Le maintien d'une homéostasie redox intracellulaire est essentielle à la survie de la cellule. Pour cela, la cellule doit réguler la concentration intracellulaire en intermédiaires réactifs de l'oxygène (ou IRO), sous-produits de la respiration. La connaissance que nous avons des mécanismes de contrôle de l'homéostasie redox repose principalement sur des données obtenues chez la bactérie. Nous avons donc choisi un eucaryote comme modèle d'étude, la levure S. cerevisiae. Le facteur de transcription Yap1 contrôle l'expression d'anti-oxydants, responsables en particulier de la réduction du peroxyde d'hydrogène (H2O2) et de l'ion superoxyde (O2.-). L'activité de Yap1 est régulée par sa localisation subcellulaire. Nous avons montré qu'in vivo, l'activation de Yap1 par le H2O2 repose sur la formation d'un pont disulfure intramoléculaire. Cette oxydation est responsable de l'accumulation nucléaire du régulateur et permet la production des anti-oxydants. L'oxydation de Yap1 par le H2O2 n'est pas directe mais elle est relayée par une peroxydase, Gpx3. L'oxydation de Gpx3 par le H2O2 entraîne la formation d'un pont disulfure intermoléculaire entre Yap1 et Gpx3, rapidement transformé en pont intramoléculaire dans Yap1. Ainsi, Gpx3 détecte et transmet spécifiquement le signal H2O2 à Yap1 par le transfert d'une modification redox. La description de ce mode d'activation assimile Gpx3 à un récepteur des peroxydes. L'ensemble de ces données nous ont conduit à renommer Gpx3 en Orp1 pour " Oxidant Receptor Peroxidase ". Après correction de la perturbation redox, Yap1 est désactivé par réduction, vraisemblablement par les thiorédoxines, dont Yap1 contrôle l'expression. La levure possède donc un système de surveillance de la concentration en peroxydes rétrocontrôlé.

Le but de cette thèse consistait en l'amélioration de l'activité thérapeutique d'agents anti-radicalaires synthétiques de type nitroxyde et nitrone. Ces deux classes d'antioxydants synthétiques ont été choisies pour leur très bonne activité de piégeurs de radicaux libres, des substances particulièrement délétères et impliquées à l'heure actuelle dans un grand nombre de pathologies. Dans une première partie de ce travail, des nitroxydes ont été fonctionnalisés par des transporteurs amphiphiles dérivés de la lysine et de l'acide aspartique, puis une deuxième approche a consisté en la modification d'une nitrone, l'alphaphényl-N-tert-butyl-nitrone (PBN) par des groupements polaires et apolaires. Les études physico-chimiques ont ensuite permit de caractériser les propriétés d'auto-assemblage en milieux aqueux de ces composés ainsi que leur caractère hydrophobe et leurs propriétés antioxydantes. Enfin, des études biologiques ont mis en évidence les propriétés protectrices de ces molécules vis-à-vis des phénomènes de stress oxydant sur des modèles in vitro et in vivo.

Diverses études épidémiologiques ont mis en évidence une relation étroite entre pollution urbaine au monoxyde de carbone (CO) et mortalité cardiovasculaire. Récemment il a été mis en évidence, chez le rat, qu'une exposition prolongée à ce polluant urbain avait pour conséquence le développement d'un phénotype cellulaire pathologique, pouvant influencer la vulnérabilité du coeur à un stress aigu. L'objectif de nos travaux était donc i) d'évaluer l'impact de la pollution au CO, sur la sensibilité du myocarde de rats au syndrome d'ischémie-reperfusion (IR) ; et ii) d'évaluer les effets potentiellement cardioprotecteurs d'un exercice pratiqué régulièrement à intensité modérée, sur le remodelage phénotypique cellulaire myocardique. Pour cela, 187 rats Wistar ont été séparés en 3 groupes : des rats contrôles, des rats exposés pendant 4 semaines au CO (30-100 ppm), et des rats entraînés en endurance avant d'être exposés au CO. La sensibilité à l'IR était évaluée par ischémie régionale réalisée sur modèle de coeur isolé perfusé de Langendorff. La fonction et les mouvements calciques de cardiomyocytes isolés était évalués en condition basale et consécutivement à un protocole d'anoxie-réoxygénation. Les résultats de ce travail confirment l'apparition d'un phénotype pathologique chez les rats exposés de façon prolongée au CO. Ce phénotype pathologique caractérisé dans notre travail par une altération de l'homéostasie calcique et du statut redox cellulaire ainsi qu'une expression tissulaire de iNOS apparait comme à l'origine de la plus grande vulnérabilité du coeur à un stress d'IR. Un autre résultat majeur de ce travail est qu'une stratégie de cardioprotection par un exercice d'intensité modérée pratiqué de manière régulière, permet de prévenir le remodelage pathologique cardiomyocytaire et ainsi l'augmentation de la sensibilité du myocarde à l'IR

La superoxyde réductase (SOR) est une enzyme de détoxification présente uniquement chez certain types de microorganismes. Elle élimine le radical superoxyde en le réduisant pour donner H2O2 sans formation d'O2 moléculaire. Le site actif de la SOR est constitué d'un centre mononucléaire de fer ferreux chélaté par 4 histidines en positions équatoriales et une cystéine en position axiale. La présence et le positionnement de cette cystéine au sein du site actif est tout à fait atypique et pourrait être à l'origine de cette réactivité particulière avec le superoxyde. Différentes structures de SOR ont montré l'existence de liaisons hydrogènes entre le soufre de cette cystéine et des NH de liaisons peptidiques de certains acides aminés dont l'isoleucine 118 sur laquelle nous avons centré notre travail. Quatre mutants de l'isoleucine 118 ont été construits et purifiés. Les caractérisations par spectroscopies UV-visible, FTIR, Résonance Raman, par la détermination du pKa et du potentiel redox du fer du site actif ont montré que les mutations sur cette position induisent un renforcement de la liaison S-Fe. Ceci a pu être associé à un affaiblissement de la liaison hydrogène entre le NH peptidique des mutants de l'isoleucine 118 et le soufre de la cystéine. Les études de cinétique rapide par radiolyse pulsée ont permis de montrer que les mutations facilitent la protonation des intermédiaires réactionnels de type Fe3+-peroxo et Fe3+-hydroxo. Ces résultats sont en accord avec l'augmentation de densité électronique autour du fer du site actif, qui induit une basicité plus importante de ces intermédiaires réactionnels. Ainsi, nous avons pu montrer que le renforcement de la liaison S-Fe a pour conséquence l'accélération de la réaction de la SOR avec le superoxyde. Le ligand axial cystéine a donc pour rôle de contrôler la densité électronique autour du fer du site actif et ainsi d'influer sur la réduction du superoxyde.

Les quantités et flux infinitésimaux de biomolécules électroactives émises par une cellule unique isolée en boite de Pétri peuvent être mesurés en temps réel par une ultramicroélectrode placée au contact de la cellule sécrétrice. Le travail présenté dans ce manuscrit a pour but d'étendre cette méthodologie analytique d'utilisation des microélectrodes de carbone platiné à l'étude du lien entre stress oxydant et l'effet de substances anti-cancéreuses (FcdiOH, DP1 et Fc-OH-TAM) sur des cellules tumorales du sein. Le signal ampérométrique est collecté par une microélectrode de carbone platiné positionnée à une centaine de nanomètres au-dessus d'une cellule tumorale du sein et incubée en présence d'espèces anticancéreuses de type ferrocifènes. La libération in situ des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et de l'azote (RNS), i.e., H2O2, ONOO-, NO et NO2-, par ces cellules (MCF7 et MDA-MB-231) est analysée. Les études morphologiques montrent que les produits FcdiOH, DP1 et Fc-OH-TAM présentent un effet anti-prolifératif significatif. Le traitement avec Fc-diOH et surtout DP1 augmente significativement la production de ROS. Par contre, Fc (témoin) et Fc-OH-TAM n'ont pas ou très peu d'effet. Cela est assez surprenant pour Fc-OH-TAM, qui a l'effet anti-prolifératif le plus fort parmi les ferrocifènes testés. Fc-diOH et DP1, quant à eux, semblent induire une surproduction de NO° et/ou de NO2-, ainsi que du peroxyde d'hydrogène. Cette comparaison inédite entre études morphologiques et électrochimiques tend à montrer que les ferrocifènes agissent par deux voies qui sont complémentaires, soit via la formation de quinone méthide (Fc-OH-TAM), soit par réaction directe (DP1, Fc-diOH).

L'ADN ou l'ARN, détenteurs de l'information génétique, peuvent subir des dommages dus aux acteurs du stress oxydant ou de l'inflammation. La cellule a développé des mécanismes de réparation de ces dommages, mais certaines lésions peuvent persister et devenir mutagènes. Dans ce but, nous nous sommes intéressés au dosage simultané de plusieurs de ces lésions à l'aide d'une technique de chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en mode tandem, outil analytique rapide et fiable ayant une très grande sensibilité. Le but de ce travail était de trouver des biomarqueurs du stress oxydant ou de l'inflammation parmi les lésions connues de l'ADN et de les quantifier dans les milieux biologiques humains afin de compléter le panel existant de biomarqueurs protéiques ou lipidiques. Ainsi, trois groupes de lésions ont pu être quantifiés : les lésions oxydatives issues de l'action des espèces oxygénées activées, les lésions chlorées issues des phénomènes inflammatoires et les adduits de la peroxydation lipidique. Les étapes de mise au point analytique ayant été optimisées, elles ont été suivies d'une validation biologique parmi différentes pathologies étudiées et représentées par le diabète, certains cancers traités par radiothérapie et les hommes atteints d'infertilité masculine. Les différents résultats montrent une variation des taux des certaines lésions dans les leucocytes circulants ou des l'urine des patients par rapport aux sujets sains. Néanmoins, ces essais nécessitent d'être confirmés quant à l'utilisation des ces lésions en tant que biomarqueurs. D'autres types de pathologies devront également être testés.

Introduction : La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique mortelle qui touche principalement les poumons et l’appareil digestif. Elle est causée par des mutations sur le gène codant la protéine du CFTR, un canal chlore exprimé à la surface des organes à sécrétions exocrines. Les fonctions principales du CFTR sont les suivantes: 1) la régulation de l’homéostasie ionique des sécrétions; 2) le maintien de la fluidité des sécrétions et; 3) le transport du glutathion. Le dysfonctionnement de la protéine du CFTR rend les sécrétions visqueuses et épaisses, avec des phénomènes obstructifs qui sont responsables de l’apparition de fibrose au sein des divers organes. Dans le poumon, l’accumulation du mucus épais rend difficile l’élimination des bactéries inhalées, ces dernières établissent alors des cycles d’infection qui endommagent les tissus pulmonaires à travers des processus inflammatoires. Dans le tube digestif, le mucus épais entrave l’absorption d’une quantité suffisante d’éléments nutritifs incluant les principaux antioxydants. L’infection et l’inflammation des poumons favorisent l’apparition d’un stress oxydant qui détruit davantage le tissu pulmonaire. Le déficit en glutathion, probablement lié au dysfonctionnement de la proteine du CFTR, et la malabsorption des antioxydants favorisent l’augmentation du stress oxydant. Une augmentation du stress oxydant a été démontrée au cours du diabète et les produits dérivés du stress oxydant ont été mis en évidence dans la pathogenèse des complications associées au diabète. Une augmentation du stress oxydant a également été montrée durant la FK, mais sans pour autant expliquer la survenue du diabète secondaire à la FK dont la prévalence augmente sans cesse. Objectifs : Notre étude consiste à évaluer l’impact du stress oxydant dans les anomalies du métabolisme du glucose durant la FK, et à étudier son rôle dans les mécanismes de sécrétion d’insuline induite par le glucose. Pour ce faire, nous avons déterminé l’impact de la peroxydation lipidique sur la tolérance au glucose et la défense antioxydante globale, in vivo, chez des patients FK présentant une altération du métabolisme du glucose. De plus, nous avons évalué le rôle du stress oxydatif sur la synthèse et la sécrétion d’insuline, in vitro, dans les cellules pancréatiques βTC-tet. Résultats : Dans l’étude in vivo, nous avons démontré que l’intolérance au glucose et le diabète étaient associés à une augmentation de la peroxydation lipidique, traduite par la hausse des niveaux sanguins de 4-hydroxynonenal lié aux protéines (HNE-P). La défense antioxydante évaluée par la mesure du glutathion sanguin démontre que les niveaux de glutathion oxydé restent également élevés avec l’intolérance au glucose. Dans l’étude in vitro, nos résultats ont mis en évidence que l’exposition de la cellule βTC-tet au stress oxydant: 1) induit un processus de peroxydation lipidique; 2) augmente la sécrétion basale d’insuline; 3) diminue la réponse de la sécrétion d’insuline induite par le glucose; et 4) n’affecte que légèrement la synthèse de novo de l’insuline. Nous avons aussi démontré que les cellules pancréatiques βTC-tet résistaient au stress oxydant en augmentant leur synthèse en glutathion tandis que la présence d’un antioxydant exogène pouvait restaurer la fonction sécrétoire de ces cellules. Conclusion : Le stress oxydant affecte le fonctionnement de la cellule pancréatique β de plusieurs manières : 1) il inhibe le métabolisme du glucose dont les dérivés sont nécessaires à la sécrétion d’insuline; 2) il active la voie de signalisation impliquant les gènes pro-inflammatoires et; 3) il affecte l’intégrité membranaire en induisant le processus de peroxydation lipidique. / Introduction: Cystic fibrosis (CF) is the most prevalent lethal genetic disorder affecting mostly lungs and the gastro-intestinal tract. CF is caused by mutations in the gene encoding the CFTR protein, a chloride channel expressed in organs with exocrine secretions. The main functions of the CFTR channel are the following: 1) regulation of electrolyte composition of secretions; 2) maintenance of fluid secretions and; 3) transport of glutathione. The CFTR protein dysfunction leads to thick and viscous secretions with obstructive phenomena responsible for fibrosis occurence in various organs. In the lungs, accumulation of the thick mucus reduces their capacity to eliminate inhaled bacteria responsible for repeated infections and pulmonary tissue damage through inflammatory processes. In the gastro-intestinal tract, the thicknened micus leads to nutritive elements and the major antioxidants malabsorption. Increased oxidative stress has been associated with the onset of diabetes and oxidative stress by-products have been involved in the pathogenesis of diabetic complications. Increased oxidative stress has also been shown in CF but the relationship between oxidative stress and the occurrence of CF-related diabetes (CFRD) remains unclear. Objectives: Our study aims to investigate the role of oxidative stress in the impaired glucose metabolism in CF patients and its relation with the altered glucose-stimulated insulin secretion process. We first determined the impact of lipid peroxidation on glucose tolerance and the antioxidant status in CF patients with altered glucose tolerance. Secondly, we evaluated the role of oxidative stress on insulin synthesis and secretion in the murine pancreatic β-cell line βTC-tet. Results: In CF patients, we demonstrated that conditions of glucose intolerance and diabetes are associated with increased lipid peroxidation as seen with increased blood levels of 4-hydroxynonenal bound to proteins (HNE-P). The antioxidant status evaluated with blood levels of glutathione showed a strong correlation between levels of oxidized glutathione and glucose intolerance. Acute exposure of βTC-tet to oxidative stress led to: 1) increased lipid peroxidation marker levels; 2) increased insulin release in basal conditions; 3) altered glucose-stimulated insulin secretion process and; 4) no effect on the insulin synthessis pathway. We also demonstrated that pancreatic βTC-tet cells can fight against oxidative stress by upregulating their glutathione synthesis whereas the presence of an exogenous antioxidant can restore their secretory function. Conclusion: Oxidative stress can induce β-cell dysfunction through many pathways: 1) it inhibits the glucose metabolism and its by-products which are required for insulin secretion, 2) it activates the signalling pathway involving the pro-inflammatory genes and; 3) it damages the cell structure by inducting the lipid peroxidation process.

Notre deuxième travail expérimental visait à élucider le rôle de la surcharge pondérale dans le développement de la cardiotoxicité des anthracyclines et du trastuzumab. Grâce à un modèle murin de surpoids modéré et de risque cardio-métabolique accru induits par programmation post-natale, nous avons mis en évidence le rôle potentiateur d’une surcharge pondérale sur le développement de la cardiotoxicité aux anthracyclines ; alors que la cardiotoxicité du trastuzumab ne semble pas être en revanche majorée par le surpoids. Nos travaux ont également permis de préciser les conditions dans lesquelles existent des potentialisations des effets lors de l’association doxorubicine et trastuzumab. / Cancer treatment has advanced considerably in recent years, allowing a reduction in mortality. Longer life expectancy of patients has helped to highlight the delayed onset of cardiovascular toxicity induced by these chemotherapies. The pathophysiological mechanisms responsible for these cardiac dysfunctions are complex, entangled and remain partially unknown. A better understanding of the phenomena involved in these cardiotoxicities is needed to prevent their occurrence. Therefore, we have developed two different experimental approaches to understand the pathophysiological mechanisms involved in the cardiac toxicity of anthracyclines and trastuzumab.A first experimental study aimed to clarify the role of iron in heart failure induced by anthracyclines. We have demonstrated that a tissular iron overload in mice prior to doxorubicin injection does not increase the cardiotoxicity of chemotherapy. On the contrary, the involvement of anti-radical defenses following the iron load could reduce cardiac oxidative damage generated by doxorubicin. In view of these data, the role of iron chelators in cardioprotection against anthracyclines has to be questioned.Our second experimental work was to elucidate the role of overweight in the development of anthracycline and trastuzumab cardiotoxicity. Using a mouse model of moderate overweight and of increased risk of cardiometabolic induced postnatal programming, we have highlighted the role of overweight on the development of anthracycline cardiotoxicity; whereas trastuzumab cardiotoxicity did not appear to be increased by overweight. Our work also clarified the conditions in which there are cumulative cardiac alterations when doxorubicin and trastuzumab are associated.

Avec les avantages intrinsèques de l'électrochimie et les progrès sans précédent dans l'instrumentation, les microélectrodes jouent un rôle de premier plan dans l'analyse du comportement de cellules vivantes. Aujourd'hui, la microfluidique gagne également en popularité en raison de la possibilité d'effectuer l'ensemble de l'expérience de bioanalyse dans un dispositif automatisé. Dans cette thèse, la fabrication de microbandes Pt/noir-Pt a été optimisée pour détecter les espèces ROS/RNS durant le stress oxydant. Celles-Ci ont été intégrées dans des microdispositifs en PDMS-Verre afin d'analyser la libération de quatre composés clés (i.e., H2O2, ONOO-, NOo, et NO-2) à partir de populations de cellules. Les performances analytiques ont été évaluées suivant la géométrie des dispositifs et les conditions hydrodynamiques. Le contrôle des réponses électrochimiques par le transport de masse a été validé par comparaison avec des prédictions théoriques. Des détections simultanées de ROS/RNS libérées par des macrophages ont ensuite été réalisées sous deux configurations différentes de dispositifs. Des résultats reproductibles et statistiquement pertinents ont été obtenus en seulement quelques expériences. Ces microdispositifs permettent de caractériser facilement le comportement moyen de populations de cellules. Cette étude préalable ouvre la voie à un très large champ d'applications bioanalytiques intégrant des détections électrochimiques à haut débit pour le suivi de cellules vivantes. / With intrinsic benefits of electrochemistry and unprecedented progress in instrumentation, microelectrodes are playing prominent roles in the analysis of living cells behaviors. Nowadays, microfluidics also gains in popularity due to the feasibility of performing the entire bioanalytical experiment within an automated device. In this thesis, fabrication of Pt/Pt-Black microband electrodes was thus optimized to detect ROS/RNS species during oxidative stress. They were integrated into PDMS-Glass microdevices in order to analyze four key compounds (i.e., H2O2, ONOO–, NO•, and NO–2) released from cells populations. High analytical performances were first evidenced according to the devices geometry and hydrodynamic conditions. The control of the electrochemical responses by mass transport was validated through comparison with theoretical predictions. Simultaneous detections of ROS/RNS release from macrophages were then carried out under two different configurations of microdevices. Reproducible and statistically relevant results were obtained within only few experiments. These microdevices allow for easy characterizations of average behaviors of cells populations. This study paves the way to a very broad field of bioanalytical applications integrating electrochemical detections for high-Throughput monitoring of living cells

L'oncoprotéine MDM2 est reconnue comme un régulateur négatif majeur du suppresseur de tumeur p53, mais plus de preuves indiquent que ses activités oncogéniques vont au-delà de p53. Ici, nous montrons que MDM2 est recruté à la chromatine indépendamment de p53 pour réguler un programme transcriptionnel complexe impliqué dans le métabolisme des acides aminés et l'homéostasie redox. L'identification des gènes cibles de MDM2 au niveau du génome entier met en évidence un rôle important pour les facteurs de transcription ATF3/4 dans le recrutement de MDM2 à la chromatine. Ce recrutement de MDM2 à la chromatine est un processus étroitement régulé qui se produit lors d'un stress oxydatif et lors d'une déprivation en serine/glycine et est modulé par la pyruvate kinase M2 (PKM2) qui est une enzyme métabolique. La déplétion de la protéine MDM2 endogène dans des cellules déficientes en p53 altère le métabolisme sérine/glycine, le rapport NAD+/NADH et le recyclage de la glutathion (GSH), important leurs état redox et leurs potentiel tumorigènique. Nos données illustrent une fonction précédemment insoupçonnée de MDM2 à la chromatine impliquée dans le métabolisme des cellules cancéreuses. / The mouse double minute 2 (MDM2) oncoprotein is recognized as a major negative regulator of the p53 tumor suppressor, but growing evidence indicates that its oncogenic activities extend beyond p53. Here, we show that MDM2 is recruited to chromatin independently of p53 to regulate a transcriptional program implicated in amino acid metabolism and redox homeostasis. Identification of MDM2 target genes at the whole-genome level highlights an important role for ATF3/4 transcription factors in tethering MDM2 to chromatin. MDM2 recruitment to chromatin is a tightly regulated process that occurs during oxidative stress and serine/glycine deprivation and is modulated by the pyruvate kinase M2 (PKM2) metabolic enzyme. Depletion of endogenous MDM2 in p53-deficient cells impairs serine/glycine metabolism, the NAD+/NADH ratio, and glutathione (GSH) recycling, impacting their redox state and tumorigenic potential. Collectively, our data illustrate a previously unsuspected function of chromatinbound MDM2 in cancer cell metabolism.