O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC, pancreatic ductal adenocarcinoma), o tipo mais prevalente de câncer do pâncreas, é uma neoplasia extremamente agressiva e com elevado índice de letalidade. Há uma necessidade premente de identificação de vulnerabilidades no PDAC que possam ser exploradas como alvos terapêuticos, e a utilização de modelos pré-clínicos que recapitulem a complexidade biológica e heterogeneidade clínica da doença é um aspecto central para a realização dessa tarefa. Os xenotransplantes de tecido tumoral derivado de pacientes (PDX, patient-derived tumor tissue xenografts), realizados em camundongos imunodeficientes, replicam com grande similaridade as principais características do tumor original e, assim, constituem uma ferramenta valiosa para o teste de drogas e estudos funcionais. Neste trabalho, 17 amostras cirúrgicas de PDAC humano foram implantadas subcutaneamente em camundongos nude atímicos. Sete tumores (41%) foram enxertados com sucesso e têm sido mantidos em sucessivas gerações de animais receptores. O exame histológico de seis desses xenoenxertos identificou características morfológicas compatíveis com os padrões reconhecidos no PDAC humano, assim como uma consistente similaridade de seu status de diferenciação histológica em relação aos perfis verificados nos tumoresoriginais. O cultivo in vitro de células derivadas de um dos xenotumores resultou em uma nova linhagem de câncer de pâncreas, com morfologia e cinética de crescimento comparáveis às de outras linhagens celulares de câncer pancreático. O potencial tumorigênico dessa nova linhagem foi validado in vivo, com uma consistente formação de tumores após inoculação em camundongos nude. A fim de aproveitar esse recurso para a investigação de potenciais alvos terapêuticos no PDAC, um rastreamento de vulnerabilidades moleculares foi realizado por meio de silenciamento gênico em larga-escala com RNA de interferência (RNAi). Uma biblioteca lentiviral de 4492 shRNAs (short hairpin RNAs), alvejando cerca de 350 genes envolvidos na regulação epigenética, foi empregada para a triagem de genes de suscetibilidade nas células derivadas de PDX, e em outras cinco linhagens tumorais pancreáticas (AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, MIA PaCa-2 e PANC-1). Inicialmente, foi realizada uma série de experimentos preliminares, visando à amplificação e controle de qualidade da biblioteca de silenciamento, à produção de vetores lentivirais e à padronização das condições experimentais para a transdução e seleção das células-alvo. Apenas três das linhagens avaliadas (AsPC-1, MIA PaCa-2 e PANC-1) mostraram-se permissíveis à transdução pelos vetores lentivirais, e foram assim utilizadas no screening de alvos epigenéticos. A análise dos dados obtidos nesse ensaio está em curso e os resultados serão utilizados para a definição de potenciais alvos candidatos. Em conclusão, recursos valiosos para apoiar a pesquisa sobre o câncer de pâncreas foram desenvolvidos. A coleção de PDXs estabelecida, bem como a linhagem celular recém-derivada, constituem uma fonte permanente e estável de células de PDAC para análises moleculares e estudos funcionais que busquem elucidar aspectos da doença ainda pouco compreendidos. Adicionalmente, os reagentes gerados e a expertise adquirida com os ensaiosrealizados com a biblioteca de shRNAs contra alvos epigenéticos serão de grande utilidade em futuras investigações para identificar genes com funções importantes na manutenção do fenótipo tumoral, e consequentemente com potencial para serem explorados terapeuticamente. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), the most prevalent type of pancreatic cancer, is a highly aggressive and lethal neoplasm. There is a pressing need to identify vulnerabilities in PDAC suited to be exploited as therapeutic targets, and the use of preclinical models recapitulating the biological complexity and clinical heterogeneity of the disease is central to this task. Patient-derived tumor tissue xenografts (PDX), established in immunodeficient mice, replicate with great similarity the main characteristics of the original tumor and thus constitute a valuable tool for drug testing and functional studies. In this work, 17 surgical samples of human PDAC were implanted subcutaneously in athymic nude mice. Seven tumors (41%) were successfully grafted and have been maintained through successive generations of recipient animals. Histological examination of six of these xenografts identified morphological characteristics compatible with the recognized patterns of human PDAC, as well as a consistent similarity of their histological differentiation status in relation to the profiles verified in the original tumors. In vitro culture of cells derived from one of these xenografts resulted in a new pancreatic cancer cell line, with morphology and growth kinetics comparable to those of other pancreatic tumor cells. The tumorigenic potential of this freshly derived cell line was validated in vivo, with a consistent tumor formation following inoculation into nude mice. To take advantage ofthis resource to investigate potential therapeutic targets in PDAC, a screening of molecular vulnerabilities was performed through large-scale gene silencing with RNA interference (RNAi). A lentiviral library containing 4492 short hairpin RNAs (shRNAs), targeting about 350 genes involved in epigenetic regulation, was employed for the search of susceptibility genes in the PDX-derived cells and in other five pancreatic tumor cell lines (AsPC-1, BxPC -3, Capan-1, MIA PaCa-2 and PANC-1). Initially, a series of preliminary experiments were carried out aiming at the amplification and quality control of the silencing library, production of lentiviral vectors and adjustment of the experimental conditions for transduction and selection of the target cells. Only three of the cell lines evaluated (AsPC-1, MIA PaCa-2 and PANC-1) were permissible for transduction by the lentiviral vectors, and were accordingly used in the screening of epigenetic targets. The analysis of data obtained in this trial is ongoing and the results will be used for definition of potential candidate targets. In conclusion, valuable resources to support research on pancreatic cancer have been developed. The established collection of PDXs as well as the newly derived cell line constitutes a permanent and stable source of PDAC cells for molecular analyzes and functional studies seeking to elucidate aspects of this disease that are still poorly understood. Additionally, both the reagents generated and the expertise gained from the RNAi assay against epigenetic targets will have inordinate usefulness in future investigations to identify genes with major functions in maintaining the malignant phenotype, and consequently with the potential to be exploited therapeutically.

Há um número crescente de pessoas e animais com obesidade e sobrepeso, com consequente aumento no número de pacientes resistentes à insulina e portadores de Diabetes mellitus (DM). O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) tem sido caracterizado como uma molécula importante em inúmeros mecanismos fisiopatológicos. Em diabéticos, pesquisas indicam uma redução deste fator em alguns tecidos estudados, sendo esta menor expressão envolvida com o desenvolvimento de hipóxia tecidual e não cicatrização de feridas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivos caracterizar um modelo diabético induzido por dieta, avaliar a vascularização, expressão gênica e proteica do VEGFA e seus receptores FLT1 e KDR em pâncreas de camundongos diabéticos e não diabéticos, antes e após a terapia gênica com VEGF. O estudo consistiu de 2 fases para as quais foram utilizados cinquenta camundongos, na primeira fase foram utilizados 28 animais distribuídos em 6 grupos experimentais: submetidos à dieta controle (CT) e dieta hipercalórica (DH) por 3, 4 e 6 meses. Na segunda fase, 4 grupos experimentais foram avaliados aos 4 meses: CT e DH sem vetor terapêutico (CTPLL e DHPLL) e CT e DH com vetor terapêutico (CTVEGF e DHVEGF). A análise gênica pelo PCR em tempo real e proteica pela imuno-histoquímica evidenciou queda na expressão de VEGF, FLT1 e KDR no grupo DH, sendo que a variável estereológica de densidade de volume vascular (Vv) indicou queda significativa (p<0,05) da vascularização pancreática no grupo DH em relação ao CT aos 3, 4 e 6 meses do estudo. O DM foi caracterizado com queda significativa (p<0,05) na insulinemia após 4 meses com DH. Após a injeção pancreática no grupo DHVEGF do lentivírus contendo a sequência que condifica o VEGF, foram observados aumento na expressão gênica de VEGF , FLT1 e KDR (p<0,05), com aumento de Vv vascular pancreático e aumento na insulinemia. Os resultados obtidos sugerem que é possível obter um modelo animal diabético induzido por dieta, que o VEGF e seus receptores participam da evolução e estabelecimento do quadro diabético, levando a uma redução da vascularização pancreática, e que o aumento na expressão do transgene no pâncreas de camundongos diabéticos possa contribuir para a revascularização pancreática e função das células B. / There is an increasing number of people and pets showing overweight and obesity, with a consequent growth of the number of insulin-resistant and diabetic patients. The vascular endothelial growth factor (VEGF) has been characterized as an important molecule in many physiopathological states. Recent studies indicate a reduction in VEGF content in some tissues of diabetic patients causing tissue hypoxia and impairing cicatrization. In this context, this study aimed to characterize a diet-induced diabetic animal model and to evaluate vascularization, gene and protein expression of VEGFA and its receptors KDR and FLT1, in pancreas of diabetic and non-diabetic mice before and after gene therapy with VEGF. The study was divided in two phases and fifty male mice were used. In the first phase 28 animals were distributed into 6 groups: control diet (CT) and high calorie diet (DH) for 3, 4 and 6 months. In the second phase, four experimental groups were evaluated at 4 months: CT and DH without therapeutic vector (CTPLL and DHPLL) and CT and DH with therapeutic vector (CTVEGF and DHVEGF). The genetic analysis using real time PCR and protein by immunohistochemistry showed decrease in expression of VEGF, FLT1 and KDR in the DH group, and the stereological estimate of vascular volume density (Vv) indicated a significant decrease (p <0,05 ) of vascularization in pancreatic DH group relative to the CT at 3, 4 and 6 months of the study. Diabetic mice were characterized with a significant decrease (p <0,05) in insulin after 4 months with DH. After injection of lentivirus containing the VEGF sequence in DHVEGF´s pancreas, increase in VEGF, FLT1 and KDR gene expression (p <0.05) was observed, accompanied by the increase of vascular Vv and insulinemia. The results suggest that it is possible to obtain a diabetic animal model induced by diet, that VEGF and its receptors participate in the development and establishment of the diabetic state, leading to a reduction of pancreas vascularization, and that the increase of transgene expression in the pancreas of diabetic mice may contribute to the revascularization and function of pancreatic B cells.

INTRODUÇÃO: O transplante de pâncreas é a opção definitiva para a manutenção do estado normoglicêmico permanente nos portadores de diabetes mellitus tipo 1. O meio de contraste de ultra-som é uma metodologia capaz de avaliar a perfusão tecidual, mas não há um estudo para a avaliação do padrão de perfusão do pâncreas transplantado normal e patológico. A importância da avaliação da perfusão do enxerto e a aplicação do meio de contraste por microbolhas foram os motivos para a realização desta pesquisa. Este estudo, desenvolvido no Instituto de Radiologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo no período de novembro de 2004 a setembro de 2006 objetivou: A) estabelecer os padrões de vascularização do enxerto nos pacientes normais e naqueles com suspeita de complicações; B) comparar os achados de exames laboratoriais, uso ou não de insulina exógena e situação clínica dos pacientes com os achados da ultra-sonografia modo-B e com meio de contraste por microbolhas; C) Estabelecer o valor da ultra-sonografia com meio de contraste de microbolhas (USMCM) na avaliação do pâncreas transplantado. CASUÍSTICA e MÉTODOS: Vinte e seis pacientes foram submetidos ao exame de ultra-sonografia com contraste em um total de trinta estudos, 20 (66,7%) em homens e 10 (33,3%) em mulheres. A idade dos pacientes variou de 25 a 51 anos, com média de idade de 40 anos (+ 7,3 anos). O tempo médio da realização do transplante até a realização do estudo variou de um dia a 63 meses (mediana de 24 meses). Ao modo-B, o pâncreas foi analisado quanto a ecogenicidade, dimensões (avaliação qualitativa e quantitativa) e contornos. Após a administração do meio de contraste, observou-se o tempo de chegada do meio de contraste no pâncreas, o padrão e a intensidade de realce. Após esta avaliação foi realizada uma classificação baseada nos achados do modo-B e contraste nas seguintes possibilidades: padrão de perfusão normal, alterações agudas (rejeição, pancreatite ou trombose) ou alterações crônicas (rejeição crônica). RESULTADOS: Observou-se associação estatisticamente significante entre a ecogenicidade e a situação clínica (p=0,010); ecogenicidade e uso de insulina (p= 0,021); dimensões (avaliação qualitativa) e situação clinica (p=0,011); dimensões (avaliação qualitativa) e uso de insulina (p=0,028); padrão de realce (p=0,024) e intensidade do realce com a situação clínica (p=0,039). Houve associação estatisticamente significante também entre o uso ou não de insulina exógena com a perfusão do enxerto (p=0,014) e a hipótese diagnóstica (ultra-som) (p=0,001). CONCLUSÃO: Os padrões de vascularização do pâncreas transplantado normais e naqueles com suspeita de complicações foram estabelecidos. Os critérios de ecogenicidade e a avaliação qualitativa das dimensões do pâncreas ao ultra-som modo-B se mostraram adequados na diferenciação entre estudos normais e alterados. A ultra-sonografia com meio de contraste de microbolhas foi útil na diferenciação entre estudos normais e alterados do pâncreas transplantado, utilizando os critérios de padrão do realce, intensidade do realce e perfusão do enxerto na fase arterial. / INTRODUCTION: Pancreatic transplantation is the long-term therapeutic option for maintaining normoglycemic status in patients with type 1 diabetes mellitus. Sonographic contrast medium allows to evaluate tissue perfusion but there are no studies comparing this parameter in normal and pathologic pancreatic grafts in the literature at the time of this writing. The importance of assessment of graft perfusion and the potential role of contrast-enhanced sonography with microbubbles in this regard were the reasons for this research. The study conducted at the Instituto de Radiologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo between November, 2004 and September, 2006 had the following objectives: A) to establish patterns of graft vascularization in normal patients and in those with suspected abnormalities; B) to compare grayscale mode and contrastenhanced sonographic findings with clinical status, laboratory results, and need for exogenous insulin; C) to define the role of contrast-enhanced sonography with microbubbles in the evaluation of pancreatic transplantation.MATERIALS AND METHODS: Twenty-six patients underwent a total of 30 sonographic examinations with microbubbles, 20 (66.7%) men and 10 (33.3%) women. Age range was 25 to 51 years, with a mean of 40 years (+ 7.3 years). Time elapsed between transplantation and imaging ranged from 1 day to 63 months (median, 24 months). Using grayscale mode, pancreas was assessed for echogenicity, dimensions (both quantitatively and qualitatively) and contours. Following intravenous contrast medium administration, time for enhancement of the pancreatic graft, pattern and intensity of enhancement were documented. A classification system based on grayscale and contrast-enhanced sonographic findings was designed, with the following categories: normal perfusion pattern, acute changes (rejection, pancreatitis or thrombosis) and chronic changes (chronic rejection). RESULTS: There was a statistically significant association between echogenicity and clinical status (p=0.010); echogenicity and need for exogenous insulin (p=0.021); dimensions (qualitative criteria) and clinical status (p=0.011); dimensions (qualitative criteria) and need for exogenous insulin (p=0.028); pattern (p=0.024) and intensity of enhancement versus clinical status (p=0.039). There was also statistically significant association between need for exogenous insulin and graft perfusion (p=0.014), and sonography-based diagnosis (p=0.001). CONCLUSION: The study provided patterns of vascularization in normal pancreatic grafts and in patients with suspected abnormalities. Distinction of normal and abnormal pancreatic grafts was possible using echogenicity and qualitative analysis of graft size on grayscale mode. Contrast-enhanced sonography with microbubbles also contributed to differentiation between normal and abnormal pancreatic grafts, using pattern and intensity of enhancement and perfusion of the graft during the arterial phase.

INTRODUÇÃO: O transplante de pâncreas é a opção definitiva para a manutenção do estado normoglicêmico permanente nos portadores de diabetes mellitus tipo 1. O meio de contraste de ultra-som é uma metodologia capaz de avaliar a perfusão tecidual, mas não há um estudo para a avaliação do padrão de perfusão do pâncreas transplantado normal e patológico. A importância da avaliação da perfusão do enxerto e a aplicação do meio de contraste por microbolhas foram os motivos para a realização desta pesquisa. Este estudo, desenvolvido no Instituto de Radiologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo no período de novembro de 2004 a setembro de 2006 objetivou: A) estabelecer os padrões de vascularização do enxerto nos pacientes normais e naqueles com suspeita de complicações; B) comparar os achados de exames laboratoriais, uso ou não de insulina exógena e situação clínica dos pacientes com os achados da ultra-sonografia modo-B e com meio de contraste por microbolhas; C) Estabelecer o valor da ultra-sonografia com meio de contraste de microbolhas (USMCM) na avaliação do pâncreas transplantado. CASUÍSTICA e MÉTODOS: Vinte e seis pacientes foram submetidos ao exame de ultra-sonografia com contraste em um total de trinta estudos, 20 (66,7%) em homens e 10 (33,3%) em mulheres. A idade dos pacientes variou de 25 a 51 anos, com média de idade de 40 anos (+ 7,3 anos). O tempo médio da realização do transplante até a realização do estudo variou de um dia a 63 meses (mediana de 24 meses). Ao modo-B, o pâncreas foi analisado quanto a ecogenicidade, dimensões (avaliação qualitativa e quantitativa) e contornos. Após a administração do meio de contraste, observou-se o tempo de chegada do meio de contraste no pâncreas, o padrão e a intensidade de realce. Após esta avaliação foi realizada uma classificação baseada nos achados do modo-B e contraste nas seguintes possibilidades: padrão de perfusão normal, alterações agudas (rejeição, pancreatite ou trombose) ou alterações crônicas (rejeição crônica). RESULTADOS: Observou-se associação estatisticamente significante entre a ecogenicidade e a situação clínica (p=0,010); ecogenicidade e uso de insulina (p= 0,021); dimensões (avaliação qualitativa) e situação clinica (p=0,011); dimensões (avaliação qualitativa) e uso de insulina (p=0,028); padrão de realce (p=0,024) e intensidade do realce com a situação clínica (p=0,039). Houve associação estatisticamente significante também entre o uso ou não de insulina exógena com a perfusão do enxerto (p=0,014) e a hipótese diagnóstica (ultra-som) (p=0,001). CONCLUSÃO: Os padrões de vascularização do pâncreas transplantado normais e naqueles com suspeita de complicações foram estabelecidos. Os critérios de ecogenicidade e a avaliação qualitativa das dimensões do pâncreas ao ultra-som modo-B se mostraram adequados na diferenciação entre estudos normais e alterados. A ultra-sonografia com meio de contraste de microbolhas foi útil na diferenciação entre estudos normais e alterados do pâncreas transplantado, utilizando os critérios de padrão do realce, intensidade do realce e perfusão do enxerto na fase arterial. / INTRODUCTION: Pancreatic transplantation is the long-term therapeutic option for maintaining normoglycemic status in patients with type 1 diabetes mellitus. Sonographic contrast medium allows to evaluate tissue perfusion but there are no studies comparing this parameter in normal and pathologic pancreatic grafts in the literature at the time of this writing. The importance of assessment of graft perfusion and the potential role of contrast-enhanced sonography with microbubbles in this regard were the reasons for this research. The study conducted at the Instituto de Radiologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo between November, 2004 and September, 2006 had the following objectives: A) to establish patterns of graft vascularization in normal patients and in those with suspected abnormalities; B) to compare grayscale mode and contrastenhanced sonographic findings with clinical status, laboratory results, and need for exogenous insulin; C) to define the role of contrast-enhanced sonography with microbubbles in the evaluation of pancreatic transplantation.MATERIALS AND METHODS: Twenty-six patients underwent a total of 30 sonographic examinations with microbubbles, 20 (66.7%) men and 10 (33.3%) women. Age range was 25 to 51 years, with a mean of 40 years (+ 7.3 years). Time elapsed between transplantation and imaging ranged from 1 day to 63 months (median, 24 months). Using grayscale mode, pancreas was assessed for echogenicity, dimensions (both quantitatively and qualitatively) and contours. Following intravenous contrast medium administration, time for enhancement of the pancreatic graft, pattern and intensity of enhancement were documented. A classification system based on grayscale and contrast-enhanced sonographic findings was designed, with the following categories: normal perfusion pattern, acute changes (rejection, pancreatitis or thrombosis) and chronic changes (chronic rejection). RESULTS: There was a statistically significant association between echogenicity and clinical status (p=0.010); echogenicity and need for exogenous insulin (p=0.021); dimensions (qualitative criteria) and clinical status (p=0.011); dimensions (qualitative criteria) and need for exogenous insulin (p=0.028); pattern (p=0.024) and intensity of enhancement versus clinical status (p=0.039). There was also statistically significant association between need for exogenous insulin and graft perfusion (p=0.014), and sonography-based diagnosis (p=0.001). CONCLUSION: The study provided patterns of vascularization in normal pancreatic grafts and in patients with suspected abnormalities. Distinction of normal and abnormal pancreatic grafts was possible using echogenicity and qualitative analysis of graft size on grayscale mode. Contrast-enhanced sonography with microbubbles also contributed to differentiation between normal and abnormal pancreatic grafts, using pattern and intensity of enhancement and perfusion of the graft during the arterial phase.

Estudos populacionais, assim como modelos animais demonstram que além dos fatores já conhecidos, como uma dieta não balanceada e sedentarismo, insultos nutricionais no período gestacional ou durante a lactação, causam alterações metabólicas importantes que levam ao surgimento da obesidade, Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) e doenças cardiovasculares em longo prazo. Nesse estudo, analisamos o pâncreas de camundongos hiperalimentados adultos (150 dias) e camundongos hiperalimentados jovens (21 e 28 dias). Os camundongos hiperalimentados de 21 dias receberam transplante de células mononucleares de medula óssea (CMO) e o resultado desse transplante foi observado aos 28 dias, quando os animais foram sacrificados. Nós investigamos: a apoptose das células beta através do fator pró-apoptótico Bax; a proliferação das células da ilhota pancreática através do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA); a expressão da citocina TNF-&#945;, relacionado com a resistência à insulina em animais obesos e a expressão de células tronco CD133 com o objetivo de estudar a participação dessa célula na renovação da massa de células beta durante o estabelecimento da DM2. As análises das proteínas citadas no pâncreas foram realizadas através de microscopia de luz, microscopia confocal, microscopia eletrônica e Western blotting. O peso dos animais, a morfometria das ilhotas pancreáticas, bem como os níveis de glicose e insulina plasmáticos também foram determinados. Nossos resultados confirmaram que os camundongos hiperalimentados adultos apresentavam elevados níveis de glicose e insulina plasmática quando comparados ao grupo controle. Além disso, camundongos hiperalimentados adultos apresentaram aumento na expressão de Bax, indicando apoptose das células beta, maior expressão de TNF-&#945; nas ilhotas pancreáticas, e presença de células CD133 nas ilhotas e ductos pancreáticos de camundongos hiperalimentados. Ao analisarmos os animais com 21 dias também observamos elevados níveis de glicose e insulina plasmática no grupo hiperalimentado. Após o transplante de CMO, os camundongos hiperalimentados apresentaram os níveis de glicose e insulina normalizados em relação ao grupo controle, porém os níveis de TNF-&#945; no pâncreas continuavam elevados. A expressão de células CD133 foi observada tanto aos 21 quanto aos 28 dias nas ilhotas pancreáticas nos grupos hiperalimentados. Porém, a expressão estava aumentada no pâncreas dos animais que receberam transplante de CMO aos 28 dias. Portanto, podemos concluir que camundongos hiperalimentados durante a lactação quando adultos se encontram em um estágio inicial do estabelecimento da DM2, com hiperglicemia e hiperinsulinema, ilhotas pancreáticas hipertrofiadas, evidência de apoptose das células beta, neogênese de células beta a partir de células do ducto pancreático, replicação de células beta já existentes e células tronco endógenas marcadas com CD133. Nos camundongos jovens, além dos parâmetros também observados nos animais adultos, observamos os benefícios das CMO para o restabelecimento da glicemia e insulinemia nos camundongos hiperalimentados. Além disso, demonstramos pela primeira vez, células CD133 marcadas com insulina nas ilhotas pancreáticas. O aumento da expressão de células CD133 no pâncreas de camundongos hiperalimentados que mantinham níveis elevados de TNF-&#945; e receberam transplante de CMO, nos sugere a importância dessa citocina para o recrutamento e diferenciação das células tronco CD133 para melhoria do percurso da diabetes. / Population studies as well as animal models show that besides the factors already known as an unbalanced diet and sedentary lifestyle, nutritional insults during pregnancy or during lactation, causes important metabolic changes that lead to the emergence of obesity, type 2 diabetes mellitus (DM2) and cardiovascular diseases in long-term. In this study, we analyzed the pancreas of overfed adult mice (150 days) and young mice (21 and 28 days). At day 21, overfed mice were transplanted with bone marrow mononuclear cells (BMCs) and the results of this transplantation were observed at day 28. We investigated beta-cell apoptosis through pro-apoptotic factor Bax, the proliferation of pancreatic islet cells by proliferating cell nuclear antigen (PCNA), expression of TNF-&#945; which has been linked to insulin resistance in obese animals and the expression of CD133 stem cells, in order to study the participation of this cell on the recovery of beta-cell mass during the establishment of DM2. The protein analysis, were performed using light microscopy, Confocal microscopy, electron microscopy and Western blotting. The animals weight, morphology of pancreatic islets, as well as plasma levels of glucose and insulin were also determined. Our results confirmed that adult overfed mice had high levels of blood glucose and insulin when compared to control mice. Moreover, overfed adult mice showed an increased expression of Bax, indicating apoptosis of beta cells, also confirmed by transmission electron microscopy, increased expression of TNF-&#945; in pancreatic islets when compared with the control group, and interestingly we observed the presence of CD133 cells in the pancreas of overfed mice. By analyzing the animals with 21 days, we also observed high levels of blood glucose and insulin in the overfed group, but we did not observe Bax expression at this lifetime. The expression of TNF-&#945; was also increased in the pancreas of overfed mice at day 21. After BMCs transplantation, the overfed group showed normal levels of blood glucose and insulin when compared with the control group, but the levels of TNF-&#945; remained high. The expression of CD133 cells was observed in the pancreatic islets both at 21 and 28 days in overfed groups. However, the expression of CD133 was increased in the pancreas of animals that received BMCs transplantation at day 28. Therefore, we conclude that overfed mice when adults are at an early stage of stablishment of DM2 with hyperglycemia and hyperinsulinemia, pancreatic islet hypertrophy, evidence of apoptosis and neogenesis of beta cells from pancreatic duct cells, replication of existing beta cells and endogenous stem cells. In young mice, further the parameters observed in adult animals, we observed the benefits of the BMCs for the restoration of glucose and insulin in overfed mice. Moreover, we demonstrated for the first time the CD133 stem cells in pancreatic islets in colocalization with insulin, suggesting that CD133 could be a progenitor beta cell marker in pancreas. Also, the increased expression of CD133 cells in the pancreas of overfed mice with elevated levels of TNF-&#945; after BMCs transplantation, suggests the importance of this cytokine for the recruitment and recovery of CD133 stem cells to improve the course of diabetes.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Camundongos C57BL/6 machos com oito semanas de idade alimentados com diferentes dietas durante 16 semanas: de alta densidade energética (ADE, 26% das calorias de carboidrato, 60% de gordura e 14% de proteína) ou dieta padrão (CO, 76% das calorias de carboidrato, 10% de gordura e 14% de proteína). Comparado ao grupo CO, o grupo ADE apresentou maior ganho de massa e maior depósito de tecido adiposo, bem como maiores níveis plasmáticos de triglicerídeos, LDL-c, ALT, AST e fosfatase alcalina e com maiores níveis de corticosterona plasmática, glicose de jejum e insulina com uma consequente resistência à insulina (avaliado pelo HOMA-IR). No TOTG, a glicose plasmática aumentou ao máximo após 15 min. da administração de glicose oral em ambos os grupos. Entretanto os níveis de glicose foram maiores no grupo ADE que no grupo CO (P<0.0001). O clearance de glicose no grupo ADE foi reduzido, permanecendo aumentado após 120 min. (P<0.001), caracterizando intolerância a glicose no grupo ADE. O teste intraperitoneal de tolerância à insulina mostrou uma rápida redução na glicose plasmática após 15 minutos da administração de insulina em ambos os grupos, mas significativamente aumentada no grupo ADE (P<0.0001), permanecendo desta forma até os 120 min. após a administração. Concluindo, camundongos C57BL/6 respondem a dieta ADE desenvolvimento os sinais e sintomas associados à síndrome metabólica observada em humanos. Por conseguinte, este modelo animal poderá ajudar-nos a compreender melhor as alterações em órgãos alvos associadas com a síndrome metabólica, assim como a possibilidade de tratamentos diferentes. / Eight-week-old male C57BL/6 mice fed different diets during 16 weeks: very high-fat chow (HFC, 26% of calories from carbohydrates, 60% from fat, and 14% from protein), or standard chow (SC, 76% of calories from carbohydrates, 10% from fat, and 14% from protein). Compared to SC mice, the HFC mice showed greater mass gain and greater total visceral fat pads, as well as higher plasma levels of triglycerides, LDL-C, ALT, AST and ALK, and higher plasma corticosterone, fasting plasma glucose and insulin with the consequent insulin resistance (assessed by HOMA-IR). In OGTT, The plasma glucose increased to a maximum after 15 min of glucose oral administration in both groups. However, the glucose level in HFC mice was higher than in SC mice (P<0.0001). The clearance of glucose in HFC mice showed a delay, remaining elevated after 120 min (P<0.001), characterizing an impairment of glucose clearance in HFC mice when compared to SC mice. The insulin tolerance test demonstrated quick decrease of plasma glucose after 15 min of insulin administration in both groups, but plasma glucose remained significantly high in HFC mice when compared to SC mice (P<0.0001) in the following time-points until 120 min. In conclusion, C57BL/6 mice respond to a very high-fat diet developing the aggregate of symptoms and signs associated with the metabolic syndrome seen in humans. Therefore, this animal model could help us better understand the target organ alterations associated with the syndrome and the possibility of different treatments.

Estudos populacionais, assim como modelos animais demonstram que além dos fatores já conhecidos, como uma dieta não balanceada e sedentarismo, insultos nutricionais no período gestacional ou durante a lactação, causam alterações metabólicas importantes que levam ao surgimento da obesidade, Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) e doenças cardiovasculares em longo prazo. Nesse estudo, analisamos o pâncreas de camundongos hiperalimentados adultos (150 dias) e camundongos hiperalimentados jovens (21 e 28 dias). Os camundongos hiperalimentados de 21 dias receberam transplante de células mononucleares de medula óssea (CMO) e o resultado desse transplante foi observado aos 28 dias, quando os animais foram sacrificados. Nós investigamos: a apoptose das células beta através do fator pró-apoptótico Bax; a proliferação das células da ilhota pancreática através do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA); a expressão da citocina TNF-&#945;, relacionado com a resistência à insulina em animais obesos e a expressão de células tronco CD133 com o objetivo de estudar a participação dessa célula na renovação da massa de células beta durante o estabelecimento da DM2. As análises das proteínas citadas no pâncreas foram realizadas através de microscopia de luz, microscopia confocal, microscopia eletrônica e Western blotting. O peso dos animais, a morfometria das ilhotas pancreáticas, bem como os níveis de glicose e insulina plasmáticos também foram determinados. Nossos resultados confirmaram que os camundongos hiperalimentados adultos apresentavam elevados níveis de glicose e insulina plasmática quando comparados ao grupo controle. Além disso, camundongos hiperalimentados adultos apresentaram aumento na expressão de Bax, indicando apoptose das células beta, maior expressão de TNF-&#945; nas ilhotas pancreáticas, e presença de células CD133 nas ilhotas e ductos pancreáticos de camundongos hiperalimentados. Ao analisarmos os animais com 21 dias também observamos elevados níveis de glicose e insulina plasmática no grupo hiperalimentado. Após o transplante de CMO, os camundongos hiperalimentados apresentaram os níveis de glicose e insulina normalizados em relação ao grupo controle, porém os níveis de TNF-&#945; no pâncreas continuavam elevados. A expressão de células CD133 foi observada tanto aos 21 quanto aos 28 dias nas ilhotas pancreáticas nos grupos hiperalimentados. Porém, a expressão estava aumentada no pâncreas dos animais que receberam transplante de CMO aos 28 dias. Portanto, podemos concluir que camundongos hiperalimentados durante a lactação quando adultos se encontram em um estágio inicial do estabelecimento da DM2, com hiperglicemia e hiperinsulinema, ilhotas pancreáticas hipertrofiadas, evidência de apoptose das células beta, neogênese de células beta a partir de células do ducto pancreático, replicação de células beta já existentes e células tronco endógenas marcadas com CD133. Nos camundongos jovens, além dos parâmetros também observados nos animais adultos, observamos os benefícios das CMO para o restabelecimento da glicemia e insulinemia nos camundongos hiperalimentados. Além disso, demonstramos pela primeira vez, células CD133 marcadas com insulina nas ilhotas pancreáticas. O aumento da expressão de células CD133 no pâncreas de camundongos hiperalimentados que mantinham níveis elevados de TNF-&#945; e receberam transplante de CMO, nos sugere a importância dessa citocina para o recrutamento e diferenciação das células tronco CD133 para melhoria do percurso da diabetes. / Population studies as well as animal models show that besides the factors already known as an unbalanced diet and sedentary lifestyle, nutritional insults during pregnancy or during lactation, causes important metabolic changes that lead to the emergence of obesity, type 2 diabetes mellitus (DM2) and cardiovascular diseases in long-term. In this study, we analyzed the pancreas of overfed adult mice (150 days) and young mice (21 and 28 days). At day 21, overfed mice were transplanted with bone marrow mononuclear cells (BMCs) and the results of this transplantation were observed at day 28. We investigated beta-cell apoptosis through pro-apoptotic factor Bax, the proliferation of pancreatic islet cells by proliferating cell nuclear antigen (PCNA), expression of TNF-&#945; which has been linked to insulin resistance in obese animals and the expression of CD133 stem cells, in order to study the participation of this cell on the recovery of beta-cell mass during the establishment of DM2. The protein analysis, were performed using light microscopy, Confocal microscopy, electron microscopy and Western blotting. The animals weight, morphology of pancreatic islets, as well as plasma levels of glucose and insulin were also determined. Our results confirmed that adult overfed mice had high levels of blood glucose and insulin when compared to control mice. Moreover, overfed adult mice showed an increased expression of Bax, indicating apoptosis of beta cells, also confirmed by transmission electron microscopy, increased expression of TNF-&#945; in pancreatic islets when compared with the control group, and interestingly we observed the presence of CD133 cells in the pancreas of overfed mice. By analyzing the animals with 21 days, we also observed high levels of blood glucose and insulin in the overfed group, but we did not observe Bax expression at this lifetime. The expression of TNF-&#945; was also increased in the pancreas of overfed mice at day 21. After BMCs transplantation, the overfed group showed normal levels of blood glucose and insulin when compared with the control group, but the levels of TNF-&#945; remained high. The expression of CD133 cells was observed in the pancreatic islets both at 21 and 28 days in overfed groups. However, the expression of CD133 was increased in the pancreas of animals that received BMCs transplantation at day 28. Therefore, we conclude that overfed mice when adults are at an early stage of stablishment of DM2 with hyperglycemia and hyperinsulinemia, pancreatic islet hypertrophy, evidence of apoptosis and neogenesis of beta cells from pancreatic duct cells, replication of existing beta cells and endogenous stem cells. In young mice, further the parameters observed in adult animals, we observed the benefits of the BMCs for the restoration of glucose and insulin in overfed mice. Moreover, we demonstrated for the first time the CD133 stem cells in pancreatic islets in colocalization with insulin, suggesting that CD133 could be a progenitor beta cell marker in pancreas. Also, the increased expression of CD133 cells in the pancreas of overfed mice with elevated levels of TNF-&#945; after BMCs transplantation, suggests the importance of this cytokine for the recruitment and recovery of CD133 stem cells to improve the course of diabetes.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Camundongos C57BL/6 machos com oito semanas de idade alimentados com diferentes dietas durante 16 semanas: de alta densidade energética (ADE, 26% das calorias de carboidrato, 60% de gordura e 14% de proteína) ou dieta padrão (CO, 76% das calorias de carboidrato, 10% de gordura e 14% de proteína). Comparado ao grupo CO, o grupo ADE apresentou maior ganho de massa e maior depósito de tecido adiposo, bem como maiores níveis plasmáticos de triglicerídeos, LDL-c, ALT, AST e fosfatase alcalina e com maiores níveis de corticosterona plasmática, glicose de jejum e insulina com uma consequente resistência à insulina (avaliado pelo HOMA-IR). No TOTG, a glicose plasmática aumentou ao máximo após 15 min. da administração de glicose oral em ambos os grupos. Entretanto os níveis de glicose foram maiores no grupo ADE que no grupo CO (P<0.0001). O clearance de glicose no grupo ADE foi reduzido, permanecendo aumentado após 120 min. (P<0.001), caracterizando intolerância a glicose no grupo ADE. O teste intraperitoneal de tolerância à insulina mostrou uma rápida redução na glicose plasmática após 15 minutos da administração de insulina em ambos os grupos, mas significativamente aumentada no grupo ADE (P<0.0001), permanecendo desta forma até os 120 min. após a administração. Concluindo, camundongos C57BL/6 respondem a dieta ADE desenvolvimento os sinais e sintomas associados à síndrome metabólica observada em humanos. Por conseguinte, este modelo animal poderá ajudar-nos a compreender melhor as alterações em órgãos alvos associadas com a síndrome metabólica, assim como a possibilidade de tratamentos diferentes. / Eight-week-old male C57BL/6 mice fed different diets during 16 weeks: very high-fat chow (HFC, 26% of calories from carbohydrates, 60% from fat, and 14% from protein), or standard chow (SC, 76% of calories from carbohydrates, 10% from fat, and 14% from protein). Compared to SC mice, the HFC mice showed greater mass gain and greater total visceral fat pads, as well as higher plasma levels of triglycerides, LDL-C, ALT, AST and ALK, and higher plasma corticosterone, fasting plasma glucose and insulin with the consequent insulin resistance (assessed by HOMA-IR). In OGTT, The plasma glucose increased to a maximum after 15 min of glucose oral administration in both groups. However, the glucose level in HFC mice was higher than in SC mice (P<0.0001). The clearance of glucose in HFC mice showed a delay, remaining elevated after 120 min (P<0.001), characterizing an impairment of glucose clearance in HFC mice when compared to SC mice. The insulin tolerance test demonstrated quick decrease of plasma glucose after 15 min of insulin administration in both groups, but plasma glucose remained significantly high in HFC mice when compared to SC mice (P<0.0001) in the following time-points until 120 min. In conclusion, C57BL/6 mice respond to a very high-fat diet developing the aggregate of symptoms and signs associated with the metabolic syndrome seen in humans. Therefore, this animal model could help us better understand the target organ alterations associated with the syndrome and the possibility of different treatments.

Introdução: O transplante de pâncreas é uma opção terapêutica para pacientes portadores de diabetes mellitus, quando bem indicado, com objetivo de restaurar a normoglicemia sem necessidade de uso de insulina, sendo que a técnica mais utilizada é o transplante simultâneo pâncreas-rim. Houve aumento da indicação e realização deste procedimento em todo o mundo nos últimos anos, crescendo a importância de se conhecer os aspectos de imagem no pré e pós-transplante de pâncreas. Objetivos: Avaliar e discutir o papel das diferentes modalidades de exames de imagem empregadas na avaliação no pré e pós-transplante de pâncreas enfatizando os achados normais e das possíveis complicações. Propor um fluxograma para realização de exames de imagem para o programa de transplante de pâncreas considerando a casuística apresentada. Metodologia: Levantamento retrospectivo dos métodos de imagem com as indicações e os achados pré e pós-procedimento em todos os pacientes submetidos a transplante de pâncreas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo. Resultados: Foram estudados 14 casos com indicação de transplante simultâneo pâncreasrim, 13 destes submetidos ao transplante no período 2010-2016, os quais apresentaram idade média de 37,6 +/- 6,2 anos (variando entre 24 e 51 anos), sendo 8 (57%) do sexo masculino e 6 (42%) do sexo feminino. Um (7,2%) paciente não pode receber o enxerto pancreático devido a procedimento cirúrgico frustro resultante de diagnóstico intra-operatório de placa ateromatosa extensa. As complicações pós-transplante mais comuns foram: coleções na 7 cavidade abdominal (6/13 casos (46,1%)), pancreatite (6/13 (46,1%)) e complicações vasculares (4/13 (30,8%)). O US com Doppler foi realizado no pós-operatório em todos os casos. Conclusões: há necessidade de avaliação vascular pré-operatória por imagem do receptor, de rotina, para evitar problemas no momento do transplante. O TSPR tem alto risco de complicações, sendo necessária a retirada do enxerto em número relativamente grande dos casos. A avaliação pelos métodos de imagem foi fundamental para o diagnóstico e planejamento do tratamento das complicações, sendo que o US com Doppler se mostrou suficiente como primeiro exame. A correlação com angioTC e(ou) angioRM foi necessária nos casos com suspeita de complicação vascular, permitindo confirmar a suspeita em todos os casos. / Introduction: Pancreas transplantation is a therapeutic option for patients with diabetes mellitus, when well indicated, to restore normoglycemia with no need of insulin, and the most commonly used technique is simultaneous pancreas-kidney transplantation. There has been an increase in the indication and performance of this procedure worldwide in recent years, increasing the importance of knowing the aspects of imaging in the pre- and posttransplantation of pancreas. Objectives: To evaluate and discuss the role of the different imaging modalities used in the assessment in the pre- and post transplantation of the pancreas emphasizing the normal findings and the possible complications. To propose a flowchart to perform imaging tests for the pancreas transplantation program considering the presented case series. Methodology: Retrospective survey of imaging methods with pre and post-procedure indications and findings in all patients undergoing pancreas transplantation at Hospital das Clínicas, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo. Results: We studied 14 cases with simultaneous pancreas-kidney transplantation, 13 of them undergoing transplantation in the period 2010-2016, which presented a mean age of 37.6 +/- 6.2 years (ranging from 24 to 51 years), of which 8 (57%) were male and 6 (42%) were female. One (7,2%) patient could not receive the pancreatic graft due to the frustrating surgical procedure resulting from an intraoperative diagnosis of extensive atheromatous plaque. The most common post-transplant complications were collections in the abdominal 9 cavity (6/13 cases (46.1%)), pancreatitis (6/13 (46.1%)) and vascular complications (4/13 (30.8% )). The US with Doppler was performed postoperatively in all cases. Conclusions: There is a need for routine preoperative vascular imaging of the recipient to avoid problems at the time of transplantation. TSPR has a high risk of complications, requiring removal of the graft in a relatively large number of cases. The evaluation by the imaging methods was fundamental for the diagnosis and planning of the treatment of the complications, and the US with Doppler was sufficient as the first examination. Correlation with angioTC and (or) angioRM was necessary in cases with suspected vascular complications, allowing confirmation of suspicion in all cases.

Há um número crescente de pessoas e animais com obesidade e sobrepeso, com consequente aumento no número de pacientes resistentes à insulina e portadores de Diabetes mellitus (DM). O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) tem sido caracterizado como uma molécula importante em inúmeros mecanismos fisiopatológicos. Em diabéticos, pesquisas indicam uma redução deste fator em alguns tecidos estudados, sendo esta menor expressão envolvida com o desenvolvimento de hipóxia tecidual e não cicatrização de feridas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivos caracterizar um modelo diabético induzido por dieta, avaliar a vascularização, expressão gênica e proteica do VEGFA e seus receptores FLT1 e KDR em pâncreas de camundongos diabéticos e não diabéticos, antes e após a terapia gênica com VEGF. O estudo consistiu de 2 fases para as quais foram utilizados cinquenta camundongos, na primeira fase foram utilizados 28 animais distribuídos em 6 grupos experimentais: submetidos à dieta controle (CT) e dieta hipercalórica (DH) por 3, 4 e 6 meses. Na segunda fase, 4 grupos experimentais foram avaliados aos 4 meses: CT e DH sem vetor terapêutico (CTPLL e DHPLL) e CT e DH com vetor terapêutico (CTVEGF e DHVEGF). A análise gênica pelo PCR em tempo real e proteica pela imuno-histoquímica evidenciou queda na expressão de VEGF, FLT1 e KDR no grupo DH, sendo que a variável estereológica de densidade de volume vascular (Vv) indicou queda significativa (p<0,05) da vascularização pancreática no grupo DH em relação ao CT aos 3, 4 e 6 meses do estudo. O DM foi caracterizado com queda significativa (p<0,05) na insulinemia após 4 meses com DH. Após a injeção pancreática no grupo DHVEGF do lentivírus contendo a sequência que condifica o VEGF, foram observados aumento na expressão gênica de VEGF , FLT1 e KDR (p<0,05), com aumento de Vv vascular pancreático e aumento na insulinemia. Os resultados obtidos sugerem que é possível obter um modelo animal diabético induzido por dieta, que o VEGF e seus receptores participam da evolução e estabelecimento do quadro diabético, levando a uma redução da vascularização pancreática, e que o aumento na expressão do transgene no pâncreas de camundongos diabéticos possa contribuir para a revascularização pancreática e função das células B. / There is an increasing number of people and pets showing overweight and obesity, with a consequent growth of the number of insulin-resistant and diabetic patients. The vascular endothelial growth factor (VEGF) has been characterized as an important molecule in many physiopathological states. Recent studies indicate a reduction in VEGF content in some tissues of diabetic patients causing tissue hypoxia and impairing cicatrization. In this context, this study aimed to characterize a diet-induced diabetic animal model and to evaluate vascularization, gene and protein expression of VEGFA and its receptors KDR and FLT1, in pancreas of diabetic and non-diabetic mice before and after gene therapy with VEGF. The study was divided in two phases and fifty male mice were used. In the first phase 28 animals were distributed into 6 groups: control diet (CT) and high calorie diet (DH) for 3, 4 and 6 months. In the second phase, four experimental groups were evaluated at 4 months: CT and DH without therapeutic vector (CTPLL and DHPLL) and CT and DH with therapeutic vector (CTVEGF and DHVEGF). The genetic analysis using real time PCR and protein by immunohistochemistry showed decrease in expression of VEGF, FLT1 and KDR in the DH group, and the stereological estimate of vascular volume density (Vv) indicated a significant decrease (p <0,05 ) of vascularization in pancreatic DH group relative to the CT at 3, 4 and 6 months of the study. Diabetic mice were characterized with a significant decrease (p <0,05) in insulin after 4 months with DH. After injection of lentivirus containing the VEGF sequence in DHVEGF´s pancreas, increase in VEGF, FLT1 and KDR gene expression (p <0.05) was observed, accompanied by the increase of vascular Vv and insulinemia. The results suggest that it is possible to obtain a diabetic animal model induced by diet, that VEGF and its receptors participate in the development and establishment of the diabetic state, leading to a reduction of pancreas vascularization, and that the increase of transgene expression in the pancreas of diabetic mice may contribute to the revascularization and function of pancreatic B cells.