La dystrophie facioscapulohumérale (FSHD) est une dystrophie musculaire autosomique dominante, dégénérative et progressive. Les traitements élaborés jusqu'à présent n'ont pas réussi à améliorer le quotidien des patients FSHD. Plusieurs études se sont focalisées sur les mécanismes moléculaires de cette pathologie, néanmoins plusieurs d'entre elles sont contradictoires. La vision actuelle de la FSHD est celle d'une pathologie due à un mécanisme épigénétique complexe et les mécanismes moléculaires responsables de cette pathologie sont encore mal connus. Plusieurs analyses comparatives des profils d'expression des ARNm et des protéines de muscles de patients atteints de FSHD et de contrôles ont permis de montrer que plusieurs gènes impliqués dans le stress oxydant sont dérégulés de façon spécifique dans les muscles FSHD. Nos travaux ont permis de montrer dans la FSHD, aussi bien au niveau systémique, musculaire et cellulaire (cultures primaires musculaires) une augmentation des dommages oxydatifs qui se traduisent par une augmentation des peroxydes lipidiques et protéines oxydées, associés à une altération des défenses antioxydantes. Ce stress oxydant dans les biopsies musculaires et cultures primaires musculaires est associé à un dysfonctionnement mitochondrial. Des analyses plus fines sur l'action des espèces réactives de l'oxygène et leurs sources pourraient contribuer à une meilleure compréhension des bases physiopathologiques de la FSHD et permettre la sélection de thérapeutiques adaptées aux anomalies des patients FSHD. / Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is an autosomal inherited muscular dystrophy. Actually no treatment led to improve the quality of life. Many studies have been focused on the molecular mechanisms of this disease, several of them were contradictory. The present view of the FSHD seems to be due to a complex epigenetic mechanism. Actually, no gene has been identified. Several comparative studies permit the identification of many genes involved in oxidative stress, deregulated in FSHD myoblasts and biopsies in comparison to healthy ones. Analysis of oxidative stress markers show that patients with FSHD present increased oxidative damage in blood as well as in biopsy muscle and muscular primary cell culture associated with altered antioxidant enzyme defenses. Oxidative stress is also associated with mitochondrial dysfunction. Complementary studies focusing in pathway of reactive oxygen species would contribute to a better understanding of pathophysiological bases of FSHD in order to establish a very helpful therapeutics for FSHD patients.

Selon la FAO, 2 milliards de personnes souffrent de la « faim cachée » qui correspond aux carences en micronutriments incluant la carence en vitamine A, principale cause de cécité dans le monde. Par ailleurs, une alimentation excédentaire est source de stress oxydant pour le corps, facteur de risque de nombreuses maladies non transmissibles comme le diabète et les maladies cardiovasculaires. Contenus dans les produits végétaux, certains caroténoïdes représentent une source indirecte de vitamine A et pourraient participer aux effets bénéfiques de la consommation de fruits et légumes via des propriétés antioxydantes. Dans cette thèse, le comportement in vitro des caroténoïdes et rétinoïdes pendant la digestion a été étudié, depuis leur libération de la matrice alimentaire jusqu'à leurs interactions avec les cellules intestinales. Mes recherches s'articulent autour de la micellisation : processus clé de l'absorption des caroténoïdes et rétinoïdes. Dans un premier temps, la stabilité et la bioaccessibilité en digestion in vitro de ces composés purs ont été comparées à celles de leurs homologues issus d'un jus de carotte, d'épinards crus et cuits et d'une farine fortifiée. Dans un deuxième temps, un nouveau modèle d'oxydation de nano-émulsions intestinales à base de sels biliaires (SB) a été développé. Les relations entre structure des micelles mixtes, réactivité à l'oxydation et protection par des antioxydants ont été étudiées grâce notamment au suivi de la dégradation des acides gras. Enfin, des expériences préliminaires ont été menées sur la réactivité enzymatique de cellules coliques (Caco-2) à divers oxydants et aux micelles mixtes. Pendant la digestion in vitro, le β-carotène et palmitate de rétinyl purs étaient particulièrement instables contrairement à la lutéine et à l'acétate de rétinyl. De plus, la matrice alimentaire protège ces composés et favorise leur bioaccessibilité surtout lorsqu'elle est broyée ou cuite. En effet, les prétraitements ont un impact conséquent sur la libération des caroténoïdes et doivent être considérés comme des moyens sérieux pour optimiser les apports. Les nano-émulsions intestinales mises au point se composaient de micelles mixtes sphériques ou cylindriques, ces dernières étant les moins résistantes à l'oxydation. En effet, la distribution des molécules de SB doit être différente selon la morphologie de la micelle, impactant ainsi leur réactivité. Dans nos conditions expérimentales, l'AAPH fut le seul oxydant efficace. L'α-tocophérol et la lutéine ont significativement ralenti la dégradation des acides gras contrairement au β-carotène. Leur place au sein de la micelle (cœur ou bordure) pourrait expliquer ces observations. Enfin, aucun des oxydants testés n'a significativement modifié l'activité catalase des cellules Caco-2. En revanche, la mise en contact avec les micelles à base de SB ont significativement diminué l'activité des 3 enzymes suivies. L'effet était positivement corrélé à la concentration en SB dont la conjugaison fut un élément déterminant. Finalement, le β-carotène, la lutéine, et l'acétate de rétinyl présents dans ces micelles ont en partie rétabli l'activité de la catalase contrairement au rétinol, palmitate de rétinyl et à l'α-tocophérol. / According to the FAO, two billions of people suffer from the « hidden hunger » which corresponds to micronutrient deficiencies and includes the vitamin A deficiency, principal cause of blindness throughout the world. Besides, an excessive food consumption entails an oxidative stress for the organism which increases the risk to develop non communicable diseases such as diabetes and cardiovascular diseases. Present in numerous fruits and vegetables, some carotenoids are an indirect source of vitamin A and could also contribute to the health benefits of the consumption of fruits and vegetables via antioxidant properties. In this thesis, in vitro behaviour of carotenoids and retinoids during in vitro digestion (IVD) has been studied, from their release from dietary matrices to their interactions with intestinal cells. My research is structured around micellisation: key process of carotenoid and retinoid absorption. First, stability and bioaccessibility during IVD of these pure compounds have been compared with those of their homologues from carrot juice, raw and cooked spinach and fortified flour. Second, a new model of oxidation of intestinal bile salt (BS)-based nanoemulsions has been developed. Relations between mixed micelles structure, reactivity to oxidation and protection by antioxidants have been studied using fatty acid degradation monitoring. Finally, preliminary experiment were carried out on enzymatic reactivity of colon cells (Caco-2) to various oxidants and mixed micelles. During IVD, pure β-carotene and retinyl palmitate were particularly unstable conversely with lutein and retinyl acetate. Moreover, the dietary matrix protected these compounds and favoured their bioaccessibility especially when it was grounded or cooked. Indeed, pre-treatment have a significant impact on carotenoid release and should be considered as serious means to optimize intake. Developed intestinal nanoemulsions constituted of spherical or cylindrical micelles, the latter being less resistant to oxidation. Distribution of BS molecules is likely to differ according to the micelle morphology, thereby influencing their reactivity. In our experimental conditions, AAPH only was efficient as oxidant. Lutein and α-tocopherol significantly slowed fatty acid degradation, conversely with β-carotene. Their location within the micelle (core or border) could explain these observations. Besides, none of the tested oxidant significantly modified the catalase activity of Caco-2 cells. However, the contact with BS-based nanoemulsions significantly decreased the activity of the three tested enzymes. This effect was positively correlated with BS concentration whose conjugation revealed determining. Finally, β-carotene, lutein and retinyl acetate in micelles partly re-established catalase activity, conversely with retinol, retinyl palmitate and α-tocopherol. To conclude, IVD is an easy tool which allows independent comparisons of several parameters on micronutrient behaviour during digestion. Furthermore, the confrontation of different matrices may help to develop relevant strategies against vitamin A deficiency. Proposed nanoemulsions displayed various physical and chemical characteristics, thereby influencing their reactivity to oxidation. The antioxidant capacity of lutein and α-tocopherol could be observed in this new model. Lastly, the preliminary results on Caco-2 cells revealed some interesting interactions between micellised BS and antioxidant enzymes. Numerous questions arose that could not be addressed in this work but open perspectives for the future.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont en augmentation au niveau mondial et sont désormais un problème de santé publique coûteux. La suralimentation et le manque d'activité physique sont des facteurs clé dans le développement pathologique. Ces dernières années, les études sur la pathogenèse des MCV ont mis en évidence de nombreux facteurs contribuant au développement de ces pathologies complexes, notamment le surpoids, l'obésité centrale, le stress oxydant, l'inflammation vasculaire et systémique, la résistance à l'insuline ou encore la dysfonction endothéliale. La prévention de ces désordres est donc la cible des stratégies pharmaceutiques et diététiques et les polyphénols ont d'ores et déjà démontré des effets bénéfiques et préventifs. Parmi les 8000 composés phénoliques décrits à ce jour, le resvératrol a émergé en tant que candidat robuste dans la prévention des pathologies liées à la nutrition. L'objectif de ce travail a été d'étudier les potentialités d'action d'un extrait de sarment de vigne (Vineatrol®) et de vins rouges riches en resvératrol et ses oligomères, sur un modèle animal d'athérosclérose nutritionnellement induite. La première partie de cette étude a consisté à mettre au point un régime alimentaire déclenchant au mieux l'athérosclérose précoce chez le hamster Syrien doré. A partir de ce modèle, un effet préventif du Vineatrol® a été mis en évidence : le Vineatrol® induit une diminution des dépôts lipidiques aortiques mais améliore également le statut oxydatif et inflammatoire des animaux. Dans une troisième partie, des vins rouges enrichis en Vineatrol® ont démontré des effets préventifs sur certains facteurs de risque de la pathologie athéromateuse et sur les désordres liés à la consommation d'un régime gras. Des mécanismes d'action possibles, expliquant les effets bénéfiques de ces vins, ont été envisagés et recherchés. Ces mécanismes pourraient impliquer une modulation de la voie du NF-κB et/ou de SIRT1. Le degré d'importance de ces différentes voies devra être confirmé. / Cardiovascular diseases (CVD) are increasing globally and are now an expensive public health problem. Overnutrition and lack of physical activity are key factors in the disease development. In recent years, studies on the pathogenesis of CVD showed many factors contributing to the development of these complex diseases including overweight, centralobesity, oxidative stress, vascular and systemic inflammation, insulin ressitance or endothelial dysfunction. Prevention of these disorders is the focus of pharmaceutical and dietarystrategies and polyphenols have already demonstrated beneficial and preventive effects. Among the 8000 phenolic compounds described to date, resveratrol has emerged as a strong candidate for the prevention of nutrition-related diseases.The objective of this work was to study the potential action of vine shoot extract (Vineatrol®) and red wines rich in resveratrol and its oligomers, in an animal model of nutritionallyinduced atherosclerosis.The first part of this study was to develop a diet triggering the best early atherosclerosis in theSyrian golden hamster. From this model, a preventive effect of Vineatrol® was highlighted: Vineatrol® induces adecrease in aortic lipid deposition but also improves the oxidative and inflammatory status of the animals. In the third part , Vineatrol®-enriched red wines showed preventive effects on risk factors foratherosclerotic disease and disorders related to the consumption of a high-fat diet. Possible mechanisms of action, explaining the beneficial effects of these wines have been consideredand sough. These mechanisms could involve modulation of the NF-κB and/or SIRT1pathways. The degree of importance of these different pathways will have to be confirmed.

L'insulinorésistance (IR), touchant 80% des sujets obèses, forme, aux côtés du déficit insulinosécrétoire, l'un des deux mécanismes physiopathologiques clés du diabète de type 2. Sa prévention nécessite de bien en comprendre les mécanismes inducteurs. Les facteurs nutritionnels tels que la surconsommation d'aliments hypercaloriques pauvres en micronutriments antioxydants jouent un rôle majeur. Ils conduisent à une production de radicaux libres excédant les défenses antioxydantes et donc à un stress oxydant qui a été proposé comme étant un trait d'union entre la surconsommation alimentaire et l'IR. Dans ce contexte, mon travail de thèse a visé à évaluer si des polyphénols (PP) de raisin rouge, composés phytochimiques antioxydants, étaient capables de moduler favorablement la cascade d'évènements conduisant de la suralimentation au stress oxydant et à l'IR. Ainsi des sujets sains à risque de développer une IR ont été supplémentés durant 9 semaines avec un extrait de raisin riche en PP. Pour sensibiliser les effets potentiels des PP, une surcharge en fructose a été donnée au cours des 6 derniers jours du protocole. Chez nos volontaires nous avons étudié : le statut redox, l'inflammation, la production d'adipokines, l'activité mitochondriale et l'insulinosensibilité par clamp euglycémique à deux paliers. Les résultats obtenus démontrent que les PP de raisins préviennent l'IR hépatique et musculaire en inhibant le stress oxydant et la dysfonction mitochondriale induite par une surcharge en fructose. En conclusion, ces travaux suggèrent l'intérêt thérapeutique d'une supplémentation en antioxydants naturels à doses nutritionnelles de PP de raisins, pour la prévention de l'IR. / Insulin resistance (IR), found in 80% of obesity cases, constitutes with insulin secretory deficiency one of the two key physiopathological mechanisms of type 2 diabetes. In order to better prevent it, in depth knowledge of its inducing mechanisms is required. Nutritional factors such as overconsumption of hypercaloric foods poor in antioxidant micronutrients play a pivotal role. The latter activate an overproduction of free radicals exceeding antioxidant defenses leading to oxidant stress, which is considered to be a unifying mechanism for nutrient overconsumption and IR. In this context, my thesis work aimed to determine if red grape polyphenols (PP), antioxidant phytochemicals, were capable to favorably modulate the cascade of events leading from overconsumption to oxidant stress to IR. Thus healthy subjects at risk of developing IR were supplemented for 9 weeks with an enriched PP grape extract. In order to study PP potential effects in a environment under metabolic stress, during the last 6 days of the protocol volunteers received a fructose overload. Throughout investigations the following parameters were studied: inflammation, adipokine production, mitochondrial activity and insulin sensitivity evaluated by a 2 step glucose clamp.The results obtained demonstrate how red grape PP prevent hepatic and muscular IR by inhibiting oxidant stress and mitochondrial dysfunction induced by fructose overload.In conclusion, this study illustrates the therapeutic efficiency of natural antioxidant supplementation in the form of nutritional doses of grape PP in the prevention of IR.

Les flavonoïdes sont des composés naturels appartenant à la famille des polyphénols, qui sont étudiés depuis de nombreuses années pour leur caractère antioxydant ainsi que leurs propriétés thérapeutique. La mise en évidence, pour certaines d’entre eux, d’une activité vasorelaxante variant en fonction de leur structure, en fait un modèle d’étude de choix pour la prévention des maladies cardiovasculaires. Le 3’,4’-dihydroxyflavonol (DiOHF) est le dérivé le plus décrit pour son fort potentiel en terme de propriétés cardioprotectrices et antioxydantes et est considéré comme un composé d’intérêt dans le traitement anti-ischémique, bien que sa faible solubilité dans l’eau soit un facteur limitant pour son utilisation. Dans ce contexte, notre premier objectif a été de synthétiser une trentaine de dérivés du DiOHF, fonctionnalisés par un groupement hydrophile, tout en préservant ses propriétés antioxydantes et pour certaines des structures obtenues, ses propriétés vasorelaxantes. Pour cela, nous avons développé une méthode de synthèse rapide utilisant les irradiations micro-onde, qui nous a permis d’optimiser les rendements, de réduire les temps de réaction et qui ne conduit à aucune formation de sous-produits. Notre second objectif a été de déterminer l’activité antioxydante de ces dérivés flavonoïques par des tests mettant en œuvre des réactions de compétition avec des radicaux libres. Faisant suite à ce premier screening, des études biologiques chez le rat ont été réalisées sur les composés montrant les meilleures performances. A partir d’essais in vitro et in vivo nous avons démontré, l’innocuité de ces dérivés flavonols, et le fort impact des modifications de structure sur l’activité vasorelaxante et antioxydante, ainsi que sur la récupération fonctionnelle et métabolique consécutive à une ischémie/reperfusion myocardique. Un autre champ d’action de ces flavonols hydrosolubles pourrait être d’explorer leur utilisation dans le traitement du diabète de type 2. Pour cela nous avons greffé deux motifs antidiabétiques, correspondant à des molécules actives déjà utilisées dans le traitement de l’insulinorésistance, sur les dérivés flavonols les plus cardioprotecteurs et/ou vasorelaxants de notre série, ainsi que sur des dérivés de l’acide cinnamique. Ces composés ont été testés pour leur activité antioxydante, laissant supposer un potentiel significativement supérieur aux analogues antidiabétiques non fonctionnalisés, en termes de protection antioxydante et fonctionnelle. / Flavonoids are natural polyphenolic compounds, and epidemiological and pharmacological studies have shown that flavonoids intake is associated with many beneficial effects. An important example is the 3’,4’-dihydroxyflavonol (DiOHF) which showed interesting therapeutic properties in vitro so it could be considered as an important lead compound to the treatment of cardiovascular diseases. However is poor water solubility prevents it use as a drug. Starting from this model we have synthesized a series of new flavones functionalized by a hydrophilic group in order to increase water solubility. To obtain these derivatives we have set up a fast, simple and clean method without formation of by-products, using micro-waves irradiation to optimize yield and to decrease reaction time. Our second purpose was to investigate the antioxidant activity of the synthesized compounds by undergoing several assays. The most promising compounds were tested in biological studies, in vitro and in vivo. The results showed a significant enhancement of the post-ischemic mechanical function recovery in vivo and in vitro. Another purpose was to designed new flavonols linked to selected antidiabetic moieties already used in the treatment of insulinoresistance. It was shown that these new compounds retain the antioxidant properties of the parent flavonols, and can be of interest in the development of new diabete 2 treatments.

Notre travail de thèse avait pour buts d’explorer les mécanismes de contrôle de la fonction respiratoire au cours de l’exercice incrémentiel maximal mais également de corréler les évènements biochimiques associés à l’exercice progressif aux modifications de l’électromyogramme des muscles participant à l’effort. Les résultats de nos trois études ont montré : 1) que la baisse de PO2, intervenant pendant les premiers paliers d’un exercice incrémentiel maximal, était bien dépendante d’une défaillance de la commande centrale de la réponse ventilatoire. 2) que le pattern ventilatoire durant la période située entre le seuil ventilatoire (VTh) et le 2ème seuil (RCP) lors d’un exercice incrémentiel, pouvait évoluer selon deux modalités différentes, l’une caractérisée essentiellement par une augmentation de VT (un tiers des sujets) et l’autre déterminée majoritairement par une augmentation de FR. L’hypothèse d’une différence interindividuelle du gain du réflexe de Hering-Breuer peut être évoquée pour expliquer ces différents modes ventilatoires pendant l’exercice ; 3) qu’il est mesuré une augmentation de la concentration plasmatique de l’IMA (marqueur du stress oxydatif), corrélée à la consommation de RAA (antioxydant endogène), durant la phase la plus intense de l’exercice incrémentiel. L’adaptation de la commande motrice via le mécanisme d’épargne musculaire (« muscle wisdom ») n’intervient que chez les sujets qui développent un stress oxydatif. Ainsi, la variabilité interindividuelle mesurée dans l’amplitude du stress oxydatif, à niveau d’exercice comparable, affecte la capacité des sujets à lutter contre la fatigue musculaire. / The aim of our PhD work was to explore, in healthy humans, the control mechanisms of the respiratory function during a maximal incremental exercise and also to correlate the changes in the motor control of working muscles to the changes in exercise-induced blood signals. The results of our three studies showed:1) The occurrence of a PO2 fall during the first steps of the incremental exercise, associated with a modest PCO2 increase, strongly suggests a non-adaptation of the central command to the oxygen demand and CO2 washout;2) Two opposite changes in the ventilatory pattern were observed between the ventilatory threshold (VTh) and the respiratory compensation point (RCP); one third of the subjects tends to recruit predominantly VT and the others the breathing frequency. The hypothesis of an inter-individual difference in the strength of the Hering-Breuer reflex seems to be the more consistent explanation. 3) The plasma concentration of IMA, a marker of the oxidative stress, increased at the highest levels of incremental exercise and was correlated to the consumption of endogenous antioxidant (RAA). Because we observed that the adaptive motor response to cycling (leftward shift of the EMG spectrum) closely depends on the importance of the oxidative stress response, we hypothesized that all the healthy subjects do not have the same chances to be protected against muscle fatigue.

Le PACAP38 est un polypeptide endogène secrété par le thalamus exerçant différents rôles physiologiques tels que vasodilatateur, immunomodulateur ou encore, analgésique. Selon certaines études, il aurait, également, un impact sur les processus cognitifs au niveau de l’hippocampe. Cependant, son mécanisme d’action est assez peu connu. Son analogue, récemment synthétisé, a, quant à lui, été très peu étudié. Il s'agit d'une version beaucoup plus stable et avec une meilleure affinité aux récepteurs au PACAP que le peptide natif.Le travail effectué et présenté dans ce mémoire a permis de comparer les effets du PACAP38 et de son analogue sur le processus de mémorisation chez des rats ayant subit des expériences de navigation spatiale hippocampo-dépendante.Lors du test de l'objet déplacé (OLT), nous avons montré qu'une dose de 30 µg/kg de PACAP38 injecté en intraveineuse améliore la consolidation de la mémoire chez des rats souffrant de troubles cognitifs induits par une injection en intrapéritonéale de lipopolysaccharides ou d'ifenprodil. L'analogue n'a, quant à lui, pas permis de réduire ces troubles.Lors du test de la piscine de Morris, le PACAP38 a exercé un effet promnésique mais pas l'analogue.Il s'est avéré que le PACAP38 contribue à l'amélioration des processus cognitifs par son activité antioxydante, en régulant les taux de cytokines pro et anti-inflammatoires et les taux de BDNF centraux d'une manière plus efficace que celle de l'analogue. / PACAP38 is an endogenous polypeptide secreted by the thalamus. It is exerting different physiological roles such as vasodilator, immunomodulator or analgesic. According to some studies, it would also have an impact on cognitive processes in the hippocampus. However, its action mechanism is relatively unknown. Its analog, recently synthesized, has, for its part, been studied very little. It is a much more stable version with better affinity to PACAP receptors than the native peptide.The work performed compares the effects of PACAP38 and its analog on memory process in rats that had undergone hippocampo-dependent spatial navigation experiments.In the object location test (OLT), we have shown that a 30 µg/kg dose of PACAP38 injected intravenously improves memory consolidation in rats with cognitive impairment induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharides or ifenprodil. The analog was not able to reduce these disorders.In the Morris water maze test, PACAP38 exerted a promnesic effect but not the analog.It has been found that PACAP38 contributes to the improvement of cognitive processes by its antioxidant activity, by regulating pro and anti-inflammatory cytokine levels and central BDNF levels in a more efficient manner than the analog. .

Chez les plantes, les stress biotiques et abiotiques causent la surproduction d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les chloroplastes et les mitochondries. Ces ROS provoquent des dommages parfois irrémédiables pour la cellule ou déclenchent des voies de signalisation rétrogrades qui induisent la tolérance au stress. En parallèle, le génome nucléaire contrôle le développement et l’activité des organites grâce à la signalisation antérograde. Dans ce contexte, le complexe nucléaire Topoisomérase VI (Topo VI) a été étudié chez Arabidopsis thaliana. Topo VI est un régulateur des gènes de réponse à la signalisation rétrograde de la ROS oxygène singulet ; toutefois, les mécanismes qui régissent cette régulation sont inconnus. Afin de les déterminer, des interacteurs de la Topo VI ont été mis en évidence dont la sous-unité alpha du facteur général de transcription TFIIF (TFIIFα). Après caractérisation de l’expression du gène TFIIFα et des isoformes protéiques codées, des analyses transcriptomiques réalisées en condition standard de croissance et en condition de stress photo-oxydant ont montré que Topo VI et TFIIFα co-régulent la majorité des gènes de réponse à ce stress. De plus, ces interacteurs ont un rôle opposé dans la régulation de l’expression de gènes « PentatricoPeptide Repeat » (PPR). Les protéines PPR sont adressées aux chloroplastes et aux mitochondries dans lesquels elles participent à la régulation post-transcriptionnelle ; chez des mutants tfIIfα, des gènes PPR impliquées dans l’édition des ARN sont réprimés et l’édition de sites cibles associés est parfois altérée. Les conséquences de ces altérations sont discutées par l’analyse de fonctions chloroplastiques. / Under biotic and abiotic stress, plants overproduce reactive oxygen species (ROS) in plastids and mitochondria. ROS can cause damages sometimes definitive for cells or trigger retrograde signalling pathways to the nucleus that provide stress tolerance. Concurrently, the nuclear genome controls the development and the activity of organelles through anterograde signalling. In this context, the nuclear complex Topoisomerase VI (Topo VI) is studied in Arabidopsis thaliana. Topo VI is a regulator of stress responsive genes in the retrograde signalling triggered by the singlet oxygen ROS; nevertheless, the mechanisms controlling this regulation are still unknown. To determine them, Topo VI interactors were found out, including the alpha subunit of the general transcription factor TFIIF (TFIIFα). TFIIFα gene expression and the encoded protein isoforms were first characterized and then, transcriptomic analysis in standard growth conditions and under photo-oxidative stress showed that Topo VI and TFIIFα co-regulate most of stress responsive genes. Moreover, these interactors have an opposite role in the expression of "PentatricoPeptide Repeat" (PPR) genes. PPR proteins are targeted to plastids or mitochondria in which they contribute to post-transcriptional regulation mechanisms; in tfIIfα mutants, PPR genes involved in organellar RNA editing are down-regulated, and the editing of associated target sites was sometimes impaired. Possible consequences of this impairment were discussed through the analysis of plastidial functions.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie génétique caractérisée par une dégénérescence des muscles squelettiques accompagnée d’une myotonie. Cette maladie est due à une expansion instable de triplets CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. L’accumulation des ARNm DMPK mutés au sein de foci nucléaires conduit à la séquestration du facteur d’épissage MBNL1 et à des altérations de l’épissage alternatif de nombreux ARNm. En particulier, l’inclusion de l’exon 5 au sein du pré-ARNm de la troponine T cardiaque (hcTNT) est renforcée chez les patients DM1. Cette inclusion anormale participe aux anomalies cardiaques présentées par les patients. Les travaux de l’équipe, menés en collaboration avec l’équipe de Nicolas Sergeant à Lille, sur la régulation de l’épissage de l’ARNm hcTNT avaient établi l’existence de 8 sites MBNL1, dont 6 nouveaux, situés de part et d’autre de l’exon 5 et la présence de régions activatrices et inhibitrices de l’inclusion fixant des facteurs d’épissage dont l’identité n’était pas connue. L’un des objectifs de ma thèse était d’étudier l’importance fonctionnelle in cellulo de chacun des 8 sites MBNL1. J’ai ainsi pu montrer que chacun des 6 nouveaux sites participe à l’inhibition de l’inclusion de l’exon 5 par MBNL1. Les données obtenues nous ont amené à proposer un modèle dans lequel MBNL1 s’associe avec les triplets de sites MBNL1 situés de part et autre de l’exon 5 et entraine la formation d’une structure à longue distance via des interactions protéiques MBNL1-MBNL1. Cette structure isolerait l’exon 5 dans une boucle et limiterait la fixation du spliceosome. Par ailleurs, j’ai mis en œuvre une approche de purification de RNP formées en extrait nucléaire pour identifier d’autres facteurs régulant l’inclusion de l’exon 5. La protéine hnRNP H a ainsi pu être identifiée. Sa capacité à activer l’inclusion de l’exon 5 in cellulo et à entrer en compétition avec MBNL1 pour la régulation de l’inclusion de l’exon 5 via sa fixation sur des sites localisés dans l’exon 5 et en aval de cet exon a pu être confirmée. La seconde partie de ma thèse a porté sur l’étude de l’effet d’un stress oxydatif généré par 500 µM d’H2O2 sur le profil global d’épissage alternatif des pré-ARNm de cellules HeLa. Lors de ce travail, j’ai pu établir que la réponse des cellules HeLa au stress oxydatif implique deux phases de réponse : une phase précoce (1h-8h) caractérisée par un fort taux de mortalité associé à une forte augmentation du taux de d’entités oxygénées réactives (ROS) intracellulaire et une phase tardive (16h-24h) corrélée à une diminution du taux de ROS intracellulaires et une surexpression des ARN satellite III. Sur la base de ces données, une analyse globale du transcriptome par emploi de puces à exons (Affymetrix) a été réalisée à partir d’ARN totaux isolés 1h, 2h, 4h et 24h après le début du stress. Nous avons ainsi identifié des modulations d’expression et d’épissage spécifiques de chacune des deux phases. L’analyse des données par des outils bio-informatiques a permis de mettre en évidence des fonctions cellulaires bien définies qui sont plus particulièrement affectées lors d’un stress oxydant. Enfin, pour comprendre l’origine des variations d’épissage observées lors d’un stress oxydant, j’ai entrepris d’analyser les effets de ce stress sur le niveau d’expression et la localisation cellulaire des composants du spliceosome ou des facteurs qui s’associent pour réguler son activité / Myotonic distrophy of type 1 (DM1) is a genetic disease characterized by skeletal muscle degeneration associated to myotonia. DM1 results from the instable expansion of CTG repeats within the 3’ untranslated region of the DMPK gene. The accumulation of mutated DMPK mRNAs within nuclear foci leads to the sequestration of the MBNL1 splicing factor and causes splicing misregulation of numerous pre-mRNAs. Among altered events the increase of the inclusion of exon 5 in the human cardiac troponin T (hcTNT) mRNA is of particular importance, since it contributes to the cardiac symptoms presented by the patients. Through collaborative work with N. Sergeant’s team from Lille, the team has studied the molecular bases of hcTNT exon 5 inclusion regulation and mapped 8 MBNL1 binding sites, including 6 new ones, within intronic regions surrounding exon 5. They also identified positive and negative splicing regulatory elements of which protein partners remain unidentified. The first objective of my PhD thesis was to test the functional importance of each individual MBNL1 binding site. The obtained results established that the 6 newly identified MBNL1 binding sites are involved in splicing regulation by MBNL1 and lead us to propose a new regulation model in which MBNL1 binds on triplets of MBNL1 sites present on each side of exon 5 and form a long distance structure via MBNL1-MBNL1 protein interaction. The formation of this looping-structure is expected to isolate exon 5 and limit its recognition by the spliceosome. In addition I searched for protein partners of the identified regulatory elements by affinity chromatography. By this way, I identified hnRNP H as a positive regulator of exon 5 inclusion. Its capacity to compete with MBNL1 to regulate splicing in cellulo by binding on exonic and intronic binding sites was further confirmed. The second part of my PhD work corresponds to the study of the global impact of oxidative stress, generated by exposition of HeLa cells to 500 µM of H2O2, on alternative splicing. This allows us to establish that the response of HeLa cells to oxidative stress involve two distincts phases: an early one (1h-8h) characterized by poor survival rate and high intracellular ROS content and a late phase (16-24h), associated with a decrease of the intracellular ROS level and the overexpression of the long non coding sat III RNAs. Based on this observation, we performed a transcriptome global analysis by using exon arrays from Affymetrix on RNA samples isolated 1, 2, 4 or 24 hours after the induction of the oxidative stress. We identified changes of the gene expression level or mRNA splicing pattern specific of each of the response phases. Data computing by bio-informatic tools identified the most affected cellular processes and functions during the cell response to oxidative stress. In order to better understand the mechanisms underlying alternative splicing modulation during oxidative stress, I started to study the impact of oxidative stress on the expression level and the cellular localization of spliceosome components and most common splicing regulation factors

L'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique d’imagerie très utilisée de nos jours, notamment pour le diagnostic médical. L’utilisation d’agents de contraste lors d’un examen IRM permet d’obtenir des images de bonne qualité. Cependant, le manque de sensibilité de cette technique d’imagerie a conduit à l’utilisation d’espèces hyperpolarisées (3He, 13C, 129Xe) en IRM. Le xénon (Xe) apparait aujourd’hui comme un composé très prometteur pour de telles applications mais son manque de sélectivité rend l’imagerie moléculaire impossible. Le développement et l’utilisation de molécules cages capable d’encapsuler le xénon et de l’amener vers la cible à imager est donc indispensable. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés au cours de cette thèse à l’élaboration de telles molécules, et plus précisément, à l’obtention de nouveaux cryptophanes qui présentent la plus forte affinité pour le xénon afin de pouvoir utiliser ces molécules en tant qu’outils pour l’IRM Xe. Une nouvelle voie de synthèse du cryptophane ayant la plus grande affinité pour le xénon a été mise au point ; ce composé a été fonctionnalisé pour la première fois au laboratoire et ceci dans le but d’obtenir les premières biosondes dérivées de composé. Le greffage d’antenne de reconnaissance sur ces biosondes permettrait alors de faire de l’imagerie ciblée. Une sonde pour la détection du peroxyde d’hydrogène (H2O2) a été synthétisée. Le peroxyde d’hydrogène est impliqué dans le développement de stress oxydant cellulaire et présent en ces de maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer). La sonde obtenue a permis d’imager H2O2 par IRM Xe pour la première fois. Un hybride composé de nanotube de carbone et de cryptophanes a aussi été synthétisé en vue de disposer d’outil présentant une forte concentration de cryptophanes et d’améliorer la sensibilité de la technique d’imagerie utilisant du xénon. / Magnetic Resonance Imaging (MRI) is widely used today for early medical diagnosis. During the MRI examination, the use of contrast agent allows the obtention of well resolved images. However the lack of sensibility of this technic lead to the utilization of hyperpolarized species (3He, 13C, 129Xe) in MRI. The xenon (Xe) is the more promising but due to its weak selectivity, it cannot be used in molecular imaging. So, the development and utilization of host molecules able to encapsulate the xenon and bring it to a targeted biological tissue or organ is necessary. In these conditions, during this thesis, we worked on the elaboration of such molecules, and particularly, in cryptophanes since these compounds have strong affinity for xenon and could be used as tools for MRI by hyperpolarized xenon (Hp Xe). A new route synthesis of cryptophane-111, that has the highest affinity for xenon, was developed; first functionalized derivatives of this compound have been also obtained in order to obtain the first biosensors based on cryptophane-111. The coating of specific ligand on these functionalized compounds could allow targeted MRI. A probe for hydrogen peroxide (H2O2) detection was synthesized. Hydrogen peroxide is implicated in cellular oxidative stress and present in case of neurodegeneratives diseases (Parkinson, Alzheimer). The probe obtained allowed the imaging of H2O2 by MRI Xe for the first time. Nanotubes functionalized with strong concentration of cryptophane have been synthesized in order to increase the sensitivity of the imaging technic that uses xenon.