Duikers are a species rich subfamily of threatened African antelope whose recent origin poses a challenge to the molecular identification of taxa and estimation of their phylogeny. I test the ability of DNA barcodes to identify all taxa within this group. I then use mitochondrial and nuclear genes to estimate a multi-locus species tree and to date divergence times. DNA barcodes are unable to distinguish many sister taxa, calling into question the utility of barcodes for the regulation of duiker trade or in identification of field-collected feces. The multi-locus phylogeny provides support for the relationships among major duiker lineages and placement of two problematic taxa, but challenges the validity of the savanna genus and identifies hybridization between taxa. This study reveals that most duikers diverged during the Pleistocene, meriting further inquiry into the role that Pleistocene glacial cycling played in the diversification and population structuring of duikers.

Oxidative phosphorylation apparatus (OXPHOS) is responsible for production of majority of ATP in mammalian organisms. This process, occurring in the inner mitochondrial membrane, is partly regulated by nuclear-encoded subunits of cytochrome c oxidase (COX), the terminal enzyme of electron transport chain. Cox4 subunit, participating in OXPHOS regulation, is an early-assembly state subunit, which is necessary for incorporation of Cox2 catalytic subunit, thus for assembly of catalytically functional COX enzyme. Moreover, regulated expression of two isoforms (Cox4i1, Cox4i2) of Cox4 subunit is hypothesized to optimize respiratory chain function according to tissue oxygen supply. However, the functional impact of the isoform switch for mammalian tissues and cells is still only partly understood. In the present thesis, unique HEK293 cell line-based model with complete absence of subunit Cox4 (knock-out, KO) was prepared employing novel CRISPR CAS9-10A paired nickase technology and further characterized. Knock-out of both isoforms Cox4i1 and Cox4i2 (COX4i1/4i2 KO clones) showed general decrease of majority of Cox subunits resulting in total absence of fully assembled COX. Moreover, detected Complex I subunits as well as the content of assembled Complex I were decreased in COX4i1/4i2 KO clones. On the...

Considerando-se a semelhança morfológica e ocorrência simpátrica de Anastrepha striata Schiner e Anastrepha bistrigata Bezzi, este trabalho propôs identificar formas para melhor caracterizá-las através de análises morfométricas do acúleo e asas de populações simpátricas e alopátricas dessas espécies, e molecular, por meio da análise de seqüências parciais do gene da citocromo oxidase I (COI). O trabalho também teve por objetivo desenvolver iniciadores espécie-específicos que possam vir a ser utilizados em estudos ecológicos em regiões em que ambas as espécies ocorram simpatricamente. As populações analisadas A. striata (seis populações) e A. bistrigata (duas populações) foram provenientes de diferentes regiões do Brasil, Colômbia e Bolívia. Para os estudos morfométricos, os acúleos e asas foram montados em lâminas para captura e análise de imagens com auxílio de câmera fotográfica acoplada ao microscópio estereoscópico, utilizando-se de software apropriado. Foram traçados e mensurados oito segmentos no acúleo e 16 na asa direita de cada indivíduo, obtendo-se assim as medidas nas quais se basearam as análises. Nos estudos moleculares, os produtos de amplificação obtidos para a COI foram seqüenciados e analisados para o estudo da caracterização molecular das diferentes populações desses insetos e desenvolvimento de iniciadores espécie-específicos. Os resultados indicam a existência clara de distinção morfométrica entre as duas espécies e confirmaram as identificações baseadas na largura e comprimento do acúleo. Os dados morfométricos mostraram também a ausência de padrões geográficos distintos entre as populações de A. striata e A. bistrigata. A. striata apresentou maior variação morfométrica entre suas populações quando comparada à diferenciação encontrada para A.bistrigata. Nas duas espécies, populações encontradas em maiores altitudes apresentaram maiores dimensões. A análise de nucleotídeos da seqüência da COI obtida para as populações de A. striata em questão indicou a ocorrência de alta similaridade entre as mesmas. As análises realizadas também indicaram que a divergência genética encontrada no fragmento da COI analisado para as diferentes populações de A. striata não permitiu o agrupamento de acordo com a distribuição geográfica dessas populações. A análise do fragmento do gene da COI permitiu o desenvolvimento de iniciadores com divergência suficiente entre as espécies em questão para permitir a amplificação de porção específica do gene da COI, que possibilita a diferenciação entre as mesmas. Os iniciadores propostos reúnem características que permitem a sua utilização em reações de PCR multiplex para a diferenciação entre espécimes de ambas as espécies. / Because of the fact that Anastrepha striata Schiner and Anastrepha bistrigata Bezzi are very similar morphologically and may also occur sympatrically, this study aimed to propose different ways to characterize them by using wing and aculeus morphometry, and mitochondrial DNA sequencing. This work also aimed to develop species-specific primers to allow for the differentiation between both species in sympatric areas. Six A. striata and two A. bistrigata populations were obtained from different regions from Brazil, Colombia and Bolivia. Specimens from different populations had their aculeus and wings removed and slide mounted for image acquisition under a stereomicroscope and morphometric analysis. Data collection for morphometry were taken for each specimen on eight segments of the aculeus and on 16 of the right wing. The molecular characterization consisted of the sequencing and analysis of a fragment of the cytochrome oxidase I (COI) gene, and the development of species-specific primers. Morphometry did not indicate any consistent variation to allow for geographical characterization of different populations, but indicated A. striata and A. bistrigata are consistently different morphologically. Populations of either species from higher altitudes were larger than the ones at lower altitudes, and A. striata displayed a much higher intraespecific variation in morphology than A.bistrigata. COI nucleotide sequences for A. striata were very similar among the populations studied, and the molecular analysis did not yield groups that were related geographically. The COI analysis allowed the development of a set of species-specific primers that were divergent enough to allow for the discrimination of A. striata and A. bistrigata in multiplex PCR reactions.

Neste trabalho, o forno de microondas focalizadas (CEM, Star System 2) e o forno de microondas doméstico adaptado (CCE, MW - 850) foram utilizados para o processo térmico descontínuo e contínuo, respectivamente para reduzir a atividade da POD e PFO presentes na água de coco. No processo descontínuo um sensor de fibra óptica permaneceu em contato direto com as amostras, o que permitiu a obtenção de perfis precisos da temperatura em função do tempo e a determinação dos parâmetros cinéticos D e z para as enzimas, no intervalo de temperatura entre 50 e 100 °C. No processo contínuo, a aquisição dos dados de temperatura foi realizada por termopar tipo T localizado na saída da cavidade do forno e alcançou temperatura máxima entre 66 e 91 °C. Para avaliar a influência dos principais constituintes químicos da água de coco na atividade enzimática soluções simuladas (água; água/açúcares; água/sais; água/sais/açúcares) e água de coco estéril com adição de POD e PFO comerciais foram submetidas ao processo descontínuo por microondas. Os parâmetros cinéticos determinados para as enzimas come rciais nas soluções simuladas obedeceram à cinética de 1ª ordem e os valores D e z foram respectivamente: PFO/água (D93°C = 16 s, z = 35,5 °C), PFO/açúcares (D91°C = 18 s, z = 33,0 °C), POD/água (D92°C = 44 s, z = 24,0 °C), POD/açúcares (D92°C = 21 s, z = 19,5 °C), PFO/água de coco estéril (D84,45ºC = 43 s, z = 39,5 °C) e POD/água de coco estéril (D86,54ºC = 20 s, z = 19,3ºC). Nas soluções simuladas com sais, as atividades iniciais das enzimas foram significativamente menores. Na água de coco as enzimas apresentaram resistência térmica maior quando comparadas aos resultados das soluções simuladas apresentando D92,20°C = 52 s e z = 17,6 °C para a PFO e D92,92°C = 16 s e z = 11,5 °C para a POD. Nos ensaios em processo contínuo a redução da atividade da PFO obedeceu à cinética de 1a ordem e os resultados corroboraram àqueles determinados para o sistema descontínuo. A POD não apresentou atividade residual detectável para temperaturas de saída acima de 88 °C, mas abaixo de 77 ºC a atividade residual foi próxima dos resultados para a POD na água de coco obtidos pelo processo descontínuo. É importante mencionar que para todos os ensaios com água de coco processada, seja no sistema descontínuo ou contínuo, não foi observada a coloração rósea, normalmente atribuída à ação enzimática. Somado a isso, o estudo mostrou que o tratamento térmico por microondas foi mais efetivo na redução da atividade da POD e PFO presentes em água de coco quando comparado com a pasteurização convencional o que torna o uso das microondas uma boa alternativa de processamento para a conservação desse alimento. / In this work a focused microwave oven (CEM, Star System 2) and an adapted domestic microwave oven (CCE, MW - 850) were employed to reduce POD and PPO activity using batch and continuous processing. In a batch processing an optic fiber sensor was kept in direct contact with the samples, thus precise temperature as a function of time profiles were obtained as well as the kinetic parameters (D and z) in the range between 50 and 100°C. In the continuous processing temperature data were obtained by type T thermocouples in the entrance and exit of the microwave oven cavity in the range between 66 and 90°C. Simulated solutions (water; water/sugars; water/salts; water/sugars/salts) and sterile coconut water were formulated with addition of commercial POD and PPO and were exposed to batch processing by microwaves to evaluate the influence of the main chemical substances present in coconut water on the enzymatic activity. Commercial enzymes in the simulated solutions followed a first order order kinetic model. D and z values were: PPO/water (D93°C = 16 s, z = 35.5 °C), PPO/sugars (D91°C = 18 s, z = 33.0 °C), POD/water (D91,5°C = 44 s, z = 24.0 °C), POD/sugars (D92°C = 21 s, z = 19.5 °C), PPO/sterile coconut water (D84,45ºC = 43 s, z = 39.5 °C) and POD/ sterile coconut water (D86,54ºC = 20 s, z = 19.3 ºC). Added salts influenced commercial PPO and POD stability and significantly reduced their activity. In coconut water the enzymes were more thermally resistant when compared to the simulated solution presenting D92,9°C = 52 s and z = 17.6 °C for PPO and D92,9°C = 16 s and z = 11.5 °C for POD. In continuous processing PPO inactivation followed a first order kinetic model and the results were similar to those obtained in the batch processing. POD didn´t present residual activity at exit temperatures above 88 ºC. Below 77 ºC residual activity was close to that of the POD/coconut water treated by batch processing. An important fact is that for all assays with coconut water, wether batch or continuous process was employed, no pink color (that is attributed to enzyme activity) was observed. Besides this study has shown that thermal treatment by microwaves was more efficient than conventional thermal treatment in reducing PPO and POD activity in coconut water, therefore microwaves are an interesting alternative for conservation of this food.

The extracellular matrix (ECM) governs many cellular processes through biochemical and mechanical cues. Particularly, the effect ECM mechanical properties on cells fate has been well established over the years. Many hydrogel systems have been used to mimic the dynamic stiffening processes occurring in ECM. However, changes in ECM stiffness does not fully recapitulate the mechanics of native ECM, as viscoelasticity is also a major factor contributing to ECM dynamic property. This thesis describes the design and characterization of an enzyme-crosslinked hydrogel system that is not only capable of being stiffened on demand, but also can be tuned to obtain viscoelasticity. The first objective of this thesis was to utilize horseradish peroxidase (HRP) to crosslink thiol-norbornene hydrogel and use mushroom tyrosinase (MT) to create secondary DOPA-dimer crosslinks that stiffened the hydrogel. The cytocompatibility of HRP-mediated thiol-norbornene gelation and the effect of stiffening on cell fate was evaluated. The second objective of this thesis represented the first step towards developing a hydrogel system whose viscoelasticity could be dynamically tuned. Thiol-norbornene hydrogel was designed to yield dynamically adaptable boronic ester bonds via partial enzymatic reaction. Thiol-norborne hydrogel was made to contain hydroxyl phenol as well as boronic acid residues within its network. MT, in this case was used to oxidize the hydroxy phenol moieties into DOPA, which then complexed with boronic acid, created dynamic bonds, introducing viscoelasticity to an initial elastic hydrogel.

Os problemas ambientais relacionados à crescente atividade industrial têm gerado preocupações aos órgãos governamentais e entidades de proteção ambientais, sendo necessários estudos de base que busquem novas alternativas para a recuperação de áreas poluídas e a solução de problemas operacionais relacionados com as técnicas empregadas. Um dos compostos mais encontrados em diversos efluentes industriais, principalmente de indústrias bioquímico-farmacêuticas, é o fenol que provoca um impacto danoso no ambiente devido ao fato de ser um poluente tóxico. O presente trabalho propõe, portanto, avaliar a oxidação e destruição do fenol através da utilização da enzima tirosinase extraída de vegetais, cujos resultados podem ser úteis para o tratamento de outros compostos fenólicos como o hormônio 17β-estradiol ou os que se encontram nos efluentes procedentes da produção de azeite (\"águas de vegetação\") após a recuperação dos polifenóis importantes como antioxidantes. A tirosinase tem a capacidade de transformar fenóis em produtos menos solúveis em água e menos danosos, permitindo assim uma agressão menor ao ambiente. Outro método de remoção do fenol também foi avaliado utilizando queratina extraída de penas de galinha, quitina e quitosana como bioadsorventes. A atividade enzimática foi determinada espectrofotometricamente com soluções de fosfato de potássio e L-tirosina. Para determinar a concentração de fenol aps a oxidação foi utilizada a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Para estudar a adsorção do fenol aplicou-se o método colorimétrico a partir das soluções de tampão borato, 4 aminoantipirina e ferricianeto de potássio e as absorbâncias foram lidas em espectrofotômetro UV-Vis a 546nm, enquanto a determinação de polifenis presentes na \"água de vegetação\" foi realizada pelo método Folin-Ciocalteu. A quantidade de tirosinase nas batatas das variedades Ágata e Galette di Bologna apresentou-se muito baixa a ponto de modificarmos a matéria prima para testes em maçã, kiwi, banana e cogumelo, mas apenas o último mostrou uma atividade bastante considerável. Assim, esta matéria-prima foi usada em ensaios a diferentes temperaturas para a estimativa dos parâmetros termodinâmicos durante da oxidação do fenol e da inativação térmica da enzima. As melhores condições da oxidação do fenol com a enzima contida no extrato de cogumelo foram: 30°C, pH 6,6, concentração de enzima 328U/mL e de fenol 100mg/L. A queratina revelou-se o melhor adsorvente para a degradação do fenol tendo mostrado remoção de 98% do mesmo em condições ótimas. / Environmental problems related to growing industrial activity have generated concerns among government entities and environmental protection, being necessary more baseline studies that seek new alternatives for the recovery of polluted areas and solution of problems related to the operational techniques employed. One of the compounds most commonly found in many industrial effluents, mainly from biochemical and pharmaceutical industries, is phenol, which causes a detrimental impact on the environment due to its toxicity. Therefore, this work proposes the oxidation and destruction of phenol using the enzyme tyrosinase, extracted from plants, whose results could be useful in the future for the treatment of other phenolic compounds such as 17β-estradiol hormone or those found in the effluent coming from the production for olive oil (\"vegetation water\") after polyphenols recovery. Such an enzyme has the ability of transforming phenols into products less soluble in water and less dangerous, thereby allowing for a minor impact on the environment. Another method of phenol removal was also evaluated using keratin extracted from chicken feathers, chitin and chitosan as phenol biosorbents. Potassium phosphate buffer and L-tyrosine solutions were used for the determination of enzymatic activity, the high performance liquid chromatography (HPLC) for the determination of phenol concentration after oxidation, and a colorimetric method making use of solutions of borate buffer, 4-aminoantipyrine and potassium ferricyanide as well as reading of the absorbance at 546nm to investigate phenol biosorption, while the presence of polyphenols in \"vegetation water\" was determined by the Folin-Ciocalteu method. The presence of the tyrosinase in potato varieties Agata and Galette di Bologna was shown to be very low, thus suggesting to change the biosorbent material. So, additional tests were done on apples, kiwi, banana and mushroom, but only the last showed a considerable activity. Therefore, only such a raw material was used in tests at variable temperature to estimate the thermodynamic parameters of both phenol oxidation and thermsal inactivation of the enzyme. The optimum conditions for the phenol oxidation by tyrosinase were: 30°C, pH 6,6, enzyme concentration 328U/mL and of phenol 100mg/L. Keratin was shown to be the best adsorbent, exhibiting under optimum conditions no less than 98% phenol removal.

Especies reativas de oxigenio/nitrogenio (ERO/ERN) produzidas por neutrofilos atraves do complexo NADPH oxidase (Nox2) estao diretamente associadas as acoes deleterias surgidas quando a inflamacao escapa do controle da homeostase. A ativacao da NADPH oxidase de neutrofilos requer o acoplamento das subunidades citosolicas aos componentes de granulos e translocacao do complexo a membrana do fagossoma. A PDI (Proteina Dissulfeto Isomerase, EC 5.3.4.1) e uma chaperona envolvida no trafego proteico celular, sendo encontrada na superficie de diversas celulas procarioticas e eucarioticas. Trabalhos previos sugeriram que PDI pode ser um dos componentes responsaveis pela montagem de Nox2, facilitando o enovelamento correto das subunidades do complexo e/ou auxiliando o transito das subunidades ate a membrana do fagossoma. Neste trabalho foi testada a atividade de Nox2 de neutrofilos inflamatorios correlacionada a atividade redutase de PDI de membrana e o efeito do nitroxido 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxil (Tempol) sobre esses processos. Neutrofilos dormentes apresentaram baixa atividade de PDI e nao foi detectado consumo de oxigenio associado ao sistema Nox2, conforme ensaios realizados com uso de um pseudo-substrato para PDI e monitoramento com eletrodo de Clark, respectivamente. Sob estimulo de forbol (PMA), os fagocitos consumiram quantidade significativa de oxigenio (6.5„b0.58 nmol.min-1) e apresentaram alta atividade de PDI, cerca de quatro vezes maior que as celulas dormentes. Quando os fagocitos foram previamente tratados com Tempol houve decrescimo dose-dependente da atividade de Nox2 (ED50: 45 ƒÝg/106 neutrofilos), em correlacao direta com o decrescimo da atividade de PDI. Testes com inibidores padroes de PDI (bacitracina e acido ditionitrobenzoico- DTNB) confirmaram que a inibicao de PDI determina decrescimo da atividade de Nox2, resultados obtidos atraves de ensaios espectrofotometricos (reducao de citocromo c, 550 nm) e quimioluminescentes (sistema luminol-peroxidase). Em conjunto, os resultados apontam que, simultaneamente a atividade de Nox2 em neutrofilos estimulados, ocorre atividade redutase de PDI, confirmando que essa chaperona esta diretamente associada a ativacao e/ou manutencao da atividade da oxidase fagocitaria. Adicionalmente, esse trabalho mostrou que o nitroxido Tempol e capaz de modular negativamente a atividade de Nox2, cujo efeito, ao menos em parte, e decorrente da inibicao de PDI, sugerindo um novo mecanismo anti-inflamatorio dos nitroxidos. / Protein disulfide isomerase (PDI, EC 5.3.4.1) is an ubiquitously expressed enzyme that catalyses the rearrangement of disulfide bonds in target proteins. Previous studies suggest that PDI, which is a chaperone involved in protein trafficking and translocates to the cell surface, may regulate the phagocytic NADPH oxidase complex (Nox2). This study examines whether the nitroxide 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (Tempol) inhibits the regulatory activity of PDI interconnected to Nox2 in inflammatory neutrophils. Phorbol-triggered superoxide anion release was correlated with the PDI reductase activity detected in neutrophils, as determined by oxygen consumption and cleavage of a fluorescent probe, respectively. Both events were significantly inhibited in a concentration-dependent manner when neutrophils were pre-treated with Tempol, which has an ED50 of 45 M. To substantiate that Tempol’s action on PDI activity is related to Nox2 downregulation, assays with the known PDI inhibitors bacitracin and dithionitrobenzoic acid were performed to confirm their ability to decrease the neutrophil respiratory burst. This study shows that Tempol’s inhibition of Nox2 activity is correlated with decreased PDI reductase activity at the neutrophil cellular membrane, suggesting a close association between the enzymes of activated phagocytes and pointing to a novel anti-inflammatory mechanism for Tempol. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

As espécies reativas de oxigênio/nitrogênio são produzidas por fagócitos, inicialmente, pela formação do ânion superóxido do qual se derivam outros potentes microbicidas. Em resposta ao estresse oxidativo/nitrosativo, todas as células apresentam capacidade de defesa antioxidante endógena. Fungos são capazes de modular sua defesa antioxidante aumentando sua patogenicidade frente às defesas do organismo hospedeiro. Vários dados experimentais levantam a hipótese que de que Candida albicans são fungos que aumentam sua defesa antioxidante para formação de biofilmes. Os nitróxidos são antioxidantes sintéticos que modulam a atividade do complexo NADPH oxidase (Nox2) de fagócitos, reduzindo a produção de ânions superóxido. Esse efeito dos nitróxidos diminui as ações deletérias de oxidantes durante um processo inflamatório, mas poderia comprometer a capacidade microbicida dos fagócitos. O objetivo deste trabalho foi o estudo da interação entre neutrófilos humanos e C. albicans na forma planctônica e biofilme, enfocando a defesa antioxidante enzimática como mecanismo de patogenicidade do fungo. O efeito de adição do nitróxido 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (Tempol) foi testado, com o intuito de verificar se este composto altera a resistência destes microrganismos ao ataque de oxidantes produzidos por fagócitos. Foi realizado o doseamento das enzimas antioxidantes superóxido dismutases (SOD) e catalase (CAT) das leveduras e dos neutrófilos na presença e ausência do Tempol. O monitoramento do burst respiratório foi utilizado para determinar os efeitos do nitróxido sobre a atividade de Nox2 dos neutrófilos. O ensaio de killing de C. albicans por neutrófilos foi realizado cultivando-se a levedura na presença de neutrófilos previamente tratados com Tempol ou apenas com o veículo e avaliado através de contagem de unidades formadoras de colônias. Os resultados revelaram uma alta atividade das enzimas SOD e CAT no fungo, sendo maior quando em biofilme. Além disso, a levedura diminuiu a atividade enzimática antioxidante dos neutrófilos humanos, quando os mesmos foram expostos. O Tempol foi capaz de reduzir essa atividade tanto na levedura quanto nos neutrófilos. A levedura em suas formas estudadas estimulou alta atividade de Nox2 dos neutrófilos e o Tempol inibiu a mesma. Através do ensaio de killing foi detectado um crescimento menor do fungo quando na presença dos neutrófilos e um maior crescimento microbiano quando adicionado o Tempol, sugerindo um comprometimento da ação fungicida dos neutrófilos. Os resultados mostraram que, na forma de biofilme, C. albicans tem uma maior defesa frente ao sistema imune do hospedeiro, decorrente, ao menos em parte, da alta atividade das enzimas SOD e CAT, o que exige uma demanda mais elevada de espécies oxidantes para controlar o foco infeccioso. A presença de um antioxidante sintético provocou diminuição da concentração destas espécies oxidantes, o que pode ser deletério no controle da infecção. / The early reactive oxygen/nitrogen species (ROS/RNS) produced by phagocytes are superoxide anions, from which are derived other oxidant compounds that are potent microbicides. In response to oxidative/nitrosative stress, all cells present endogenous antioxidant defense capacity. Some fungi are able to modulate their antioxidant defense, increasing their pathogenicity forward to the oxidant host organism attack. Attention has been given to the ability of Candida albicans biofilms modulate their antioxidant defense, associated to the increase of morbidity and mortality of infected patients. Nitroxides are synthetic antioxidants that modulate the activity of Nox2 in phagocytes, reducing the production of superoxide anions. This effect of nitroxides decreases the harmful effects of ROS/RNS during an inflammatory process, but could compromise the microbicidal capacity of phagocytes. The aim of this work was to study the interaction between human phagocytes and C. albicans in both, planktonic and biofilm, forms. Also, the effect of nitroxide 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (Tempol) was tested in order to verify the hypothesis of interference of this antioxidant in the host immune defense. The antioxidant enzymes catalase (CAT) and superoxide dismutases (SOD) were evaluated in yeasts and neutrophils, either in presence or absence of Tempol. Neutrophil respiratory burst was monitored to determine the effects of the nitroxide on superoxide anion production. Killing assay of C. albicans was performed by cultivating yeast in the presence of human neutrophils with or without Tempol addition, followed by colony forming units counting. The results showed a high activity of SOD and CAT in the fungus, which was stronger when biofilm form was established than that planktonic one. In addition, the exposure to yeast caused a decrease on antioxidant enzymes activities of human neutrophils. Tempol addition caused a significant impairment on both antioxidant enzymatic activities, as in neutrophil suspensions as in cultured fungi. Exposure to C. albicans biofilms stimulated a larger neutrophil superoxide anion formation than correspondent planktonic form, an event that was inhibited by Tempol. Nitroxide addition partially deleted neutrophil fungicide capability, suggesting a deleterious action on phagocytic fulfillment on host defence. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

A ação de espécies reativas de oxigênio e/ou de nitrogênio (ERO/ERN), produzidas por neutrófilos através do complexo NADPH oxidase (Nox2) e óxido nítrico sintase (iNOS), estão diretamente associadas à capacidade microbicida de fagócitos. Entretanto, se a produção destes oxidantes escapa ao controle da homeostase bioquímica, ocorrem danos oxidativos aos tecidos circunvizinhos do foco inflamatório, quando, então, há necessidade de intervenção farmacológica. Neste trabalho foi testado o efeito dos nitróxidos piperídinicos 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Tempo) e 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Ac-Tempo) sobre a atividade de Nox2 de neutrófilos inflamatórios e suas consequências sobre a capacidade fungicida dos fagócitos. Neutrófilos isolados de cavidade peritoneal de camundongos foram incubados (37°C, 10 min) com Tempo (50-400 μM) ou Ac-Tempo (25-200 μM) e estimulados com Candida albicans (ATCC 10231) opsonizadas (107 C. albicans/105 neutrófilos). A atividade de Nox2 foi determinada polarograficamente, pelo consumo de oxigênio mensurado através de eletrodo de Clark, ou espectrofotometricamente, medindo-se a redução de citocromo c (550nm). A atividade de Nox2 (119,311,6 nmol de O2-•.min-1) foi diminuída pelo tratamento com ambos os nitróxidos, de forma dose-dependente, embora Ac-Tempo tenha sido mais eficaz (ED50 31 M) que Tempo (ED50 160 M). Paralelamente, foi verificada a fluorescência (λexc361, λemi440) emitida pelo grupo acridina após reação de espécies radicalares com Ac-Tempo, corroborando a hipótese de que nitróxidos depletam radicais produzidos por neutrófilos estimulados com C. albicans. O nitróxido Tempo não mostrou nenhuma ação direta sobre culturas de C. albicans, conforme análises de antifugigramas padrões. Entretanto, testes de capacidade microbicida de neutrófilos mostraram que o tratamento prévio das células com Tempo (300 µM) causou decréscimo de 80% na efetividade fungicida sobre C. albicans. Testes in vivo mostraram que Tempo administrado em dose oral única (26,52 mg/kg) foi capaz de diminuir o edema de pata originado em resposta à inoculação do fungo (107 C. albicans) cujo ponto máximo de efeito foi 18 horas após a administração do nitróxido, bem como determinou significativa diminuição de nitração de proteínas em tecido muscular das patas dos animais, conforme resultados de ensaios com anticorpos anti-nitrotirosina. Em conjunto, os resultados corroboram a premissa de que a atividade de Nox2 é essencial para a resposta do hospedeiro a C. albicans e que a administração de nitróxidos para modular a produção de oxidantes nos focos infecciosos pode diminuir a resposta do sistema imune à infecção fúngica. / Production of oxidants species by neutrophils through NADPH oxidase complex (Nox2) is directly associated with the microbicidal activity of phagocytes. In this work we tested the effect of the nitroxides 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-piperidine-1-oxil (Tempo) and 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidine-1-oxil (Ac-Tempo) on the activity of inflammatory neutrophil Nox2 complex and the consequences on the fungicidal phagocytes capability. Neutrophils were incubated with Tempo (50-400 mM) or Ac-Tempo (25-200 mM) and stimulated with Candida albicans. Nox2 activity was determined polarographically by oxygen consumption measured by Clark electrode. Oxidase activity decreased by treatment with both nitroxides in a dose-dependent manner. However, Ac-Tempo was more effective (ED5044M) that Tempo (ED50160M). In parallel, the fluorescence intensity elicited by acridine after reaction with free radicals was determined. Neutrophils stimulation elicited significant fluorescent response in direct correlation with Ac-Tempo doses (R2=0.997), supporting the hypothesis that nitroxide is consumed by free radicals neutrophils-released. Fungicidal neutrophils activity assay explicited that pretreatment of cells with Tempo caused 80% decrease in the effectiveness on C. albicans death. Oral administration of a Tempo single dose was able to reduce paw edema elicited in response to inoculation of the fungus. Also, a significant decrease in protein nitration in paw tissues was found in this condition. Together, the results support the premise that Nox2 activity is essential for the host response against C. albicans and that nitroxides cause a decrease on the oxidant immune response to fungal infection.

Durante algumas das reações que levam à formação de AGEs, espécies reativas de oxigênio são geradas e concorrem paralelamente com o estresse oxidativo e com os danos estruturais e funcionais às macromoléculas. A formação de AGEs in vivo pode envolver os neutrófilos, que após estímulo inflamatório, induzem importantes enzimas geradoras de ERO, como o sistema NADPH oxidase. Entretanto ainda permanecem questionamentos sobre a relação entre o Sistema NADPH oxidase de neutrófilos e os AGEs. O presente trabalho visa contribuir para o entendimento do papel do sistema NADPH oxidase e da geração de ERO na formação de AGEs e o impacto da formação destes produtos na função renal destes animais. Foi utilizado um modelo experimental de diabetes induzido pela injeção i.p. de aloxano em ratos Wistar que foram divididos em 5 grupos: controle, diabético, diabético tratado com aminoguanidina (AG), diabético tratado com apocinina (AP) e diabético tratado com apocinina e aminoguanidina (AP+AG). A AG é um conhecido inibidor da formação de AGEs, e a AP é inibidor do sistema NADPH oxidase. Os inibidores, ou água foram administrados aos animais por gavagem por 50 dias após a instalação do DM. A formação de ERO reflete a atividade de NADPH oxidase e foi mensurada em neutrófilos peritoneais por quimiluminescência e pelo ensaio de redução do citocromo C. A expressão das subunidades p47phox e a p67phox do sistema NADPH oxidase foi avaliada por imunofluorescência. Os AGEs circulantes foram avaliados por fluorescência e a função renal foi avaliada pela dosagem da uréia e creatinina séricas e análises histológica dos rins. Pelos parâmetros avaliados neste estudo, verificamos que o tratamento com AP, diminuiu a geração de ERO tanto no grupo controle, quanto diabético, mas não afetou a via de formação de AGEs. O que indica que, provavelmente, não há interrelação entre as vias do sistema da NADPH oxidase de neutrófilos e a formação de AGEs, no nosso modelo experimental. O tratamento com a AP atenuou a glomerulonefrite do grupo diabético. A AG, na dose e no tempo administrado, 100mg/Kg por 50 dias, melhorou o perfil glicêmico dos animais diabéticos, preveniu a formação de AGEs e o dano glomerular. Além disso, o tratamento com a AG aumentou a atividade do sistema NADPH oxidase e a expressão das subunidades citosólicas p47phox e a p67phox do sistema. Não podemos afirmar que o aumento da atividade e expressão do sistema NADPH oxidase seja devido à diminuição dos AGEs no nosso sistema ou um efeito isolado da aminoguanidina, ainda não descrito na literatura. A compreensão do papel desta enzima em modelo experimental de diabetes pode ajudar na compreensão do processo inflamatório persistente que ocorre devido ao acúmulo desses produtos nas complicações da doença, permitindo uma melhor adequação da abordagem clínica e tratamento desses pacientes. / Chronic hyperglycemia observed in diabetes disease leads to the advanced glycation end products (AGEs) formation, which are able to damage the patient organs, especially the kidney. Some AGEs formation reactions may also generate reactive oxygen species (ROS) and they are able to compete with oxidative stress and structural and functional macromolecules damages. Neutrophils are immune cells capable of expressing great amount of important ROS generator enzymes such as NADPH oxidase just after inflammatory stimuli. There are still questions about the relationship between the neutrophil NADPH oxidase system and AGEs despite the information that in vivo AGEs formation may involve neutrophils. The present study aims to contribute to the understanding of NADPH oxidase role and its ROS generation in AGEs formation and what is the impact of these products formation in renal function of rat model. Our experimental diabetes model was reached by alloxan i.p. injection in rats. These animals were divided in five groups: control, diabetic, diabetic treated with aminoguanidine (AG), diabetic treated with apocynin (AP) and diabetic treated with apocynin and aminoguanidine (AG + AP). AG is an AGEs formation inhibitor, and AP is a NADPH oxidase inhibitor. The inhibitors compounds or the vehicle (water) were administered by gavage for 50 days after DM confirmation. ROS formation reflects the NADPH oxidase activity and it was measured by chemiluminescence assay and by cytochrome C reduction in peritoneal neutrophils. The expression of NADPH oxidase p47phox and p67phox subunits was assessed by immunofluorescence. Circulating AGEs were analyzed by fluorescence and the renal function was evaluated by serum urea and creatinin concentration and by kidney histological sections. Our results showed that AP treatment decreased ROS generation in both control and diabetic groups, but did not affect the process of AGEs formation. This may indicate that in our experimental model there is no interrelation between the neutrophil NADPH oxidase system and the AGEs formation. It was also observed that the AP attenuated glomerulonephritis in diabetic mice. AG, at the administered dose and time, 100mg/Kg for 50 dias, improved glycemic control, prevented the AGEs formation and prevented glomerular damage. Furthermore, AG treatment increased the NADPH oxidase activity and its p47phox and p67phox cytosolic subunits expression. We are not able to confirm if the increased activity and expression of NADPH oxidase were caused by the AGEs decrease in our system or by an isolated effect of aminoguanidine not yet described. Understanding the NADPH oxidase role in experimental diabetes could improve the knowledge about the persistent inflammatory process that occurs due to these products accumulation during the disease complication, allowing a better clinical approach and treatment of these patients. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES