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Submitted by Gabrielle de Castro Macedo (gabriellecmacedo@gmail.com) on 2018-06-08T21:57:13Z No. of bitstreams: 1 Tese Gabrielle M.pdf: 2925084 bytes, checksum: df56d11b8216e24580f2f7ca847eb592 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Lucia Martins Frederico null (mlucia@fca.unesp.br) on 2018-06-11T12:07:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 macedo_gc_dr_botfca.pdf: 2799637 bytes, checksum: 38a0ff40cf7c14a31feec651dd99b926 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-11T12:07:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 macedo_gc_dr_botfca.pdf: 2799637 bytes, checksum: 38a0ff40cf7c14a31feec651dd99b926 (MD5) Previous issue date: 2018-05-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O emprego de substâncias tóxicas as plantas, como o glyphosate, em doses muito menores que as recomendadas comercialmente pode ocasionar alterações em varáveis como crescimento, acúmulo de biomassa, altura, conteúdo de proteína e resistência a doenças. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram realizar estudos para uma melhor compreensão das alterações bioquímicas, fisiológicas e fenológicas do arroz causadas por subdoses de glyphosate. O experimento 1 foi realizado à campo, na Fazenda Experimental Lageado, pertencente à Faculdade de Ciências Agronômicas, FCA/UNESP, Botucatu/SP, nos anos agrícolas de 2015/2016 e 2016/2017. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados, arranjado em esquema fatorial 2x7, sendo o primeiro fator época de aplicação do glyphosate (V3 ou R1) e, o segundo, as doses do herbicida (0; 7,5; 15; 30; 60; 120 e 240 g e.a. ha-1), com quatro repetições. Foram avaliados a produtividade, o comprimento de panículas, número de perfilhos por m², peso de 1000 grãos, número de grãos por panícula, a fertilidade de espiguetas e o número de dias entre a aplicação e o início de cada fase fenológica. Os experimentos 2 e 3 foram realizados em casa de vegetação, no Núcleo de Pesquisas Avançadas em Matologia (NUPAM), pertecentente à Faculdade de Ciências Agronômicas, FCA/UNESP, Botucatu/SP. O experimento 2 seguiu delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial (7x3) com cinco repetições. Os tratamentos foram constituídos por sete doses do herbicida glyphosate (0; 7,5; 15; 30; 60; 120 e 240 g e.a. ha-1) aplicados no estádio V3, e 3 períodos de chuva após a aplicação (12, 24 horas e ausência). Foram avaliados o perfilhamento e o acúmulo de massa das plantas. O experimento 3 foi arranjado em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial (7x3) com quatro repetições. Os tratamentos foram constituídos por dez doses do herbicida glyphosate (0; 1,5; 3; 6; 12; 24; 36; 72; 180 e 360 g e.a. ha-1), aplicadas quando as plantas se encontravam em estádio V4, e três regimes de fornecimento de água (fornecimento contínuo, RH1 e RH2). Foram avaliados o consumo de água diário, o perfilhamento e o acúmulo de massa das plantas. A aplicação de subdoses de glyphosate em condições de campo não influenciou a produtividade e os componentes de produtividade das plantas de arroz até a dose de 60 g e.a. ha-1 de glyphosate quando a aplicação ocorreu em V3, e até 30 g e.a. ha-1 de glyphosate quando a aplicação ocorreu em R1. A partir destas doses, houve severo efeito de intoxicação da cultura. Observou-se que os diferentes períodos de chuva após a aplicação de subdoses de glyphosate não interferiram na resposta das plantas de arroz aos tratamentos. Não foi observado efeito hormético para acúmulo de biomassa e consumo de água em casa de vegetação. A aplicação de doses entre 30 e 240 g e.a. ha-1 de glyphosate proporcionou incremento do perfilhamento das plantas de arroz em todos os estudos realizados, sendo a dose que causou incremento dependente das condições de condução do estudo. / The use of toxic substances in plants, such as glyphosate, in doses much smaller than those recommended commercially can cause changes in variables such as growth, biomass accumulation, height, protein content and resistance to diseases. In this way, the objectives of this work were to carry out studies for a better understanding of the biochemical, physiological and phenological alterations of the paddy rice caused by glyphosate subdoses. Experiment 1 was carried out at the Experimental Farm Lageado, belonging to the College of Agronomic Sciences, FCA / UNESP, in Botucatu, Sao Paulo, in the agricultural years of 2015/2016 and 2016/2017. The experimental design was a randomized block arranged in a 2x7 factorial scheme, with the first factor being the glyphosate application time (V3 or R1) and the second herbicide dose (0, 7.5, 15, 30, 60, 120 and 240 g a.e. ha-1), with four replications. The productivity, panicle length, number of tillers per m², weight of 1000 grains, number of grains per panicle, spikelet fertility and the number of days between the application and the beginning of each phenological phase were evaluated. Experiments 2 and 3 were carried out in a greenhouse at the Weed Science Advanced Research Center (NUPAM), belonging to the Faculty of Agronomic Sciences, FCA / UNESP, in Botucatu, Sao Paulo. Experiment 2 was in a completely randomized design in a factorial scheme (7x3) with five replications. The factor one was doses of the herbicide glyphosate (0, 7.5, 15, 30, 60, 120 and 240 g a.e. ha-1) applied in the V3 and factor two was rainy periods after application (12, 24 hours and without rain). The tillering and mass accumulation of plants were evaluated. Experiment 3 was arranged in a completely randomized design in a factorial scheme (7x3) with four replications. The factor one consisted of ten doses of the herbicide glyphosate (0, 1.5, 3, 6, 12, 24, 36, 72, 180 and 360 g a.e. ha-1) applied when plants were in the V4 stage, and factor two was 3 water supply schemes (no stress, RH1 and RH2). Daily water consumption, tillering and plant mass accumulation were evaluated. The application of glyphosate subdoses under field conditions did not influence yield, productivity components or phenology of paddy rice plants up to the 60 g a.e. ha-1 of glyphosate when the application occurred in V3 and up to 30 g a.e. ha-1 of glyphosate when application occurred at R1. From these doses, there was a severe effect of intoxication of the culture. It was observed that different rainy periods after application of glyphosate subdoses did not interfere in the response of paddy rice plants to the treatments. At greenhouse conditions, no hormesis effect was observed for biomass accumulation and water consumption. The application of doses from 30 to 240 g a.e. ha-1 of glyphosate increased the tillering of paddy rice plants in all the studies carried out, being the dose that caused increment dependent of the conditions of conduction of each study.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais. / Made available in DSpace on 2012-10-23T09:14:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 252071.pdf: 5257645 bytes, checksum: bee1225cc96eb8ce8977174c82ff2e31 (MD5) / O banco de germoplasma de arroz irrigado da Epagri na Estação Experimental de Itajaí (EEI) é composto de 130 acessos conservados de forma ex situ. O conhecimento disponível destes acessos era informal. O objetivo deste trabalho foi caracterizar morfológica e molecularmente os acessos de arroz irrigado da Epagri-EEI. Foram utilizados 30 descritores morfológicos e quatro combinações de iniciadores AFLP. Com a análise de freqüência das classes dos descritores utilizados neste estudo, observou-se que os acessos possuem ampla divergência genética, principalmente na folha, no colmo, no grão e quanto a vigor, arquitetura, ciclo e altura de planta. Com a análise agrupamento através da caracterização morfológica, os acessos agruparam-se em dois grandes grupos com 42% de similaridade. Já com marcadores AFLP, os acessos agruparam-se em dois grandes grupos com 60% de similaridade. Os descritores morfológicos mostraram maior divergência na separação dos grupos do que o AFLP. Este último, foi muito eficiente na detecção de variabilidade entre os acessos. Com a caracterização molecular obteve-se 111 marcadores com uma média de 28 marcadores por combinação de iniciador. Os resultados deste trabalho permitem concluir que os acessos de arroz irrigado da Epagri-EEI possuem diversidade genética, e que, nos dois métodos de caracterização, evidencia-se o estreitamento da base genética nas cultivares de arroz irrigado lançadas para região sul do Brasil, lançadas pela Epagri, Irga e Embrapa. No entanto, ressalta-se que as linhagens e uma cultivar catarinenses (SC 213, SC 385, SC 389, SC 354, SC 355 e SCS 114 Andosan) possuem ampla base genética. O trabalho também revelou a existência de características importantes existentes nos acessos e que poderão ser introduzidas em futuras variedades do programa de melhoramento genético. Além disso, todas as informações geradas neste trabalho farão parte da caracterização dos acessos do banco de germoplasma da Epagri.

Resumo: O presente trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos da adubação nitrogenada e silicatada nos componentes vegetativos (número de colmos por metro quadrado, porcentagem de colmos férteis e número de espiguetas granadas e chochas por panícula), nos componentes da produção (número de panículas por metro quadrado, número total de espigueta por panícula, fertilidade das espiguetas e massa de 1000 grãos), na altura da planta, na produtividade, nos teores de macronutrientes, nos teores de silício no solo e na planta e na anatomia da folha bandeira do arroz de sequeiro, cv. IAC 202, cultivado em túnel plástico. O experimento foi constituído da combinação de três doses de nitrogênio (5, 75 e 150 mg de N/kg de solo) aplicado na forma de uréia e quatro doses de silício (0, 200, 400 e 600 mg de SiO2/kg de solo), aplicado na forma de silicato de cálcio. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizados em esquema fatorial 3x4, com cinco repetições, totalizando 60 unidades experimentais. O silicato de cálcio foi incorporado ao solo 30 dias antes da semeadura. Na época do florescimento foram coletadas folhas bandeiras para análise de teor de macronutrientes e estudo anatônico. Amostras do tecido vegetal (colmo e folhas) e do solo foram coletadas no momento da colheita para determinação do silício na planta e no solo, respectivamente. Os resultados obtidos permitiram concluir que o incremento da adubação nitrogenada aumentou o número de colmos e panículas por metro quadrado, o número total de espiguetas e a produtividade, enquanto que a porcentagem de colmos férteis, fertilidade das espiguetas, massa de grãos diminuíram. A adubação silicatada aumentou significativamente a massa de grãos. O aumento nos níveis da adubação nitrogenada diminuiu os teores de silício na planta, porém nenhum efeito foi encontrado para os teores do... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: The present study aimed to evaluate the silicon and nitrogen fertilization effects on the vegetative components (number of stem by square meter, percentage of fertile stems and the number of fertile spikelets and unfertile grains by panicle), on the yield components (number of panicle by square meter, total number of spikelets by panicle, spikelets fertilization and mass of 1000 grains), on the plants height, productivity, macronutrients level, silicon level in the soil and in the plants and on the anatomy of the flag leaves from the rice culture, cv. IAC 202, cultuved in plastic tunnel. The experiment was constituted by a combination of three doses of nitrogen (5, 75, and 150mg of N/kg of soil) applied as urea in four doses of silicon (0, 200, 400, and 600mg of SiO2/kg of soil), applied as calcium silicate. The experimental design used was the entirely casually factorial scheme 3 x 4, with five replications, totalizing 60 experimental units. The calcium silicate was incorporated to the soil 30 days before sowing. At flourishing time, it was collected flag leaves to analyze the macronutrients level and for anatomical study. Samples of straw tissue (stem and leaf) and soil were collected at harvest period to determine the silicon in content the plant and soil, respectively. The obtained results allowed to conclude that the increment of nitrogen fertilization increased the number of stems and panicle by square meter square, total number of spikelets and productivity, while the percentage of fertile stems, spikelets fertility and mass of grains decreased. The silicon fertilization increased the mass of grains significantly. The nitrogen fertilization decreased the silicon content in the plant, however, there is no effects this element in the soil. The nitrogen fertilization also decreased the silicon deposition on the external cells wall and epidermal tissue of the rice leaves... (Complete abstract, click electronic address below). / Orientador: Hélio Grassi Filho / Coorientador: Carlos Alexandre Costa Crusciol / Mestre

O ferro é elemento essencial para quase todos os organismos, participando de reações importantes no metabolismo das plantas, incluindo a fotossíntese. A homeostase desse metal não é completamente entendida em organismos vegetais, sendo que tanto o excesso quanto a deficiência são deletérios. O arroz (Oryza sativa L. ssp. indica) é normalmente cultivado em terrenos irrigados, o que pode levar ao excesso de ferro. Neste trabalho, nós utilizamos a técnica de Análise Diferencial de Representações (RDA) para isolar seqüências cuja expressão é aumentada ou diminuída pelo excesso de ferro. Foram isoladas 24 seqüências aumentadas e 15 inibidas. Onze seqüências tiveram seu padrão de expressão confirmado como sendo ativadas pelo excesso de ferro, de 14 testadas. Nenhuma seqüência teve seu padrão confirmado como sendo inibido pelo excesso de ferro. Dentre as seqüências confirmadas como diferencialmente expressas, foram encontrados genes relacionados à fotossíntese, resposta a estresse, degradação de proteínas, metabolismo de açúcares e aminoácidos e fatores de transcrição. Vários desses genes estão associados a senescência em outros trabalhos, indicando que a planta sob excesso de ferro pode estar entrando na rota que leva à senescência. Também foi encontrado um fator de transcrição da família WRKY cuja expressão é mais acentuada no 3º dia de tratamento, com diminuição gradual até o 9º dia. Esse dado pode indicar que essa proteína pode estar envolvida na resposta inicial ao estresse, sendo um candidato a regulador da resposta.

A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence a um grupo de fatores de crescimento hematopoiético, controlando a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e o oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina no tratamento de anemias, desordens renais e cardíacas, tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos (COS-1 e CHO) em culturas in vitro e tem sido expressa experimentalmente em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da expressão transgênica desta proteína em plantas sem, no entanto, sucesso na regeneração de plantas saudáveis e férteis. No presente trabalho, plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa) e tabaco (Nicotiana tabaccum) contendo o gene da EPO foram geradas, nas quais foi avaliada a expressão gênica e detectada a presença da proteína recombinante. O gene recombinante da EPO utilizado foi sintetizado baseado na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. Um fragmento de 582 pb correspondente ao cDNA da EPO foi clonado e submetido a seqüenciamento automático. Uma mutação no nucleotídeo 252 (G A) foi identificada, o que não modificou o aminoácido codificado pelo códon, uma glicina. O fragmento foi transferido para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual contém o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1'. Este cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a, que foi transformado nas cepas AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de arroz e de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma da planta foi comprovada por PCR. A expressão da EPO nas plantas de tabaco foi detectada por RT-PCR convencional e quantitiativa, e a presença da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot, provando o sucesso da obtenção de plantas transgênicas de tabaco expressando EPO. Foi obtida por auto-fecundação a geração T1, a qual apresentou segregação mendeliana. Nenhuma das plantas avaliadas apresentou qualquer tipo de deformidade ou mal-formação. Não foi possível a obtenção de plantas de arroz transgênicas devido à deficiência das mesmas no processo de regeneração, possivelmente em conseqüência da super-expressão do transgene em função do promotor escolhido. / Erythropoietin (EPO) is a hormone that belongs to a group of growth hematopoeitic factors, which control the proliferation and differentiation of marrow bone´s cells. It acts inducing the production of blood red cells, increasing the amount of circulating hemoglobin and oxygen. This hormone, mostly secreted by kidneys, is widely used in medicine as a treatment for anaemia, kidney and heart disorders, tumors and numerous diseases. Recombinant EPO has been produced in mammalian cells (COS-1 and CHO) cultured in vitro and has been also experimentally inserted into insect, yeast and bacterial cells. Up to now, to the best of our knowledge, there is only one description of transgenic expression of this protein in plants but without success in the generation of healthy, fertile plants. In the present work we evaluated the expression of human EPO in plants such as rice (Oryza sativa) and tobacco (Nicotiana tabaccum). The recombinant EPO gene was synthesized based on the nucleotide “overlapping” technique. A fragment of 582 bp corresponding to the EPO cDNA was cloned and then submitted to automatic sequencing. At that time, a mutation on nucleotide 252 (G A) was identified. It did not modify the encoded amino acid of the codon, a glycine. This fragment was transferred to the expression vector pWUbi.tm1, armed with the promoter of the ubiquitin gene and the terminator tm1’. This expression cassette was transferred to the binary vector pWBVec4a, which was then transformed into strains ALG1 and LB4404 of Agrobacterium tumefaciens. These strains were employed in the transformation of rice and tobacco, respectively. Transgenic integration into plant genomes was evaluated by PCR. The expression of EPO in tobacco plants was detected by conventional and quantitative RTPCR and the presence of the protein was evaluated by SDS-PAGE and western blot, successfully proving the generation of transgenic tobacco plants expressing EPO. By selfcrossing it was obtained a collection of T1 plants, which presented mendelian segregation of the transgene, and none of the plants presented any kind of miss-formation or deformity. It was not possible to obtain rice transgenic plants due to their deficiency in the regeneration process, possibly due to the transgene over-expression driven by the ubiquitin promoter.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas constantemente pelo metabolismo aeróbico. Em situações de estresse biótico ou abiótico, a produção é aumentada e a toxicidade das ERO pode conduzir a diversos danos celulares. As ERO atuam também como moléculas sinalizadoras regulando a expressão de genes de defesa a estresses, senescência, morte programada da célula, crescimento e desenvolvimento da planta, entre outros processos metabólicos. Uma vez que as ERO são tóxicas e também participam de eventos de sinalização, as células vegetais requerem mecanismos que regulem finamente a concentração intracelular destas moléculas. A ascorbato peroxidase (APx) é uma enzima fundamental do metabolismo antioxidante, catalisando a decomposição do H2O2. Em arroz, a APx é codificada por oito genes, cujas isoformas são caracterizadas por sua localização subcelular: citosólica, peroxissomal, mitocondrial ou cloroplástica. O objetivo deste trabalho foi caracterizar funcionalmente as APx citosólicas (OsAPx1 e OsAPx2) e peroxissomais (OsAPx3 e OsAPx4). A estratégia utilizada foi o silenciamento pós-transcricional por RNA de interferência (RNAi) dos genes individualmente e de ambos os genes codificantes de isoformas do mesmo compartimento subcelular. A redução da expressão de cada gene, assim como de ambos os genes de um compartimento, resultou na produção de diferentes sinais. As plantas RNAi mostraram diferentes fenótipos e padrões de expressão transcricional dos genes da família OsAPx. Analisando as plantas silenciadas para os genes OsAPx1 e OsAPx2 sob estresse com radiação UV e altas doses de alumínio, foi observada compensação por outras enzimas antioxidantes e aclimatação, possivelmente sinalizados pelos níveis mais elevados de H2O2. Estes resultados indicam que cada isoforma de OsAPx pode apresentar funções específicas na célula. / Reactive Oxygen Species (ROS) are continually produced by aerobic metabolism. Under biotic and abiotic stresses, the production is enhanced and the ROS toxicity can lead to cell damage. ROS act also as signalling molecules and are able to regulate the expression of resistance genes, senescence, programmed cell death, plant growth and development, among other metabolic processes. By the fact that ROS are cytotoxic and make part of signalling events, plant cells need mechanisms to tightly regulate the intracellular concentration of these molecules. Ascorbate peroxidase (APx) is a fundamental enzyme of the antioxidant metabolism, it catalyses the H2O2 decomposition. In rice, APx are encoded by a small multigene family, and the different isoforms are classified according to their subcellular localization: cytosolic, peroxisomal, mithocondrial or chloroplastic. The present work aimed to characterize the function of cytosolic (OsAPx1 and OsAPx2) and peroxisomal (OsAPx3 and OsAPx4) APx isoforms. The strategy was the post-transcription silencing by interference RNA (RNAi) of single genes and both genes of the same subcellular localization. The reduced expression of each gene or both genes from the same compartment resulted in the development of different signals. RNAi plants showed changes in the phenotype and in the transcriptional expression of the OsAPx gene family. The analyses of OsAPx1 and OsAPx2 silenced plants under stresses with UV radiation and aluminum revealed that the lack of APx was compensated by other antioxidant enzymes and the acclimation could be signaled by the increased level of H2O2. These results indicate that each isoform of APx should have specific functions in the cell.

O ferro é um micronutiente essencial em plantas, como também para praticamente todos os demais organismos. Porém, as formas livres de ferro intracelular podem ser extremamente danosas. A proteína ferritina tem papel crucial neste contexto, com a função de acumular ferro de uma forma segura e biodisponível. Cada proteína pode acumular aproximadamente 4500 átomos de ferro em sua cavidade interna. Em plantas, existe um número variado de cópias gênicas para ferritina e estas cópias têm expressão modulada por fatores bióticos e abióticos. No genoma do arroz foram caracterizadas duas cópias para o gene da ferritina. Como existem poucos estudos funcionais para ferritina em arroz, este trabalho teve como objetivos: (a) silenciar as duas cópias da ferritina da subespécie japonica variedade Nipponbare; (b) caracterizar, por PCR, mutantes para ferritina por inserção do retroelemento TOS17; (c) caracterizar a expressão da ferritina da subespécie de arroz japonica, variedade Nipponbare, em plantas cultivadas em meio hidropônico sob excesso de ferro. Utilizando o sistema Gateway (Invitrogen) nós desenvolvemos uma construção que expressa um RNA em grampo projetado para silenciar ambas as cópias dos genes da ferritina de arroz. Baseando-se em um protocolo bem estabelecido de regeneração de plantas transgênicas de arroz, nós regeneramos plantas transgênicas silenciadas para os genes da ferritina. Foi obtido 75% de sucesso na geração das plantas silenciadas, o que está de acordo com a literatura. Os transformates primários (T0) não apresentaram anormalidades morfológicas evidentes. É possível que uma rota compensatória para armazenar ferro de forma segura seja ativada quando os níveis de ferritina são diminuídos. Além disso, as plantas produzidas neste trabalho são uma ferramenta potencial para estudar a relação ferro-planta. Baseando-se em análises in silico e por PCR, nós caracterizamos três linhagens mutantes contendo inserção do retroelemento TOS17 no gene OsFer2, entretanto, ainda não identificamos mutantes homozigotos. Em plantas de arroz crescidas em meio hidropônico, o aumento da concentração de ferro resultou em maiores níveis de expressão de ferritina, avaliados por RT-PCR semi-quantitativo, após 6 h e 12 h de exposição aos tratamentos de 50 e 500 ppm de FeSO4 do que na condição controle (5,6 ppm). / Iron is an essential micronutrient for plants, as for virtually all organisms. However, free intracelular iron forms can be extremely dangerous. The ferritin protein has a crucial role in this context, storing iron in a safe and bioavailable form. Each protein molecule can accumulate about 4500 iron atoms in its internal cavity. In plants, there is a variable number of ferritin gene copies and their expression is modulated by biotic and abiotic factors. There are two copies of the ferritin gene in the rice genome. As there are few functional studies for the ferritin genes in rice, this work had the objetives of: (a) to silence both copies of the ferritin genes in the japonica Nipponbare variety; (b) to identify and characterize TOS17 insertional mutants for the ferritin genes using in silico and PCR essays; (c) to characterize the expression of ferritin in the japonica Nipponbare variety under iron stress conditions. Using the Gateway system we generated a construct that expresses a hairpin RNA designed to silence both rice ferritin gene copies. Based on a well-established protocol to regenerate transgenic plants, we developed transgenic ferritin silenced lines. We obtained 75% success in generating rice silenced lines against ferritin. The primary transformants (T0) had no clear morphological abnormalities. It is possible that a compensatory pathway to store iron in a safe form can be induced when levels of ferritin are downregulated. Furthermore, the plants generated in this work are a potential tool to study iron-plant relations. Based on in silico and PCR essays we characterized three TOS17 insertional mutant lines for the OsFer2 gene, but until now we could not identify TOS17 homozygous mutants. In rice plants grown in hydroponic culture, increasing iron concentrations resulted in higher expression levels of ferritin, evaluated by semi-quantitative RT-PCR, after 6h and 12h exposure to 50 and 500 ppm of FeSO4, than in the control treatment (5,6 ppm).

CARVALHO, Fabrício Eulálio Leite. Chloroplast redox metabolism and npq regulation in arabidopsis and rice exposed to excessive light: new insights into psii photoprotection mechanisms. 2016. 171 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Aline Mendes (alinemendes.ufc@gmail.com) on 2016-08-22T20:11:28Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_felcarvalho.pdf: 30686669 bytes, checksum: 85dc625a7c251e2887eb83f7896091be (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-23T18:27:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_felcarvalho.pdf: 30686669 bytes, checksum: 85dc625a7c251e2887eb83f7896091be (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-23T18:27:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_felcarvalho.pdf: 30686669 bytes, checksum: 85dc625a7c251e2887eb83f7896091be (MD5) Previous issue date: 2016 / Plants are sessile organisms, which evolved from aquatic environment to land. This crucial change in habitat opened a new word of resources, but also generated numerous adaptive challenges. Among these defies, sustain photosynthesis under an excessive light environment consist in one of the most important adverse factors to be overcame by plants. Excessive light is defined as the light absorbed by plants, which exceeds their photosynthetic capacity. Under such conditions, the over-accumulation of oxygen reactive species (ROS) could lead to impairment on photosystem two reaction centers (RCII), generating photoinhibition and affecting negatively crop productivity. In this sense, the development of photoprotective mechanisms was essential for plants surviving. Among such mechanisms, non-photochemical quenching (NPQ) and antioxidative metabolism have been intensively studied. However, the real importance of such photoprotective mechanisms and the possible integrative processes which connect NPQ and redox metabolism still not totally understood. The present study addressed to comprehend the integrative mechanisms underlying NPQ and antioxidative processes in two different plants species: one classic plant model (Arabidopsis thaliana) and one important crop model (Oryza sativa). In order to reach such objectives, first was employed new fluorimetric-based methodologies related to photoinhibition quantification, involving photochemical quenching measured in the dark subsequently illumination (qPd) and the fraction of NPQ formed which was related to photoprotection (pNPQ). The use of this methodology was well succeed with A.Thaliana plants under an important physiological problem: light tolerance during plant ontogenesis. The importance of ROS accumulation during less tolerant developmental phases (juvenile and senescent) and chlorophyll concentrations were discussed. Subsequently, the mechanisms underlying pNPQ formation were investigated in the same model, which revealed the importance of combined adjustments in PsbS protein expression, delta pH formation and zeaxanthin/violaxanthin pigment contents for phototolerance during A. thaliana ontogenesis. The importance of total xanthophyll pool in pNPQ generation was evaluated. Finally, the current study attempted to employ the methodology involving qPd in a crop model (rice) knockdown for thylakoidal ascorbate peroxidase isoform (APX8 proteins; apx8 = transformed plants). The data revealed new importance for APX8, which were more sensitive to light, specially under moderate growth light (400 µmol m-2 s-1) compared with non-transformed (NT). Transformed apx8 plants accumulated less chlorophyll, over-accumulated H2O2 and presented impairment on thermal component of NPQ (qE) formation. Under high light intensities growth conditions (4 days), apx8 plants activated compensatory mechanisms which were probably effective as photoprotective mechanism. / Plantas são organismos sésseis e por sua natureza precisaram desenvolver diversos mecanismos ligados a maximização da utilização dos recursos primordiais disponíveis para sua sobrevivência nas mais diversas condições ambientais. Em condições ambientais ótimas de crescimento, a intensidade de energia absorvida a partir da luz incidente equivale a demanda energética exercida pela atividade metabólica circunstancial da planta. Entretanto, na quase totalidade dos casos, tais condições não existem na natureza. O excesso de luz é caracterizado por uma condição ambiental na qual o organismo vegetal é submetido a uma quantidade de energia luminosa mais alta do que a capacidade de utilização nas reações bioquímicas que compõem o metabolismo celular necessário para o crescimento normal do indivíduo. Sendo assim, o excesso de luz pode ser consequência de altas intensidades de luz incidente ou devido a restrições nas reações de consumo de poder redutor, especialmente assimilação de CO2. Portanto, plantas submetidas a estresse salino por exemplo, o qual está muitas vezes associado a uma restrição de natureza estomática, podem apresentar estresse de excesso de luz, mesmo sob intensidades moderadas de luz incidente. A energia excedente pode aumentar a probabilidade da ocorrência de reações colaterais tais como a formação das espécies reativas de oxigênio (EROS). Essas moléculas de alta reatividade podem gerar diversos efeitos negativos para o funcionamento celular, incluindo desnaturação de proteínas, peroxidarão lipídica de membranas e fotoinibição da atividade do fotossistema II (PSII). A ocorrência de fotoinibição é extremamente negativa para o crescimento e desenvolvimento vegetal, afetando a produção de alimentos global. Entretanto, pressões evolutivas causadas pela seleção natural conduziram ao aparecimento de diversos mecanismos de proteção fotooxidativa. Entre as respostas de fotoproteção acionadas em vegetais, duas merecem especial destaque: a dissipação de energia na forma de calor (componente qE do quenching não-fotoquímico - NPQ) e a modulação da expressão de genes ligados a rotas de síntese de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos. Em uma perspectiva sistêmica, entretanto, nenhuma dessas respostas ocorre de maneira isolada em uma célula vegetal. Contrariamente, esses mecanismos interagem de maneira contínua e interdependente, partilhando substratos e rotas de sinalização, e, deste modo, conduzindo à aclimatação da planta às condições de excesso de luz. O presente estudo de doutorado objetivou primariamente aprofundar os conhecimentos existentes acerca dos papéis do NPQ na fotoproteção de plantas. Com esse intuito, plantas modelo da espécie Arabidopsis thaliana foram utilizadas para entender as dinâmicas fotossintéticas em resposta ao excesso de luz. Uma metodologia pioneira para a detecção de fotoinibição, baseada em técnicas de fluorimetria da clorofila a relacionadas à quantificação do quenching fotoquímico medido no escuro, subsequente a um período de iluminação (qPd) foi utilizada. Essa metodologia permite a quantificação dos primeiros indícios de fechamento permanente dos centros de reação do PSII (RCII) e possibilita a quantificação da fração de NPQ que de fato contribui para a fotoproteção (pNPQ). Plantas de Arabidopsis de diferentes idades foram utilizadas, objetivando-se a aplicação da metodologia em um problema fisiológico relevante. Os resultados obtidos nesse estudo são apresentados no capítulo 2 do pressente trabalho e evidenciam que: a) plantas de Arabidopsis apresentam maior susceptibilidade a fotoinibição nas fases juvenil e senescente da ontogênese, b) a fotoproteção foi positivamente associada com a maior eficiência de formação do pNPQ e conteúdo total de clorofilas; c) a maior susceptibilidade a fotoinibição foi coincidiu com acúmulo de EROS nas fases juvenil e senescente e d) o uso da técnica baseada no qPd foi bem sucedido, evidenciando o potencial para futuras aplicações em outros contextos fisiológicos. Posteriormente, buscou-se um maior entendimento acerca dos mecanismos inerentes ao parâmetro pNPQ. Utilizou-se uma abordagem simplificada consistindo em apenas três fases ontogenéticas de plantas de Arabidopsis no intuito de investigar os processos de conhecido envolvimento com a formação do qE, ΔpH, relação violoxantina/zeaxantina e quantidade da proteína PsbS. Esses dados estão relacionados no capítulo 3 do presente trabalho e evidenciam que: a) plantas senescentes e juvenis apresentam menor quantidade de PsbS e formação de ΔpH respectivamente em comparação a plantas maduras, b) as plantas maduras apresentam maior quantidade de pigmentos xantofilas, o que em combinação com maiores níveis de clorofila reportados anteriormente podem explicar uma maior eficiência e potencial na formação de qE, o qual estaria intimamente ligado ao pNPQ. Finalmente, o presente trabalho de doutorado buscou a aplicação dos conhecimentos gerados acerca das novas técnicas de detecção da fotoinibição e pNPQ em uma planta modelo de interesse agronômico, arroz (Oryza sativa). Objetivando-se investigar a relação das EROS com os processos de fotoproteção associados ao pNPQ, plantas de arroz silenciadas por meio de RNAi para a expressão das APX de tilacóides (APX8) foram empregadas. Os resultados obtidos nesses estudos se encontram no capítulo 4 da presente tese e evidenciam que: a) em luz moderada, plantas silenciadas (apx8) apresentam maior susceptibilidade a fotoinibição associada a menor acúmulo de biomassa e menor produtividade, b) essas características das plantas apx8 provavelmente estiveram ligadas a menor eficiência de formação de pNPQ e qE, c) as diferenças relacionadas ao pNPQ provavelmente estiveram associadas com menor conteúdo de clorofilas e acúmulo de EROS nas plantas apx8, evidenciando novamente a importância desses fatores com a capacidade de fotoproteção em plantas e d) em condições de aclimatação ao excesso de luz, a ausência da APX8 é compensada por outras peroxidases, levando a redução nos níveis de EROS e provavelmente recuperação dos níveis de clorofila, que levam a uma recuperação do fenótipo evidenciado em luz moderada.Conclui-se com a presente tese que o uso das metodologias relacionadas a determinação do qPd para estudos de integridade dos RCII foi eficaz para duas espécies distintas, Arabidopsis thaliana e Oryza sativa. Adicionalmente, os resultados indicam que a eficiência de formação do pNPQ parece ser um fator determinante para a capacidade de fotoproteção, que por sua vez é dependente do conteúdo de pigmentos fotossintéticos, especialmente clorofila e carotenoides, assim como eficiência do metabolismo antioxidativo. Essas relações são primeiramente descritas no presente trabalho de doutorado e apresentam potencial de aplicação futura em estudos envolvendo obtenção de plantas mais tolerantes ao excesso de luz. Tais condições de excesso de luz são recorrentes em diversas regiões do mundo, mas especialmente importantes em regiões do semiárido do nordeste do Brasil, onde se encontram em combinação com outros fatores de estresse abiótico, tais como seca e alta salinidade do solo. Espera-se com essas descobertas, contribuir para o conhecimento científico da área de bioquímica vegetal e, posteriormente, possibilitar sua aplicação em âmbito do desenvolvimento agrícola regional.

Diversos estudos têm sugerido uma possível associação entre o consumo de proteínas vegetais e redução de pressão arterial. Feijão consumido com arroz é fonte de proteínas de alto valor biológico que fazem parte do hábito alimentar da população brasileira. Assim, pode ser uma opção a mais de intervenção nutricional para manejo de hipertensão arterial sistêmica (HAS) com provável adesão, visto que, esses alimentos são de fácil disponibilidade. No entanto estudos sobre associação do consumo de feijão com hipertensão são poucos. Assim, o presente estudo tem como objetivos avaliar a associação entre o consumo de feijão e arroz e níveis pressóricos de pacientes em tratamento anti-hipertensivo. Outra intervenção nutricional para controle da HAS é a restrição de sal na dieta, cuja eficácia já foi demonstrada, mas é de difícil adesão. Considerando a importância de avaliar a adesão à restrição de sal e a falta de instrumentos de fácil aplicação na rotina assistencial, outro objetivo dessa dissertação foi realizar a validação do questionário de restrição de sódio dietético (DSRQ) desenvolvido para pacientes com insuficiência cardíaca, em pacientes com hipertensão. Esse questionário pode ser útil para identificação de barreiras e facilitadores dessa recomendação e também orientar o desenvolvimento de intervenções de aconselhamento aos pacientes com hipertensão. Foi realizado um estudo transversal, com pacientes hipertensos em tratamento atendidos no ambulatório de hipertensão e Unidade Básica de Saúde do Hospital de Clinicas de Porto Alegre – HCPA. Foram aplicados três recordatórios alimentares de 24h e coletados dados demográficos, antropométricos, medidas de pressão arterial, dados laboratoriais e prescrição medicamentosa. A associação entre o consumo de feijão e arroz e níveis pressóricos foi avaliada pelo teste de comparação de medianas Man Whitney, ANOVA one way e modelo linear generalizado. Participaram desse estudo 242 pacientes, estratificados em pressão controlada ou não controlada. 113 participantes apresentaram pressão arterial controlada, com pressão arterial sistólica e diastólica de 124,9 ±10,3 mmHg e 75,7 ±8,1 mmHg, respectivamente e 129 apresentaram pressão arterial não controlada com níveis de pressão arterial sistólica e diastólica de 154,3 ±17,4 / 88,5 ±12,8 mmHg. Não houve associação entre o consumo de feijão e arroz e pressão arterial controlada ou não controlada (p=0,975). O consumo de feijão e arroz foi categorizado em quartis e pelo teste ANOVA não foi observado associação significativa entre os quartis e pressão arterial sistólica (p=0,053) e diastólica (p=0,553). A razão de prevalência bruta de PA não controlada para indivíduos que não consumiram feijão e arroz foi de 0,86 (IC95% 0,65 a 1,15; p=0,31). Concluindo, os dados sugerem não haver associação entre o consumo de feijão e arroz com níveis pressóricos em pacientes em tratamento anti-hipertensivo. A validação do DSRQ foi realizada por um estudo metodológico, com 104 pacientes do ambulatório de Hipertensão – HCPA. Foram coletados dados demográficos, medidas de pressão arterial, prescrição medicamentosa e três recordatórios alimentares de 24 horas para estimação do consumo de sódio. O questionário é composto por três subescalas – atitude, norma subjetiva e controle comportamental percebido. A fidedignidade foi avaliada por meio da consistência interna dos seus itens utilizando o coeficiente Alfa de Cronbach. A validade do constructo foi avaliada pela análise dos componentes principais e a validade convergente pela correlação de Spearman. O Coeficiente Alfa de Cronbach foi 0,77 para os 15 itens do questionário; e para as subescalas de atitude, norma subjetiva e atitude comportamental foram de: 0,75, 0,25 e 0,82, respectivamente, após exclusão do item 20. A análise dos componentes principais com extração de três fatores representou 53,5% da variância explicada e resultou em novo agrupamento dos itens nos três componentes da análise fatorial. A correlação de Spearman entre as subescalas e o sódio estimado através do RA24h foi significativa apenas entre a subescala comportamento dependente e sódio estimado (p=0,006). Assim, pode-se concluir que o instrumento apresenta validade e fidedignidade de seu constructo para avaliar as barreiras e atitudes de pacientes hipertensos. / Several studies have suggested a possible association between vegetable protein intake and the reduction in blood pressure. Consuming a combination of black beans and rice is part of the Brazilian consumption pattern and is a high-biological-value source. Therefore, it can be an extra nutritional intervention for the management of the hypertension (HT). This mixture presents a high possibility of adherence, once these types of food are easily available. However, there are few studies about the association between the black beans intake and hypertension. Thus, the present study aims to evaluate the association between black beans and rice consumption and the pressure levels of the patients under hypertension treatment. Other nutritional intervention for the HT control is a salt restriction diet, whose efficacy has already been demonstrated, although the adherence to it is difficult. Taking into consideration the importance of assessing the adherence to a salt restriction diet, and the lack of easy-application instruments in the clinic routine of the patients, other goal of this dissertation was to perform the validation of the dietary sodium restriction questionnaire (DSRQ) for patients with hypertension. The DSRQ was developed for heart failure patients. This questionnaire can be useful to identify barriers and facilitators of the salt restriction recommendation, also to guide the development of counseling interventions for patients with hypertension. The cross-sectional study was performed with patients who were under treatment in the outpatient hypertension and the Basic Health Unit of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre – HCPA. Three 24 hour food recall (24HR) were conducted and demographic data, blood pressure measures, laboratory data and medication prescription were collected. The association between black beans and rice consumption and the pressure levels was analyzed by the Man Whitney median comparison, one way ANOVA and generalized linear models. 242 individuals participated in this study and they were stratified in two groups: controlled blood pressure group and uncontrolled blood pressure. 113 participants present a controlled blood pressure, showing 124.9 ±10.3 mmHg as the systolic blood pressure result and 75.7 ±8.1 mmHg as the diastolic result. 129 participants presented an uncontrolled blood pressure. As the systolic blood pressure result, it was found 154.3 ±17.4 mmHg, and as the diastolic result, 88.5 ±12.8 mmHg. It was not found any association between the black beans and rice intake and the controlled / uncontrolled pressure levels (p=0.975). The black beans and rice consumption was categorized in quartiles and, by the ANOVA test, no significant association between the quartiles, the systolic blood pressure (p=0,053) and the diastolic (p=0.553) was observed. The prevalence ratio crude controlled BP for individuals who did not consume beans and rice was 0.86 (95% CI 0.65 to 1.15, P = 0.31). In conclusion, the data suggested no association between Black beans and rice intake with the pressure levels of the patients under hypertension treatment. The DSRQ validation was performed through a methodological study, with 104 hypertension outpatient patients of the HCPA. Demographics data, blood pressure measures, medication prescription were collected. Three 24HR was conducted for estimated dietary sodium. The DSRQ is composed of three subscales: attitude, norm subjective and perceived behavioral control. The reliability was assessed by the internal consistency of the items of the questionnaire using Cronbach´s Alpha coefficient. The construct validity was evaluated by the Principal Component Analysis (PCA) test and the convergent validity calculated by the Spearman correlation. The Cronbach´s Alpha coefficient found was 0.77 for the 15-items questionnaire; for the attitude, norm subjective and perceived behavioral control subscales were found 0.75, 0.25 and 0.82, respectively – after the exclusion of the item 20. Extracting three factors of the PCA, explained 53.5% of the variance, and it also resulted in a new arrangement of the three components of the factorial analysis. The Spearman correlation between the subscales and the estimated dietary sodium found by the 24HR was significant only between the dependent behavior subscale and the estimated dietary sodium (p=0.006). Thus, it is possible to conclude that the instrument presents validity and reliability of its construct to evaluate the barriers and facilitators of patients with hypertension.