O tratamento atual indicado para casos de envenenamentos por peçonhas é a administração intravenosa de antivenenos, produzidos através da hiperimunização de animais. Entretanto, os antivenenos disponíveis podem, algumas vezes, não proteger os pacientes e causar reações de hipersensibilidade. Fosfolipases A2 (PLA2), L-aminoácido oxidases (LAAO), metalo e serinoproteases são os principais componentes de peçonhas ofídicas e contribuem para a neurotoxicidade, hemorragia, hemólise, miotoxicidade, cardiotoxicidade e formação de edemas. Foram empregados ensaios para avaliar as atividades das enzimas presentes na peçonha de serpentes da espécie Lachesis muta rhombeata e aquele para atividade de protease foi otimizado. A tecnologia de Phage display foi empregada para a seleção de fagos-anticorpos capazes de reconhecer a peçonha bruta. Os fagos foram amplificados em Escherichia coli TG1 e usados para infectar E. coli HB2151, a qual produz fragmentos de anticorpos humanos solúveis. Estes foram purificados e utilizados em testes de inibição de alguns dos componentes tóxicos da peçonha. Os testes de atividade para PLA2, protease e Laminoácido oxidase foram padronizados com sucesso e as 3 proteínas mostraram elevada atividade enzimática. Após otimização, a quantidade de peçonha necessária para o ensaio de protease foi reduzida em 25 vezes. A massa molecular de PLA2 foi estimada em 17 kDa e as massas moleculares de proteases foram estimadas em 40, 35 e 24 kDa, através de zimogramas. O método de bio panning foi eficiente para a seleção de fagos-anticorpos contra a peçonha bruta. Diversos fragmentos de anticorpos foram purificados e incubados com a peçonha bruta para testar suas capacidades de neutralização sobre cada enzima. Cinco clones demonstraram-se hábeis em inibir a PLA2 através da inibição da hemólise. O clone 4E inibiu 100% da hemólise durante as duas horas de ensaio quando pré-incubado na proporção 2:1 (scFv:peçonha). Os clones 2C e 4E inibiram 100% durante uma hora quando pré-incubados na proporção 1:1 e os clones 2F e 9F inibiram a hemólise parcialmente. Outros testes serão conduzidos para a seleção de clones capazes de neutralizar as demais enzimas, os quais, juntamente com os clones já selecionados, serão analisados através de ensaios in vivo. Espera-se que eles possam contribuir para a construção de um novo antiveneno capaz de superar algumas das dificuldades associadas às técnicas de imunoterapia convencionais / The current treatment for animal envenoming is the intravenous administration of antivenoms, produced by animal hyperimmunization. Unfortunately, available antivenoms sometimes do not protect patients and may cause hypersensitivity reactions. Phospholipases A2 (PLA2), L-amino acid oxidases, metallo and serine proteases are considered the most important snake venom components and contribute to neurotoxicity, hemorrhage, hemolysis, myotoxicity, edematogeny and cardiotoxicity. Assays for evaluating the enzymes present in Lachesis muta rhombeata venom were developed and the protease one was optimized. Phage display technology was used to select phage antibodies able to recognize the crude venom. Phages were amplified in Escherichia coli TG1 and used to infect E. coli HB2151, which produces human antibody fragments. Inhibition tests aiming the neutralization of some toxic components of the venom were performed using purified antibody fragments. Activity assays for evaluating PLA2, protease and L-aminoacid oxidase were successfully performed and all enzymes showed high activity levels. The molecular mass of PLA2 was estimated in 17 kDa and the molecular mass of proteases were estimated in 40, 35 and 24 kDa, by zymography. After optimizing the conditions for proteolytic assay, it was possible to use 25 times less venom than it was necessary at first. The bio panning method was efficient for selecting specific phage antibodies against the crude venom. Several clones were selected to infect HB2151 and to produce soluble antibody fragments, which were purified and incubated with the venom to test their inhibition capacity over each enzyme. Five clones demonstrated ability to neutralize PLA2 by inhibiting hemolysis. The clone 4E could inhibit 100% of hemolysis for over 2 hours when preincubated at the ratio 2:1 (scFv:venom). Clones 2C and 4E could inhibit 100% for 1 hour when preincubated at the ratio 1:1 and clones 2F e 9F could inhibit partially. Other tests will be performed to select clones able to neutralize other enzymes and, together with the clones already selected, will be evaluated by in vivo experiments. It is expected that they may contribute to the construction of a potential new antivenom able to overcome some of the problems associated with conventional immunotherapy

A eletroquímica direta de enzimas redox depende da distância entre os sítios redox da proteína e a superfície do eletrodo e também da eficiência na imobilização dessas enzimas na superfície eletródica. Dessa forma, a obtenção de enzimas mais hidrofóbicas possibilita a melhora na interação entre elas e a superfície de eletrodos sólidos, como os de carbono. Neste estudo, foi desenvolvida uma rota para a obtenção da glicose oxidase oligomerizada (Ol-GOx) com o objetivo de melhorar a interação entre a enzima e a superfície de fibras de carbono, uma vez que enzimas oligomerizadas contêm suas porções hidrofóbicas expostas.Para tanto, diferentes ácidos de Brønsted foram utilizados, sendo que a enzima obtida a partir da reação com o ácido trifluorometanosulfônico (TFMS) foi a que se manteve ativa cataliticamente. A Ol-GOx se mostrou um biocatalisador promissor devido a sua hidrofobicidade e seu tamanho, os quais permitiram uma imobilização mais eficiente em superfícies de carbono. Após a caracterização estrutural, concluiu-se que a Ol-GOx é formada por um oligômero composto por 10 unidades de GOx nativa com raio hidrodinâmico de aproximadamente 96 nm. Por voltametria cíclica estudou-se a transferência direta de elétrons (TDE) entre o cofator dinucleotídeo de flavina e adenina (FAD) e a superfície das fibras de carbono, sendo observado um aumento de 7 vezes nas correntes faradaicas em relação ao obtido para a GOx nativa. Além disso, as propriedades bioeletrocatalíticas foram melhoradas em 30% quando analisada a oxidação da glicose. Concluiu-se ainda que quanto maior a quantidade de folhas-β presente na estrutura proteica, maior a TDE observada entre a enzima e a superfície das fibras de carbono. / The direct electrochemistry of redox enzymes is dependent on the distance between the active centers of the protein and the electrode surface, and also on the efficiency in the immobilization of these enzymes on the electrodic surface. Thus, the synthesis of more hydrophobic enzymes could lead to better interaction between the redox enzymes and the solid electrode surfaces, such as carbon electrodes. In this study, it was proposed a chemical route to obtain oligomerized glucose oxidase (Ol-GOx), aiming to improve the interaction between the enzyme and the surface of carbon fibers, since oligomerized proteins have their hydrophobic chains exposed. After structural characterization, it was concluded that Ol-GOx is formed by 10 dimeric units of native GOx with a hydrodynamic radius corresponding to approximately 96 nm. By cyclic voltammetry, it was studied the direct electron transfer (DET) between the flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor and the surface of carbon fibers, where it was observed an increase of 7-fold in the faradaic currents in comparison to that observed for native GOx. Besides, bioelectrocatalytic properties are 30% improved, when analyzed the glucose oxidation by cyclic voltammetry. It was also concluded that the greater the β-sheet content in protein structure, the higher the DET observed between the enzyme and the carbon fibers surface.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-06-24T17:32:03Z No. of bitstreams: 1 terciavargasdossantos.pdf: 1319000 bytes, checksum: b8f887e97d3fabf28d84847b01a29f04 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-28T13:18:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 terciavargasdossantos.pdf: 1319000 bytes, checksum: b8f887e97d3fabf28d84847b01a29f04 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T13:18:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 terciavargasdossantos.pdf: 1319000 bytes, checksum: b8f887e97d3fabf28d84847b01a29f04 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O conhecimento atual da diversidade de moluscos terrestres não leva em consideração a variabilidade intra e interespecífica, principalmente no que diz respeito a espécies de clima tropical, como é o caso de Subulina octona. A associação entre análises morfométricas e moleculares, ambas inéditas para estudos em S. octona, tem permitido a identificação de táxons e a compreensão de suas relações. No presente estudo, foi observada variabilidade na concha, no sistema reprodutor, na coloração corporal e na estrutura molecular com base na COI do DNA mitocondrial de populações de S. octona. A análise morfométrica ao longo do desenvolvimento demonstrou que a variabilidade intrapopulacional diminuiu ao longo do desenvolvimento dos moluscos e foi maior nas populações com dois fenótipos de coloração corporal. O componente que melhor explicou a variabilidade na maior parte da vida foi o comprimento da concha, seguido pela largura da abertura. Como a distância geográfica não explicou a variação na forma da concha, acredita-se que possa estar havendo um considerável fluxo gênico por ação antrópica e que a seleção esteja atuando modelando os padrões morfométricos na espécie. O fato de os padrões de crescimento e a forma final da concha na idade adulta terem variado entre populações mesmo em condições idênticas de criação, demonstra o importante papel da determinação genética. A anatomia do sistema reprodutor foi semelhante entre populações, mas a morfometria foi variável entre indivíduos e entre populações. Dentro das populações a porção masculina do sistema reprodutor foi mais variável que a feminina, conforme esperado para estruturas que sofrem seleção sexual. Já entre populações, a maior diferença foi observada na porção feminina. O sistema reprodutor foi mais variável que a concha, porém apresentando compatibilidade entre as populações quanto à forma das estruturas. A diferenciação morfométrica e fenotípica para coloração corporal não foram corroboradas pela variação molecular uma vez que indivíduos com mesmo haplótipo COI foram variáveis para concha e cor da massa cefalopodal. O modelo de evolução neutra das sequências foi aceito para as amostras analisadas apesar de nem todas as mutações serem silenciosas, destacando o papel da deriva na evolução da espécie. A baixa variabilidade de algumas populações pode ser reflexo da forte endogamia, devido à baixa capacidade de dispersão e capacidade de autofecundação da espécie, a despeito do fluxo gênico via dispersão passiva por ação antrópica. Foi observada estruturação genética para uma das populações, por apresentar um haplótipo exclusivo e formação de uma linhagem diferenciada no dendrograma de Máxima Verossimilhança. As diferentes linhagens apresentaram diferenças morfométricas para estruturas reprodutivas que evidenciam a evolução independente das linhagens. Tais observações devem ser investigadas com mais detalhes a fim de confirmar a existência de espécies crípticas. A análise da diversidade encontrada no presente estudo forneceu ainda subsídios para pesquisas posteriores que visem esclarecer sobre a origem de S. octona. / Current knowledge of the diversity of terrestrial molluscs does not take into account the intraand interspecific variability, particularly with regard to species from tropical climates, as is the case of Subulina octona. The association between morphometric and molecular analysis, which remain unpublished for studies in S. octona, has allowed the identification of taxa and understanding of their relationships. In the present study, we observed variability in the shell, reproductive system, body color and molecular structure based on COI of mitochondrial DNA between populations of S. octona. Morphometric analysis along development showed that within-population variability decreased during the development of molluscs and was higher in populations with two body color phenotypes. The best component to explain the variability in most of lifetime was the shell length, followed by the opening width. Because the geographic distance does not explain the variation in shell shape, we believe that there may be considerable gene flow favored by human activities and that the selection may be shaping the morphometric patterns in this species. The interpopulation variation in growth patterns and shell shape in adulthood, even under identical rearing conditions, shows the important role of genetic determination. The anatomy of reproductive system was similar between populations, but the morphology was variable between individuals and populations. Within populations, the male portion of the reproductive system was more variable than the female portion, as expected for structures that are under sexual selection. Among populations, the largest difference was observed in the female portion. The reproductive system was more variable than the shell, but showed interpopulation compatibility for the shape of structures. Morphometric and body color phenotypic differentiation were not corroborated by molecular variation since individuals with the same COI haplotype were variable to shell shape and color head-foot mass. The neutral evolution model of sequences has been accepted for the samples analyzed even though not all mutations are silent, highlighting the role of drift in the species evolution. The low variability of some populations may reflect the strong inbreeding due to low dispersal ability and capacity of selfing species, in spite of gene flow via passive dispersal by human activities. We observed a genetic structure of populations, because it presents a unique haplotype and form a distinct lineage in the maximum likelihood dendrograma. Different lineages showed morphometric differences in reproductive structures, which show their independent evolution. These observations must be investigated in more detail to confirm the existence of cryptic species. The analysis of the diversity found in this study also provided grants for further research aimed at shedding light on the origin of S. octona.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Depression is a psychiatric disorder associated with a negative impact on quality of life. Monoaminergic system has been involved in this disease and in the action of antidepressants. This study aimed to investigate the potential antidepressant-like of 7-fluoro-1,3-diphenylisoquinoline-1-amine (FDPI) and the possible involvement of monoaminergic system. Results showed that FDPI (1, 10 and 20 mg/kg, intragastric (i.g.)) reduced the immobility time, increased swimming time, but did not alter climbing time of mice in the modified forced swimming test (FST). These effects were similar to those of paroxetine (8 mg/kg, intraperitoneally (i.p.)), a selective serotonin reuptake inhibitor, which was used as positive control. Pretreatments with p-chlorophenylalanine (pCPA, an inhibitor of serotonin (5-HT) synthesis, 100 mg/kg, i.p., once a day for 4 consecutive days), N-[1]-N-(2-pyridinyl) cyclohexanecarboxamide (WAY 100635, a 5-HT1A receptor antagonist, 0.1 mg/kg, subcutaneous injection (s.c.)) and ondansetron (a 5-HT3 receptor antagonist, 1 mg/kg, i.p.) reversed the antidepressant-like effect of FDPI at the dose 1 mg/kg in FST, this did not occurs with ritanserin (a 5-HT2A/2C receptor antagonist, 1 mg/kg, i.p.). Antagonist related with dopaminergic system, as haloperidol (a D2 receptor antagonist, 0.2 mg/kg, i.p.) and SCH23390 (a D1 receptor antagonist, 0.05 mg/kg, s.c.) were able to reverse the antidepressant-like effect of FDPI at the dose 1 mg/kg in FST, this did not occurs with sulpiride (a D2 and D3 receptors antagonist, 50 mg/kg, i.p.). FDPI, at doses of 10 and 20 mg/kg, inhibited monoamine oxidase-B activity in prefrontal cortex of mice. These results suggest that FDPI produced an antidepressant-like action in the FST in mice, possibly by an involvement of the monoaminergic system. Additional studies are necessary in order to propose FDPI as a drug for depression treatment. / A depressão é uma doença psiquiátrica associada com um impacto negativo na qualidade de vida. O sistema monoaminérgico parece estar envolvido nessa doença e na ação dos antidepressivos. Esse estudo teve como objetivo investigar o potencial do tipo antidepressivo do 7-flúor- 1,3 difenilisoquinolina-1-amino (FDPI) e o possível envolvimento do sistema monoaminérgico. Os resultados mostraram que o FDPI (1, 10 e 20 mg/kg, intragástrico (i.g.)) reduziu o tempo de imobilidade, aumentou o tempo de nado, mas não alterou o tempo de escalada dos camundongos durante o teste do nado forçado (TNF) modificado. Esses efeitos foram similares aos da paroxetina (8 mg/kg, intraperitoneal (i.p.)), um inibidor seletivo da recaptação de serotonina, o qual foi usado como controle positivo. Os pré-tratamentos com p-clorofenilalanina (pCPA, um inibidor da síntese de serotonina (5-HT), 100 mg/kg, i.p., uma vez por dia, por 4 dias consecutivos), N-{2-[4-(2-metoxifenil)-1-piperazinil]etil}-N-(2-piridinil) ciclohexanocarboxamida (WAY 100635, um antagonista dos receptores 5-HT1A, 0,1 mg/kg, subcutâneo (s.c.)) e ondansetrona (um antagonista dos receptores 5-HT3, 1 mg/kg, i.p.) conseguiram reverter o efeito do tipo antidepressivo do FDPI na dose de 1 mg/kg no TNF, o que não aconteceu com a ritanserina (um antagonista do receptores 5-HT2A/2C, 1 mg/kg, i.p.). Antagonistas relacionados com o sistema dopaminérgico, como haloperidol (um antagonista do receptor D2, 0,2 mg/kg, i.p.), e SCH23390 (um antagonista do receptor D1, 0,05 mg/kg, s.c.) foram capazes de reverter o efeito do tipo antidepressivo do FDPI na dose de 1 mg/kg no TNF, o que não aconteceu com o sulpiride (um antagonista dos receptores D2 e D3, 50mg/kg, i.p.). O composto FDPI nas doses de 10 e 20 mg/kg inibiu a atividade da monoamino oxidase B em córtex pré-frontal de camundongos. Estes resultados sugerem que o FDPI apresentou uma ação do tipo antidepressiva no TNF em camundongos, possivelmente por um envolvimento do sistema monoaminérgico. Mais estudos se fazem necessários antes que se possa propor o FDPI como uma droga para o tratamento da depressão.

Em quadros mais avançados da insuficiência cardíaca (IC), além do comprometimento do miocárdio, observa-se uma importante perda de massa muscular esquelética, a qual contribui para o mau prognóstico e orbimortalidade dos pacientes. As espécies reativas de oxigênio (ROS) parecem estar diretamente envolvidas no desenvolvimento e progressão da atrofia muscular em doenças crônico-degenerativas. De fato, já é sabido que a IC está associada ao estresse oxidativo na musculatura esquelética, o qual parece contribuir para o catabolismo proteico culminando em atrofia muscular na síndrome, apesar desta relação de causa e efeito ainda ser pouco investigada. No entanto, as fontes envolvidas na produção exacerbada de ROS na musculatura esquelética em ratos com infarto do miocárdio ainda não foram caracterizadas. Como a NADPH oxidase é um complexo enzimático especializado em produzir ROS, e sabendo que esta família de enzimas pró-oxidantes é ativada for agentes pró-inflamatórios e alguns agonistas de receptores acoplados à proteína G que estão aumentados na IC, na primeira parte do projeto de pesquisa testou-se a hipótese de que as NADPH oxidases estariam hiperativadas nos músculos plantar e sóleo de ratos submetidos ao infarto do miocárdio, contribuindo para um quadro de estresse oxidativo e consequente hiperativação do sistema proteolítico ubiquitina proteassoma (SUP), culminando assim na atrofia deste tecido. Para testar esta hipótese, ratos Wistar foram submetidos à cirurgia de infarto do miocárdio ou Sham e, quatro semanas pós-cirurgias, foram submetidos a oito semanas de tratamento com uma substância inibidora da NADPH oxidase (apocinina) ou placebo. Foram quantificados nos músculos plantar e sóleo: níveis de mRNA de componentes da família Nox da NADPH oxidase presentes no tecido muscular, bem como a atividade desse complexo enzimático; marcadores de estresse oxidativo; atividade de enzimas antioxidantes e concentração total de glutationa; níveis de mRNA de componentes do SUP e atividade do proteassoma; e o trofismo muscular (Subprojeto 1). A segunda parte deste projeto testou a hipótese de que o treinamento físico aeróbico (TFA) previniria a hiperativação das NADPH oxidases na musculatura esquelética de ratos submetidos ao infarto do miocárdio, contribuindo para uma diminuição do quadro de estresse oxidativo e menor ativação do SUP, prevenindo assim a atrofia deste tecido. Para testar esta hipótese, ratos Sham e infartados foram submetidos a oito semanas de TFA ou permaneceram sedentários (Subprojeto 2). As variáveis estudadas foram as mesmas relacionadas ao subprojeto 1. Os resultados do subprojeto 1 demonstraram que o infarto do miocárdio em ratos promove atrofia do músculo plantar desencadeada em parte pela ativação da NADPH oxidase, promovendo uma maior produção de ROS e consequente hiperativação do SUP. Além disso, o infarto do miocárdio promove atrofia do músculo sóleo, a qual também está associada a um aumento dos níveis de ROS e da atividade do proteassoma, porém independente da ativação da NADPH oxidase. Em relação ao subprojeto 2, nossos dados também demonstram que o TFA previne parcialmente a atrofia do músculo plantar de ratos infartados, prevenindo a hiperativação da NADPH oxidase e a hiperativação do SUP induzida pelo infarto do miocárdio. Essa intervenção não farmacológica também previne a atrofia do músculo sóleo dos ratos infartados associada à redução das ROS e à redução da hiperativação do SUP induzida pelo infarto do miocárdio, porém de forma independente da atividade do complexo enzimático NADPH oxidase. Dessa forma, concluímos que a NADPH oxidase está envolvida de maneira músculo-específica com a produção de ROS levando a ativação do SUP e à atrofia muscular associada ao infarto crônico do miocárdio. O TFA é capaz de prevenir a atrofia muscular esquelética induzida pelo infarto do miocárdio associada a redução das ROS em ambos os músculos estudados. No musculo plantar, esta resposta esta relacionada a uma redução na hiperativação do complexo enzimático NADPH oxidase, ressaltando a contribuição desse complexo para a geração de ROS em músculos glicolíticos de ratos infartados. O TFA consiste em importante ferramenta não farmacológica agindo na homeostase redox e proteica no musculo esquelético de ratos infartados / Although heart failure (HF) is a syndrome of cardiac origin, it promotes significant skeletal muscle atrophy in more advanced stages, which contributes to poor prognosis and increased mortality rate. Reactive oxygen species (ROS) seem to be directly involved in the development and progression of muscle atrophy in chronic degenerative diseases. In fact, HF is associated with skeletal muscle oxidative stress, which seems to contribute to protein catabolism and muscle atrophy. However, it is important to highlight that the sources involved in the exacerbated skeletal muscle ROS production in HF have not been characterized yet. NADPH oxidase enzyme complex is an important source of ROS production activated by proinflammatory cytokines and some G-protein-coupled receptors, which are increased in HF. Therefore, in the first part of the thesis, we tested whether NADPH oxidases would be overactivated in plantaris and soleus muscles of rats submitted to myocardial infarction, thus contributing to oxidative stress and consequent ubiquitin proteasome proteolytic system (UPS) hyperactivation, ultimately leading to muscle atrophy. To test this hypothesis, Wistar rats underwent myocardial infarction or Sham surgery and, four weeks post-surgery, rats underwent eight weeks of treatment with an NADPH oxidase inhibitor (apocynin) or placebo. It was quantified in plantaris and soleus muscles: mRNA levels of skeletal muscle-NOX family, as well as NADPH oxidase activity; oxidative stress markers; antioxidant enzymes activity and total glutathione concentration; mRNA levels of UPS components and proteasome activity; and muscle trophicity (Subproject 1). In the second part of the thesis we tested whether aerobic exercise training (AET) would prevent NADPH oxidases overactivity in plantaris and soleus muscles of rats submitted to myocardial infarction, thus decreasing oxidative stress and UPS hyperactivation, preventing skeletal muscle atrophy. To test this hypothesis, Sham and infarcted rats underwent eight weeks of AET or remained sedentary (Subproject 2). The variables studied were the same as in Subproject 1. The results of the subproject 1 demonstrated that myocardial infarction in rats induces plantaris muscle atrophy triggered in part by overactivation of NADPH oxidase promoting increased ROS production paralleled by UPS hyperactivation. Moreover, myocardial infarction induced soleus muscle atrophy, which was also associated with increased ROS levels and proteasome overactivity, but independently of NADPH oxidase activation. Regarding the subproject 2, our data showed that AET partially prevented plantaris muscle atrophy in infarcted rats, preventing myocardial infarction-induced NADPH oxidase hyperactivation and UPS hyperactivation. AET also prevented soleus muscle atrophy in infarcted rats, which was associated with a ROS levels reduction and prevention of myocardial infarction-induced UPS hyperactivation, but independently of NADPH oxidase activity. Collectively, our data give support for the involvement of NADPH oxidase as a source of ROS production leading to UPS activation and skeletal muscle atrophy associated with chronic myocardial infarction, however this occurs in a muscle specific pattern. AET prevents myocardial infarction-induced skeletal muscle atrophy and exacerbated ROS levels in both plantaris and soleus muscles. In plantaris muscle, this response is related to a prevention of NADPH oxidase hyperactivation, highlighting the contribution of this enzyme complex to ROS production in glycolytic muscles of infarcted rats. Finally, AET is an important nonpharmacologic tool acting in skeletal muscle redox and protein homeostasis of infarcted rats

As células trofoblásticas provenientes de cones ectoplacentários na fase de pós-implantação expressam as subunidades do complexo NAD(P)H-oxidase de membrana p22-phox, gp91-phox, p47-phox, p40-phox, p67-phox e Rac1 previamente descritas em fagócitos e envolvidas com a atividade fagocitária destas células. Ocorre modulação da expressão das subunidades do complexo enzimático NAD(P)H-oxidase sob o estímulo com PMA, agente capaz de fosforilar a subunidade p47-phox e ativar esta enzima em fagócitos profissionais. Nossos ensaios experimentais indicam que as células trofoblásticas são capazes de gerar espécies reativas de oxigênio dependente da atividade do complexo NAD(P)H-oxidase de membrana de baixa intensidade quando não estimuladas e de forma muito mais intensa quando estimuladas pelo PMA. As características de expressão e atividade do complexo enzimático NAD(P)H-oxidase de membrana encontradas neste estudo sugerem que esta enzima é semelhante a encontrada em outros fagócitos e, desta forma possa talvez estar também envolvida com processos de defesa da interface materno-fetal. / In macrophages and neutrophils, the activation of the phagocytosis is defined by the acquisition of competence for microbicide, tumoricide and cytolytic functions resultant of generation and release of oxygen reactive species, besides the phagocytic process per se. Like these phagocytes, trophoblast cells in many species are also phagocytic. This cellular population involves completely the embryo and exhibits different and specific characteristics along the gestation. In rodents and primates, these cells are strategically positioned between maternal and fetal circulation and exhibit invasive and phagocytic activity, respectively responsible for anchorage of the embryo into the endometrium and uptake of an adequate nutritional supply for the embryo development. In rodents, these activities present a maximum degree during the implantation period, gradually declining, as the placenta develops. In the presence of strange particles at the maternal-placental interface, however, this process can be reactivated and, in this case, may be related to defense\'s mechanisms. Previous studies performed in our laboratory showed the potential of the trophoblast in producing and releasing reactive species of oxygen/nitrogen, in a very similar manner to that observed in macrophages and neutrophils. The production of such molecules is associated to different enzymes, but the localization of hydrogen peroxide on trophoblast cell surface has suggested a NAD(P)H-oxidase activity. NAD(P)H-oxidase is formed by the cytochrome b558 associated to the cellular membrane (subunits p22-phox + gp91-phox), the cytosolic subunits p47-phox, p67-phox and p40phox and, the GTPases Rac1 and Rac2 in an electron generator system that uses NADH or NADPH as substratum. Once activated, the enzymatic complex is responsible for the electron inflow to the molecular oxygen, yields superoxide anion. Thus, based on the literature and results previously obtained by our group, this study analyzed the protein and gene expression of the NAD(P)H-oxidase complex subunits respectively by immunolocalization and Westernblotting and rt-PCR, in the mouse trophoblast stimulated with PMA. Rt-PCR semi-quantitative analyses showed increase expression of the subunits p22-phox, gp91-phox, p47-phox, p67-phox, p40phox and Rac1 in PMA-treated in comparison with non treated ectoplacental cones. The expression of the subunits gp91-phox, p47-phox and p67-phox were confirmed by Western blotting and, like gene expression also increased in the presence of PMA. These subunits were mostly located in the trophoblast giant cell population, associated to the phagocytic process at the maternal-placental interface. Increased expression of such subunits may be related to an increase in the NAD(P)H-oxidase activity. To analyze this possibility and to determine the role played by NAD(P)H-oxidase activity in the reactive oxygen species produced by trophoblast cells, cellular assays were performed using the oxyethidium fluorescence, a product of dihydroethidium oxidation by superoxide anion. Thus, under PMA stimulus and antimycin A that blocks the mitochondrial NAD(P)H-oxidase activity and, apocynin and allopurinol, respectively blocking the membrane NAD(P)H-oxidase and xhantine oxidase and, still, using specific superoxide and hydrogen peroxide scavengers (superoxide dismutase enzyme and catalase) we showed the generation of reactive species of oxygen-NAD(P)H-oxidase dependent by trophoblast cells, mostly when stimulated. These results come to add important information about the potential of the trophoblast in producing reactive species at the maternal-fetal interface and, open a new investigation interest on the NADPH-oxidase regulatory processes and its involvement in defense functions of the embryo in both healthy and pathological processes that can determine the failure of the gestation.

Lesão do DNA mitocondrial (mtDNA) promove disfunção desta organela, contribuindo para a gênese do envelhecimento e fisiopatologia de doenças como aterosclerose e diabetes. A mitocôndria é a principal fonte quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células, e o complexo NAD(P)H oxidase a principal fonte de ROS envolvidas na sinalização celular. A possível inter-relação entre estas duas importantes vias produtoras de ROS não está definida. O objetivo deste estudo foi investigar o perfil de alterações na expressão e atividade da NAD(P)H oxidase de células musculares lisas vasculares (VSMC) em resposta a perturbações mínimas da função mitocondrial análogas às esperadas em doenças crônico-degenerativas vasculares. Inicialmente, validamos modelo in vitro de disfunção mitocondrial induzida por incubação de VSMC com brometo de etídio (24 - 72 h). Lesões mínimas do mtDNA foram documentadas por alterações nos produtos de amplificação (PCR) da região repetitiva da D-loop e redução da taxa de consumo de oxigênio total em ~15% vs. basal (p<0,05). Este grau de lesão não foi suficiente para induzir alterações morfológicas evidentes ou apoptose, e foi associado ao retardo de 25 - 30% no aumento de população celular induzido por soro fetal bovino. Nestas condições, não se detectou aumento da produção basal de superóxido ou mudanças nos níveis de glutationa, óxidos de nitrogênio, ou da atividade superóxido dismutase. A produção basal de peróxido de hidrogênio aumentou ~15%. Após disfunção mitocondrial, houve significativo aumento (30 - 45%) na atividade basal do complexo NAD(P)H oxidase em fração de membrana de VSMC. Entretanto, a ativação da oxidase pela AII, conhecido agonista da oxidase vascular, foi essencialmente abolida, indicando dependência funcional da ativação da oxidase com a integridade da mitocôndria. Em sintonia com esses dados, na condição basal, ocorreu aumento de expressão da isoforma Nox4 da oxidase, enquanto o aumento do mRNA da Nox1 normalmente visto após AII foi minimizado. Por outro lado, o aumento da atividade da NADPH oxidase causado pelo estressor do RE tunicamicina (indutor de Nox4) foi também abolido pela disfunção mitocondrial, entretanto, ocorreu aumento do mRNA da Nox4, indicando que as alterações funcionais da oxidase nesta situação não decorrem apenas de mudanças da expressão. Dissociação semelhante entre expressão e atividade ocorreu após exposição de 72 horas ao EtBr (i.e., durante adaptação). Nesta, ocorreu maior expressão do mRNA de Nox1 e Nox4 com AII, sem aumento da atividade da oxidase em membranas. Incubação do EtBr por 24 horas não induziu per se aumento consistente nos índices de estresse do RE e induziu inversão do padrão do tráfego subcelular da dissulfeto isomerase protéica (PDI), uma chaperona redox descrita recentemente como reguladora da NADPH oxidase. Após 72 horas de incubação com EtBr, a expressão de chaperonas marcadoras de estresse do RE foi bastante diminuída e o tráfego da PDI teve o padrão restaurado. Demonstramos por microscopia confocal evidências preliminares de possível co-localização entre Nox1 e mitocôndria. Estes dados sugerem uma relevante inter-relação funcional entre mitocôndria e complexo NAD(P)H oxidase, associada pelo menos a alterações de expressão e/ou tráfego subcelular de subunidades catalíticas e reguladoras desse complexo. / Mitochondrial DNA (mtDNA) damage induces dysfunction of this organelle, contributing to the genesis of aging and to the pathophysiology of diseases such as atherosclerosis and diabetes. Mitochondria are the main quantitative source of reactive oxygen species (ROS) in cells, while NAD(P)H oxidase complex is a major source of cell signaling-associated ROS. The possible crosstalk between these two relevant sources of ROS is unclear. The aim of this study was to investigate changes in activity and/or expression of vascular smooth muscle cell (VSMC) NAD(P)H oxidase in response to minor perturbations of mitochondrial function similar to those expected to occur in chronic degenerative vascular diseases. Initially, we validated an in vitro model of mitochondrial dysfunction in VSMC, through incubation with ethidium bromide (24 - 72 h). Minimal mtDNA damage after EtBr was shown by distinct amplification patterns (at PCR) of D-loop repetitive region and by ~ 15% oxygen consumption decrease vs. basal (p<0.05). Such mtDNA damage was not sufficient to induce morphologic changes or apoptosis, whereas serum-stimulated increase in cell number was prevented by 25-30%. Under those conditions, baseline superoxide production, as well as levels of glutathione or nitrogen oxides or superoxide dismutase activity were unchanged. Baseline hydrogen peroxide production increased ~15%. VSMC membrane fraction NADPH oxidase activity was increased by 30-45% after mitochondrial dysfunction. However, oxidase activation due to AII (100 nM, 4h) was markedly abrogated, indicating that A-II-driven oxidase activation requires integrity of mitochondrial function. Accordingly, there were increases in baseline mRNA expression of Nox4 oxidase isoform, while the expected increase in Nox1 by AII was minimized. On the other hand, the NADPH oxidase activity induced by the endoplasmic reticulum stressor tunicamycin (Nox4 inducer) after mitochondrial dysfunction was abrogated, however simultaneously with increased Nox4 mRNA, thus indicating that the observed functional alterations in the oxidase complex in these conditions cannot be associated only to mRNA expression changes. After VSMC EtBr incubation for 72 h, similar dissociation between expression and activity was observed, with increase in Nox 1 and Nox4 mRNA by AII, without parallel increase in membrane fraction oxidase activity. Although there was little change in ER stress markers after 24h EtBr, protein disulfide isomerase (PDI), a redox chaperone recently described by us as a novel NAD(P)H oxidase regulator, exhibited a reversal of its subcellular traffic pattern. After 72 h EtBr, the expression of ER markers was strongly decreased and normal PDI traffic was restored. Confocal microscopy suggested possible co-localization between Nox1 and mitochondria. These results suggest a functionally relevant crosstalk between mitochondria and NADPH oxidase complex associated at least to changes in expression and/or subcellular traffic of catalytic or regulatory subunits of this complex.

INTRODUÇÃO: A ativação da NADPH oxidase de neutrófilos requer o acoplamento das subunidades citosólicas p47phox, p67phox, p40phox e Rac2 ao componente de membrana citocromo b558. Em trabalhos anteriores, nós mostramos que as isoformas vasculares da oxidase são reguladas pela proteína dissulfeto isomerase (PDI), uma chaperona redox. Neste trabalho, nós utilizamos um sistema cellfree semirecombinante como ferramenta para investigar o papel da PDI na ativação da NADPH oxidase do neutrófilo. RESULTADOS: Inibidores da PDI, scrambled RNAse (100g/mL) ou bacitracina (1mM), praticamente suprimiram a geração de superóxido. Para avaliação dos efeitos do estado redox da PDI sobre a atividade da oxidase, amostras de PDI foram previamente oxidadas (H2O2; 0,5 mM) ou reduzidas (DTT; 0,5 mM). A PDI oxidada (100 nM) aumentou a produção de superóxido em aproximadamente 30%, enquanto a mesma concentração de PDI reduzida promoveu efeito inverso, inibindo a atividade do complexo. A adição de um peptídeo contendo a seqüência peptídica do sítio ativo da PDI inibiu a produção de superóxido em 70%. Dados de imunolocalização e colocalização demonstraram que a interação da PDI com a subunidade p47phox parece ser intensificada pelo estímulo com PMA e envolvem modificações do estado redox de ambas as proteínas. CONCLUSÕES: Nossos dados confirmam a associação física e funcional entre a PDI e o complexo NADPH oxidase. Além disso, sugerem que a PDI exerça um importante papel como fator de regulação redox da ativação da oxidase. / Activation of the leukocyte NADPH oxidase requires the assembly of the cytosolic subunits p47phox, p67phox and p40phox and Rac2 with the membranebound cytochrome b558. We have previously shown that the vascular oxidase is regulated by the redox chaperone protein disulfide isomerase (PDI). Taking advantage of the semirecombinant cellfree system, we sought to investigate the role of PDI in the activation of neutrophil NADPH oxidase. The PDI thiol inhibitors scrambled RNase (100g/mL) or bacitracin (1mM), almost suppressed superoxide generation. In order to investigate if the redox status of PDI thiols could modulate superoxide generation, PDI was oxidized or reduced by treatment with H2O2 (0.5mM) or DTT (1mM), respectively. Oxidized PDI increased by 30% superoxide production, while reduced PDI diminished superoxide generation also in 30%. The addition of a peptide (1M) containing PDI´s exact active site sequence inhibited superoxide production by 70 %. Immuno and colocalization data demonstrated the interaction of PDI with the subunit p47phox to be intensified by PMA stimulation and to involve redox status exchange of both proteins. Our data confirm the physical and functional association between PDI and the oxidase complex. Moreover, we show a relevant role for PDI as a redoxdependent supportive factor for NADPH oxidase activation.

Assembly of cytochrome c oxidase (COX), the terminal enzyme of the mitochondrial respiratory chain, requires a concerted activity of a number of chaperones and factors for the correct insertion of subunits, accessory proteins, cofactors and prosthetic groups. Most of the fundamental biological knowledge concerning mitochondrial copper homeostasis and insertion of copper into COX derives from investigations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. In this organism, Cox17 was the first identified factor involved in this pathway. It is a low molecular weight protein containing highly conserved twin Cx9C motifs and is localized in the cytoplasm as well as in the mitochondrial intermembrane space. It was shown that copper-binding is essential for its function. So far, the role of Cox17 in the mammalian mitochondrial copper metabolism has not been well elucidated. Homozygous disruption of the mouse COX17 gene leads to COX deficiency followed by embryonic death, which implies an indispensable role for Cox17 in cell survival. In this thesis, the role of COX17 in the biogenesis of the respiratory chain in HeLa cells was explored by use of siRNA. The knockdown of COX17 results in a reduced steady-state concentration of the copper-bearing subunits of COX and affects growth of HeLa cells accompagnied by an accumulation of ROS and apoptotic cells. Furthermore, in accordance with its predicted function as a copper chaperone and its role in formation of the binuclear copper center of COX, COX17 siRNA knockdown affects COX-activity and -assembly. It is now well accepted that the multienzyme complexes of the respiratory chain are organized in vivo as supramolecular functional structures, so called supercomplexes. While the abundance of COX dimers seems to be unaffected, blue native gel electrophoresis reveals the disappearance of COX-containing supercomplexes as an early response. Accumulation of a novel ~150 kDa complex containing Cox1, but not Cox2 could be observed. This observation may indicate that the absence of Cox17 interferes with copper delivery to Cox2, but not to Cox1. Data presented here suggest that supercomplex formation is not simply due to assembly of completely assembled complexes. Instead an interdependent assembly scenario for the formation of supercomplexes is proposed that requires the coordinated synthesis and association of individual complexes.:List of Figures and Tables Abbreviations Abstract 1 Indroduction 1.1 Mitochondria and the respriratory chain 1.2 The human mitochondrial genome 1.3 Homoplasmy and heteroplasmy 1.4 Mitochondrial disorders 1.4.1 Mutations in mitochondrial DNA 1.4.2 Mutations in nuclear DNA 1.5 Cytochrome c oxidase 1.6 Cytochrome c oxidase assembly 1.7 Copper and its trafficking in the cell 1.8 Mitochondrial copper metabolism 1.9 Cox17 1.10 Aims of the thesis 2 Materials and Methods 2.1 Materials 2.1.1 Chemicals and reagents 2.1.2 Antibodies 2.1.3 Plasmid 2.1.4 Kits 2.1.5 Marker 2.1.6 Enzymes 2.1.7 Primers 2.1.8 siRNAs 2.2 Methods 2.2.1 Cell culture 2.2.1.1 Cell culture: HeLa cells 2.2.1.2 Cell culture: HeLa cells transfected with pTurboRFP-mito 2.2.1.3 Subcultivation 2.2.1.4 Determination of cell number 2.2.1.5 Cell storage and thawing 2.2.2 Transient transfection of HeLa cells 2.2.3 Transfection of HeLa cells with pTurboRFP-mito 2.2.4 Immunocytochemistry 2.2.5 RNA extraction and quantitative real-time PCR 2.2.6 Isolation of mitochondria 2.2.6.1 Isolation of mitochondria for BN-PAGE Analysis 2.2.6.2 Isolation of mitochondria for localization studies 2.2.6.3 Isolation of bovine heart mitochondria 2.2.7 Proteinase K treatment of mitochondria and mitoplasts 2.2.8 Photometric activity assay 2.2.8.1 Citrate synthase activity 2.2.8.2 Cytochrome c oxidase activity 2.2.9 Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) 2.2.9.1 In gel activity assay 2.2.9.2 2D-BN/SDS-PAGE 2.2.10 SDS-PAGE and Western blot analysis 2.2.11 Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) 2.2.12 Flow cytometric phenotyping 2.2.12.1 Determination of cell cyle phase 2.2.12.2 Identification of apoptotic cells 2.2.12.3 Detection of ROS 2.2.13 Oxygen measurement 2.2.14 Cu–His supplementation 3 Results 3.1 Subcellular localization of Cox17 3.2 Transient knockdown of COX17 in HeLa cells 3.2.1 Knockdown of COX17 mRNA 3.2.2 Knockdown of Cox17 protein 3.2.3 Effect of COX17 knockdown on the steady-state levels of OXPHOS subunits 3.2.4 Effect of COX17 knockdown on the steady-state levels of copperbearing COX subunits 3.2.5 Subdiffraction-resolution fluorescence imaging 3.3 Phenotypical characterization 3.3.1 Growth analyis 3.3.2 Cell cycle analysis 3.3.3 Apoptosis assay 3.3.4 Detection of ROS 3.3.5 Oxygen measurement 3.4 Cytochrome c oxidase activity 3.5 Characterization of mt OXPHOS complexes 3.5.1 BN-PAGE/in gel activity assays 3.5.2 Supramolecular organization of COX 3.5.3 Molecular organization of Cox17 3.5.4 Molecular organisation of copper-bearing COX subunits Cox1 and Cox2 3.5.5 Supramolecular organization of RC complexes 3.5.6 dSTORM of supercomplexes 3.6 Copper supplementation 4 Discussion 4.1 Dual localization of human Cox17 4.2 COX17 knockdown affects steady-state levels of copper-bearing COX subunits Cox1 and Cox2 4.3 Supramolecular organization of RC is affected as an early response to COX17 knockdown 4.4 Cox17 is primarily engaged in copper delivery to Sco1/Sco2 4.5 Copper supplementation alone cannot rescue the COX17 phenotype 4.6 Outlook 5 Appendix 6 PhD publication record 7 References

Carotid artery stenosis (CAS) develops from atherosclerotic lesions and plaques. Plaque rupture or stenosis may result in occlusion of the carotid artery. Accordingly, the asymptomatic disease becomes symptomatic, characterized by ischemic stroke or transient ischemic attacks, indicating an urgent need for better understanding of the underlying molecular mechanisms and eventually prevent symptomatic CAS. NOX4, a member of the NADPH oxidase family, has anti-atherosclerotic and anti-inflammatory properties in animal models of early atherosclerosis. We hypothesized that NOX4 mRNA expression is linked to protective mechanisms in CAS patients with advanced atherosclerotic lesions as well. Indeed, NOX4 mRNA expression is lower in patients with symptomatic CAS. A low NOX4 mRNA expression is associated with an increased risk of the development of clinical symptoms. In fact, NOX4 appears to be linked to plaque stability, apoptosis and plaque hemorrhage. This is supported by cleaved caspase-3 and glycophorin C and correlates inversely with plaque NOX4 mRNA expression. Even healing of a ruptured plaque appears to be connected to NOX4, as NOX4 mRNA expression correlates to fibrous cap collagen and is reciprocally related to MMP9 activity. In conclusion, low intra-plaque NOX4 mRNA expression is associated with an increased risk for symptomatic outcome and with reduced plaque stabilizing mechanisms suggesting protective effects of NOX4 in human advanced atherosclerosis.