Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2012-10-26T11:47:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 301502.pdf: 1315666 bytes, checksum: 02b304dc4e46a9fd15c36c2823dbb0f2 (MD5) / Introdução: As Glitazonas (rosiglitazona e pioglitazona) são fármacos utilizados para o tratamento do diabetes tipo II. Estes fármacos são agonistas do receptor ativados por proliferadores de peroxissomos gama (PPAR- ) e induzem à transcrição de genes relacionados ao metabolismo glicídico e lipídico e à expressão de proteínas produzidas e/ou liberadas no processo inflamatório. Objetivos: 1) Avaliar o efeito anti-inflamatório da rosiglitazona e da pioglitazona administrados por via intraperitoneal (i.p.), na primeira (4 h) e na segunda (48 h) fases da resposta inflamatória induzida pela carragenina (Cg) no modelo da pleurisia murina. 2) Avaliar o efeito antioxidante da pioglitazona utilizando-se o mesmo modelo experimental. Delineamento do estudo: Trata-se de um estudo experimental, prospectivo e controlado. Métodos: Neste estudo foram utilizados camundongos albinos Swiss de 1 mês de idade e pesando de 18-20 g. Diferentes grupos de animais foram tratados previamente com a rosiglitazona (0,5 - 10 mg/Kg) ou a pioglitazona (5 - 50 mg/Kg), em diferentes períodos de tempo (0,5 - 2 h) antes da Cg. Apenas para o grupo de animais destinado a avaliação da exsudação e a contagem total e diferencial dos leucócitos no lavado da cavidade pleural foi administrada 0,2 mL da solução de azul de Evans (25 mg/Kg, i.v.), 10 min antes da administração da Cg. Os parâmetros inflamatórios avaliados no lavado da cavidade pleural para ambos os fármacos foram: leucócitos, exsudação, atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO), adenosina-deaminase (ADA), concentrações do fator de necrose tumoral alfa (TNF- ) e da interleucina-1 beta (IL-1 ). Além disso, para a rosiglitazona avaliou-se também as concentrações dos metabólitos do óxido nítrico (NOx), interleucina-17A (IL-17A) e fator de crescimento endotelial vascular-alfa (VEGF- ), no lavado da cavidade pleural. Para a pioglitazona os parâmetros estudados para avaliar o estresse oxidativo foram: atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa S-transferase (GST), no sangue total, bem como a peroxidação lipídica (TBARS) no lavado da cavidade pleural. A análise estatística utilizada foi o teste T de Student ou ANOVA (Newman Keuls). Além disso, para avaliar as possíveis correlações utilizou-se o teste de Pearson. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos. Resultados: A rosiglitazona, em ambas as fases (4 e 48 h) da pleurisia induzida pela Cg, inibiu os leucócitos (P < 0,01), a exsudação (P < 0,01), a atividade das enzimas ADA e MPO (P < 0,05) e as concentrações de NOx, TNF- , IL-1 , IL-17A e VEGF- (P < 0,05). Já a pioglitazona, na pleurisia 4 e 48 h reduziu os leucócitos (P < 0,01), a atividade da ADA (P < 0,01) e as concentrações de TNF- e IL-1 (P < 0,01). A atividade da MPO foi inibida pela pioglitazona somente na pleurisia 4 h (P < 0,01). Na avaliação dos parâmetros relacionados ao estresse oxidativo, a pioglitazona na pleurisia 4 e 48 h reduziu a atividade das enzimas SOD, CAT, GPx e GST (P < 0,05) e as concentrações de TBARS (P < 0,05). Conclusão: A atividade anti-inflamatória da rosiglitazona e da pioglitazona parece estar relacionada com a redução do influxo de células ativadas e consequente redução da liberação e/ou produção de mediadores inflamatórios. Além disso, o efeito antioxidante observado para a pioglitazona deve-se em parte pela inibição de enzimas antioxidantes e marcadores de peroxidação lipídica. / Introduction: The glitazones (rosiglitazone and pioglitazone) are drugs used to treat type II diabetes. These drugs are receptor agonists of peroxisome proliferator-activated gamma (PPAR-) and induce the transcription of genes related to glucose and lipid metabolism and expression of inflammatory proteins produced and/or released in the inflammatory process. Objectives: 1) To evaluate the anti-inflammatory effect of rosiglitazone and pioglitazone administered intraperitoneally (i.p.) in the first (4 h) and second (48 h) phases of the inflammatory response induced by carrageenan (Cg) in the murine model of pleurisy. 2) To evaluate the antioxidant effect of pioglitazone using the same experimental model. Study desings: This is an experimental, prospective and controlled study. Methods: In this study it was used Swiss albino mice, 1 month old and weighing 18-20 g. Different groups of animals were pretrated with rosiglitazone (0.5 -10 mg/Kg) or pioglitazone (5 - 50 mg/Kg) in different periods of time (0.5 # 2 h) prior to Cg. To evaluate the exudation a group of animals received 0.2 mL of Evans blue (25 mg/Kg) 10 min before administration of Cg. The studied inflammatory parameters evaluated were: leukocytes, exudation, activities of myeloperoxidase (MPO) and adenosine deaminase (ADA), concentrations of tumor necrosis factor (TNF-) and interleukin-1 beta (IL-1). In addition for rosiglitazone it was evaluated concentrations of nitric oxide metabolites (NOx), interleukin-17A (IL-17A) and vascular endothelial growth factor-alpha (VEGF-) in the pleural fluid. For pioglitazone the following parameters of oxidative stress were evaluated: activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), gluthatione S-transferase (GST), whole blood, as well as lipid peroxidation (TBARS) in pleural fluid. The statistical analysis used was Student T test or ANOVA (Newman Keuls). In addition, to evaluate the correlations it was used Pearson. Values of P < 0.05 were considered significant. Results: Rosiglitazone in both phases (4 and 48 h) of pleurisy induced by Cg inhibited leukocytes (P < 0.01), exudation (P < 0.01), activities of ADA and MPO (P < 0.05), and concentration of NOx, TNF-, IL-1, IL-17A and VEGF- (P < 0.05). Pioglitazone in pleurisy 4 and 48 h also reduced leukocytes (P < 0.01), activity of ADA (P < 0.01), and concentration of TNF- and IL-1 (P < 0.01). The activity of MPO was inhibited by pioglitazone only in the pleurisy 4 h (P < 0.01). In the evaluation of parametes related to oxidative stress in pleurisy 4 and 48 h, pioglitazone reduced activities of SOD, CAT, GPx and GST (P < 0.05), and concentrations of TBARS (P < 0.05). Conclusion: The anti-inflamatory effects of rosiglitazone and pioglitazone appears to be related to reducing the influx of activated cells and consequent reduction of release and/or production of inflammatory mediators. The antioxidant effect observed for pioglitazone is may be due to in part by inhibiton of antioxidant enzymes and markers of lipid peroxidation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2013-03-04T19:19:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 305017.pdf: 1234167 bytes, checksum: 2818a0c83b8dc9366e881cc4f0adaab6 (MD5) / A agregação plaquetária ocorre fisiologicamente para ocluir lesões em vasos ou em condições anormais como na disfunção endotelial ou na sepse. Diversos estímulos fisiológicos podem ativar as plaquetas tanto in vivo quanto in vitro. Alguns destes agentes agregantes são colágeno, ADP, 5-HT, trombina, TxA2 entre outros. O óxido nítrico, assim como a prostaglandina I2 (prostaciclina), atua como inibidor fisiológico da agregação plaquetária. O NO atua de diversas maneiras sobre a agregação plaquetária, desde a mobilização de cálcio até a inibição de receptores plaquetários. Um dos mecanismos de ação do NO na inibição da agregação plaquetária é através da ativação da enzima guanilato ciclase solúvel, e conseqüente formação do GMPc. O aumento de GMPc intracelular diminui as concentrações de cálcio intracelular, contribuindo para a inibição plaquetária. Neste estudo, foi avaliado se o NO apresentaria efeito inibitório na agregação plaquetária em ratos mesmo após a sua remoção e se esta inibição seria duradoura. A agregação plaquetária foi induzida por ADP ou colágeno em plasma rico em plaquetas de ratos, e como ferramentas farmacológicas para estudar o efeito do NO, foram usados o GTN (trinitrato de glicerila) e o GSNO (S-nitrosoglutationa), ambos doadores de NO. O inibidor da enzima guanilato ciclase solúvel ODQ foi utilizado para verificar a participação desta enzima na inibição da agregação plaquetária. O presente estudo mostrou que distintos doadores de NO causam perfis diferentes de inibição da agregação plaquetária e que este efeito agudo parece envolver ativação da guanilato ciclase. Outro achado importante e inédito foi que este efeito anti-agregante do NO é duradouro e que, talvez, possa ser explicado por S-nitrosilação de proteínas presentes em plaquetas. Por fim, um choque endotoxêmico induzido por endotoxina bacteriana (LPS) diminuiu o número de plaquetas circulantes e a agregação plaquetária. / Platelet aggregation occurs physiologically to occlude vessels lesions or abnormal conditions as endothelial dysfunction or sepsis. Several physiological stimuli can activate platelets in vivo and in vitro. Some of these aggregating agents are collagen, ADP, 5-HT, thrombin, TxA2 and others. Nitric oxide (NO) and prostaglandin I2 (prostacyclin) work as physiological platelet aggregation inhibitors. NO acts on platelet aggregation in several manners from mobilization of calcium to platelet receptors inhibition. One NO mechanism of action in inhibiting platelet aggregation is through the soluble guanylate cyclase enzyme activation and subsequent cGMP formation. Increased cGMP reduces intracellular calcium concentrations contributing to platelet inhibition. In this study, it was evaluated whether NO would present inhibitory effect in platelet aggregation even after its removal and whether that effect would last. Platelet aggregation was induced by ADP or collagen in platelet rich plasma from rats and as pharmacological tools to study the NO effect, we used the GTN (glyceryl trinitrate) and GSNO (S-nitrosoglutathione), both NO donors. The inhibitor of soluble guanylate cyclase enzyme (ODQ) was used to verify the involvement of this enzyme in the platelet aggregation inhibition. The present study showed that NO donors cause different profiles of platelet aggregation inhibition and this effect seems to involve acute activation of guanylate cyclase. Another important finding was that this unprecedented and anti-aggregating effect of NO is sustained and perhaps can be explained by S-nitrosylation of proteins present in platelets. Finally, the endotoxemic shock induced by bacterial endotoxin (LPS) decreased the number of circulating platelets and platelet aggregation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biolólogicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-26T00:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 314078.pdf: 10245292 bytes, checksum: 7c929eea613abee45aaedc328628ac4e (MD5) / A S-nitrosilação de PtpA de Mycobacterium tuberculosis diminui sua atividade fosfatase. O objetivo deste trabalho é investigar o efeito da S-nitrosilação nos parâmetros cinéticos e na estabilidade térmica de PtpA. Por meio de ensaios de biotin switch observou-se que a substituição do resíduo Cys53 por um resíduo de alanina em mutantes resultou em proteínas incapazes de se ligar a biotina após tratamento com doador de NO. Observou-se também que a KM da PtpA nitrosilada foi semelhante à sua forma não modificada, mas a Vmax foi reduzida pela metade. Em contraste, a mutante C53A tratada com GSNO mostrou KM e Vmax semelhantes à forma não tratada. Na desnaturação térmica de PtpA S-nitrosilada, a TM diminuiu consideravelmente na proteína selvagem, C11A e C16A, porém as mutantes C53A, C11A/C53A e C16A/C53A não tiveram mudanças significativas. Esses resultados sugerem que a S-nitrosilação ocorre especificamente na C53 não catalítica, essa alteração não afeta a afinidade pelo substrato e a S-nitrosilação da Cys53 afeta a estabilidade térmica da proteína. Por outro lado, outras duas proteínas de M tuberculosis foram estudadas, PtkA e SapM. A tirosina cinase PtkA fosforila a PtpA em dois resíduos de tirosina situados no PDYY-loop e se autofosforila na Tyr262. Neste trabalho, a PtkA recombinante foi expressa em bactérias E. coli BL21(DE3) e purificada por IMAC. Ensaios de CD revelaram que a proteína apresenta 42% de ?-hélice e 7% de folha-?, o que sugere que a proteína recombinante está corretamente enovelada. Por pertencer a família de proteínas HAD, a PtkA requer Mg2+ para a hidrólise do ATP. Foi observado que a TM da proteína aumenta consideravelmente na presença do metal, de 31 °C para 43 °C. Assim pode-se dizer que a ligação do metal ao sítio ativo estabiliza a estrutura terciária da proteína. A PtkA também é S-nitrosilada, porém o efeito dessa modificação pós-traducional sobre a atividade e estrutura da proteína ainda é desconhecido. A sequência de DNA que codifica SapM também foi inserida no vetor de expressão pET-14b. Diversas condições de expressão foram testadas sendo que se obteve maior rendimento em bactérias E. coli BL21 (DE3) pLysS na temperatura e tempo de indução de 15 °C por 20 horas. Como a proteína permaneceu na fração insolúvel do lisado bacteriano, essa teve que ser solubilizada pela adição de ureia 8M e posteriormente purificada por IMAC. As condições para o correto re-enovelamento ainda devem ser otimizadas para dar sequência à caracterização de SapM.<br> / Abstract : The S-nitrosylation of Mycobacterium tuberculosis PtpA decreases its phosphatase activity. The aim of this work is to investigate the effect of S-nitrosylation in PtpA kinetic parameters and thermal stability. By biotin switch assays it was observed that the substitution of Cys53 residue by an alanine residue in mutants C53A, C53A/C11A, C53A/C16A and C53A/C11A/C16A resulted in proteins unable to bind biotin upon NO donor treatment. It was also observed that the KM of nitrosylated PtpA was similar to its unmodified form, but the Vmax was reduced to half. In contrast, C53A treated with GSNO showed KM and Vmax similar to the untreated form. Thermal denaturation of Snitrosylated PtpA was evaluated by CD spectroscopy. When GSNO was added to PtpA, the TM decreased in wild type, C11A and C16A, while significant differences in C53A, C11A/C53A and C16A/C53A mutants were not observed. These results suggest that S-nitrosylation occurs specifically in the non-catalytic Cys53, this modification does not affect substrate affinity, and S-nitrosylated Cys53 affects protein thermal stability. Moreover, two other M. tuberculosis proteins are studied, PtkA and SapM. Tyrosine kinase PtkA phosphorylates PtpA in two tyrosine residues located in PDYY-loop and autophosphorylates at Tyr262. In this work, recombinant PtkA was expressed in E. coli BL21 (DE3), and purified by IMAC. CD experiments reveal that the protein has 42% á- helix and 7% â-sheet, which suggest that the recombinant protein is properly coiled. Like other proteins belonging to HAD family, PtkA requires Mg2+ for ATP hydrolysis. It was observed that the TM of this protein greatly increases in the presence of metal, from 31 °C to 43 °C. Thus, it can be said that the metal binding to the active site of this enzyme stabilizes the tertiary structure of the protein. It was observed that PtkA is also S-nitrosylated, but the effect of this post-translational modification on the structure and activity of the protein is still unknown. The DNA sequence encoding SapM was also inserted into the expression vector pET-14b. Various expression conditions were tested. The higher yield was obtained in E. coli BL21 (DE3) pLysS during 20 hours of induction at 15 °C. As the protein remained in the insoluble fraction of the bacterial lysate, it had to be solubilized by addition of 8M urea, and further purified by IMAC. The conditions for proper refolding still have to be optimized in order to be able to continue SapM characterization

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317916.pdf: 1258675 bytes, checksum: bca79daba9e5f6b05b6c9d073a3d532b (MD5) Previous issue date: 2013 / A produção excessiva de óxido nítrico (NO) durante a sepse está relacionada com a disfunção vascular caracterizada por hipotensão e hiporreatividade a vasoconstritores. NO reage rapidamente com resíduos de tiol (-SH) levando à formação de nitrosotióis (R-SNO). Não obstante a sua natureza reversível, a formação de R-SNO em proteínas pode resultar em efeitos duradouros para a sua função. Outra característica importante dos R-SNO é que eles podem transferir NO na presença de tióis livres (mas não com a eficácia de 100%) através da reação conhecida como transnitrosilação Um modelo já descrito pelo nosso laboratório para estudos de S-nitrosilação e disfunção vascular consiste na infusão de doadores de NO que induzem uma redução substancial da função vasoconstritora de forma semelhante ao que ocorre no quadro da sepse. No que se refere ao mecanismo, doadores de NO transferem parte do seu conteúdo de NO para resíduos de tióis de proteínas endógenas. Considerando todas estas informações, neste trabalho investigamos a participação do NO e R-SNO sobre a hiporreatividade vascular à fenilefrina em animais infundidos com nitroprussiato de sódio (SNP) e animais sépticos. Nossos resultados mostram que animais infundidos com SNP apresentam redução substancial e persistente da resposta contrátil à fenilefrina, apesar da pressão arterial média estar dentro de valores normais. Observou-se também que a administração de L-cisteína induz a hipotensão em animais infundidos com SNP. Esta hipotensão é decorrente, pelo menos em parte, da ativação da guanilato ciclase solúvel. Adicionalmente, injeções sucessivas de L-cisteína atenuam a hiporreatividade à fenilefrina. A oxidação prévia de tióis com DTNB previne e reverte a diminuição da resposta pressórica à fenilefrina em animais infundidos com SNP. A oxidação de tióis com DTNB é revertida por DTT restituindo o estado hiporreativo resultante da infusão com SNP. Em animais sépticos, o DTNB também preveniu a hiporreatividade à fenilefrina. Levando em consideração que DTNB não atravessa a membrana plasmática, é provável que os resultados do efeito da oxidação de resíduos de tiol sejam em proteínas localizadas na face externa da membrana. Nossos resultados mostram que a S-nitrosilação de resíduos de tiol e a formação consequente de R-SNO tem papel fundamental na função vascular, contribuindo para a hiporreatividade a vasconstritores. Por conseguinte, a interferência em R-SNO formados na sepse pode ter impacto substancial na melhora da disfunção cardiovascular desta condição.<br> / Abstract : The excessive production of nitric oxide (NO) during sepsis is related to vascular dysfunction characterized by hypotension and hyporesponsiveness to vasoconstrictors. NO reacts fast to thiol (-SH) residues leading to the formation of nitrosothiols (R-SNO). Notwithstanding its reversible nature, formation of R-SNO in proteins may cause long-lasting consequences to their function. Another important characteristic of R-SNO is that they can exchange (but not with 100% efficacy) NO when in the presence of free thiols by a reaction known as transnitrosylation. A model has been described by our laboratory for studies of vascular dysfunction similar to those that takes place in sepsis. The model consists of the infusion of NO donors leading to a substantial reduction of vasoconstrictor functionality, similarly to what occurs in the context of sepsis. As for the mechanism, we suggest that the infused NO donor will transfer to thiol residues in endogenous proteins. Considering all this information we have investigated the role of NO and R-SNO on vascular hyporeactivity to phenylephrine in rats infused with sodium nitroprusside (SNP) and in septic animals. Our results show that animals infused with SNP show a substantial and persistent reduction in the contractile response to phenylephrine, despite the blood pressure being within normal values. We also observed that administration of L-cysteine induces hypotension in animals infused with SNP. This hypotension is due, at least in part, to the activation of soluble guanylatecyclase. Successive injections of L-cysteine attenuate the hyporeactivity to phenylephrine in SNP infused rats. Previous oxidation of thiols with DTNB prevents and post-infusion reverts the hyporeactivity to phenylephrine in SNP infused animals. The relevance of the availability of reduced thiols was shown by the demonstration that reduction of DTNB oxidized thiols with DTT promptly recovered the hyporeactivity to phenylephrine caused by SNP infusion. In septic animals, DTNB also prevented the hyporeactivity to vasocontritors. Taking into account that DTNB does not cross the plasma membrane, it is likely that its effect results from the oxidation of thiol residues in proteins located at the external face of the membrane. Our results show that possibly S-nitrosylation of thiol residues in proteins and the consequent formation of R-SNO have a critical role in the vascular function, contributing to the hyporeactivity to vasoconstrictors. Therefore, interference with R-SNO formed in sepsis may have a substantial impact on improving cardiovascular dysfunction in this condition.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-22T06:44:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 241413.pdf: 1484767 bytes, checksum: c1e7cc0760e15a4730de832d5bec248f (MD5) / O aumento da concentração intracelular de guanosina monofosfato cíclico (cGMP) após a ativação da guanilil ciclase solúvel (sGC) é o principal mecanismo mediador do efeito antiproliferativo do óxido nítrico (NO) em células musculares lisas vasculares (CMLV). Entretanto, pouco se conhece sobre o efeito do NO na proliferação de células musculares lisas uterinas (CMLU). Além disso, a importância dos canais de potássio (CK) e de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) na proliferação celular, nos levou a investigar a relação entre o NO, os nucleotídeos cíclicos e CK na proliferação de células musculares lisas vascular e uterina. Os doadores de NO (dois nitrosotióis, S-nitroso-N-acetil-D,L-penicilamina, SNAP, S-nitrosoglutationa, GSNO, e um nitrato orgânico, propano-1,2,3-triol trinitrato, GTN) inibiram a proliferação das células musculares lisas de maneira concentração-dependente sem induzir morte celular. O efeito citostático dos doadores pode ser inteiramente atribuído à liberação de NO, uma vez que nem NAP nem GSH (precursores não-nitrosilados dos nitrosotióis) interferiram na proliferação celular. A prevenção do efeito inibitório do NO na proliferação de CMLV por ODQ, um inibidor seletivo da sGC e por KT-5823, um inibidor da proteína quinase dependente de cGMP, PKG, bem como a prevenção do efeito antiproliferativo do 8-Br-cGMP, um análogo de cGMP permeável à membrana, pelo KT-5823, confirmaram que o NO inibe a proliferação da CMLV por um mecanismo dependente de cGMP e que a PKG é o alvo molecular mais importante deste nucleotídeo cíclico. Em contraste, ambos os compostos em nada interferiram com a inibição da proliferação de CMLU induzida por NO. A idêntica abundância do mRNA da sGC nos dois tipos de células musculares lisas e a prevenção do efeito antiproliferativo do BAY 41-2272 (um ativador da sGC) na CMLU por ODQ e KT-5823, demonstraram que o mecanismo de transdução de sinal sGC/cGMP/PKG pode ser mobilizado para reduzir a proliferação do músculo liso uterino, mas que o efeito do NO na proliferação da CMLU não está correlacionado com ativação da sGC, nem com o aumento da concentração intracelular de cGMP nem com a ativação da PKG. A prevenção dos efeitos antiproliferativos do NO e do isoproterenol (um agonista beta-adrenérgico e ativador clássico de adenilil ciclase, AC) na CMLU por SQ22536 (um inibidor seletivo de AC) e KT-5720 (um inibidor seletivo da proteína quinase dependente de cAMP; PKA), assim como a prevenção do efeito inibitório do dibutiril-cAMP (um análogo de cAMP permeável à membrana) por KT-5720, mostraram que o efeito do NO na proliferação da CMLU é mediado por ativação da AC, aumento da concentração intracelular de cAMP e ativação da PKA. Uma fração significativa do efeito antiproliferativo do NO nas células musculares lisas vascular e uterina também é mediada por CK uma vez que o tetraetilamônio, um bloqueador não-seletivo de CK, preveniu o efeito do NO. Contudo, o bloqueio do efeito inibitório do NO na proliferação das células musculares lisas por 4-aminopiridina (um bloqueador seletivo de CK dependente de voltagem) e por bloqueadores de canais de potássio dependentes de cálcio (iberiotoxina, caribdotoxina, apamina e clotrimazol) mostrou que a modulação de CK voltagem- e cálcio-dependentes parece ter a mesma importância para o efeito do NO na inibição da proliferação de ambas as células. Este achado está em contraste com a relevância dos canais ATP-dependentes apenas em CMLU, demonstrada pelo bloqueio do efeito do NO com a glibenclamida, um bloqueador seletivo de CK ATP-dependente. O efeito antiproliferativo do ativador de CK dependentes de cálcio (NS1619), confirmou o envolvimento destes canais no efeito inibitório do NO na proliferação da CMLV, da mesma forma que o cromakalim e o diazóxido (ativadores de CK ATP-dependente), confirmaram a participação deste tipo de canal no efeito inibitório do NO na proliferação de CMLU. Além disso, a prevenção completa do efeito antiproliferativo do NO na CMLV por combinação de concentrações sub-efetivas de ODQ e TEA, sugere que o NO inibe a proliferação do músculo liso através da fosforilação de CK. Assim, a reversão completa dos efeitos antiproliferativos de 8-Br-cGMP na CMLV e de Db-cAMP na CMLU por bloqueadores de CK indica que a fosforilação de CK deve ser relevante no efeito inibitório do NO na proliferação de ambas as células. Nossos dados também sugerem que CMLV incubadas com doadores de NO por um curto período de tempo formam reservas de nitrosotióis que mantém a atividade da sGC e a modulação de CK, causando um efeito antiproliferativo de longa duração do NO. Finalmente, o efeito inibitório do NO na proliferação foi mimetizado por nifedipina (um bloqueador de canal de cálcio) e revertido por A23187 (um ionóforo de cálcio) na CMLV, sugerindo que a modulação dos canais de potássio mediada por NO altera a sinalização de cálcio e inibe a proliferação celular. Em resumo, nossos resultados mostram que o efeito antiproliferativo do NO na CMLU depende de cAMP e ativação de PKA, apesar da presença e da funcionalidade do mecanismo de transdução de sinal sGC/cGMP/PKG, sugerindo a não-universalidade do paradigma NO/cGMP, pelo menos no que refere à inibição da proliferação de células musculares lisas. Além disso, o efeito antiproliferativo do NO também mobiliza diferentes subtipos de CK, através de mecanismos dependentes de nucleotídeos cíclicos e/ou nitrosilação.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T02:45:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T02:42:21Z : No. of bitstreams: 1 183467.pdf: 2252968 bytes, checksum: c3563ef834ca901c4f6e150db7c09a4c (MD5) / O [óxido nítrico] é uma molécula com inúmeras ações em vários sistemas. Este estudo teve como objetivo investigar o efeito do tratamento sistêmico prévio de [doadores de NO] no processo de [inflamação] aguda. O pré-tratamento de camundongos com SNP ou SNAP (4 h ou 12) reduziu (~50%) o edema de pata induzido por carragenina, sulfato de dextrana, bradicinina e histamina, mas não reduziu o edema induzido por serotonina. As alterações na permeabilidade vascular e na migração de neutrófilos para o tecido foram avaliados através da medida do extravasamento por azul de Evans e da determinação da atividade da mieloperoxidase (MPO), respectivamente. O pré-tratamento com SNP reduziu significativamente tanto o extravasamento plasmático como o aumento da atividade da MPO. Para testar a participação da [guanilato ciclase] e [canais de K+] no efeito redutor dos doadores de NO sobre o edema de pata, os animais foram pré-tratados com SNP 8 h antes da injeção de carragenina. O [azul de metileno] ou [tetraetilamônio] foram injetados em grupos de animais 30 min antes ou 2, 4 ou 6 h após a injeção de SNP. O azul de metileno bloqueou o efeito redutor do NO no edema de pata quando injetado 30 min antes ou 2 h depois do SNP, mas não 4 ou 6 h após a injeção de doadores de NO. O TEA bloqueou o efeito redutor do NO no edema de pata em todos os tempos avaliados. Estes resultados mostram que uma única injeção de doadores de NO exerce um importante efeito antiinflamatório. Este efeito é de longa duração persistindo por períodos de tempo muitos maiores que a meia-vida do NO. Este efeito é dependente de cGMP, nas primeiras horas após a injeção de doadores de NO, e de canais de K+, durante todo o tempo de análise. Portanto o efeito de longa duração do NO parece estar estreitamente relacionado com a ativação de canais de K+.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T06:20:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T00:59:30Z : No. of bitstreams: 1 183506.pdf: 3172236 bytes, checksum: d0f26079bd5b4a9bb6a659d1c2b0c9bb (MD5) / O presente trabalho avaliou, através de técnicas moleculares, bioquímicas e farmacológicas, o efeito citotóxico do óxido nítrico (NO) e do taxol sobre células linfoblásticas leucêmicas. Foi investigado o envolvimento do NF-kB e a importância da glutationa na citotoxicidade causada pelo NO e pelo taxol. Os resultados obtidos, demonstraram que o efeito citotóxico do NO e do taxol sobre células leucêmicas linfoblásticas parecem atuar em vias muito semelhantes, ou seja, ambos apresentaram ações independentes de alterações no citoesqueleto, inibiram a atividade do NF-kB e depletaram os níveis de glutationa (GSH). Além disso, quando associados, apresentaram efeito citotóxico sinérgico. Sendo assim, concluímos que o NO e o taxol, além de diminuírem os níveis de glutationa intracelular, o que sensibiliza as células aos danos oxidativos e nitrosativos, também impedem o restabelecimento dos níveis normais de GSH intracelular, através da inibição da atividade do NF-kB.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. / Made available in DSpace on 2012-10-19T00:28:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2016-01-09T01:33:41Z : No. of bitstreams: 1 138192.pdf: 2560101 bytes, checksum: a56549dbf4b12123c06cd4270a4b8e7f (MD5)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-19T05:59:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T22:59:27Z : No. of bitstreams: 1 183470.pdf: 2453428 bytes, checksum: eda21befa64120ff686c47632c0453f7 (MD5) / Tendo em conta que na [sepse] a forma cálcio-independente da óxido nítrico sintase (iNOS) é induzida, que os níveis de [glicocorticóides] circulantes estão aumentados na sepse e que o tratamento com corticóides sintéticos não funciona em pacientes sépticos o objetivo deste estudo foi avaliar [in vivo] a relação entre o [óxido nítrico] e o efeito da dexametasona em animais tratados com LPS. Assim, observamos que: i) o tratamento de animais com endotoxina aumentou os níveis de NOS cálcio-independente no pulmão, baço e rim e os níveis de NOS cálcio-dependente na musculatura esquelética; ii) a injeção prévia de dexametasona inibiu a expressão de NOS nos órgãos estudados, exceto no rim; iii) um doador de NO (SNAP) injetado previamente em animais tratados com dexametasona + LPS decresceu o efeito inibitório do glicocorticóide na expressão das NOS no pulmão, baço e na musculatura esquelética; e iv) o mesmo pré-tratamento com SNAP antes de dexametasona e LPS fez retornar os níveis séricos de NOx e a apoptose de células linfóides do baço aos valores obtidos com a administração de LPS somente. Sabendo da afinidade do NO por sulfidrilas livres presentes em vários alvos proteicos e com base nos nossos resultados, sugerimos que a redução do efeito da dexametasona causado pelo NO é um dos possíveis mecanismos responsáveis pela falha do efeito anti-inflamatório dos glicocorticóides em pacientes sépticos, talvez pela interação do NO com sulfidrilas críticas ao funcionamento do [receptor] de glicocorticóides, via [S-nitrosilação].

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-02-25T19:12:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Ana Paula Sampaio Feitosa.pdf: 3707255 bytes, checksum: 56c270d2bf8dd01798cd86abcc07a877 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-25T19:12:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Ana Paula Sampaio Feitosa.pdf: 3707255 bytes, checksum: 56c270d2bf8dd01798cd86abcc07a877 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / CNPQ / O Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) é um ectoparasita de cães domésticos e possui grande importância médica e veterinária por está associado à transmissão de inúmeros patógenos, entre eles existe a suspeita do mesmo está associado à transmissão da Leishmania infantum. O objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta imune inata celular e humoral através da caracterização morfológica e ultraestrutural de hemócitos, avaliação da dinâmica hemocitária no 1º, 2º e 5º dia após infecção (dpi) com L. infantum, fagocitose com 1º dpi, atividade da fenoloxidase no 1º, 2º e 5º dpi, produção de óxido nítrico no 1º, 2º e 5º dpi, expressão gênica da denfesina e Glutationa S-transferase em Rh. sanguineus no tempo 0 e no 1º, 2º, 5º e 7º dpi, além de avaliar a permanência do parasita no tempo 0 e nos dias 1, 2, 5 e 7 após a infecção com L. infantum (dpi). Foram identificados cinco tipos celulares, prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos, esferulócitos e adipohemócitos na hemolinfa do Rh. sanguineus. A partir da contagem total e diferencial dos hemócitos circulantes na hemolinfa de fêmeas de Rh. sanguineus a média do número total de hemócitos no grupo inoculado com L. infantum apresentou-se significantemente elevado (P < 0.001), no 1° e 2° dpi em relação ao grupo controle. Na contagem diferencial de hemócitos observou-se que a percentagem de plasmatócitos e granulócitos no grupo infectado, aumentou significantemente no 1°, 2° e 5° dpi (P < 0.001). Nos ensaios de fagocitose observou-se que plasmatócitos e granulócitos foram capazes de realizar fagocitose de partículas de látex e promastigotas de L. infantum, no 1dpi. A produção de NO aumentou significativamente (P < 0.05) no 2° e 5° dpi e a atividade da PO apresentou aumento significativo (P < 0.05) no 5° dpi. A expressão do gene 18S ribossomal de L. infantum teve um aumento significativo (P < 0.05) no 2°, 5° e 7° após a infecção em relação ao tempo 0. A expressão da GST foi maior no 1º e 2º dpi e o gene defensina foi maior apenas no 5º dpi. Embora não existam estudos sobre a resposta do Rh. sanguineus frente a infecção com L. infatum, estes resultados sugerem, que após a infecção com L.infantum a resposta imune celular e humoral em Rh. sanguineus é ativada, porém mais estudos são necessários para avaliar o impacto dessa resposta no combate a infecção. / The Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) is an ectoparasite of domestic dogs and has great medical and veterinary importance for being associated with the transmission of many pathogens, among them there is a suspicion of it is association with the transmission of Leishmania infantum. The aim of this study was to evaluate the innate cellular and humoral immune response by morphological and ultrastructural characterization of hemocytes, hemocyte dynamics evaluation, phagocytosis, phenoloxidase activity, nitric oxide production at the 1st, 2nd and 5th dpi, gene expression of denfesina and Glutathione S-transferase in Rh . sanguineus and on days 1, 2, 5 and 7 after infection with L. infantum and to evaluate the persistence of the parasite at time 0 and on days 1, 2, 5 and 7 after infection with L. infantum (dpi). Five cell types were identified, prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, and spherulocytes adipohemocytes in Rh. sanguineus hemolymph. From the total and differential counts of circulating hemocytes in the hemolymph of Rh. sanguineus females the average of total number of hemocytes in the group inoculated with L. infantum showed to be significantly higher (P <0.001), on 1st and 2nd dpi in comparison to control group. In differential counting of hemocytes, it was observed that the percentage of granulocytes and plasmatocytes in the infected group, increased significantly at the 1st, 2nd and 5th dpi (P <0.001). In phagocytosis assays, it was observed that plasmatocytes and granulocytes were able to perform phagocytosis of latex particles and promastigotes of L. infantum, 1 day after infection. NO production increased significantly (P < 0.05) in the 1st, 2nd and 5th dpi and the PO activity increased significantly (P < 0.05) in the 5th dpi. The expression of the 18S ribosomal gene expressed by L. infantum had a significant increase (P < 0.05) in the 2st, 5th and 7th after infection in comparison to time 0. The expression of GST was higher in the 1st and 2nd dpi and the defensin gene was higher only in 5 dpi. Although there are no studies on Rh. sanguineus response against infection with L. infatum, these results suggest that after infection with L.infantum cellular and humoral immune response in Rh. sanguineus is activate, nevertheless more studies are needed to assess the impact of such response in fighting infection.