice from commercial fields and most of the Oryza rufipogon accessions in the US National Small Grains Collection are more accurately classified as Oryza nivara. This is significant since Oryza rufipogon is regulated under the Federal Noxious Weed Act, while Oryza nivara is not. Oryza nivara closely related to TX4 was found to be widely distributed across the rice production areas of Texas and was also found in Arkansas, Louisiana, and Mississippi. Of 240 samples from across Texas, 23 samples from six different counties were identical with TX4 with all 18 DNA markers tested. The reported glufosinate tolerance of TX4 is a potential problem since this same herbicide would be used in conjunction with genetically modified (GM) that is being developed as a method of red rice control. Thus, field, greenhouse and tissue culture studies were conducted to evaluate the degree of glufosinate tolerance in TX4. TX4 typically was severely damaged by glufosinate, but not efficiently controlled. Even with the maximum number of herbicide applications at the proposed maximum label rate, TX4 often re-sprouted and produced viable seed. Herbicide tolerance was found to be variable, but appears to be sufficient to present a problem with the use of the GM glufosinate resistant varieties currently under development, particularly when combined with variation in the response of ??sensitive?? varieties.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:06:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_final_Daniel_Farias.pdf: 1887776 bytes, checksum: a4a075b3f8cd4f8bd1c035e70aecf8ee (MD5) Previous issue date: 2013-12-04 / Rice is the most important grain in terms of economic value in the world, this crop has a significance to developing countries, both the culture aspect, as social and economic point. Rice is considered one of the best foods, with better nutritional balancing, extremely versatile, it is adapted in different soils and climates, this specie has greatest potential to increase the food production to control the world hunger. Despite the contribution that molecular markers gave for plant breeding, the increase of genome and transcriptome sequence data, the plant breeding approaches have greatly advanced. With this fact Bioinformatic becomes an essential tool for studies with genomic data. The principal aim of this study is to generate a tool that can contribute with assembly researches, and the assembly of Oryza glumaepatula genome. The first chapter is a review of rice, both on the cultivated species such as wilds. The second chapter presents the AEROS, a tool that aim provides the evaluation and comparison of genome assemblers, providing inferences about the results of these programs. The third chapter presents de assembly of the wild rice specie Oryza glumaepatula. With this study, we development AREOS program, that simulates a reference sequence and reads from Illumina platform. The draw assembly of Oryza glumaepatula genome has 292,860 scaffolds, and 412M bases. / O arroz é um dos mais importantes grãos em termos de valor econômico no mundo, essa cultura possui grande importância para os países em desenvolvimento, tanto pelo aspecto cultura, quanto sob o ponto de vista social e econômico, pois este é considerado um dos alimentos com melhor balanceamento nutricional, extremamente versátil, que se adapta a diferentes condições de solo e clima, sendo a espécie de maior potencial de aumento de produção para o controle da fome no mundo. Apesar da contribuição dada pelos marcadores moleculares no incremento do melhoramento genético vegetal, o aumento da disponibilidade de dados referentes a regiões genômicas sequenciadas e de análises de transcriptomas, possibilitaram um grande avanço em pesquisas de melhoramento genético. Esse fato fez com que a Bioinformática se tornasse uma ferramenta essencial para o tratamento de dados genômicos. O objetivo geral desse trabalho é gerar uma ferramenta que possa contribuir para os trabalhos com montagens de genomas, e montar o genoma da espécie Oryza glumaepatula. O primeiro capítulo aborda uma revisão bibliográfica sobre o arroz, tanto sobre as espécies cultivadas como as selvagens. O segundo capítulo apresenta a ferramenta AREOS, que tem como objetivo proporcionar a avaliação e a comparação de programas de montagem de genomas, proporcionando aos pesquisadores que irão trabalhar com esses dados, inferir sobre os resultados desses programas. O terceiro e último capítulo apresenta a montagem do genoma de arroz selvagem Oryza glumaepatula. Com a realização desse trabalho, foi desenvolvido o programa AREOS que simula uma sequência de referência e leituras de sequenciamento da plataforma Solexa da Illumina. Além disso, o genoma de O. glumaepatula(GEN 1233) foi sequenciado e montado. A montagem parcial do genoma dessa espécie possui um total de 292.860 scaffolds com 412M bases.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) afetam significativamente a homeostase redox celular. No entanto, o peróxido de hidrogênio (H2O2), uma das ERO mais estudadas, é considerado regulador chave em uma série de processos fisiológicos, dependendo de sua concentração na célula: em baixas concentrações atua como molécula sinalizadora envolvida na aclimatação da planta a estresses, desencadeando tolerância a estresses bióticos e abióticos; por outro lado, em altas concentrações o H2O2 pode levar à morte celular. Gradientes de ERO e fitohormônios têm influência nas respostas de crescimento local e consecutivamente afetam o estado redox celular. Diversos fitohormônios afetam a sinalização redox celular controlando processos de crescimento e defesa. Os níveis de H2O2 intracelulares são controlados pela ação de diversas enzimas da classe das peroxidases e catalases. Dentre as peroxidases, a família de proteínas GPX pode ser encontrada em praticamente todos os reinos e vem sendo cada vez mais estudada em plantas. Em arroz, essa família é composta de cinco genes, enquanto em Arabidopsis foram identificados oito genes. Este trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente as GPX mitocondriais e cloroplastídica de arroz e sete dos oito genes de Arabidopsis thaliana. Mutantes knockout de Arabidopsis para os genes AtGPX1, AtGPX2, AtGPX3, AtGPX4, AtGPX6, AtGPX7 e AtGPX8 foram obtidos.Nesta espécie, pelo menos AtGPX2, AtGPX3 e AtGPX6 são necessárias para a correta formação da arquitetura da raiz dependente dos hormônios ABA, auxina e SL. O sileciamento por RNAi em arroz para os genes OsGPX1, OsGPX3 e OsGPX4 gerou plantas com crescimento deficiente de raiz, parte área e formação de panículas. A redução em 80% da expressão gênica da isoforma cloroplastídica (OsGPX4) foi letal para o desenvolvimento de plântulas regeneradas a partir de calos de arroz, enquanto que a redução da expressão de 40% e 95% de OsGPX1 (GPX1s) e OsGPX3 (GPX3s), respectivamente, não impediu a regeneração de plantas. No entanto, plantas GPX1s apresentaram menor tamanho, menor número de panículas e menor produção de sementes em comparação com as plantas NT (não transformadas). Adicionalmente, plantas GPX3s apresentaram redução do comprimento tanto da parte aérea quanto das raízes, além de acúmulo de H2O2 cerca de vinte vezes maior do que a planta NT. Neste trabalho, foi demonstrada a participação das enzimas GPX durante o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo de plantas de arroz e o estabelecimento da arquitetura da raiz dependente de hormônios em Arabidopsis. O conjunto de dados obtidos contribuempara o entendimento do papel dessas enzimas na homeostase redox, como também na interação com fitohormônios nos processos de desenvolvimento e defesa vegetais. / Reactive oxygen species (ROS) affect significantly cellular redox homeostasis. Hydrogen peroxide (H2O2), one of the most studied ROS, is considered a key regulator in a number of physiological processes dependent of its concentration in the cell: at low concentrations acts as a signaling molecule involved in plant acclimation to stress, triggering tolerance to biotic and abiotic stresses; on the other hand, at high concentrations can promote cell death. Gradients of ROS and phytohormones can influence the responses of local growth and consecutively can affect the cellular redox state. Several phytohormones affect redox signaling processes controlling cell growth and defense. The intracellular levels of H2O2 are controlled by the action of several enzymes like peroxidases and catalases. Among the peroxidases, the GPX family of proteins can be found in virtually all kingdoms and is being increasingly studied in plants. In rice, this family consists of five genes, while in Arabidopsis eight genes were identified. This study aimed to characterize functionally rice and Arabidopsis GPX genes. Arabidopsis thaliana nockout mutants for AtGPX1, AtGPX2, AtGPX3, AtGPX4, AtGPX6, and AtGPX7 AtGPX8 genes were obtained. In Arabidopsis, at least AtGPX2, AtGPX3 and AtGPX6 are necessary to hormone-dependent control of root achitecture formation. RNAi knockdown in rice of OsGPX1, and OsGPX3 OsGPX4 generated plants with shorter root and shoot lengths, and deficient panicle formation. An 80% gene expression reduction of the chloroplastic isoform (OsGPX4) was lethal, and impaired the regeneration of plants from rice calli, whereas the reduction of expression in 40% and 95% of OsGPX1 (GPX1s) and OsGPX3 (GPX3s), respectively, did not prevent plant regeneration. However, GPX1s plants were smaller and had fewer panicles and seed compared to NT (non-transformed) plants. Additionally, GPX3s plants showed reduced length of the shoot as roots and accumulation of H2O2 about twenty times greater than the plant NT. GPX participation during vegetative and reproductive development of rice plants and the hormone-dependent root arquitecture formation in Arabidopsis was demonstrated in this work. The data set obtained contributed to the understanding of the role of these enzymes in the redox homeostasis, as well as how the interaction with phytohormones in development processes and plant defense occurs.

Chow Hoi Yee. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2003. / Includes bibliographical references (leaves 127-153). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.iii / Acknowledgments --- p.vi / Abbreviations --- p.vii / Table of contents --- p.viii / List of Figures --- p.xi / List of Tables --- p.xiv / Chapter Chapter One --- Literature Review / Chapter 1.1 --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.2 --- The life cycle of rice --- p.3 / Chapter 1.3 --- Physiological and molecular studies on rice leaf development --- p.6 / Chapter 1.3.1 --- Physiological study of rice leaf development --- p.6 / Chapter 1.3.1.1 --- Leaf primordium formation and SAM --- p.6 / Chapter 1.3.1.2 --- Leaf expansion and water status --- p.7 / Chapter 1.3.1.3 --- Leaf senescence and phytohormone --- p.8 / Chapter 1.3.1.4 --- Rice leaf and temperature --- p.9 / Chapter 1.3.2 --- Molecular study of rice leaf development / Chapter 1.3.2.1 --- Leaf primordium formation and SAM --- p.10 / Chapter 1.3.2.2 --- Leaf elongation and related genes --- p.13 / Chapter 1.3.2.3 --- Leaf senescence and related genes --- p.13 / Chapter 1.3.2.4 --- Photoreceptor genes --- p.14 / Chapter 1.3.2.5 --- Temperature-related genes --- p.17 / Chapter 1.4 --- Prospectus --- p.18 / Chapter Chapter Two --- Isolation of Genes Differentially Expressed During the Development of Rice by RAP-PCR / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.20 / Chapter 2.2 --- Materials and Methods --- p.23 / Chapter 2.2.1 --- Strains and culture conditions --- p.23 / Chapter 2.2.2 --- Isolation of total RNAs --- p.23 / Chapter 2.2.3 --- cDNA Library construction --- p.24 / Chapter 2.2.3.1 --- First strand synthesis --- p.24 / Chapter 2.2.3.2 --- cDNA amplification by LD PCR --- p.25 / Chapter 2.2.3.3 --- Proteinase K digestion --- p.25 / Chapter 2.2.3.4 --- Sfi digestion --- p.26 / Chapter 2.2.3.5 --- cDNA size fractionation by CHROMA-SPIN´ёØ-400 --- p.26 / Chapter 2.2.3.6 --- Ligation of cDNA to λTripEx2vector --- p.26 / Chapter 2.2.3.7 --- Titering the unamplified library --- p.27 / Chapter 2.2.3.8 --- Determining the percentage of recombinant clones --- p.27 / Chapter 2.2.3.9 --- Library amplification --- p.28 / Chapter 2.2.3.10 --- Titering the amplified library --- p.28 / Chapter 2.2.3.11 --- Converting λ TripEx2 recombinant clones to pTripEx2 recombinant plasmids --- p.28 / Chapter 2.2.4 --- RNA fingerprinting by RAP-PCR --- p.29 / Chapter 2.2.5 --- Reverse dot-blot analysis --- p.30 / Chapter 2.2.5.1 --- Membrane preparation --- p.30 / Chapter 2.2.5.2 --- Probe preparation --- p.30 / Chapter 2.2.5.3 --- Hybridization --- p.31 / Chapter 2.2.5.4 --- Stringency washes and chemiluminescent detection --- p.31 / Chapter 2.2.6 --- Sequencing of differentially expressed genes --- p.32 / Chapter 2.2.6.1 --- Extraction of plasmid DNA --- p.32 / Chapter 2.2.6.2 --- DNA cycle sequencing --- p.33 / Chapter 2.3 --- Results --- p.34 / Chapter 2.3.1 --- Total RNA isolation --- p.34 / Chapter 2.3.2 --- cDNA library --- p.37 / Chapter 2.3.3 --- RNA fingerprinting --- p.40 / Chapter 2.3.4 --- Reverse dot-blot analysis --- p.45 / Chapter 2.3.5 --- Sequence analyses --- p.48 / Chapter 2.4 --- Discussion --- p.68 / Chapter Chapter Three --- cDNA Microarray Analysis and expression Pattern Analysis by Northern Blot Hybridization / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.71 / Chapter 3.2 --- Materials and Methods --- p.76 / Chapter 3.2.1 --- RNA extraction by RNeasy® Mini Kit for cDNA microarray --- p.76 / Chapter 3.2.2 --- Microarray analysis --- p.76 / Chapter 3.2.2.1 --- Array preparation --- p.76 / Chapter 3.2.2.2 --- Probe preparation --- p.78 / Chapter 3.2.2.3 --- Hybridization --- p.79 / Chapter 3.2.2.4 --- Stringency washes and TSA Detection --- p.79 / Chapter 3.2.2.5 --- Microarray Analyses --- p.80 / Chapter 3.2.3 --- RNA extraction by Tri-reagent for Northern Blot hybridization --- p.81 / Chapter 3.2.4 --- RNA fragmentation by formaldehyde gel electrophoresis --- p.81 / Chapter 3.2.5 --- Northern blotting --- p.82 / Chapter 3.2.6 --- Preparation of probe --- p.83 / Chapter 3.2.7 --- Hybridization and stringency washes --- p.84 / Chapter 3.2.8 --- Stripping and reprobing of Northern Blot --- p.85 / Chapter 3.3 --- Results --- p.86 / Chapter 3.3.1 --- Total RNA isolation --- p.86 / Chapter 3.3.2 --- Microarray analysis --- p.86 / Chapter 3.3.3 --- Normalization of microarray data --- p.91 / Chapter 3.3.4 --- Detection of probe labeling efficiency --- p.92 / Chapter 3.3.5 --- Northern blot analysis --- p.100 / Chapter 3.3.5.1 --- Genes expressed highly in primordia stage --- p.100 / Chapter 3.3.5.2 --- Genes with low expression in primordia stage --- p.101 / Chapter 3.3.5.3 --- Genes with high expression in half expanded stage --- p.101 / Chapter 3.3.5.4 --- Genes steadily increased in expression throughout the development --- p.103 / Chapter 3.3.5.5 --- Genes with low expression in fully expanded stage --- p.104 / Chapter 3.4 --- Discussion --- p.114 / Chapter Chapter four --- General Discussion --- p.122 / References --- p.127

Devido ao constante ataque à camada de ozônio, as plantas, nos próximos anos, terão que lidar cada vez mais com uma maior quantidade de luz UV atingindo a atmosfera terrestre. O arroz é considerado uma planta modelo para as monocotiledôneas por possuir um genoma relativamente pequeno (aproximadamente 390 Mb) e devido a sua grande sintenia com outros cereais. Recentemente, as proteínas E2F foram descritas, especialmente em vertebrados, como fatores transcricionais que podem estar envolvidos com a resposta ao dano de DNA. Tendo como objetivo principal estudar como a família de fatores transcricionais E2F responde ao dano genotóxico em arroz, experimentos com luz UV-B foram conduzidos para avaliar o envolvimento destes com as respostas ao dano de DNA. Além disso, foram realizadas análises filogenéticas dessa família gênica com representantes de plantas. Em arroz, estudos prévios de nosso grupo identificaram seis genes pertencentes à família E2F, sendo quatro E2F típicos e dois E2F atípicos. Em resposta à luz UV, dois dos quatro genes que codificam E2F típicos e os dois genes de E2F atípicos, tiveram a expressão relativa aumentada após o estresse em relação a plantas mantidas em condição controle. Nesse experimento, além dos genes E2F e dos genes de reparo, também foram avaliados os níveis de transcritos de genes sabidamente envolvidos com ciclo celular e apoptose, permitindo-se verificar se o aumento de expressão dos genes E2F em resposta ao estresse está efetivamente relacionado com a resposta a danos no DNA e não a estes dois outros processos celulares. As análises filogenéticas revelaram que um desses dois E2F típicos, que apresentou sua expressão diferencial nas condições testadas, provavelmente atue como um repressor de transcrição. Esta afirmação está baseada em estudos comparativos com sequências da planta modelo para as dicotiledôneas, Arabidopsis thaliana. O conjunto de resultados obtidos sugere que alguns membros da família E2F de arroz estão envolvidos especificamente com as repostas ao dano ao DNA, além de permitir a proposição de um possível mecanismo de ação. / Due to the constant attack to the ozone layer, the plants, in the coming years, will have to deal with an increasing amount of UV light reaching the earth's atmosphere. Rice is considered a model plant for monocots due to its relatively small genome (approximately 390 Mb) and because its high synteny with other cereals. E2F proteins have recently been reported, especially in vertebrates, as transcriptional factors involved in the response to DNA damage. To study how the family of transcription factors E2F responds to genotoxic damage in rice, experiments with UV-B were conducted to evaluate their involvement with the responses to DNA damage. In addition, phylogenetic analyzes of this gene family in plants were performed. In rice, previous studies of our group identified six genes belonging to the E2F family, four typical and two atypical E2F. In response to UV light, two of four genes encoding typical E2F and the two atypical E2F genes increased their relative expression after stress compared to the plants grown in the control condition. In this experiment, in addition to the E2F gene and repair genes, we have also analyzed the transcriptional level of genes known to be involved with cell cycle and apoptosis, in order to verify if the increases in E2F gene expression, in response to stress, are actually related to the response to DNA damage, rather than to other two cellular processes. Phylogenetic analysis revealed that one of these two typical E2F, which showed differential expression under the conditions tested, probably acts as a transcriptional repressor. This analysis is based on comparisons with sequences from the model plant for dicots, Arabidopsis thaliana. These set of results suggest that some members of the E2F family of rice are involved specifically with responses to DNA damage and allowed the proposition of a possible mechanism of action.

CARVALHO, F. E. L. A superexpressão de proteínas relacionadas com atividades fotoquímica e fotorespiratória induzida por silenciamento das APX citosólicas contribui para uma fotoinibição similar a de arroz não-transformado submetido à alta luz. 2013. 118 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-20T18:03:08Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_felcarvalho.pdf: 6791804 bytes, checksum: 7a0dd96f599fa1365821ce8e5dedba09 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T19:24:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_felcarvalho.pdf: 6791804 bytes, checksum: 7a0dd96f599fa1365821ce8e5dedba09 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T19:24:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_felcarvalho.pdf: 6791804 bytes, checksum: 7a0dd96f599fa1365821ce8e5dedba09 (MD5) Previous issue date: 2013 / In tropical regions, where there is a high incidence of light, electrons can accumulate in the transport chain (PET) producing large quantities of H2O2 and other ROS, which might generate photodamage and photoinhibition. To survive to these challenges, plants have developed several mechanisms to mitigate the excess energy in photosystems, besides having an efficient machinery for removal of excess H2O2, which includes cytosolic APX (cAPX). However, double-silenced rice plants for cAPX (OsAPX1/2) do not show large differences in morpho-phenotype when compared to non-transformed (NT), although OsAPX1/2 presents induction of expression on several proteins related to photosynthesis. The physiological implications of this induction, as well as its consequences for OsAPX1/2 resistance against stresses of high light (HL), are still poorly known. Aiming to clarify the role of cAPx in photosynthesis, OsAPX1/2 plants were produced, subjected to 24 hours of HL (2,000 μmol m-2s-1) and studied for the expression and activity of proteins related to photosynthesis, photorespiration and redox homeostasis. The amount of several PET proteins (Lhcb1, PsbO, PsbP, PsbQ, PSAC, PC, FNR and FDX) and Chl and Pheo were increased in OsAPX1/2 in normal growth conditions, however without causing changes in the in vivo photochemistry activity parameters (Fv/Fm and ΔFm/Fm'). In contrast, expression of proteins associated with Calvin-Benson cycle (Rls, ativase RBC) and rubisco carboxylation activity (in vivo and in vitro) were not altered in mutants under normal growth conditions. In HL, the expression of proteins related to photosynthesis was strongly repressed in all genotypes, as well as gas exchange parameters and Fv/Fm, the latter being strong indication of photoinhibition. Moreover, proteins related to photorespiration showed increased expression/activity in response to HL in NT and maintenance of already high levels in OsAPX1/2. In OsAPX1/2 the expression and activity of chloroplastic Cu/Zn-SOD showed a similar response exhibited by photorespiration-related proteins, although the activity of thylakoid APX has been greatly reduced, meaning deficiency in water-water cycle. Taken together, these data demonstrate that induction of expression of proteins related PET in OsAPX1/2 plants may represent a compensatory mechanism for maintaining the photosynthetic activity levels similar to NT. Moreover, in HL, it is possible that the increased expression of photorespiration-related proteins in OsAPX1/2 acts as alternative electron sink, compensating the deficiency in the water-water cycle from these plants. / Em regiões tropicais, onde existe alta incidência luminosa, os elétrons podem se acumular na cadeia transportadora (PET) produzindo grandes quantidades de H2O2 e outras ROS, que podem gerar fotodano e fotoinibição. Para sobreviver a esse desafio, plantas desenvolveram vários mecanismos de atenuação do excesso de energia nos fotossistemas, além de contar com uma eficiente maquinaria de remoção do excesso de H2O2, da qual fazem parte as APX citosólicas (cAPX). Entretanto, plantas duplamente silenciadas para as cAPX (OsAPX1/2) não apresentam grandes diferenças morfo-fenotípicas quando comparadas às não transformadas (NT), embora OsAPX1/2 apresente indução de expressão de diversas proteínas relacionadas com a fotossíntese, comparadas com as NT. As implicações fisiológicas dessa indução, assim como suas consequências para a resistência de OsAPX1/2 contra estresses de alta luz (HL), ainda são pouco conhecidas. Objetivando clarificar o papel das cAPx na fotossíntese, plantas de arroz OsAPX1/2 foram produzidas, submetidas a 24 horas de HL (2000 μmol m-2s-1) e estudadas quanto à expressão e atividade de proteínas relacionadas com a fotossíntese, fotorespiração e homeostase redox. A quantidade de diversas proteínas da PET (Lhcb1, PsbO, PsbP, PsbQ, PSAC, PC, e FDX FNR), bem como teores de Chl e Pheo foram aumentadas em OsAPX1/2 em condições normais de crescimento sem causar alterações nos parâmetros de atividade fotoquímica in vivo (Fv/Fm e Fm/Fm'). Em contraste, as proteínas relacionadas com expressão ciclo de Calvin-Benson (Rls, ativase de Rbc) e a atividade de carboxilação da rubisco (in vivo e in vitro) não foram alterados nos mutantes em condições normais de crescimento. Em HL, a expressão de proteínas relacionadas com fotossíntese foi fortemente reprimida em ambos os genótipos, assim como os parâmetros de trocas gasosas e Fv/Fm, sendo esse último forte indício de fotoinibição. Por outro lado, as proteínas relacionadas com a fotorespiração, ou mostraram aumento na expressão/atividade em resposta à luz elevada (NT) ou manutenção de níveis já elevados (OsAPX1/2). A expressão e atividade de Cu/Zn-SOD de cloroplastos mostrou resposta similar a exibida pelas proteínas da fotorespiração, embora a atividade de APX de tilacóides tenha sido fortemente reduzida em OsAPX1/2, evidenciando deficiência no ciclo água-água. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a indução da expressão de proteínas relacionadas com o PET em OsAPX1/2 pode representar um mecanismo compensatório para a manutenção da atividade fotossintética aos níveis da NT. Por outro lado, sob HL, é possível que o aumento da expressão de proteínas associadas com fotorespiração em OsAPX1/2 atue como dissipador alternativo de elétrons, compensando a deficiência no ciclo da água-água dessas plantas