Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O cloroplasto à uma organela caracterÃstica dos organismos fotossintetizantes sendo seu papel primordial na geraÃÃo de energia a partir de gÃs carbÃnico e Ãgua. Essa organela pode ter seu funcionamento comprometido quando submetida a estresses ambientais devido a fragilidade e complexidade do sistema. Para evitar perdas provocadas pelo estresse existem vÃrios mecanismos de adaptaÃÃo e regulaÃÃo das reaÃÃes que ocorrem no cloroplasto. Recentemente caracterizou-se mais um desses provÃveis mecanismos que foi chamado de clororespiraÃÃo. A clororespiraÃÃo foi esclarecida com a descoberta de uma enzima similar a oxidase alternativa da mitocondria que chamou-se de oxidase terminal do plastÃdeo (PTOX). A funÃÃo dessa respiraÃÃo do cloroplasto permanece incerta, mas uma das hipÃteses mais aceitas à que o funcionamento da clororespiraÃÃo poderia prevenir a formaÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio atravÃs da reciclagem dos intermediÃrios redutores do cloroplasto. No presente trabalho foi caracterizado a presenÃa de dois genes que codificam para a oxidase terminal do plastÃdeo em plantas de Zea mays. Estudou-se tambÃm a expressÃo diferencial de ambos genes da PTOX em resposta ou estresse hÃdrico, alÃm da caracterizaÃÃo da clororespiraÃÃo atravÃs da atividade da NADH desidrogenase plastidial (NDH) em gel de poliacrilamida. A caracterizaÃÃo molecular dos genes da PTOX mostrou homologia de 60% quando comparadas as sequÃncias dos genes e de 79% quando comparadas as prÃ-proteÃnas traduzidas. Os genes dessa proteÃna tÃm estruturas similares, sendo compostos por oito introns e 9 Ãxons. Um estudo das regiÃes dos promotores dos genes mostrou que existiam elementos comuns porÃm a presenÃa de elementos diferentes como, o elementos cis MBS que à responssivo à seca, poderia revelar uma regulaÃÃo diferencial dos genes. A resposta diferencial foi confirmada atravÃs de RT-PCR semiquantitativo. O gene chamado de ptox1 teve sua expressÃo estÃvel, podendo ser considerado um gene constitutivo, enquanto que o gene chamado de ptox2 teve um aumento da expressÃo proporcional ao estresse aplicado tanto em folhas como em raÃzes de plantas de milho. A anÃlise da atividade da NDH em gel (zimograma) revelou a presenÃa dessa enzima em cloroplastos de milho confirmando a presenÃa das enzimas da clororespiraÃÃo. O estudo filogenÃtico de sequencias de cDNA de bancos de dados mostraram que milho e sorgo pertencentes ao grupo das monocotiledÃneas, sÃo espÃcies muito prÃximas e que compartilham dois genes ortÃlogos da PTOX identificados como ptox1 e ptox2. Concluiu-se pela primeira vez a presenÃa de dois genes da PTOX no genoma do milho, uma monocotiledÃena de metabolismo C4. Os genes foram denominados de ptox1 e ptox2. Eles foram encontrados em raÃzes e folhas e apenas o gene da ptox2 pareceu ser induzido em resposta ao estresse osmÃtico. / The chloroplast is an organelle characteristic of photosynthetic organisms and their role in generating energy from carbon dioxide and water. This organelle may be functionally compromised when subjected to environmental stress due to the fragility and complexity of the system. To avoid losses caused by stresses plants have evolved various coping mechanisms, as well as, regulation of the reactions that occur in the chloroplast. Most recently it was characterized one of these mechanisms that was called chlororespiration. The chlororespiration was bring to light with the discovery of an enzyme, similar to the alternative oxidase of mitochondria, that was called the plastid terminal oxidase (PTOX). The function of this chloroplast respiration remains uncertain, but one of the most accepted hypothesis is that the operation of chlororespiration could prevent the formation of reactive oxygen species by recycling the reducing intermediates of the chloroplast. The present study characterized the presence of two genes encoding the plastid terminal oxidase in plants of Zea mays., and its differential expression in response to water stress. It was also characterized the chlororespiration through the activity of plastidial NADH dehydrogenase (NDH) in polyacrylamide gel. The molecular characterization of PTOX genes showed 60% homology when compared sequences of genes, but 79% when compared to pretranslated proteins. The genes of this protein have similar structures, being composed of nine exons and eight introns. A study of regions of the promoters of the genes showed that there were common elements, but the presence of different elements such as the cis elements that MBS responsive to drought, could reveal a differential regulation of genes. The differential response was confirmed by semiquantitative RT-PCR. The gene called ptox1 had its expression level stable and could be considered a constitutive gene, while the gene called ptox2 had an increased expression proportional to the applied stress in both leaves and roots of maize plants. The analysis of NDH activity gel (zimograms) revealed the presence of this enzyme in maize chloroplasts suggesting the existence of the chlororespiratory pathway. The phylogenetic analysis of cDNA sequences from NCBI databases showed that maize and sorghum, being closely related species, share two genes )identified as orthologs of PTOX (ptox1 and ptox2). It was confirmed for the first time the presence of two PTOX genes in the genome of maize, a C4-metabolism monocotyledon and its differential expression under drought stress.

O amido resistente de milho (ARM) não é digerido em humanos fornecendo benefícios para a saúde tais como redução do colesterol, do índice glicêmico e fermentação no cólon. Porém, a substituição parcial de farinha de trigo (FT) por ARM em massa de pão resulta na diluição do glúten prejudicando a qualidade do produto. Massa de pão foi produzida com 12,5 g/100g de ARM e os efeitos das enzimas glicose-oxidase (Gox), tranglutaminase (TG) e xilanase (HE) na massa foram estudados. Massa produzida sem ARM e sem enzimas foi considerada padrão e massa produzida com ARM e sem enzimas foi considerada controle para comparação. Uma metodologia foi desenvolvida para medir o torque durante o amassamento em grande escala, utilizando um reômetro dinâmico adaptado. As propriedades reológicas foram avaliadas nos testes de medidas descritivas de textura, adesividade Chen-Hoseney, extensão uniaxial Kieffer, extensão biaxial e testes oscilatórios em reômetro. Pão produzido de acordo com as formulações padrão, controle e ótima foi avaliado com relação ao volume específico (VEP), firmeza do miolo, cor e análise sensorial para o atributo preferência. As três enzimas testadas influenciaram positivamente o torque máximo atingido durante o amassamento que variou entre (8,36 e 9,38) N m. Gox e TG apresentaram efeito positivo na altura máxima desenvolvida pela massa medida em reofermentógrafo enquanto que o efeito da HE foi negativo. Uma formulação com ARM e enzimas apresentou desempenho de panificação similar a massa padrão (altura máxima ajustada igual a (45,5 ± 3,9) mm), correspondente a adição de (4, 2,5 e 0,5) mg/100g de TG, Gox e HE respectivamente (ótima). A formulação ótima apresentou adesividade, trabalho de adesão, coesividade, dureza, resiliência, resistência à extensão e extensibilidade similares a massa padrão e diferentes da massa controle. As enzimas aumentaram o índice de strain hardening reduzido pela adição de ARM. Para o pão de forma, o VEP variou entre (3,16 e 3,64) cm3/g (diferença não significativa) e o pão produzido com a formulação ótima foi o mais escolhido como preferido. Durante o armazenamento por até 7 dias, o ARM diminuiu a taxa de envelhecimento do pão enquanto que as enzimas apresentaram efeito oposto. Em geral, a substituição parcial de FT por ARM reduziu a elasticidade da massa diminuindo a qualidade do pão enquanto que as enzimas minimizaram esse efeito. / Resistant starch (RS) is not digested by humans providing benefits for health such as reduction of blood LDL cholesterol levels, reduction of post-prandial blood glucose and fermentation in the colon. However, partial replacement of wheat flour (WF) with RS prejudices bread quality due to gluten dilution. Dough was formulated with 12.5 g/100g of RS and the effects of the enzymes glucose-oxidase (Gox), tranglutaminase (TG) and xylanase (HE) were studied. Dough produced without RS or enzymes was considered as regular and dough produced with RS and without enzymes was considered as control for comparison. A methodology was developed to measure torque during dough mixing in large scale using a dynamic rheometer. With respect to dough rheology, tests performed included texture profile analysis, Chen-Hoseney stickiness, Kieffer uniaxial extension, biaxial extension and oscillatory tests in rheometer. Bread was produced from regular, control and optimum formulations and the quality was assessed concerning specific volume, firmness, color and preference by sensory panel. The three enzymes tested influenced positively the maximum torque during mixing which varied between (8.36 and 9.38) N m. Gox and TG showed positive effects on the maximum height developed by dough measured in rheofermentometer while HE showed a negative one. A formulation with RS and baking performance similar to regular dough was found (adjusted maximum height equal to (45.5 ± 3.9) mm), corresponding to (4, 2.5 and 0.5) mg/100g of TG, Gox and HE respectively (optimum). The optimum formulation showed stickiness, work of adhesion, cohesiveness, hardness, resilience, resistance to extension and extensibility, similar to the regular dough and statistically different from control dough. Strain hardening index was reduced by the addition of RS and increased by the addition of enzymes. Regarding bread tests, specific volume of bread varied between (3.16 e 3.64) cm3/g (not significant difference) and the bread produced with theoptimum dough was the most preferred by the sensory panel. During 7 days of storage, RS reduced the aging rate while enzymes had the opposite effect. In general, WF replacement by RS reduced dough elasticity affecting the bread quality while enzymes helped minimizing this effect.

Foi estudado o efeito da lactona sesquiterpênica licnofolido sobre o \"burst\" respiratório de leucócitos polimorfonucleares inflamatórios (PMN) estimulados por forbol (PMA), pelo peptídeo quimiotático fMLP ou zimozan opsonizado (OZ). O licnofolido inibiu de forma dose-dependente a liberação de O2•- pelos PMN, sem alteração do período \"Iag\" do complexo NADPH. oxidase. O efeito foi mais acentuado quando os PMN foram estimulados diretamente pela via de proteína quinase C. A adição de ditiotreitol ou glutationa reduzida (GSH) às suspensões celulares antes da incubação com licnofolido preveniu parcialmente o efeito inibitório. O tratamento dos PMN com a lactona determinou uma queda drástica dos níveis celulares de GSH livre, sem incremento de glutationa oxidada (GSSG). A reação direta entre GSH e licnofolido foi confirmada com a detecção de um aduto glutationil-licnofolido através de identificação por espectrometria de massa (ESI-MS/MS). A S-tiolação protéica induzida pelo PMA foi reduzida em PMN tratados com Iicnofo/ido, como detectado através de determinação de incorporação de [35S], sendo que 80% desses tióis foram identificados como GSH. Uma série de proteínas S-glutationadas foi detectada através de autoradiografias, sendo que aquelas correspondentes a 38 e 24 kDa tiveram essa modificação póstraducional suprimida pelo tratamento com dose de licnofolido capaz de suprimir o \"burst\" respiratório dos PMN. Estes resultados indicam que a depleção celular de GSH causada pelo licnofolido impede a sustentação do \"burst\" respiratório pelos PMN, em correlação direta com a diminuição de S-glutationação protéica. / An investigation was made into the action of the sesquiterpene lactone lychnopholide on the respiratory burst of inflammatory polymorphonuclear leukocytes. Lychnopholide determined concentration-related inhibition of the generation of phorbol 12-myristate 13-acetate-, chemotatic peptide-, and opsonized zymozan-induced superoxide anion with no effect on the lag time of the assembly of the NADPH oxidase complex, such action was greater on the protein kinase C pathway that on both membrane receptor dependent stimuli via. Subsequent additions of D-glucose, Ca2+, Mg2+, dithiothreitol ar reduced glutathione (GSH) did not reverse the inhibitory action. The addition of both thiols prior to the lychnopholide treatment partially hindered the inhibition rate. The endogenous level of GSH in leukocytes was drastically depleted under the lychnopholide treatment, without corresponding increases occurring in the oxidized form (GSSG). A direct reaction between glutathione and lychnopholide was confirmed from a glutathionyl-lychnopholide adduct detected by electrospray mass spectrometry analysis and identified by tandem mass analysis in cellular extracts. Protein S-thiolation induced by PMA stimulation was decreased in lactone-treated PMN as detected by [35S] scintillation count, which indicated that about 80% of the thiols were glutathione. A subset of S-glutathionylated proteins was identified through gel electrophoresis, which revealed that the modification of the phorbol-triggered protein sulfhydryl in the protein bands corresponding to 38 and 24 kDa was precluded by the lychnopholide treatment correlated with respiratory burst inhibition. These results show that GSH depletion determined by lychnopholide treatment renders PMN to sustain respiratory burst, whose action is proportional to protein S-glutahionylation decrease.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa caracterizada citogeneticamente pela presença do cromossomo Philadelfia (Ph) e molecularmente pelo neogene bcr-abl1 que codifica a oncoproteína BCR-ABL com alta atividade de tirosina-quinase. A célula leucêmica BCR-ABL+ apresenta baixa adesão ao estroma medular, resistência à apoptose e potencial mitogênico exacerbado. A LMC possui curso evolutivo trifásico (fase crônica, acelerada e blástica) e seu tratamento pode ser realizado por meio de diferentes modalidades terapêuticas, destacando-se o mesilato de imatinibe (MI) que inibe a TK BCR-ABL induzindo altas taxas de remissão citogenética dos pacientes na fase crônica da doença. Apesar do MI ser eficiente, os pacientes na fase acelerada e blástica da doença são comumente refratários a essa terapia e na fase crônica há casos de resistência ao MI descritos. Nesse contexto, potenciais novos fármacos são investigados para melhorar a eficiência da terapia da LMC. Nesse estudo, investigamos o efeito do veneno bruto (VB) e da enzima L-amino-ácido-oxidase (LAAO) da Bothrops pirajai em desencadear apoptose em células BCR-ABL+. A apoptose das células HL-60 e HL-60.BCR-ABL foi quantificada pela detecção da percentagem de células com núcleos hipodiplóides pela da citometria de fluxo e confirmada pela observação da ativação das caspases 3, 8 e 9 por western-blot. Os resultados obtidos indicam que a LAAO é capaz de induzir apoptose em células HL-60 e HL-60.BCR-ABL por ativação das vias extrínseca e intrínseca. Além disso, foi verificado que a LAAO diminui a fosforilação de BCR-ABL em células HL-60.BCR-ABL e quando associada ao MI potencializou a inibição da atividade quinase de BCR-ABL. Os dados da presente investigação indicaram ainda que a LAAO é capaz de modular a expressão de bad, bak, bax, bid, bimel, fas,fasl, a1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w e c-flip, genes reguladores da apoptose celular. Apesar do pouco conhecimento acerca do mecanismo de ação dessa toxina, os dados obtidos sugerem que a LAAO possui o potencial de estimular a apoptose nas linhagens HL-60 e HL-60.BCR-ABL e aumentar o efeito do inibidor da atividade quinase, MI, dados relevantes para estudos futuros associados a descrição de novos fármacos contra leucemia mielóide crônica. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder cytogenetically characterized by the presence of Philadelphia chromosome (Ph) and molecularly by bcr-abl1 neogene that encodes the BCR-ABL oncoprotein with high tyrosine kinase (TK) activity. The leukemic cell BCR-ABL+ presents poor adhesion to bone marrow stroma, resistance to apoptosis and exacerbated mitogenic potential. The CML has a three-phase course (chronic, accelerated and blastic phase) and its treatment can be performed by different therapeutic modalities, especially the imatinib mesylate (IM) that inhibits the TK BCR-ABL inducing high rates of cytogenetic remission in chronic phase. Although MI is effective, patients in accelerated and blastic phases of the disease are often refractory to this therapy and there are also cases of resistance to MI described in chronic phase. In this context, potential new drugs are investigated to improve the efficiency of the therapy of CML. In this study, we investigated the effect of crude venom (CV) and of the enzyme L-amino acid oxidase (LAAO) from Bothrops pirajai in triggering apoptosis in BCR-ABL+. The apoptosis of HL-60 cells and HL-60. BCR-ABL was quantified by detecting the percentage of cells with hypodiploid nuclei by flow cytometry and confirmed by observation of the activation of caspases 3, 8 and 9 by Western blot. The results indicate that LAAO is able to induce apoptosis in HL-60 cells and HL-60. BCR-ABL by activation of the extrinsic and intrinsic pathways. Furthermore, it was found that LAAO decreases phosphorylation of BCR-ABL in HL-60 cells. BCR-ABL when associated with MI potencialized the inhibition of kinase activity of BCR-ABL. The data from this study also indicated that the LAAO is able to modulate the expression of bad, bak, bax, bid, bimel, fas, FasL, A1, bcl-2, bcl-xl, bcl-w and c-flip, regulatory genes of apoptosis. Even though there is little knowledge about the mechanism of action of this toxin, the data obtained suggests that LAAO has the potential to stimulate apoptosis in HL-60 lines and HL-60. BCR-ABL and increase the effect of the inhibitor of protein kinase activity, MI, relevant data for future studies associated with the description of new drugs against chronic myeloid leukemia.

Introdução e Objetivos: A Doença hepática gordurosa não alcóolica (DHGNA) é claramente marcada por influência ambiental, no entanto, fatores genéticos têm sido associados a progressão para formas mais graves de DHGNA. O estresse oxidativo tem sido cada vez mais enfatizado nesta evolução e o sistema NADPH parece ser uma importante fonte de produção de espécies reativas de oxigênio. O papel dos polimorfismos do sistema NADPH nessa população e sua possível relação com progressão de doença e síndrome metabólica são desconhecidos. Desta maneira, investigamos dois polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) na região reguladora dos genes que codificam a NADPH oxidase 4 subunidade catalítica (NOX4) e sua subunidade regulatória p22phox (CYBA) e sua relação com variáveis histológicas e bioquímicas em pacientes com DHGNA. Métodos: 207 pacientes com DHGNA com biópsia hepática (esteatose=27; esteato-hepatite=180), sendo (70% do sexo feminino), foram genotipados para SNPs da Nox4 (rs3017887) e CYBA -675 T/A. O DNA genômico foi extraído a partir de células do sangue periférico e a genotipagem foi realizada utilizando primers específicos e sondas fluorescentes marcadas por sequenciamento. A análise histológica foi baseada na classificação de Kleiner et al (2005). Todos os pacientes eram negativos para os marcadores de hepatites virais, doença de Wilson, hemocromatose, doenças auto-imunes e tinham ingestão diária de álcool < 100 g/semana. Resultados:Associação do CYBA -675 T/A com triglicerídeos foi observada: 176,87 ± 12,93 (TT) versus 228,70 ± 21,66 (XA), p = 0,007 . Quando a população é estratificada, a associação aparece apenas entre os pacientes que possuem esteatohepatite não alcoólica (EHNA). Foi observada uma associação do CYBA-675 T / A com HDL: 48,05 ± 1,71 (TT) vs 41,70 ± 2,91 (TA) vs 28,03 ± 9,47 mg / dL (AA), p = 0,001. Quando a população é estratificada, a associação aparece apenas entre os pacientes que possuem EHNA. Quando se estudou o SNP no gene da NOX4, observou-se associação com ALT (CA + AA: 60,10 ± 6,01 U/L vs CC: 44,23 ± 4,36 U/L; P = 0,02). Porém, quando a população foi estratificada em esteatose e EHNA não se verificou diferença estatisticamente significante na frequência dos genótipos. Não houve associação de SNPs de genes que codificam proteínas do sistema NADPH oxidase nos genes CYBA (não registrado) e Nox4 (rs 3017887) e a presença de EHNA, nos portadores de DHGNA. Quanto aos resultados clínicos, observou-se que os graus de fibrose mais avançados ocorreram em pacientes com diagnóstico de Diabetes Mellitus tipo 2 (66,9% vs 37,5%; p= 0,007), além de serem mais obesos (32,2% vs 29%; p=0,003). Além disso, os níveis séricos de glicose e insulina aumentaram significantemente, de acordo com a presença de EHNA. A frequência da SM foi significativamente maior em pacientes com EHNA. Conclusões: 1) Houve associação entre a presença do genótipo CC na Nox4 SNP com uma maior concentração de ALT na população em geral 2) Houve associação entre a presença do genótipo AA no polimorfismo do gene -675 T/A CYBA com uma maior concentração de TGL e menor de HDL, nos pacientes com EHNA 3) Houve associação entre a presença de síndrome metabólica e graus avançados de fibrose hepática em portadores de DHGNA. No entanto, a amostra deve ser ampliada para confirmar estas associações, bem como, para melhor explorar possíveis relações com escores de fibrose e inflamação / Background/Aims: Oxidative stress has been implicated in progression to severe forms of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). NADPH oxidase appears to be an important source of production of reactive oxygen species. We investigated by the first time two single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the regulatory region of genes encoding the NADPH oxidase 4 (NOX4) and p22phox (CYBA) in NAFLD. Methods: 207 biopsy-proven NAFLD patients (27 = steatosis; 180= NASH) were evaluated. Genomic DNA was extracted from peripheral blood cells and on Nox4 and CYBA polymorphisms were determined by direct sequencing of PCR. All the patients were negative for markers of viral hepatitis, Metabolic diseases, autoimmune diseases and had daily intake of alcohol < 100 g/week. Results: An association of CYBA -675 T / A with triglycerides was observed: 176.87 ± 12.93 (TT) versus 228.70 ± 21.66 (XA), mean ± SEM, p = 0.007. When the population is stratified, the association appears only among patients who have non-alcoholic steatohepatitis (NASH). An association of CYBA-675 T/A with HDL was observed: 48.05 ± 1.71 (TT) vs 41.70 ± 2.91 (TA) vs 28.03 ± 9.47 mg/dL (AA), mean ± SEM, p = 0.001. When the population is stratified, the association appears only among patients who have NASH. When the NOX4 (rs 3017887) gene was studied, there was association with ALT (CA + AA: 60.10 ± 6.01 U / L vs CC: 44.23 ± 4.36 U/L; P = 0, 02). However, when the population was stratified in steatosis and NASH, there was no statistically significant difference in the frequency of genotypes. There was no association of SNPs from genes encoding NADPH oxidase system proteins in the CYBA (unregistered) and Nox4 (rs 3017887) genes and the presence of NASH in the DHGNA carriers. Regarding the clinical results, it was observed that the most advanced degrees of fibrosis occurred in patients diagnosed with Type 2 Diabetes Mellitus (66.9% vs 37.5%, p = 0.007), in addition to being more obese (32.2% % vs 29%, p = 0.003). In addition, serum glucose and insulin levels increased significantly, according to the presence of NASH. The frequency of MS was significantly higher in patients with NASH. Conclusions: 1) There was an association between the presence of the CC genotype in the Nox4 SNP with a higher concentration of ALT in the general population. 2) There was an association between the presence of the AA genotype in the CYBA gene -675 T / A polymorphism with a higher concentration of TGL and lower HDL in patients with NASH. 3) There was an association between the presence of metabolic syndrome and advanced degrees of hepatic fibrosis in patients with NAFLD. However, the sample should be expanded to confirm these associations, as well as to better explore possible relationships with fibrosis and inflammation scores

INTRODUÇÃO: A infecção pelo vírus da hepatite C é a principal causa de doença hepática crônica que progride para cirrose e carcinoma hepatocelular. Diversos fatores relacionados ao vírus e ao hospedeiro determinam a progressão para formas mais graves de fibrose hepática. A produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) promovendo o estresse oxidativo contribui significativamente na fibrogênese hepática e pode ser gerada de múltiplas fontes, incluindo a cadeia respiratória mitocondrial, o citocromo p4502E1, peroxissomos e as NADPH oxidases (NOXs) no fígado. O sistema da NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phospate) oxidase tem uma participação muito importante na geração de EROS induzidas pelo vírus da hepatite C (VHC). Por isso, no presente estudo, investigamos dois polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) na região reguladora dos genes codificadores da subunidade catalisadora da NADPH oxidase 4 (NOX4) e sua subunidade regulatória p22phox (CYBA) e a associação deles com variáveis metabólicas e histológicas em pacientes com VHC. MÉTODOS: Cento e setenta e oito pacientes portadores do VHC e virgens de tratamento (49,3% sexo masculino; 65% VHC genótipo 1) foram analisados. Todos os pacientes tinham VHC RNA positivo e foram genotipados para os SNPs rs3017887 na NOX4 e -675 T -> A na CYBA usando-se primer e probes específicos. RESULTADOS: Nenhuma associação foi vista entre as frequências genotípicas dos SNPs da NOX4 e CYBA com marcadores de inflamação ou grau de fibrose hepática na população total estudada. A presença dos genótipos CA + AA do SNP da NOX4 SNP teve associação com menor concentração sérica da alanino aminotransferase (ALT) na população masculina (CA + AA = 72,23 ± 6,34 U/L versus CC = 100,22 ± 9,85; média ± SEM; P = 0,05). O genótipo TT do SNP da CYBA teve associação com menor concentração sérica da ALT na população masculina (TT = 84,01 ± 6,77 U/L versus TA + AA = 109,67 ± 18,37 U/L; média ± SEM; P = 0,047). Por outro lado, o alelo menor do SNP da NOX4 foi inversamente associado com a frequência de síndrome metabólica (SM) na população masculina (odds ratio (OR): 0,15; 95% intervalo de confiança (IC): 0,03 - 0,79; P = 0,025). CONCLUSÕES: Os resultados sugerem que os SNPs da NOX4 e CYBA avaliados no estudo não são marcadores genéticos diretos de fibrose hepática em pacientes portadores do VHC, entretanto o SNP rs3017887 da NOX4 poderia influir indiretamente na susceptibilidade da fibrose hepática devido a associação inversa com SM nos pacientes do sexo masculino. / BACKGROUND: The hepatitis C virus infection is the leading cause of chronic liver disease that progresses into cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Several factors related to the virus and the host determine the progression to more severe forms of liver fibrosis. The production of reactive oxygen species (ROS) promoting oxidative stress contribute significantly in liver fibrogenesis and can be generated from multiple sources, including mitochondrial respiratory chain, cytochrome p4502E1, peroxisomes and NADPH oxidases (NOXS) in the liver. Given the important contribution of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase system to the generation of reactive oxygen species induced by hepatitis C virus (HCV), we investigated in the present study, two single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the putative regulatory region of the genes encoding NADPH oxidase 4 catalytic subunit (NOX4) and its regulatory subunit p22phox (CYBA) and their relation with metabolic and histological variables in patients with HCV. METHODS: One hundred seventy eight naïve HCV patients (49.3% male; 65% HCV genotype 1) with positive HCV RNA were genotyped using specific primers and fluorescent-labeled probes for SNPs rs3017887 in NOX4 and -675 T -> A in CYBA. RESULTS: No association was found between the genotype frequencies of NOX4 and CYBA SNPs and inflammation scores or fibrosis stages in the overall population. The presence of the CA + AA genotypes of the NOX4 SNP was nominally associated with a lower alaninoamine transferase (ALT) concentration in the male population (CA + AA = 72.23 ± 6.34U/L versus CC = 100.22 ± 9.85; mean ± SEM; P = 0.05). The TT genotype of the CYBA SNP was also nominally associated with a lower ALT concentration in the male population (TT = 84.01 ± 6.77U/L versus TA + AA = 109.67 ± 18.37U/L; mean ± SEM; P = 0.047). The minor A-allele of the NOX4 SNP was inversely associated with the frequency of metabolic syndrome (MS) in the male population (odds ratio (OR): 0.15; 95% confidence interval (CI): 0.03 to 0.79; P = 0.025). CONCLUSIONS: The results suggest that the evaluated NOX4 and CYBA SNPs are not direct genetic determinants of fibrosis in HCV patients, but nevertheless NOX4 rs3017887 SNP could indirectly influence fibrosis susceptibility due to its inverse association with MS in male patients

As L-aminoácido oxidases (LAAOs) isoladas de peçonhas de serpentes são alvos de um grande número de pesquisas devido às suas inúmeras ações biológicas e farmacológicas. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar funcionalmente a Laminoácido oxidase da peçonha de Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) por meio das atividades: bactericida, fungicida, leishmanicida, tripanomicida, citotóxica, inflamatória e análise da expressão de genes e proteínas apoptóticas. A CR-LAAO mostrou-se altamente citotóxica sobre as células tumorais HepG2 e HL-60, promovendo cerca de 80% de morte celular na maior concentração testada (100 ?g/mL) e apresentou baixa toxicidade sobre células PBMC. Foi possível observar que a proteína induziu apoptose (AV+) em PBMC. Em HepG2, as menores concentrações (0,1-2,5 ?g/mL) causaram apoptose (AV+), e as maiores (5-100 ?g/mL) causaram apoptose/necrose (PI+/AV+). Em HL-60, as concentrações testadas (0,1-100 ?g/mL) induziram apoptose/necrose (PI+/AV+). A expressão do gene FAS e ativação das caspases 8 e 3 determinou a ativação da via extrínseca da apoptose na linhagem HL-60. A CR-LAAO promoveu algumas alterações na modulação do ciclo celular, sendo que nas linhagens tumorais os atrasos se concentraram nas fases G0/G1 e S do ciclo celular. Ademais, a CR-LAAO mostrouse bactericida contra as cepas S. aureus e E. coli, com maior especificidade para a cepa gram-positiva (S. aureus). Em análises de microscopia de transmissão, foi possível observar um desmantelamento da parede celular bacteriana. Após 6h de pré-incubação com C. albicans, a CR-LAAO foi capaz de inibir 80% do crescimento da levedura. A CR-LAAO mostrou-se também um bom agente leishmanicida contra as espécies L. infantum chagasi (IC50=16,66 ?g/mL) e L. braziliensis (IC50=24,47 ?g/mL) e inibiu o crescimento da forma promastigota do Trypanosoma cruzi (IC50=196,8 ?g/mL). Testes in vivo revelaram que a CR-LAAO promoveu inflamação local aguda, recrutando células inflamatórias como neutrófilos e induzindo a formação de citocinas (IL-6 e IL-1?) e mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2). Os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta potencial biotecnológico evidente, com efeitos antiparasitários, fungicida, bactericida, bem como atividade antitumoral in vitro. Dessa forma, os resultados obtidos para a CR-LAAO fornecem subsídios importantes para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas de ação direcionada, como quimioterápicos e antimicrobianos mais eficazes. / L-amino acid oxidases (LAAOs) isolated from snake venoms are targets of a large number of researches due to their numerous biological and pharmacological actions. The objective of this study was to functionally characterize the L-amino acid oxidase from the venom of Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) through the activities: bactericidal, fungicidal, leishmanicidal, trypanocidal, cytotoxic, inflammatory and analysis of gene expression and apoptotic proteins. CR-LAAO showed high cytotoxicity in HepG2 and HL-60 tumor cells, inducing about 80% cell death at the highest concentration tested (100 ?g/mL) and showing low toxicity in PBMC cells. It was observed that the protein induced apoptosis (AV+) in PBMC. In HepG2, lower concentrations (0.1-2.5 ?g/mL) caused apoptosis (AV+), while major concentrations (5-100 ?g/mL) caused apoptosis/necrosis (PI+/AV+). In HL-60, the concentrations tested (0.1-100 ?g/mL) induced apoptosis/necrosis (PI+/AV+). The FAS gene expression and activation of caspases 8 and 3 determined the activation of the extrinsic pathway of apoptosis in HL-60 cells. CR- LAAO promoted some changes in the modulation of the cell cycle, and delays in tumor cell lines were concentrated in G0/G1 and S cell cycle phases. In addition, CR-LAAO proved to be bactericidal against S. aureus and E. coli strains, with higher specificity for Gram-positive strains (S. aureus). In analyses of transmission electron microscopy, it was possible to observe a dismantling of the bacterial cell wall. After 6 hours of preincubation with C. albicans, CR-LAAO was able to inhibit 80% of growth of yeast. CR-LAAO also showed antiparasite potential against species L. chagasi infantum (IC50 = 16.66 ?g/mL) and L. braziliensis (IC50 = 24.47 ?g/mL) and inhibited the growth of Trypanosoma cruzi promastigote form (IC50 = 196.8 ?g/mL). In vivo tests revealed that CR-LAAO promotes acute local inflammation by recruiting inflammatory cells as neutrophils and by inducing the production of cytokines (IL-6 and IL-1?) and lipid mediators (PGE2 and LTB4). The results suggest that CR-LAAO presents evident biotechnological potential, with antiparasite, fungicidal, bactericidal and antitumor effects in vitro. Thus, the results obtained for CR-LAAO provide important information for the development of therapeutic strategies with directed action, such as more effective chemotherapeutic and antimicrobial agents.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa clonal caracterizada pela presença do cromossomo Philadelphia e o oncogene BCR-ABL1. Este oncogene codifica a oncoproteína Bcr-Abl com atividade tirosina-quinase constitutiva. A proteína Bcr-Abl é responsável pela resistência das células leucêmicas a apoptose. Atualmente, os pacientes com LMC são tratados com os inibidores de tirosina-quinase - mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe. Apesar de o tratamento ser eficiente, pacientes em fases avançadas e mesmo na fase crônica da doença, apresentam resistência à terapia. Desta forma, novos fármacos devem ser investigados para melhorar o tratamento da LMC. As L-aminoácido oxidases (LAAOs) têm sido descritas como substâncias citotóxicas e indutoras de apoptose. Assim, o principal objetivo do presente estudo foi investigar o potencial antitumoral da LAAO isolada da serpente Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) nas células Bcr-Abl positivas. Avaliou-se a citotoxicidade da CR-LAAO nas linhagens HL-60 (linhagem Bcr-Abl negativa), HL-60.Bcr-Abl, K562 e KCL22 (linhagens Bcr-Abl positivas) e nas células mononucleares (MNC) de sangue periférico de indivíduos saudáveis, na presença ou ausência da catalase. Para investigar os mecanismos da ação citotóxica da CR-LAAO, realizou-se os ensaios de indução de apoptose por meio da quantificação das percentagens de núcleos hipodiplóides e anexina V-FITC, nas linhagens celulares e nas células MNC de indivíduos saudáveis e pacientes com LMC. Avaliou-se também os níveis de expressão das caspases 3, 8 e 9, o potencial de membrana mitocondrial, danos no DNA e o efeito apoptótico da toxina combinada com os inibidores de tirosina-quinase nas linhagens Bcr-Abl positivas. Além disso, investigamos se a CR-LAAO foi capaz de modular a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-146a, miR-21, miR-130a e miR-130b, assim como das proteínas pro- e anti-apoptóticas Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 e Mcl-1 nas linhagens Bcr-Abl positivas. Nossos resultados mostraram que o efeito citotóxico da CR-LAAO foi mais potente nas linhagens Bcr-Abl positivas em relação às células MNC de indivíduos saudáveis, e está associado ao peróxido de hidrogênio produzido durante a reação enzimática da CR-LAAO. Demonstrou-se também que a CR-LAAO induziu apoptose nas linhagens Bcr-Abl postivas testadas e nas células MNC de pacientes com LMC na fase crônica da doença. Em todas as linhagens celulares detectou-se danos no DNA, perda do potencial de membrana e ativação das caspases 3, 8 e 9. A percentagem de apoptose aumentou quando as células HL-60.Bcr-Abl foram tratadas com a CR-LAAO combinada com os inibidores de tirosina-quinase. A CR-LAAO modulou a expressão dos apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a e miR-130b e de possíveis proteínas alvos nas linhagens Bcr-Abl positivas. Sendo assim, os resultados obtidos sugerem que a CR-LAAO apresenta uma ação antitumoral capaz de destruir as células leucêmicas / Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disease characterized by the presence of Philadelphia chromosome and BCR-ABL1 oncogene. This oncogene encodes the Bcr-Abl tyrosine kinase (TK) which presents a constitutive activity. The Bcr-Abl is responsible for leukemic cells resistance to apoptosis. The CML patients are currently treated with tyrosine kinase inhibitors (TKI) - imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib. Although TKI are efficient for CML treatment, patients in advanced phases and even in chronic phase of the disease present resistance to therapy. Thus, potential new drugs must be investigated to improve the CML treatment. The L-amino acid oxidases (LAAOs) have been described as cytotoxic and apoptosis-inducing substances. Here, we investigated the LAAO from Calloselasma rhodostoma (CR-LAAO) antitumoral potential against Bcr-Abl positive cells. We evaluated the CR-LAAO cytotoxic effect against HL-60 (Bcr-Abl negative cell line), HL-60.Bcr-Abl, K562, KCL22 (Bcr-Abl positive cell lines) and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy subjects, in the presence or absence of catalase. To investigate the mechanisms underlying the CR-LAAO cytotoxic action, we performed the apoptosis induction assays through the hypodiploid nuclei and annexin-V quantification in the cell lines and PBMC from healthy subjects and CML patients. We also evaluated the levels of caspases 3, 8 and 9 expression, the mitochondrial membrane potential, DNA damage and the apoptotic effect of CR-LAAO combined with TKI on Bcr-Abl positive cells. In addition we investigated if CR-LAAO was capable of modulating the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-29c, hsa-let-7d, miR-145, miR-146a, miR-21, miR-130a, miR-130b, miR-142-3p and miR-26a, the pro- and anti-apoptotic proteins (Bak, Bax, Bid, Bim, A1, Bcl-2, c-Flip, Ciap-2 and Mcl-1 expression in HL-60, HL-60.Bcr-Abl, K562 and KCL22 cells. Our results showed that the CR-LAAO cytotoxic effect was more potent in Bcr-Abl positive cell lines than in PBMC from healthy subjects and it is linked to hydrogen peroxide produced during the enzymatic action of CR-LAAO. It was also demonstrated that CR-LAAO was capable of inducing apoptosis in Bcr-Abl positive cell lines and CML patient\'s cells in chronic phase of the disease. In all tested cell lines, the loss of mitochondrial membrane potential, DNA damage and caspases 3, 8 and 9 activation were detected. The apoptosis percentage was improved when HL-60.Bcr-Abl cells were treated with CR-LAAO combined with TKI. The CR-LAAO modulated the apoptomiRs miR-15a, miR-16, miR-145, miR-26a, hsa-let-7d, miR-142-3p, miR-29c, miR-21, miR-130a and miR-130b expression as well the predict target proteins levels on Bcr-Abl positive cells. Thus, our results suggest that CR-LAAO presents an antitumoral action capable of destroying the CML cells.

A imobilização de moléculas de interesse biológico em superfícies sólidas é essencial para uma série de aplicações biotecnológicas. Dentre as técnicas de imobilização, a automontagem camada por camada por adsorção física possui inúmeras vantagens, incluindo condições brandas e fisiológicas de preparação, capacidade de incorporar diferentes biomoléculas, e controle molecular. Nesta tese foram explorados filmes nanoestruturados de materiais de interesse biológico, bem como modelos de membranas, em que foram empregadas a técnica de automontagem e a preparação de lipossomos. Os lipossomos, que serviram como modelos de membrana, foram imobilizados em filmes automontados e sua integridade estrutural foi mantida. Também foram utilizados para incorporar e estabilizar melanina, e então imobilizados em filmes automontados, com preservação da propriedade fluorescente da melanina. A automontagem também foi utilizada para imobilização das enzimas uricase, fitase e colesterol oxidase, alternadas com camadas de polieletrólitos. Estes filmes mostraram bom desempenho como biossensores amperométricos para uricase e fitase, e como biossensores usando espectroscopia de impedância para a fitase e colesterol oxidase. Tais biossensores foram usados para detectar baixas quantidades de ácido úrico, ácido fítico e colesterol, respectivamente. Não houve efeitos de interferentes nos sensores amperométricos devido à utilização de eletrodos previamente modificados com azul da Prússia, que funcionou como mediador redox. A alta sensibilidade e seletividade dos biossensores foram atribuídas à natureza do filme ultrafino e à capacidade de reconhecimento das biomoléculas, respectivamente. Esta abordagem abre caminho para novas tecnologias de dispositivos para diagnósticos clínicos e análises de alimentos, bem como para entender mecanismos de interação da biomolécula com a membrana celular para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. / The immobilization of molecules of biological interest on solid surfaces is essential for a number of biotechnological applications. Among the techniques for immobilization the layer-by-layer (LbL) method based on physical adsorption exhibits several advantages, including mild, physiological conditions for film preparation, ability to incorporate different biomolecules and molecular control. In this thesis, nanostructured films made with materials of biological interest were exploited as model membranes, where use was made of the LbL technique and liposomes. The latter, which served as membrane models, were immobilized in LbL films and had their structural integrity preserved. Liposomes were also used to incorporate and stabilize melanin, which were then deposited on LbL films with the fluorescence of melanin being preserved. The LbL method was also used to immobilize the enzymes uricase, phytase and cholesterol oxidase, alternated with layers of polyelectrolytes. These LbL films were employed in amperometric biosensors with uricase and phytase, and in biosensors based on impedance spectroscopy for phytase and cholesterol oxidase. Low amounts of uric acid, phytic acid and cholesterol were detected, respectively. There was no effect from interferents in the amperometric biosensors because the electrodes were previously modified with a layer of Prussian Blue, which acted as a redox mediator. The high sensitivity and selectivity were attributed to the ultrathin nature of the films and the ability of molecular recognition of the biomolecules, respectively. The approaches used here open the way for novel devices for clinical diagnostics and food quality control, in addition to understanding the interaction mechanisms between the biomolecules and the cell membranes, which is important for developing therapeutic agents.

Neste projeto, demonstramos a modulação da enzima NAD(P)H oxidase pela glicose, palmitato e interleucina - 1? através da análise da expressão protéica do componente p47PHOX e pela atividade dessa enzima via produção de superóxido e peróxido de hidrogênio. Demonstramos também a participação da enzima NAD(P)H oxidase no processo de secreção de insulina induzido pela glicose pois a inibição da enzima pelo DPI e oligonucleotídeo anti p47PHOX promoveu uma diminuição da secreção do hormônio. A partir desse dado passamos a avaliar o mecanismo de ação da enzima no processo secretório e demonstramos que a inibição dessa enzima promove uma inibição de genes essenciais no processo de secreção de insulina como GLUT-2 e glicocinase.Assim podemos concluir que a enzima NAD(P)H oxidase é modulada pela glicose, palmitato e interleucina 1? e que essa enzima participa do processo de secreção insulina modulando genes essenciais para o processo secretório como GLUT-2 e glicocinase. / The expression and activity of the componenents of NAD(P)H oxidase in pancreatic islets were described for the first time in our laboratory (OLIVEIRA, HR et ai, 2003). It was shown the gene and protein expression of the components of this enzyme in Seta cells and that enzyme activation is mediated by glucose. Glucose induced insulin secretion was followed by increase in EROS generation and this increase was in part mediated by NAD(P)H oxidase activation (the same mechanism observed in phagocytes). In this study, the modulation of NAD(P)H oxidase activity by glucose, palmitate and interleukin 1ß as investigated through protein expression of p47phox vity of this enzyme through superoxide and hydrogen peroxide production. To determinate the role of NAD(P)H oxidase in the process of glucoseinduced insulin secretion the enzyme was inhibited by DPI and oligonucleotide anti p47phox, in the both cases the enzyme inhibition produced a decrease on insulin secretion. In order to investigated NAD(P)H oxidase mechanism of action in insulin secretion, we shown that the inhibition enzyme by DPI reduced the GLUT-2 and glucokinase gene expression. We can concluded hat NAD(P)H oxidase was modulated by glucose, palmitate and interleukin 1ß and that enzyme participed in process of glucoseinduced insulin secretion through modulation of GLUT-2 and glucokinase gene expression.