Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T08:35:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 280488.pdf: 1132214 bytes, checksum: 35224f58973c9b99525a5eeeb2f53138 (MD5) / A Daunorrubicina (DNR) é amplamente utilizada na fase de indução do tratamento da Leucemia Mielóide Aguda (LMA). No entanto, o fenômeno de resistência a múltiplos fármacos (MDR), pode comprometer sua eficiência terapêutica como agente antineoplásico. Considerando que fármacos doadores de Óxido Nítrico (NO) têm sido investigados por terem um papel importante na sensibilização de células neoplásicas aos agentes quimioterápicos, o objetivo desse trabalho foi investigar o envolvimento do NO nos mecanismos moleculares de resistência à DNR em células de LMA de origem humana K562. Nossos resultados mostram que a incubação das células K562, com concentrações crescentes de DNR e de SNAP, um doador de NO, não causou morte celular significativa quando utilizados de forma individualizada. No entanto, a adição simultânea desses compostos, causou citotoxicidade de maneira concentração dependente. Para estudar os mecanismos pelos quais esses compostos provocaram morte celular, foi realizada a avaliação do ciclo celular, da expressão das proteínas antiapoptóticas Bcl-2 e survivina, proapotótica Bax e da caspase-3. A DNR (100 µM) e o SNAP (1mM) respectivamente causam bloqueio nas fases S e G0/G1 do ciclo celular na célula K562. Contudo, quando adicionados simultaneamente, o SNAP não altera o bloqueio causado pela DNR na fase S. Além disso, as células K562 apresentam de maneira constitutiva a expressão das proteínas antiapoptóticas Bcl-2 e survivina, e o tratamento com DNR e SNAP, isoladamente, não alteraram de forma significativa a expressão dessas proteínas. No entanto, a adição simultânea desses compostos causou redução de 40% e 70% na expressão de Bcl-2 e na survivina, respectivamente. A DNR e o SNAP também não alteram a expressão da proteína proapoptótica Bax, porém a associação desses compostos causou um aumento de 30% na expressão dessa proteína. A análise da distribuição intracelular de DNR nas células K562, por imunofluorescência mostra que a DNR acumula-se em regiões pontuais do citoplasma. Entretanto, quando as células K562 são tratadas com a associação de DNR e SNAP, há um acúmulo maior de DNR na célula e sua localização ocorre preferencialmente na região nuclear. Os resultados, obtidos na avaliação do acúmulo e retenção de DNR por citometria de fluxo, corroboram com esses resultados. Na análise da expressão dos genes abcc1 e lrp por RT-PCR, foi observado que as células K562 apresentam expressão constitutiva de ambos os genes. Em relação ao gene lrp, observamos que a DNR e o SNAP associados ou não causaram uma significativa diminuição na sua expressão. No entanto, a expressão do gene abcc1 não foi alterada na presença de SNAP e o tratamento com DNR causou uma pequena redução na sua expressão, a qual foi intensificada com a associação DNR e SNAP. A compilação das evidências obtidas nesse estudo nos permite sugerir que o NO inibe a atividade da abcc1, o que leva a um aumento intracelular de DNR, o qual permite que o fármaco atinja seu alvo de ação citotóxica no núcleo. Assim, o dano ao DNA causado pela DNR ativa a apoptose via mitocondrial pelo aumento da expressão da Bax e inibição das proteínas Bcl-2 e survivina, culminando na ativação da caspase 3 e indução da apoptose nas células de leucemia mielóide aguda K562. / Daunorubicin (DNR) is widely used in the induction phase of the treatment for Acute Myeloid Leukemia (AML). However, multiple drug resistance (MDR) may compromise its therapeutic efficacy as an antineoplastic agent. Considering that Nitric Oxide (NO) donating drugs have been investigated for their important role in the sensitization of neoplastic cells to chemotherapy drugs, the goal of this work was to investigate the involvement of NO in the molecular mechanisms of resistance to DNR in human AML K562 cells. Our results have shown that the incubation of K562 cells, with increasing concentrations of DNR and SNAP (NO donors) did not cause significant cell death when used individually, but the simultaneous addition of these compounds produced cytotoxicity in a concentration-dependent manner. In order to study the mechanisms through which these compounds induce cell death, the cell cycle, the expression of anti-apoptotic proteins Bcl-2 and survivin, proapoptotic Bax, and caspase-3 were evaluated. DNR (100 ìM) and SNAP (1 mM) halt phases S and G0/G1 of the cell cycle in K562 cells, respectively. When added simultaneously, however, SNAP does not alter the block caused by DNR on phase S. Furthermore, K562 cells constitutively express anti-apoptotic proteins Bcl-2 and survivin, and treatment with DNR and SNAP separately does not significantly alter the expression of these proteins. Notwithstanding, the simultaneous addition of these compounds resulted in 40% and 70% reductions in the expression of Bcl-2 and survivin, respectively. DNR and SNAP also did not alter the expression of the proapoptotic protein Bax, but the association of both compounds resulted in a 30% increase in the expression of the same protein. The immunofluorescence analysis of the intracellular distribution of DNR in K562 cells shows that DNR accumulates in speckles in the cytoplasm. However, when K562 cells are treated with a mixture of DNR and SNAP, there is a greater accumulation of DNR in the cells, located primarily in the nuclear region. The results obtained in the evaluation of the accumulation and retention of DNR through flow cytometry support the previously mentioned findings. The RT-PCR analysis of the expression of abcc1and Irp genes showed that K562 cells constitutively express both genes. Regarding Irp, DNR and SNAP did not produce a significant decrease in its expression, either combined or separately. However, the expression of the abcc1 gene was not affected by the presence of SNAP but when treated with DNR its expression presented a small reduction, which was intensified by the association of DNR and SNAP. The compilation of evidence obtained in this study allows us to suggest that NO inhibits the activity of abcc1, leading to an intracellular increase in DNR, which allows this drug to reach its target of cytotoxic activity in the nucleus. Thus, the DNA damage caused by DNR triggers the mitochondrial apoptosis pathway with an increase in the expression of Bax and inhibition of Bcl-2 and survivin proteins, culminating in the activation of caspase-3 and the induction of apoptosis in acute myeloid leukemia K562 cells.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2012-10-24T05:57:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 258293.pdf: 2567446 bytes, checksum: bd9193aa408c9f4bc98aadd3e5e048a7 (MD5) / Uma fração rica em proantocianidinas (FRP) obtida das cascas da C. celtidifolius foi avaliada quanto ao seu potencial vasorrelaxante em preparações vasculares isoladas. Em leito arterial mesentérico, artéria mesentérica e aorta torácica isolados de ratos a FRP induz relaxamento dependente da concentração. Em vasos de pequeno calibre, este efeito foi significativamente reduzido pelo L-NOARG ou por Krebs despolarizante, e completamente abolido quando ambos são combinados. O efeito também foi reduzido na presença de ODQ e pela caribdotoxina. Em vasos de grande calibre, o L-NOARG e o ODQ também reduziram o relaxamento da fração, bem como a ausência de cálcio no e a presença de um bloqueador de influxo de cálcio (lantânio) na solução de Krebs-Henseleit. N-metilmaleimida e a neomicina também foram capazes de reduzir significativamente a vasodilatação induzida pela FRP. Em outro grupo de experimentos, a vasodilatação induzida pela FRP foi significativamente reduzida pelo Wortmannina. A FRP também foi testada quanto ao seu potencial antiaterogênico em camundongos C57/BL6 LDLr KO. Nestes experimentos, a fração não foi capaz de reduzir as concentrações de lipídios séricos (colesterol total, HDL ou VLDL mais LDL), assim como não reverteu os danos vasculares morfofuncionais provocados pela dieta, quando avaliados nos experimentos de reatividade vascular e na determinação da área de lesão aterosclerótica. Os resultados indicam que a FRP apresenta efeito vasorrelaxante dependente de endotélio em artérias de pequeno e grande calibre, que este efeito envolve a ativação da via NO/GMPc e que o mecanismo de ativação da via envolve o influxo de cálcio do meio extracelular pela ativação de proteínas sensíveis ao NEM e via ativação da PLC e por promover hiperpolarização do músculo liso vascular induzido por abertura de canais KCa2+ em vasos de pequeno calibre. A fração também promove a fosforilação da enzima eNOS, pela via PI3K/Akt, mas não apresenta atividade antiaterogênica quando avaliada no modelo de aterogênese induzida pela dieta em camundongos C57/BL6 LDLr KO.

Memoria para optar el título de Bioquímico / La plasticidad homeostática mantiene la actividad sináptica y neuronal en rangos fisiológicos. En cultivos neuronales primarios, estos cambios compensatorios se inducen por perturbaciones prolongadas (48 horas) de la actividad neuronal utilizando fármacos. Así, al incubar cultivos con Bicuculina, un inhibidor de la neurotransmisión inhibidora (GABAérgica), aumenta la actividad neuronal. Los cambios compensatorios incluyen inhibición de la neurotransmisión excitadora, que está mediada por el neurotransmisor L-glutamato. En las sinapsis glutamatérgicas, los receptores post-sinápticos son principalmente canales iónicos que conducen cationes y existen subtipos de ellos basados en su perfil farmacológico diferencial. Así, el receptor tipo NMDA conduce sodio, potasio y calcio. Se ha propuesto que este receptor puede ser inhibido de manera homeostática por óxido nítrico (NO) frente a períodos de actividad aumentada, induciendo neuroprotección. NO modifica la actividad del receptor NMDA a través de S-nitrosilación de residuos de cisteína relevantes. Sin embargo, también se ha reportado que NO es tóxico. En el hipocampo, la sobre-estimulación del receptor NMDA activa a la óxido nítrico sintasa, que es calcio-dependiente, síntesis de NO y muerte neuronal por excitotoxicidad. También se sabe que diversas zonas cerebrales son diferencialmente sensibles a la excitotoxicidad, siendo el hipocampo una de las zonas más vulnerables. Para dilucidar los efectos controversiales del NO en nuestro laboratorio se realizaron ensayos de viabilidad celular en cultivos primarios de neuronas incubados con NMDA. Se usaron tanto cultivos primarios hipocampales como corticales, en los cuales se indujeron aumentos de actividad prolongadas por incubaciones por 48 horas con bicuculina. Después de un insulto excitotóxico con NMDA, se encontró que las neuronas corticales son más resistentes al daño excitotóxico comparado con neuronas hipocampales, en que la sobrevida celular alcanzó al 72,93 ± 4,75 y 71,17 ± 2,81% en cultivos control e incubados con bicuculina. La mayor sobrevida de cultivos corticales depende de NO y la neurotrofina BDNF y su receptor TrkB. En cambio, en neuronas hipocampales, se confirmó la toxicidad de NO y la presencia de BDNF no tuvo efecto sobre la viabilidad. Basados en estos hallazgos, la hipótesis de esta memoria es la siguiente: BDNF, a través de su receptor TrkB, induce síntesis de NO lo que lleva a modulación homeostática del receptor de NMDA en neuronas corticales pero no hipocampales. Esta vía no depende de fosforilación del receptor TrkB en el residuo Y515. Se encontró que BDNF es capaz de inducir síntesis de NO en neuronas corticales, pero no en hipocampales. Además, NO inhibe los influjos de calcio mediadas por el receptor de NMDA en neuronas corticales, pero no hipocampales. Esta vía neuroprotectora no pudo ser detectada en células hipocampales, en la cual el NO fue sintetizado principalmente en respuesta a estimulación NMDA, lo que no inhibió los influjos de calcio. Este estudio muestra que BDNF tiene un papel neuroprotector frente a un insulto excitotóxico en neuronas corticales pero no hipocampales, efecto que está mediado por NO. Por lo tanto, efectos biológicos opuestos del NO dependen de la vía de señalización implicada en su síntesis. Es posible que este mecanismo neuroprotector pueda ser potenciado en regiones cerebrales vulnerables a insultos excitotóxicos asociados a patologías como la epilepsia, isquemia y accidentes vasculares

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento. Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T18:08:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327458.pdf: 1187846 bytes, checksum: bb77d7020fe2410f5c0f4f5d63d46b99 (MD5) Previous issue date: 2014 / O glioblastoma multiforme é o tumor primário do sistema nervoso central mais frequente em adultos. No Brasil, segundo dados do INCA, a incidência de tumores deste tipo foi de 6,96/100 000 habitantes em 2005. A mediana de sobrevida é, geralmente, menor que um ano desde o diagnóstico, e a maioria dos pacientes (90% a 95%) evolui para óbito em dois anos. Com o intuito de procurar novas alternativas para o tratamento dessas neoplasias, diversos compostos têm sido estudados, entre eles, as chalconas. Chalconas são compostos fenólicos que fazem parte da via de biossintese de flavonóides em plantas e apresentam uma estrutura química simples e versátil. O objeto de estudo deste trabalho são três chalconas sintetizadas a partir da estrutura química comum da familia das chalconas, são elas A23, C31 e J11. Usando células de glioblastoma multiforme da linhagem comercial A172 e proveniente de ressecção cirúrgica, GBM1, essas substâncias foram testadas em diferentes ensaios para elucidação do seu mecanismo de funcionamento. Inicialmente foram realizados testes de viabilidade celular por MTT para determinar-se a concentração inibitória de 50% da ação (IC50) de cada uma das chalconas. Em sequência, esta concentração foi utilizada para observar e quantificar o tipo de morte, se apoptótica ou necrótica, causado. Tentando elucidar a maneira com que esses compostos causaram a morte ou a redução de viabilidade observadas, diferentes ensaios foram realizados. Primeiramente para se medir os níveis de espécies reativas de oxigênio e de oxido nitrico, foram utilizadas as sondas fluorescentes DCFDA e DAF-2, respectivamente. Além destes resultados, foi mensurada também a distribuição das células no ciclo celular. Com os dados obtidos foi possivel traçar um perfil aproximado dos mecanismos de ação de cada chalcona. Brevemente, A23 revelou-se um eficiente antioxidante e teve a maior taxa de indução de apoptose e necrose dentre as chalconas estudadas por uma via desconhecida. Contrariamente, C31 apresentou um efeito oxidativo e de aumento dos níveis de ON muito relevante, sendo por estas vias, sua provável ação de indução de apotose e consequente redução de viabilidade. Por último tem-se que J11, promoveu aumento nos níveis de apoptose apenas em GBM1 e teve uma ação antioxidativa em ambas as células testadas. Seu efeito redutor de viabilidade provavelmente se deve a indução da produção de altos níveis de ON e pelo seu efeito citostático, observado na análise do ciclo celular. Com o exposto neste estudo, foi possivel desvendar a ação de duas das três chalconas testadas e direcionar a pesquisa futura para as vias analisadas.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:35:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 330195.pdf: 1831812 bytes, checksum: f6a68fbb57eacf59ff3ac3dff0a9e6d9 (MD5) Previous issue date: 2014 / Abstract : Introdução: Nas últimas décadas, descobriu-se que o adipócito era capaz de secretar adipocinas e citocinas com funções autócrinas, parácrinas e sistêmicas, que influenciavam de maneira importante, todo o metabolismo dos organismos vivos. Dentre os fatores associados aos distúrbios da biologia do adipócito, podemos destacar o estresse oxidativo, intimamente relacionado à formação dos produtos finais de glicação avançada (AGEs). Esparsos trabalhos na literatura têm procurado elucidar o papel da via do óxido nítrico (NO.) na fisiologia do tecido adiposo. Essa via, por meio do aumento das concentrações de guanosina 3'5' monofosfato cíclico (GMPc), promove efeitos positivos na biologia do adipócito, e consequentemente maior equilíbrio no balanço energético e metabolismo sistêmicos. Outra maneira de incrementar as concentrações de GMPc é por meio da administração de inibidores da fosfodiesterase 5, medicamentos que no futuro talvez sejam úteis nos distúrbios do tecido adiposo, como a obesidade, e suas consequências. Objetivos: Identificar o impacto de uma dieta hipercalórica e hiperlipídica (dieta de cafeteria) sobre a variação do peso corporal, a ingestão alimentar, a resistência à ação da insulina, as concentrações séricas de adiponectina, bem como nas concentrações de fator de necrose tumoral a (TNFa), interleucina 6 (IL-6), NO. e AGEs no tecido adiposo visceral. Analisar o efeito do tadalafil na intensidade da resistência à insulina, nas concentrações séricas de adiponectina, assim como nas concentrações de TNFa, IL-6 e AGEs no tecido adiposo visceral. Métodos: Estudo analítico experimental controlado e com intervenção, envolvendo um total de 72 ratos machos Wistar, distribuídos em 06 subgrupos de 12 animais: subgrupo ração salina ? SGRS, recebeu ração e solução salina; subgrupo ração tadalafil - SGRT, recebeu ração e tadalafil; subgrupo ração magro - SGRM, recebeu ração e solução salina; subgrupo cafeteria salina - SGCS, recebeu dieta de cafeteria e solução salina; subgrupo cafeteria tadalafil - SGCT, recebeu dieta de cafeteria e tadalafil e subgrupo cafeteria magro - SGCM, recebeu dieta de cafeteria e solução salina. O estudo teve a duração de 10 semanas, e o peso dos animais e a ingestão alimentar foram registrados semanalmente. Foram mensuradas as concentrações séricas de insulina e adiponectina, bem como as concentrações de TNFa, IL-6, nitrito (metabólito do NO.) e compostos de Maillard (equivalente aos AGEs) no tecido adiposo, sendo que todo o material foi coletado no momento do sacrifício dos animais. Na análise estatística foram empregados os testes ANOVA one way com correção de Tukey,ANOVA two way e teste t pareado. Resultados: Foi observado um aumento significativo do peso corporal ao longo do estudo em todos os subgrupos. A média de peso final aos 60 dias foi superior nos animais alimentados com dieta de cafeteria. A ingestão alimentar em gramas foi maior nos animais alimentados com ração. Os animais alimentados com dieta de cafeteria apresentavam uma maior expansão do tecido adiposo. As médias do modelo de avaliação da homeostase para resistência à insulina (HOMA-IR) entre os subgrupos no final do acompanhamento não foram diferentes. A proporção da adiponectina sérica em relação ao tecido adiposo total foi maior nos animais que receberam dieta balanceada, e as concentrações de IL-6 foram maiores nos animais que receberam dieta de cafeteria. A concentração de nitrito foi maior nos animais submetidos à dieta balanceada. As concentrações médias de compostos de Maillard foram maiores nos animais submetidos à dieta de cafeteria e nos animais de maior peso. Nos animais submetidos à dieta de cafeteria e tadalafil a concentração de compostos de Maillard foi menor. Conclusão: A dieta de cafeteria por 60 dias, apesar de mais sacietógena, levou a uma média de peso ponderal e tecido adiposo visceral superiores nos animais a ela submetidos sem, no entanto, induzir a um aumento expressivo da resistência à ação da insulina. Apesar da expansão do tecido adiposo total, a dieta de cafeteria não foi capaz de aumentar proporcionalmente as concentrações de adiponectina, sugerindo a interferência de outros fatores na fisiologia desta adipocina. O aumento das concentrações de IL-6, no tecido adiposo visceral dos animais alimentados com dieta de cafeteria, indica um provável incremento no processo inflamatório local. A diminuição dos níveis de nitrito no tecido adiposo dos animais submetidos à dieta de cafeteria sugere um prejuízo à via do óxido nítrico, enquanto o aumento das concentrações de compostos de Maillard, e, por consequência de AGEs, uma intensificação do processo oxidativo. Outro fator relacionado aos compostos de Maillard foi o peso, já que os animais de menor peso apresentavam também uma concentração menor destes compostos. O uso do tadalafil não foi eficaz na redução da resistência à insulina, no aumento das concentrações séricas de adiponectina e na diminuição das concentrações de citocinas inflamatórias no tecido adiposo. No entanto, o tadalafil mostrou-se capaz de reduzir a concentração de AGEs no tecido adiposo de animais submetidos à dieta de cafeteria, sugerindo um possível efeito favorável sobre o estresse oxidativo.<br> / Abstract : Introduction: In recent decades, new discoveries demonstrated that the adipocytes were capable of secreting adipokines and cytokines with autocrine, paracrine and systemic functions, which influenced in important ways throughout the metabolism of living organisms. Among the factors associated with adipocyte biology disorders we can highlight oxidative stress, closely related to the advanced glycation end products (AGEs) formation. Few studies have sought to elucidate the role of nitric oxide (NO.) in the adipose tissue physiology. This pathway increases the titles of guanosine 3'5' cyclic monophosphate (cGMP), ultimately bringing positive effects on adipocyte biology, and consequently greater balance in energy control and systemic metabolism. Another way to increase cGMP levels is through the administration of phosphodiesterase-5 (PDE5) inhibitors, drugs that may be useful in the future in adipose tissue disorders, such as obesity and its consequences. Objectives: To identify the impact of a hypercaloric and hyperlipidic diet (cafeteria diet) on body weight variation, food intake, insulin resistance, serum adiponectin levels and visceral adipose tissue levels of tumor necrosis factor a (TNFa), interleukin 6 (IL-6), NO., and AGEs. To analyze the consequences of the administration of tadalafil in the intensity of insulin resistance, serum adiponectin levels, as well as visceral adipose tissue levels of TNFa, IL-6, and AGEs. Methods: Analytical controlled experimental intervention study involving a total of 72 male Wistar rats, divided into 06 subgroups of 12 animals: chow-saline subgroup (CSG) received chow and saline; chow-tadalafil subgroup (CTG) received chow and tadalafil; chow lean subgroup (CLG) received chow and saline; cafeteria diet-saline subgroup (CafSG) received cafeteria diet and saline; cafeteria diet-tadalafil subgroup (CafTG) received cafeteria diet and tadalafil; and cafeteria diet-saline lean subgroup (CafLG) received cafeteria diet and saline. The study lasted 10 weeks and weight gain and food intake were recorded weekly. Insulin and adiponectin levels were detected in serum. The concentrations of TNFa, IL-6, nitrite (NO. metabolite) and Maillard compounds (AGEs equivalent) were detected in adipose tissue. All the samples for testing were collected at the time of animals' sacrifice. In statistical analysis, one-way ANOVA test with Tukey correction, two-way ANOVA, and paired t test were applied. Results: A significant increase of body weight throughout the study was observed in all subgroups. The mean final weight at 60 days was higher in animals fedcafeteria diet. Food intake in grams was higher in animals fed with chow at many times of the study. Animals fed the cafeteria diet had greater expansion of epididymal and retroperitoneal adipose tissue. The mean homeostasis model assessment for insulin resistance (HOMA -IR) between subgroups at the end of follow-up was not different. The serum adiponectin levels in relation to total adipose tissue were higher in animals fed a balanced diet, and the IL-6 levels were higher in animals fed cafeteria diet. The nitrite concentration was higher in animals subjected to balanced diet. Mean levels of Maillard compounds were higher in animals subjected to the cafeteria diet, and in the animals with the highest weight. In animals submitted to the cafeteria diet and tadalafil, concentration of Maillard compounds was lower. Conclusion: Cafeteria diet for 60 days, although more satiating, led to a higher mean total weight and visceral adipose tissue in animals that were submitted to it, without, however, resulting in a significant increase in insulin resistance. Despite the total adipose tissue expansion, cafeteria diet was not able to proportionally increase adiponectin levels, suggesting the influence of other factors in this adipokine production. Increased levels of visceral adipose tissue IL-6 of animals fed cafeteria diet indicate a probable increase in the local inflammatory process. The decreased adipose tissue nitrite levels of animals subjected to the cafeteria diet suggest injury to the nitric oxide pathway, while increased Maillard compounds levels, and consequently of AGEs, an intensification of the oxidative process. Another factor related to Maillard compounds was the weight of the animals, as leaner animals showed lower concentration of these compounds. The use of tadalafil was not effective in reducing insulin resistance, increasing adiponectin levels, and decreasing inflammatory cytokines in adipose tissue. However tadalafil was capable of reducing AGEs levels in the adipose tissue of animals fed cafeteria diet, suggesting a possible favorable effect on oxidative stress.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:52:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327305.pdf: 1442510 bytes, checksum: 5fde4eea9cfd5385aece2ec737690160 (MD5) Previous issue date: 2014 / O choque séptico é um potente estímulo para a ativação de vários sistemas orgânicos e dentre eles, o sistema nervoso simpático (SNS) que, além dos efeitos nos vasos, também tem impacto no coração. Altas concentrações de adrenalina e noradrenalina são encontradas na circulação de pacientes com endotoxemia e sepse, sendo estes níveis diretamente relacionados com aumento da mortalidade dos indivíduos sépticos. Embora seja conhecido que a ativação simpática exacerbada é deletéria para a homeostase do organismo, ainda não é bem compreendido qual o papel da hiperativação simpática durante um quadro de choque séptico/sepse. Portanto, no presente trabalho nós estudamos o papel da transmissão ganglionar autonômica no que diz respeito à hiporeatividade a-adrenérgica do choque séptico, e, adicionalmente, examinamos as consequências do bloqueio ganglionar precoce na expressão de receptores a1D-adrenérgicos na aorta torácica de ratos, bem como em parâmetros inflamatórios e bioquímicos. Para isso, o choque séptico foi induzido por uma ligadura e perfuração do ceco (modelo de CLP) em ratos Wistar fêmeas. Uma hora após o procedimento de CLP, os animais receberam hexametônio (um bloqueador ganglionar), pentolínio (um bloqueador ganglionar mais seletivo para o gânglio simpático) ou salina (PBS). Seis e 24 h após a cirurgia de indução do choque séptico a resposta cardiovascular a agonistas vasoconstritores foi avaliada. Adicionalmente, 24 h após o procedimento de CLP, parâmetros inflamatórios e bioquímicos, hemograma, expressão de receptores a1D-adrenérgicos em aorta e curva de mortalidade foram avaliados. O choque séptico aumentou os níveis plasmáticos de nitrato e nitrito (NOx), ureia, creatinina, transaminases hepáticas (TGO e TGP), citocinas pró-inflamatórias (TNF-a e IL-1ß), bem como promoveu leucopenia e trombocitopenia. Além disso, os animais em choque séptico estavam hipotensos e hiporreativos à noradrenalina e fenilefrina. A hiporeatividade aos agentes vasoconstritores foi devida, pelo menos em parte, à redução na densidade dos receptores a1D-adrenérgicos na aorta da ordem de 60%. Finalmente, o choque séptico resultou em elevada mortalidade. O tratamento precoce com pentolínio reduziu os níveis plasmáticos de NOx e ureia, preveniu a hiporeatividade aos agonistas vasoconstritores, preservou a densidade dos receptores a1D-adrenérgicos na aorta e aumentou a sobrevida dos animais. Apesar do tratamento precoce com o12hexametônio ter sido capaz de prevenir a hiporeatividade à noradrenalina e fenilefrina, sua administração não resultou em nenhum efeito benéfico adicional. Assim, nossos resultados mostram claramente que a interferência com a transmissão ganglionar e consequente redução da hiperativação simpática, tem importante impacto no resgate da reatividade vascular à agonistas vasoconstritores e na redução da letalidade do choque séptico induzido por ligação e perfuração do ceco em ratos. Esses efeitos benéficos estão relacionados, em parte, com a manutenção da densidade dos receptores a1D-adrenérgicos nos vasos. Esses resultados podem levar à uma nova estratégia terapêutica no auxílio do tratamento do choque séptico/sepse.<br> / Abstract : Septic shock is a potent stimulus for the activation of several organic systems, including the sympathetic nervous system (SNS), which besides its effects on vessels, directly impacts on the heart. High circulating epinephrine and norepinephrine concentrations were reported during endotoxaemia and septic shock, being directly associated to high mortality in septic patients. Although it is known that sympathetic overstimulation is deleterious to homeostasis of the organism, the function of sympathetic hyperactivation during septic shock is poorly understood. Therefore, in this work we studied the role of autonomic ganglionic transmission with respect to a-adrenergic hyporeactivity in septic shock, and, additionally, examined the consequences of early ganglionic blockade on the density of a1D-adrenergic receptors in rat thoracic aorta, as well as inflammatory and biochemical parameters. For this, septic shock was induced by cecal ligation and puncture (CLP model) in female Wistar rats. One hour after surgery, animals received hexamethonium (a ganglionic blocker), pentolinium (a ganglionic blocker with a higher selectivity for sympathetic ganglia) or saline (PBS). Six and 24 h after surgery, the cardiovascular responses to adrenergic agonists were evaluated. In addition, 24 h after surgery, inflammatory and biochemical parameters, hemogram, the density of a1D-adrenergic receptors in aorta and survival were also evaluated. Septic shock increased plasma levels of nitrate and nitrite (NOx), urea, creatinine, hepatic transaminases (TGO and TGP), pro-inflammatory cytokines (TNF-a and IL-1ß) and promoted leukopenia and thrombocytopenia in CLP animals. Furthermore, the septic animals were hypotensive and showed hyporeactivity to norepinephrine and phenylephrine. The hyporeactivity to vasoconstrictors agents was due, at least in part, to the reduction of ~60% in a1D-adrenergic receptors density in the aorta. Septic shock also resulted in high mortality. Early treatment with pentolinium reduced plasma levels of NOx and urea, prevented the hyporeactivity to vasoconstrictors agents, preserved the density of a1D-adrenergic receptors in the aorta and increased survival. Notwithstanding the beneficial effect of the early treatment with hexamethonium on the hyporeactivity to noradrenaline and phenylephrine, no additional beneficial effects were observed. Thus, our results clearly show that interference, with the ganglionic transmission with the consequent reduction in sympathetic hyperactivation, has a15profound impact on the recovery of vascular reactivity to vasoconstrictor agonists and in reducing mortality of sepsis-induced by CLP in rats. These beneficial effects are related, in part, with the maintenance of the density of a1D-adrenergic receptors in vessels. These results may lead to a new therapeutic strategy for the treatment of sepsis/septic shock.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2013-07-16T00:36:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 224127.pdf: 1281267 bytes, checksum: 3b666a8a74b2a1c54415bfbd224e99f2 (MD5) / A própolis é uma resina natural produzida pelas abelhas e utilizada popularmente para o tratamento de inúmeras doenças, entre elas os processos inflamatórios. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar, através de estudos in vitro e in vivo, usando técnicas farmacológicas e bioquímicas, a atividade antiinflamatória da própolis padronizada do sul do Brasil (P1) e de seu principal constituinte, Artepillin C, e investigar a farmacocinética de absorção desse constituinte após a ingestão oral de própolis P1. Foram utilizados os modelos farmacológicos de inflamação in vivo: edema de pata, peritonite e prostaglandina E2 (PGE2) no lavado peritoneal, avaliação da atividade da eNOS em cultura de células do endotélio vascular (EA.HY926), determinação da produção de óxido nítrico em cultura de células RAW 264.7 estimuladas com LPS; avaliação da expressão e atividade da p38-MAPK em cultura primária de músculo liso vascular aórtico de rato (VSM) na presença de angiotensina II; avaliação da atividade específica do fator NF B em células HEK 293 trasnfectadas como gene de expressão do NF B, estimuladas com TNF . Além disso, foram avaliadas as concentrações plasmáticas de Artepillin C em camundongos tratados com própolis ou Artepillin C para a determinação de biodisponibilidade através de HPLC e CG acoplada a espectroscopia de massa. Os resultados demonstraram que a própolis ou Artepillin C possuem efeito antiedematogênico e antiinflamatório, reduzem a produção de PGE2 no lavado peritoneal, mas não afetam a expressão da enzima eNOS ou a sua atividade. No entanto, eles inibem a ativação de RAW 264.7 e a conseqüente produção de NO, e promovem a ativação do sistema da p38-MAPK em VSM, e inibem a ativação do NF B. Além disso, demonstramos que concentrações efetivas de Artepillin C são encontradas no plasma após a ingestão oral de própolis P1 e de Artepillin C, com pico de concentração máxima entre 1 e 2 h. Esses dados indicam que a própolis P1 e o Artepillin C possuem efeito antiinflamatório envolvidos, pelo menos em parte, com a inibição da produção de PGE2, pela inibição da atividade de macrófagos e conseqüente redução da produção de NO durante o processo inflamatório, pelo aumento da resistência vascular mediada pela ativação do sistema p38-MAPK e pela inibição do NF B. Esses resultados justificam o uso popular da própolis como antinflamatório e demonstram pela primeira vez que o Artepillin C pode se considerado um biomarcador importante para o controle químico e biológico da qualidade da resina de própolis no Brasil.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-20T17:43:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Este estudo avaliou a papel do óxido nítrico (NO) na latência de transferência (LT) de ratos no labirinto em cruz, um parâmetro de aprendizagem e memória. Ratos Wistar machos foram distribuídos em grupos e receberam (via i.p.), L-NAME (5,10,50mg.kg-1; inibidor da síntese de NO), D-NAME (50mg.kg-1), Escopolamina (SCO; 1mg.kg-1) e MK-801 (0.075, 0.15mg.kg-1; antagonista NMDA) ou Salina 0,9%. Outros grupos receberam uma co-administração de L-NAME (50mg.kg-1) e L-ARG (100 e 200mg.kg-1) ou L-NAME (5mg.kg-1) e MK-801 (0,075mg.kg-1). Trinta minutos após a administração das drogas, cada rato foi colocado no final do braço aberto e a LT para um braço fechado foi registrado (LT1); após 24h, o mesmo protocolo foi repetido (LT2). A administração de SCO, MK-801 (0,15mg.kg-1) e L-NAME (50mg.kg-1), mas não D-NAME, prolongou a LT2 indicando prejuízo na aprendizagem. A co-administração de L-ARG (200mg.kg-1) reverteu o déficit de aprendizagem induzido por L-NAME (50mg.kg-1). Ratos tratados com L-NAME (5 e 10mg.kg-1) exibiram aprendizagem, ainda que hipertensos. O prejuízo de aprendizagem induzido pelo L-NAME não é devido a hipertensão, mas provavelmente à inibição da síntese de NO no sistema nervoso central. A co-administração de doses sub-efetivas de L-NAME e MK-801 prejudicou a aprendizagem; é possível uma interação entre a síntese de NO e os receptores NMDA na aprendizagem da LT em ratos.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T21:45:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 204945.pdf: 262144 bytes, checksum: db663bf54acf11b487a1120421fd357d (MD5)

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T22:07:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Avaliamos a relação entre o [óxido nítrico] (NO), a enzima guanilato ciclase solúvel e [canais de potássio] no estabelecimento da [hiporresponsividade] vascular à fenilefrina (Fen) durante o [choque séptico] em ratos. Os efeitos pressóricos da Fen são menores em ratos tratados com LPS 8 ou 24 horas antes do experimento. O pré-tratamento com inibidores da NO sintase (nitro-L-arginina metil éster ou aminoguanidina) preveniu a hiporresponsividade causada pelo LPS. Porém, quando administrado apenas uma vez, antes da Fen, o L-NAME reverteu a hiporresponsividade na 8a hora de endotoxemia, mas não na 24a hora. Por sua vez, o 1H-[1,2,4]-oxadiazolo-[4,3-a]-quinoxalin-1 (ODQ) reverteu a hiporresponsividade na 24a hora de endotoxemia, mas não na 8a hora. O [tetraetilamônio] normalizou os efeitos da Fen tanto 8 como 24 horas após o LPS. A imunoeletroforese para a isoforma induzida da NO sintase (iNOS) revelou que a expressão dessa enzima é alta na 8a hora após o LPS e quase indetectável na 24a hora de endotoxemia. O NO, oriundo da iNOS, é importante para iniciar o estado de hiporresponsividade à Fen, mas não para mantê-lo por longos períodos. O aparecimento e a manutenção da hiporresponsividade vascular parece depender da interação entre o NO, a guanilato ciclase e canais de potássio. Animais submetidos a cirurgia para ligadura e perfuração do ceco tiveram a duração dos efeitos vasodilatadores da [bradicinina] aumentada. Os bloqueadores de canais de potássio, tetraetilamônio, 4 aminopiridina e glibenclamida normalizaram as respostas para a BK. O aumento na responsividade à BK foi evitado pela aminoguanidina. A responsividade à BK é maior em animais sépticos e seus efeitos são mediados por receptores B2 da bradicinina, num processo dependente da produção de NO e da abertura de canais de potássio.