Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-04-20T12:31:20Z No. of bitstreams: 2 Tese - Eduardo Camelo de Castro - 2015.pdf: 5148354 bytes, checksum: bbedf154e2b63e301d86d884047f4fed (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-04-20T12:34:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Eduardo Camelo de Castro - 2015.pdf: 5148354 bytes, checksum: bbedf154e2b63e301d86d884047f4fed (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-20T12:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Eduardo Camelo de Castro - 2015.pdf: 5148354 bytes, checksum: bbedf154e2b63e301d86d884047f4fed (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-01-31 / OBJECTIVES: To evaluate the variability of three-dimensional automatic counting of follicles measuring between 2 - 6 mm and 2 - 10 mm during the menstrual cycle. Considering that this is a standard exam for the early follicular phase, to check if this test can be applied during other phases of the ovarian cycle. METHODS: A Prospective observational study. Serial transvaginal ultrasound scans were performed from 04/20/2013 to 10/30/2014 on infertile patients. Inclusion criteria included age between 18 and 35 years, body mass index 18-25 kg / m2, regular menstrual cycles, no history of ovarian surgery and no hormonal changes to TSH, prolactin, fasting insulin and fasting glucose. Those patients with ovarian cysts or who did not complete one or more days of the serial transvaginal ultrasound scans and who did not undergo three-dimensional (3D) scanning with the researcher, were excluded. The antral follicle count was taken in 3D mode with automated software. Visits were scheduled for early follicular (2 to 5 days), mid-follicular (days 6 - 10), periovulatory (days 12 - 16) and luteal (days 20 - 26) phases of the menstrual cycle. RESULTS: Forty-five women were included. The Friedman test showed that the total number of antral follicles measuring 2-6 mm varied significantly (p=0.001) across the four periods of the menstrual cycle. The Paired Student’s t-test showed a significant increase in follicles count 2-6 mm from the mid-follicular and periovulatory to the luteal phase. We found no significant intracycle variation between the small antral follicles (2-6 mm) in the early follicular, mid-follicular and periovulatory phases. The Friedman test showed that the total number of antral follicles measuring 2-10 mm varied significantly (p=0.003) across the menstrual cycle. Paired Student’s t-test showed a significant increase in count from the early follicular to the mid-follicular phase. CONCLUSIONS: The variation of three-dimensional automatic follicles counting 2-6 mm in the early follicular, mid-follicular and periovulatory phases was not statistically significant. There was a significant variation in the 3D automatic count of ovarian follicles measuring 2-10 mm during the menstrual cycle. The significant variability in the counting of antral follicles measuring 2-10 mm across the menstrual cycle does not permit this examination to be carried out of early follicular phase. / OBJETIVOS: Avaliar a variabilidade da contagem automática tridimensional dos folículos de 2 a 6 mm e de 2 a 10 mm durante o ciclo menstrual. Considerando que este exame esta padronizado para a fase folicular precoce, verificar se este teste pode ser aplicado durante as outras fases do ciclo ovariano. METODOLOGIA: Estudo prospectivo observacional. Foram incluídas todas as pacientes inférteis que fizeram monitorização da ovulação de 20/04/2013 a 30/10/2014, que tinham entre 18 e 35 anos, índice de massa corporal de 18 a 25 kg/m2, ciclos menstruais regulares, sem história de cirurgia ovariana e sem aterações hormonais sugestivas de doenças endócrinas como alteração da dosagem do TSH, prolactina, insulina de jejum e glicemia de jejum. Foram excluídas as pacientes que apresentaram cistos ovarianos, as que faltaram em um ou mais dias da monitorização da ovulação e as que não realizaram a monitorização no ultrassom tridimensional (3D) com o pesquisador. A contagem dos folículos antrais (CFA) foi feita pelo modo 3D com software de automação na fase folicular precoce (2º ao 5º dia), na fase folicular media (6º ao 10º dia), no período periovulatório (12º - 16º dia) e na fase lútea (20º ao 26º dia). RESULTADOS: Quarenta e cinco mulheres foram incluídas. Houve diferença entre as médias das contagens dos folículos que mediram de 2 a 6 mm (p=0,001) e 2 a 10 mm (p=0,003) pelo teste de Friedman que avaliou conjuntamente a CFA das quatro fases do ciclo. Quando se aplicou o teste t-Student pareado, houve um aumento significativo na CFA de 2 a 6 mm quando se comparou a contagem desses folículos na fase folicular média e periovulatória com a contagem da fase lútea. Não houve diferença estatisticamente significante entre a contagem destes folículos pequenos nas fases folicular precoce, folicular média e periovulatória. Houve um aumento significativo na CFA de 2 a 10 mm da fase folicular precoce para a fase folicular média quando se aplicou o teste t-Student pareado. CONCLUSÕES: A variação da contagem automática tridimensional dos folículos de 2 a 6 mm, nas fases folicular precoce, folicular média e periovulatória, não mostrou significância estatística. Houve uma variação significativa da contagem automática 3D dos folículos ovarianos de 2 a 10 mm durante o ciclo menstrual. A variabilidade significativa da contagem dos folículos antrais de 2 a 10 mm durante o ciclo não permite que este exame seja realizado fora da fase folicular precoce.

Introdução: O processo de envelhecimento reprodutivo ocorre em virtude do declínio progressivo na quantidade e qualidade de óvulos que se inicia após a puberdade, se mantém ao longo da menacme, com redução gradual da fertilidade, e termina na menopausa, caracterizada pelo esgotamento do número de folículos e, consequentemente, da reserva ovariana funcional (ROF). A vida pré-natal constitui um importante período para o desenvolvimento dos órgãos genitais internos femininos e mudanças nessa fase podem ter repercussões futuras: quando o feto é submetido a condições adversas intrauterinas, mecanismos metabólicos e endócrinos de adaptação podem mudar o eixo metabólico pós-natal predispondo a certas doenças na vida adulta. Com base nesses dados, postulou-se que condições desfavoráveis de vida intrauterina que poderiam se refletir com alterações do peso ao nascer (PN) poderiam levar à reprogramação de genes envolvidos no controle da ROF e que talvez nascer pequeno para idade gestacional (PIG) ou grande (GIG) possibilitaria a interferência com a ROF estimada por meio das concentrações séricas do hormônio antimülleriano (AMH). Objetivos: O objetivo deste estudo foi avaliar a relação do PN com a ROF, estimada por meio da concentração sérica do AMH em mulheres na menacme com 34 a 35 anos de idade. Pacientes e Métodos: Trata-se de um estudo transversal aninhado a uma coorte de mulheres que nasceram no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP-USP), no período de 01 de junho de 1978 e 31 de maio de 1979. O desfecho primário avaliado foi a concentração sérica de AMH, um marcador da ROF, e sua correlação com o PN, divididos em três grupos: PIG, adequado para a idade gestacional (AIG) e GIG. Resultados: Das 274 pacientes incluídas no estudo, 19 foram classificadas como PIG, 238 como AIG e 17 como GIG. As concentrações médias de AMH não foram significativamente diferentes (p=0,11) entre mulheres na menacme nascidas PIG, AIG e GIG (2,14 ng/mL, 2,13 ng/mLe 2,57 ng/mL, respectivamente). Conclusão: Não se observou diferença nas concentrações séricas de AMH entre mulheres nascidas PIG, AIG e GIG avaliadas entre 34 e 35 anos de idade. A casuística avaliada permitiu detectar ou descartar uma grande diferença entre os grupos (effectsize de 0,7). Dessa forma, evidenciou-se que o PN não apresenta grande influência sobre a ROF, estimada pelas concentrações séricas do AMH, em mulheres na menacme, entre 34 e 35 anos de idade. Caso novos estudos evidenciem que diferenças pequenas ou moderadas nas concentrações séricas do AMH possam apresentar relevantes repercussões clínicas em mulheres nesta faixa etária, outras pesquisas serão necessárias, sendo os dados do presente estudo úteis para o cálculo amostral. / Background: The reproductive aging process occurs by a progressive decline in the quantity and quality of oocyte, starting after pubertal onset, remaining through menacme with gradual reduction of fertility and ends with menopause, which is the depletion of ovarian follicles and hence the depletion of functional ovarian reserve (FOR). Prenatal life corresponds to a critical window for the development of female internal genitalia and changes at this stage may have future repercussions: when the fetus is submitted to intra uterine adverse conditions, adaptive metabolic and endocrine mechanisms will change the metabolic axis in the postnatal period thereafter predisposing to several diseases in adulthood. Based on this correlation, we postulate that unfavorable conditions of intrauterine life that could reflect on birth weight (BW) could lead to the reprogramming of genes involved in the control of FOR and that maybe being born small for gestational age (SGA) or large for gestational age (LGA) could interfere with the FOR estimated through serum concentrations of Anti-Müllerian hormone (AMH). Objective: To investigate the relationship between BW and ROF estimated through AMH serum concentration in menacme women with 34-35 years old. Patients and Methods: This is a prospective birth cohort assessing all women who were born in Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP-USP) between June 1, 1978 and May 31, 1979. The primary endpoint was to evaluate serum AMH concentration, a marker of FOR and its correlation with BW divided into three groups: SGA, adequate for gestational age (AGA) and LGA. Results: Out of the 274 patients included in the study: 19 were classified as SGA, 238 as AGA, and 17 as LGA. The average of AMH concentrationwas not significantly different (p=0.11) among women in reproductive age born SGA, AGA and LGA (2.14 ng/mL, 2.13 ng/mL, and 2.57 ng/mL respectively. A variance analysis between the three groups and OR did not find a significant different between them (p=0.11). Conclusion: There was no difference in serum AMH concentration in women born SGA, AGA and LGA with 34 to 35 years old. This sample also allowed to detect or rule out a major difference between the groups (effect size of 0.7). In conclusion, BW does not have a great influence on FOR, estimated through serum AMH concentration in menacmewomen, between 34 and 35 years old. If new studies show clearly that small or moderate differences in serum AMH concentration could impact clinical outcomes in women at this age, further studies will be needed, and the data of this study could be useful for sample size calculation.

Orientadores: Cristina Laguna Benetti Pinto, Rose Luce Gomes do Amaral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-28T09:13:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GiraldoSouza_HelenaPatriciaDonovan_M.pdf: 2305470 bytes, checksum: add3640d7732bc5676b5b9eb414466b0 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Introdução: Insuficiência Ovariana Prematura 46XX (IOP) é um estado de hipogonadismo, caracterizado por oligoamenorréia, infertilidade e deficiência estrogênica em mulheres abaixo de 40 anos. Mulheres com IOP deveriam ser tratadas com reposição estrogênica até pelo menos a idade da menopausa, para reduzir os sinais e sintomas do hipoestrogenismo e se possível, preservar a massa mineral óssea. Objetivos: Avaliar se Terapia Hormonal (TH) com baixa dose estrogênica é adequada para reduzir a perda de massa óssea de mulheres com IOP. Métodos: Estudo de corte transversal. Foram avaliadas 239 mulheres com IOP: 132 usando TH baixa dose (17-Beta-Estradiol 1mg + Noretisterona ou estrogênio conjugado 0,625mg + acetado de Medroxiprogesterona) e 107 mulheres sem TH. Todas responderam anamnese detalhada (idade, idade na última menstruação e idade no início de tratamento) e foram submetidas a avaliação de densidade mineral óssea (DMO) na coluna lombar (CL), colo femoral (CF) e fêmur total (FT) através da técnica DEXA. Resultados: As médias de idade, idade na última menstruação e de IMC para o grupo sem tratamento e para o grupo com TH foram 38,1 ± 6,1 e 36,8 ± 7,3 anos; 31,4 ± 7,3 e 30,7 ± 7,2 anos; 26,6 ± 7,1 e 25,8 ± 4,6, respectivamente (p=NS). A DMO média na CL foi 1,06 ± 0,15 e 1,00 ± 0,17g/cm2 (p=0,003), para CF 0,92 ± 0,15 e 0,89 ± 0,14 (p=0,0479) e FT de 0,92 ± 0,19 e 0,91 ± 0,13 g/cm2 (p=0,039), respectivamente para os grupos. Verificou-se DMO alterada na CL em 45,1% (35,2% Osteopenia e 9,8% Osteoporose) das mulheres sem tratamento e 60,1% (38,1 Osteopenia e 22% Osteoporose) quando usavam TH baixa dose (p=0,01). No CF 25,4% (21,5% Osteopenia e 3,9% Osteoporose) das mulheres sem tratamento e 29,6% (22,8% Osteopenia e 6,7% Osteoporose) quando usavam TH baixa dose (p=0,38) mostravam alteração e, para FT, em 32,35% (19,6% Osteopenia e 12,7% Osteoporose) das sem tratamento e 36,4% (21,2% Osteopenia e 15,2% Osteoporose) para TH de baixa dose (p=0,34). Conclusão: A TH de baixa dose não parece ser adequada para reduzir a perda de massa óssea de coluna lombar, colo de fêmur e fêmur total em mulheres com IOP / Abstract: Introduction: Premature Ovarian Insufficiency (POI) is a hypogonadism state, characterized by oligoamenorhea, infertility and estrogen deficiency in women below the age of 40. Women with POI should be treated with estrogen replacement until at least the age of menopause, in order to reduce the signs and symptoms of hypoestrogenism and if possible, preserve bone mineral density (BMD). Aim: To assess whether hormone therapy (HT) with low estrogen dose is sufficient to avoid bone mass loss in women with POI. Methods: Cross-sectional study. Two hundred and thirty nine women were evaluated: 132 using low dose TH (1 mg of 17-Beta-Oestradiol + Norethisterone or 0.625 mg of conjugated estrogen + medroxyprogesterone acetate) and 107 women without HT. Detailed history was obtained from the studied women (age, age of last menstrual period and age of onset of treatment) and were subjected to evaluation of bone mineral density (BMD) in the lumbar spine (LS), femoral neck (FN) and total femur (TF) through DEXA technique. Results: The mean age, age at last menstrual period and BMI for the untreated group and the group with HT were 38.1 ± 6.1 and 36.8 ± 7.3 years; 31.4 ± 7.3 and 30.7 ± 7.2 years; 26.6 ± 7.1 and 25.8 ± 4.6 respectively (p = NS). The mean LS BMD was 1.06 ± 0.15 and 1.00 ± 0,17g / cm2 (p = 0.003), CF 0.92 ± 0.15 and 0.89 ± 0.14 (p = 0.0479) and FT 0.92 ± 0.19 and 0.91 ± 0.13 g / cm2 (p = 0.039) respectively for the groups. BMD at LS was compromised in 45.1% (35.2% osteopenia and osteoporosis 9.8%) for women without treatment and 60.1% (38.1% osteopenia and 22% osteoporosis) low dose HT (p = 0.01). For the FN 25.4% (21.5% Osteopenia and Osteoporosis 3.9%) of women without treatment and 29.6% (22.8% Osteopenia and Osteoporosis 6.7%) for the ones in use of TH low dose, were compromised (p = 0 38). For TF compromise was found in 32.35% (19.6% osteopenia and 12.7% osteoporosis) of the untreated women and 36.4% (21.2% and 15.2% osteoporosis osteopenia) for low dose HT (p = 0.34). Conclusion: The low dose HT seems to be inadequate to reduce bone loss in the lumbar spine, femoral neck and total femur in women with IOP / Mestrado / Fisiopatologia Ginecológica / Mestra em Ciências da Saúde

A síndrome de hiperestímulo ovariano (SHO) pode ocorrer de forma espontânea na gestação ou durante indução da ovulação para fertilização in vitro. Com o objetivo de identificar fatores clínicos e hormonais de risco para a SHO iatrogênica e analisar o papel das variantes alélicas do FSHR na sua etiologia, estudamos 29 pacientes com SHO iatrogênica moderada e grave. Idade < 33,5 anos, FSH basal < 5,2 UI/L e resposta de estradiol > 1757 pg/mL durante a estimulação ovariana atuaram como preditores independentes do risco de desenvolvimento da SHO iatrogênica, sendo a associação dos três fatores capaz de predizer a síndrome com acurácia de 78%. Não foram encontradas mutações nas 29 pacientes com SHO iatrogênica. Entretanto, o alelo Asn680 do polimorfismo Ser680Asn se associou às formas mais graves da SHO iatrogênica / Ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS) can occur spontaneously during early pregnancy or as an iatrogenic complication in assisted reproductive medicine. The aim of this study was to identify clinical and hormonal risk factors for iatrogenic OHHS and to evaluate the role of allelic variants of the FSHR in the etiology of this syndrome. We studied 29 patients with moderate and severe iatrogenic OHHS. Age < 33.5 y, basal FSH < 5.2 U/L and estradiol response during ovarian stimulation > 1757 pg/mL were independent risk factors for iatrogenic OHSS and these three factors in association were able to predict the syndrome with accuracy of 78%. We did not find mutations in any patient studied. However, there was a predominance of the Asn680 allele of Ser680Asn polymorphism in patients with the most severe forms of the syndrome

A síndrome de hiperestímulo ovariano (SHO) pode ocorrer de forma espontânea na gestação ou durante indução da ovulação para fertilização in vitro. Com o objetivo de identificar fatores clínicos e hormonais de risco para a SHO iatrogênica e analisar o papel das variantes alélicas do FSHR na sua etiologia, estudamos 29 pacientes com SHO iatrogênica moderada e grave. Idade < 33,5 anos, FSH basal < 5,2 UI/L e resposta de estradiol > 1757 pg/mL durante a estimulação ovariana atuaram como preditores independentes do risco de desenvolvimento da SHO iatrogênica, sendo a associação dos três fatores capaz de predizer a síndrome com acurácia de 78%. Não foram encontradas mutações nas 29 pacientes com SHO iatrogênica. Entretanto, o alelo Asn680 do polimorfismo Ser680Asn se associou às formas mais graves da SHO iatrogênica / Ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS) can occur spontaneously during early pregnancy or as an iatrogenic complication in assisted reproductive medicine. The aim of this study was to identify clinical and hormonal risk factors for iatrogenic OHHS and to evaluate the role of allelic variants of the FSHR in the etiology of this syndrome. We studied 29 patients with moderate and severe iatrogenic OHHS. Age < 33.5 y, basal FSH < 5.2 U/L and estradiol response during ovarian stimulation > 1757 pg/mL were independent risk factors for iatrogenic OHSS and these three factors in association were able to predict the syndrome with accuracy of 78%. We did not find mutations in any patient studied. However, there was a predominance of the Asn680 allele of Ser680Asn polymorphism in patients with the most severe forms of the syndrome

Este estudo teve como objetivo geral a análise do gene FMR1 (Fragile X Mental Retardation gene 1) quanto a sua relação com a insuficiência ovariana primária (Fragile X-related Primary Ovarian Insufficiency, FXPOI). No Capítulo I, apresentamos revisão da literatura sobre FXPOI. A pré-mutação do gene FMR1 constitui a mais frequente causa genética de predisposição para menopausa precoce e entre os casos familiais, cerca de 10% estão associados à pré-mutação do gene FMR1. Entretanto, pouco se conhece sobre a expressão do gene no ovário de mamíferos e os mecanismos pelos quais a pré-mutação causa POI permanecem desconhecidos. O Capítulo II apresenta os resultados do estudo da expressão do gene FMR1 nos ovários adultos, humano e murino. As enormes dificuldades inerentes à obtenção e ao estudo de células germinativas femininas nos levaram a estudar células da granulosa humana (HGC), que são de fácil obtenção, como subprodutos de procedimentos de fertilização in vitro. Também estudamos a expressão do Fmr1 em células da granulosa de camundongos da linhagem CD1 (MGC), coletadas nos ovidutos, após estimulação da ovulação. As células da granulosa interagem intensamente com os ovócitos durante a foliculogênese, transmitindo sinais através do ovário e apoiando o crescimento e a maturação dos ovócitos durante as últimas fases do crescimento folicular. É, portanto, possível que alterações celulares induzidas pela pré-mutação do gene FMR1 nas HGC afetem o crescimento folicular, a taxa de ovulação e a fecundidade. Padronizamos os protocolos de isolamento e de cultivo das HGC do fluido folicular e confirmamos a origem das células isoladas pela expressão de marcadores de HGC, por RT-PCR, e pela natureza lipídica dos grânulos citoplasmáticos, pela coloração com o corante lipofílico DiI. Demonstramos, por RT-PCR que as HGC isoladas do líquido folicular expressam o mRNA do FMR1. Em camundongos, também por RT-PCR, evidenciamos a expressão do mRNA do Fmr1 em ovócitos e nas MGC, coletados do oviduto após hiper-estimulação da ovulação. Por hibridação in situ de RNA em HCG cultivadas, detectamos o mRNA do FMR1 disperso no citoplasma e no núcleo, concentrado em regiões cujas características indicaram ser nucléolos. Essa mesma distribuição foi observada em fibroblastos cultivados. Essa provável localização nucleolar sugere que o transcrito do FMR1, nessas células, constitua ribonucleoproteínas mensageiras, para seu direcionamento do nucléolo para sítios citoplasmáticos específicos, onde ocorre sua tradução. Verificamos, por Western blotting, que as HGC expressam, em níveis elevados, isoformas da FMRP, com massa molecular entre 60 e 95 kDa. Determinamos a localização subcelular da FMRP nas HGC e da Fmrp nas MGC, por imunocoloração. Os sinais de hibridação foram visualizados dispersos, em grânulos finos, no citoplasma das HGC e das MGC, de maneira semelhante ao padrão de distribuição da proteína em neurônios. Nos filopódios das MGC, observamos marcação concentrada em alguns pontos, de forma semelhante ao padrão, previamente descrito, de distribuição da Fmrp em espinhas dendríticas de neurônios de hipocampo de rato, constituindo grânulos de RNA, que promovem o transporte de mRNA e controlam a tradução. O padrão de distribuição semelhante entre neurônios e MGC pode refletir similaridade da função da Fmrp nos dois tecidos. A indução de estresse oxidativo nas HGC por tratamento com arsenito sódico, levou a proteína a deixar de ter distribuição citoplasmática difusa e passar a fazer parte de grânulos de estresse perinucleares, colocalizando-se com TIA-1, marcador dessas estruturas. Resultados semelhantes foram anteriormente obtidos em células HeLa e no hipocampo de rato. Esses resultados apoiam a hipótese de que a FMRP participa do mecanismo transitório de parada da tradução após estresse. No Capítulo III, descrevemos nossas tentativas para obtenção de linhagem de células tronco embrionárias (ESC) de camundongo knockin (KI) quanto a pré-mutação do gene Fmr1. Para a obtenção de embriões KI, fêmeas selvagens (WT; linhagem C57) foram cruzadas com machos KI (linhagem C57/BL6) e fêmeas KI foram cruzadas com machos WT. Pretendíamos comparar a expressão do gene Fmr1 na linhagem de ESC KI e linhagem de ESC WT, inclusive durante a diferenciação Não tivemos sucesso, o que pode ser atribuído às dificuldades inerentes à obtenção de ESC. No acompanhamento dos primeiros quatro dias do desenvolvimento in vitro dos embriões, alterações de clivagem e parada de desenvolvimento foram mais frequentemente observadas nos embriões obtidos de fêmeas KI. Entretanto as taxas médias de sobrevivência de ovócitos para blastocistos e de embriões com 8 a 16 células para blastocistos não diferiram estatisticamente entre as fêmeas KI e selvagens; a grande variabilidade entre o número de blastocistos obtidos por fêmea e o pequeno número delas nos grupos KI (seis) e selvagem (sete) indicam que esses resultados devem ser interpretados com cautela. A análise da proteína Fmrp nos blastocistos, por imunocoloração, mostrou distribuição provavelmente citoplasmática, com padrão granular de marcação, sendo as granulações mais frequentes nos blastocistos de fêmeas WT, porém mais grosseiras nos blastocistos de fêmeas KI. Esse conjunto de dados é sugestivo de efeito da pré-mutação do gene Fmr1 em fêmea murina sobre o início do desenvolvimento de seus embriões. Esse aspecto necessita investigação mais aprofundada / This study aimed at investigating the FMR1 gene (Fragile X Mental Retardation gene 1), regarding its relationship with primary ovarian insufficiency (Fragile X-related Primary Ovarian Insufficiency, FXPOI). In Chapter I, we present a literature review on FXPOI. The FMR1 premutation is the most frequent genetic cause of predisposition to premature ovary insufficiency (POI) and, among the POI familial cases, about 10% are associated with the FMR1 gene premutation. However, little is known about the gene expression in the mammal ovary, and the mechanisms by which the premutation causes POI remain unknown. Chapter II presents the study of the FMR1 gene expression in the human and murine adult ovaries. The enormous difficulties inherent in obtaining and studying female germ cells led us to study human granulosa cells (HGC), which are easily obtained as byproducts of in vitro fertilization procedures. We also studied the FMR1 expression in granulosa cells of mice of the CD1 strain (MGC), collected from the oviducts after ovulation induction. Granulosa cells interact functionally with oocytes during folliculogenesis, transmitting signals through the ovary and supporting growth and maturation of oocytes during the later stages of follicular growth. It is, therefore, possible that cellular changes induced by the FMR1 premutation in HGCs affect follicular growth, ovulation rate and fecundity. We standardized protocols for isolation and culture of HGCs obtained from follicular fluid and confirmed the origin of the isolated cells by the expression of HGC markers, using RT-PCR, and by the lipid nature of the cytoplasmic granules, as demonstrated by the staining with the lipophilic dye DiI. We demonstrated, by RT-PCR, that HGCs isolated from follicular fluid express the FMR1 mRNA. In mice, also by RT-PCR, we detected the Fmr1 mRNA in oocytes and in the MGCs, collected from the oviduct after ovulation hyperstimulation. Using RNA in situ hybridization on cultured HCGs, we detected the FMR1 mRNA dispersed in the cytoplasm and, in the nucleus, concentrated in regions whose features indicated to be nucleoli. This same distribution was observed in cultured fibroblasts. This probable nucleolar localization of the FMR1 transcript in these cells suggests that it constitutes messenger ribonucleoproteins for further targeting to specific cytoplasmic sites where translation occurs. We verified, by Western blotting, that HGCs express high levels of the main FMRP isoforms, with molecular mass between 60 and 95 kDa. We determined the FMRP subcellular localization in HGCs and that of Fmrp in MGCs, by immunostaining. The hybridization signals were seen scattered in fine granules in the cytoplasm of both HGCs and MGCs, in a pattern of distribution similar to that observed in neurons. In the MGC filopodia, the protein labeling was concentrated at some sites, similar to the previously described pattern of Fmrp distribution in neuronal dendritic spines of rat hippocampus, where it is part of RNA granules, promoting mRNA transport and translation control. The similar distribution pattern between neurons and MGC may reflect the similarity of FMRP function in both tissues. The induction of oxidative stress in the HGC by treatment with sodium arsenite led the protein to leave its diffuse cytoplasmic distribution to become part of perinuclear stress granules, co-localized with TIA-1, a marker of these structures. Similar results were previously obtained in HeLa cells and in rat hippocampus. These results support the hypothesis that FMRP participates in the mechanism of the transient translation arrest after stress. In Chapter III, we describe our attempts to obtain an embryonic stem cell line (ESC) from knock-in mice (KI) for the FMR1 premutation. To obtain KI embryos, wild females (WT, strain C57) were crossed with males KI (strain C57/BL6), and KI females were crossed with WT males. We planned to compare the expression of the fmr1 gene in the ESCs from the KI and WT strains, including during differentiation. We did not succeed in obtaining an ESC KI line, which can be attributed to difficulties inherent to the procedure. At follow-up of the first four days of in vitro development of embryos, changes in cleavage and developmental arrest were more frequently observed in embryos obtained from KI females. Meanwhile, the average survival rates of oocytes to blastocysts, and 8-16 cell embryos to blastocysts were not statistically different between the KI and WT females. The great variability among the numbers of blastocysts obtained per female and the small size of the KI (six females) and WT (seven females) groups indicate that these results should be interpreted with caution. Immunostaining analysis of the Fmrp in blastocysts showed a probably cytoplasmic distribution, with a granular pattern of labeling, the grains being more common in blastocysts from WT females, but coarser in blastocysts from KI females. These data are suggestive that the Fmr1 premutation in murine females affects the early development of their embryos. This aspect needs further investigation

Objetivo: Avaliar as evidências disponíveis comparando a eficácia da estimulação ovariana (EO) com uso de citrato de clomifeno (CC) e/ ou letrozol (LTZ) para reduzir o consumo de FSH, em relação à estimulação ovariana padrão (EOP). Métodos: Realizamos uma revisão sistematizada e meta-análise de ensaios clínicos randomizados (ECRs) que compararam os desfechos reprodutivos na fertilização in vitro. As buscas foram realizadas em onze bancos de dados eletrônicos e avaliamos manualmente a lista de referência dos estudos incluídos e revisões similares. Nós estratificamos os resultados separando os estudos baseados no agente oral utilizado (CC ou LTZ) e nas características da mulher incluída (em que se espera e em que não se espera má resposta ovariana). Os desfechos avaliados foram risco relativo (RR) para nascimento vivo, gravidez clínica, aborto, e taxa de cancelamento de ciclo, Peto Odds Ratio (OR) para síndrome de hiperestímulo ovariano (SHO), e diferença média (MD) para número de óocitos captados e consumo de FSH (ampolas). Resultados: Foram incluídos 22 estudos nesta revisão. Considerando o grupo de mulheres em que se espera má resposta, a evidência sugere que o uso de CC durante a estimulação ovariana resulta em similares taxas de nascidos vivos (RR= 0,9, IC95% = 0,6 a 1,2, evidência de moderada qualidade) e de gravidez clínica (RR= 1,0, IC95% = 0,8 a 1,4, evidência de moderada qualidade); o uso de LTZ não causa alteração significativa no número de oócitos captados (MD= -0,4, IC95% = -0,9 a +0,1, evidência de alta qualidade). Considerando os estudos que avaliaram mulheres em que não se esperava má resposta, a evidência sugere que o uso de CC reduz o número de oócitos captados (MD= -4,6, IC95%= -6,1 a -3,0, evidência de alta qualidade) e o risco de SHO (Peto OR= 0,2, IC95%= 0,1 a 0,3, evidência de moderada qualidade), enquanto os resultados são semelhantes para taxas de nascidos vivos (RR= 0,9, IC 95% = 0,7 a 1,1, evidência de moderada qualidade) e de gravidez clínica (RR= 1,0, IC95% = 0,9 a 1,2, evidência de alta qualidade). Para os demais desfechos a qualidade das evidências foi baixa ou muito baixa. Conclusões: A utilização de CC em mulheres em que se espera má resposta tem a vantagem de alcançar resultados reprodutivos semelhantes com redução dos custos. Para as demais mulheres, o uso do CC tem a vantagem adicional de reduzir o risco de SHO, mas também reduz o número de oócitos captados. Mais estudos seriam necessários para avaliar o efeito do LTZ com o mesmo propósito. Estudos futuros devem ter como objetivo estudar a taxa de gravidez cumulativa por oócito captado, insatisfação da paciente e aceitação para repetir o ciclo se não engravidar, que são dados importantes para a tomada de decisões clínicas. / Objective: To assess the available evidence comparing effectiveness of ovarian stimulation (OS) using clomiphene citrate (CC) and/or letrozole (LTZ) for reducing FSH consumption compared with standard OS. Methods: We performed a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials (RCTs) that compared the reproductive outcomes following in vitro fertilization. We searched eleven electronic databases and hand-searched the reference list of included studies and related reviews. We stratified the results separating the studies depending on the oral agent (CC or LTZ) and on the characteristics of the included women (expected poor ovarian response or other women). When combining the results of included studies, we assessed the relative risk (RR) for live birth, clinical pregnancy, miscarriage, and cycle cancelation, Peto Odds Ratio (OR) for OHSS, and mean difference (MD) for the number of oocytes retrieved and FSH consumption. Results: A total of 22 studies were included in this review. Considering women with expected poor ovarian response, the available evidence suggests that using CC for reducing FSH consumption during OS provide similar live birth (RR=0.9, 95%CI=0.6-1.2, moderate quality evidence) and clinical pregnancy rates (RR=1.0, 95%CI=0.8-1.4, moderate quality evidence); the use of LTZ doesn\'t cause a relevant change on the number of oocytes retrieved (MD=-0.4, 95%CI= -0.9 to +0.1, high quality evidence). Considering the studies evaluating other women, the available evidence suggests that using CC for reducing FSH consumption during OS reduces the number of oocytes retrieved (MD=-4.6, 95%CI=-6.1 to -3.0, high quality evidence) and the risk of OHSS (Peto OR=0.2, 95%CI=0.1-0.3, moderate quality evidence), while results in similar live birth (RR=0.9, 95%CI=0.7-1.1, moderate quality evidence) and clinical pregnancy rates (RR=1.0, 95%CI=0.9-1.2, high quality evidence). The quality of the evidence was low or very low for the other outcomes. Conclusion: The use of CC for reducing FSH consumption in women with expected poor ovarian response has the advantage of providing similar reproductive outcomes with reduced costs. For the other women, the use of CC for reducing FSH consumption has the additional advantage of reducing OHSS, but also reduces the total number of oocytes retrieved. More studies are necessary to evaluate the effect of LTZ for the same purpose. Future studies should aim on cumulative pregnancy per oocyte retrieval, patient dissatisfaction and agreement to repeat the cycle if not pregnant; which are important outcomes for clinical decisions.

This thesis has hypothesised that species inhabiting different environments such as coastal and estuarine areas exhibit the same reproductive strategies in terms of oocyte development, oocyte recruitment and fecundity. Thus, the ovaries of Anchoa filifera, Cetengraulis edentulus, Citharichthys spilopterus, Stellifer brasiliensis, S. rastrifer, Menticirrhus americanus, Paralonchurus brasiliensis and Diplectrum radiale were examined using histology and image processing techniques. The fishes were captured bimonthly, from June (2012) to May (2013), in the coastal of Ubatuba and in the estuary of Cananéia, inner shelf of São Paulo State, Brazil. The ovaries were removed, weighed, fixed in formalin and prepared the histological sections. All sections were photographed and the images analysed using the free software ImageJ. The results revealed that all species exhibited asynchronous oocyte development, although some differences in the oocyte development pattern among species have been recorded. The stock of pre-vitellogenic oocytes can develop and be recruited into yolked stock at any time in all species. The simultaneous hermaphrodite D. radiale has an unrestricted testicular type with cystic spermatogenesis. In this species, the accessory reproductive structure has the function to store the hydrated oocytes up to the next spawning event and absorb non-spawned oocytes. The size at which the oocytes are recruited to vitellogenesis (ORS) showed difference among species. The total number of oocytes produced per development stage did not differ significantly between the congeneric species S. brasiliensis and S. rastrifer. However, the number of advanced vitellogenic oocytes varied among gonochoristic species and increased with increasing the ovary weight, total length and weight. The mean batch fecundity ranged from 1,644 in A. filifera to 58,884 oocytes in M. americanus, whereas the mean relative BF ranged 51 in D. radiale to 1,205 oocytes g-1 in C. spilopterus. The number of potential batches in the ovaries also differed among species, ranging from 1 in A. filifera, C. edentulus and M. americanus to 4 in C. spilopterus. Thus, the hypothesis of this thesis was rejected. / A presente tese testou a hipótese de que espécies que habitam diferentes ambientes, costeiros e estuarinos, apresentam as mesmas estratégias reprodutivas em relação ao desenvolvimento ovariano, recrutamento ovocitário e fecundidade. Desse modo, ovários de Anchoa filifera, Cetengraulis edentulus, Citharichthys spilopterus, Stellifer brasiliensis, S. rastrifer, Menticirrhus americanus, Paralonchurus brasiliensis e Diplectrum radiale foram amostrados e analisados através de técnicas histológicas e de processamento de imagens. As capturas foram realizadas no período de junho (2012) a maio (2013) na região costeira de Ubatuba e no estuário de Cananéia, São Paulo, Brasil. Os ovários foram removidos, pesados, fixados em solução de formalina e obtidos os preparados permanentes. Todas as secções histológicas foram fotografadas e as imagens analisadas no programa ImageJ. Os resultados revelaram que todas as espécies apresentam desenvolvimento ovócitário do tipo assincrônico. O recrutamento ovocitário ocorre constantemente durante o período de desova das espécies. Os testículos do hermafrodita simultâneo D. radiale é do tipo irrestrito com espermatogênese cística. Nessa espécie, a estrutura acessória reprodutiva tem a função de armazenar os ovócitos hidratados até o próximo evento de desova e absorver ovócitos que não foram desovados (atresia). Os ovócitos das espécies iniciam a vitelogênese em diferentes tamanhos. O número total de ovócitos produzidos por fase de desenvolvimento não diferiram significativamente entre as espécies congêneres S. brasiliensis e S. rastrifer. No entanto, o número de ovócitos em vitelogênese avançada diferiu entre as espécies gonocóricas. A fecundidade média por lote variou de 1.644 em A. filifera a 58.884 ovócitos em M. americanus, enquanto que a fecundidade relativa variou de 51 a 1.205 ovócitos g-1 em D. radiale e C. spilopterus, respectivamente. O número de lotes potenciais presentes nos ovários também diferiu entre as espécies, variando de 1 em A. filifera, C. edentulus e M. americanus a 4 em C. spilopterus. Assim, a hipótese postulada inicialmente foi rejeitada.

O Urso-de-óculos (Tremarctos ornatus), único urso endêmico da América do Sul, é uma espécie severamente ameaçada devido à perda do seu hábitat e à caça. É importante do ponto de vista da conservação pela função que cumpre no ecossistema onde habita e pela sua relação com a cultura Andina. Por estas razões, torna-se necessária a aplicação de alternativas de conservação a espécie. Uma ferramenta alternativa de conservação é a reprodução assistida, porém, existe pouco conhecimento da reprodução desta espécie. A pouca informação sobre os padrões reprodutivos diminui a possibilidade de se estabelecer programas de reprodução bem sucedidos e torna-se mais difícil a criação de planos de conservação. O objetivo deste estudo foi caracterizar o ciclo ovariano na fêmea do Urso-de-óculos. Para tanto foi realizada a monitoração endócrina por meio da extração e dosagem de metabólitos fecais dos esteróides sexuais: estradiol e progesterona. O estudo foi realizado com amostras colhidas de seis fêmeas de T. ornatus mantidas em cativeiro em dois zoológicos da cidade de Lima, Peru, pelo período de treze meses, desde Fevereiro de 2010 até Abril de 2011. As extrações dos metabólitos fecais foram feitas no Laboratorio de Reproducción Animal, FMVUNMSM, em Lima, Peru; e foram quantificados por enzimaimunoensaio (EIE), no Instituto de Bioquímica Médica, Veterinärmedizinische Universität Wien-Áustria. Os resultados indicam que é possível descrever e monitorar a endocrinologia do ciclo ovariano em T. ornatus de forma não-invasiva através do uso de metabólitos fecais de esteroides sexuais; demonstrando que o Urso-de-óculos em cativeiro é uma espécie que conta com uma reprodução não sazonal, com fase folicular e lútea durando em média 08 e 22 dias, respectivamente. Nestas condições, apresenta em média, de três a quatro fases de atividade ovarianas por ano. Os resultados encontrados ajudarão a compreender o ciclo ovariano nos Ursos-de-óculos e facilitar o desenvolvimento de programas de reprodução assistida na espécie. / Spectacled bear (Tremarctos ornatus) is the only bear species that inhabits South America. It is an endangered species due to habitat loss and hunting. For the conservation point of view it is an important species for the ecosystem maintenance and also for their relationship with the Andean culture. For these reasons it is necessary to apply conservation alternatives for this species. Assisted reproduction is an alternative conservation tool; however, there is a lack of knowledge of the Spectacled bear reproduction. Little information about the reproductive parameters diminishes the possibility to establish a successful breeding program and make difficult the implementation of conservation plans for the species. The aim of this study was to characterize the ovarian cycle in the female Spectacled bear with noninvasive techniques for monitoring fecal metabolites of reproductive hormones (estradiol and progesterone). The study was carried out with samples collected by a 13-month period (Feb/10 to April/11), from six captive females T. ornatus kept in two zoological institutions in Lima, Peru. The metabolites extraction was carried out at Laboratory of Animal Reproduction, FMV-UNMSM, in Lima-Peru, and the hormonal analysis was performed in the Institute of Medical Biochemistry, Veterinärmedizinische Universität Wien-Austria. The results show us that it is possible to describe and realize a non-invasive monitoring of ovarian cycles in T. ornatus, with the use of fecal metabolites of sex steroids; and demonstrates that in captive conditions Spectacled bear is a non-seasonal reproduction species, with follicular and luteal phases lasting on average 8 and 22 days, respectively, whereas in captivity has on average three to four stages of ovarian activity per year. These results will help to understand the ovarian cycle in Spectacled Bear and facilitate the development of programs of assisted reproduction in the species.

This thesis has hypothesised that species inhabiting different environments such as coastal and estuarine areas exhibit the same reproductive strategies in terms of oocyte development, oocyte recruitment and fecundity. Thus, the ovaries of Anchoa filifera, Cetengraulis edentulus, Citharichthys spilopterus, Stellifer brasiliensis, S. rastrifer, Menticirrhus americanus, Paralonchurus brasiliensis and Diplectrum radiale were examined using histology and image processing techniques. The fishes were captured bimonthly, from June (2012) to May (2013), in the coastal of Ubatuba and in the estuary of Cananéia, inner shelf of São Paulo State, Brazil. The ovaries were removed, weighed, fixed in formalin and prepared the histological sections. All sections were photographed and the images analysed using the free software ImageJ. The results revealed that all species exhibited asynchronous oocyte development, although some differences in the oocyte development pattern among species have been recorded. The stock of pre-vitellogenic oocytes can develop and be recruited into yolked stock at any time in all species. The simultaneous hermaphrodite D. radiale has an unrestricted testicular type with cystic spermatogenesis. In this species, the accessory reproductive structure has the function to store the hydrated oocytes up to the next spawning event and absorb non-spawned oocytes. The size at which the oocytes are recruited to vitellogenesis (ORS) showed difference among species. The total number of oocytes produced per development stage did not differ significantly between the congeneric species S. brasiliensis and S. rastrifer. However, the number of advanced vitellogenic oocytes varied among gonochoristic species and increased with increasing the ovary weight, total length and weight. The mean batch fecundity ranged from 1,644 in A. filifera to 58,884 oocytes in M. americanus, whereas the mean relative BF ranged 51 in D. radiale to 1,205 oocytes g-1 in C. spilopterus. The number of potential batches in the ovaries also differed among species, ranging from 1 in A. filifera, C. edentulus and M. americanus to 4 in C. spilopterus. Thus, the hypothesis of this thesis was rejected. / A presente tese testou a hipótese de que espécies que habitam diferentes ambientes, costeiros e estuarinos, apresentam as mesmas estratégias reprodutivas em relação ao desenvolvimento ovariano, recrutamento ovocitário e fecundidade. Desse modo, ovários de Anchoa filifera, Cetengraulis edentulus, Citharichthys spilopterus, Stellifer brasiliensis, S. rastrifer, Menticirrhus americanus, Paralonchurus brasiliensis e Diplectrum radiale foram amostrados e analisados através de técnicas histológicas e de processamento de imagens. As capturas foram realizadas no período de junho (2012) a maio (2013) na região costeira de Ubatuba e no estuário de Cananéia, São Paulo, Brasil. Os ovários foram removidos, pesados, fixados em solução de formalina e obtidos os preparados permanentes. Todas as secções histológicas foram fotografadas e as imagens analisadas no programa ImageJ. Os resultados revelaram que todas as espécies apresentam desenvolvimento ovócitário do tipo assincrônico. O recrutamento ovocitário ocorre constantemente durante o período de desova das espécies. Os testículos do hermafrodita simultâneo D. radiale é do tipo irrestrito com espermatogênese cística. Nessa espécie, a estrutura acessória reprodutiva tem a função de armazenar os ovócitos hidratados até o próximo evento de desova e absorver ovócitos que não foram desovados (atresia). Os ovócitos das espécies iniciam a vitelogênese em diferentes tamanhos. O número total de ovócitos produzidos por fase de desenvolvimento não diferiram significativamente entre as espécies congêneres S. brasiliensis e S. rastrifer. No entanto, o número de ovócitos em vitelogênese avançada diferiu entre as espécies gonocóricas. A fecundidade média por lote variou de 1.644 em A. filifera a 58.884 ovócitos em M. americanus, enquanto que a fecundidade relativa variou de 51 a 1.205 ovócitos g-1 em D. radiale e C. spilopterus, respectivamente. O número de lotes potenciais presentes nos ovários também diferiu entre as espécies, variando de 1 em A. filifera, C. edentulus e M. americanus a 4 em C. spilopterus. Assim, a hipótese postulada inicialmente foi rejeitada.