Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Actinobacillus pleuropneumoniae est un bacille Gram-négatif de la famille des Pasteurellaceae. A. pleuropneumoniae est l'agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, une maladie hautement contagieuse et endémique qui cause encore à ce jour d’énormes pertes économiques dans le monde de l’industrie porcine. La pathogenèsedes infections à A. pleuropneumoniae implique plusieurs facteurs de virulence de la bactérie dont les principaux sont les lipopolysaccharides (LPS) et la capsule polysaccharidique (CPS). Ces derniers sont impliqués dans l'adhérence d’A. pleuropneumoniae. Très récemment, il a été démontré qu’A. pleuropneumoniae était capable de produire, sous certaines conditions un biofilm riche en poly- N-acétyl-D-glucosamine (PGA). Cependant, le rôle de cette structure dans la pathogenèse ainsi que les facteurs intervenant dans sa formation et ses signaux déclencheurs sont peu connus à ce jour. Dans cette étude, nous avons démontré que l’antigène O du LPS joue un rôle important dans la formation d’un biofilm mature par A. pleuropneumoniae que ce soit dans un modèle statique ou dans un modèle dynamique en flux, le «drip flow reactor», plus représentatif de l’environnement pulmonaire. Alors que l’absence de la capsule ou du noyau oligosaccharidique du LPS ne semble pas affecter la formation du biofilm, le défaut de formation du biofilm chez le mutant antigène O semble être lié à un problème de production de PGA. En effet, des tests d’immunodétection du PGA associé aux bactéries, à l’aide d’anticorps spécifiques, et les études d’expression du PGA démontrent que le mutant antigène O produit moins de polysaccharide. De plus, les gènes codant pour le système de stress exocytoplasmique CpxRA semblent être moins exprimés chez le mutant antigène O. I L’expression du système CpxRA a également été étudiée lors de l’exposition de souches faiblement productrices de biofilm à des doses sous inhibitrices de pénicilline G (sous-CMI de PG). L’expression des gènes cpxR et cpxA ainsi que d’un gène codant pour la biosynthèse du PGA est augmentée après exposition à des doses sous-CMI de PG. Cette augmentation est suivie d’une augmentation de la capacité des souches étudiées à former un biofilm ainsi que d’une modification de la composition de la matrice extracellulaire. Ces résultats suggèrent que des doses sous-CMI de PG semblent agir comme signaux activateurs de la formation de biofilm chez A. pleuropneumoniae. Finalement, des expériences visant à établir l’implication du biofilm dans l’échappement d’A. pleuropneumoniae au système immunitaire ont démontré que les bactéries du biofilm sont moins susceptibles d’activer des cellules immunitaires que les bactéries planctoniques. À l’aide de la spectrométrie de masse, nous avons démontré une distribution différente des structures du lipide A du LPS entre les bactéries planctoniques et ceux du biofilm. Ces modifications structurelles au niveau du lipide A pourraient expliquer, du moins en partie, cette diminution de la réponse inflammatoire suite à l’exposition des macrophages aux bactéries du biofilm d’A. pleuropneumoniae. Au cours de ce projet, nous avons ainsi pu identifier de nouveaux facteurs importants pour la formation du biofilm d’A. pleuropneumoniae nous permettant de mieux comprendre les mécanismes de formation du biofilm ainsi que son implication dans la pathogénicité. / Actinobacillus pleuropneumoniae is a Gram-negative bacterium belonging to the Pasteurellaceae family and the causative agent of porcine pleuropneumonia, a highly contagious disease that causes important economic losses to the swine industry worldwide. Several virulence factors of A. pleuropneumoniae have been identified. These factors include the Apx toxins, iron uptake systems and surface polysaccharides. Surface polysaccharides including lipopolysaccharides (LPS) and capsular polysaccharides (CPS) are implicated in the adhesion of A. pleuropneumoniae. Recent literature indicates that A. pleuropneumoniae has the ability to rapidly form a biofilm rich in poly-N-acetyl-D-glucosamine (PGA). However, the role of the biofilm in the pathogenesis as well as factors and signals involved in are little known to date. In this study, we demonstrated that the LPS O antigen plays an important role in the biofilm formation by A. pleuropneumoniae whether in a static model or a dynamic model under continuous flow, the "drip flow reactor" which is more representative of the lung environment. While truncation of the LPS core oligosaccharide or the absence of CPS did not have any effect, absence of O antigen markedly reduced the ability of A. pleuropneumoniae serotype 1 to form a mature biofilm. This finding was linked for the O-antigen mutant to a reduced pgaA expression and, consequently, a reduced PGA production. Indeed, compared to the parental or other strains, the biofilm of the O-antigen mutant was dramatically reduced and it had less cell-associated PGA. Real-time PCR analyses revealed a significant reduction in the level of pgaA which encodes for biosynthesis of PGA. Interestingly, the O-antigen mutant also exhibited reduced expression of stress extracytoplasmic CpxRA system. Expression of CpxRA system was also investigated during the exposure of field isolates of A. pleuropneumoniae to sub-minimal inhibitory concentrations of penicillin G (sub-MICs of PG). III Surprisingly, cpxR, cpxA and pgaA expression was increased after exposure to sub-MICs of PG. The up-regulation of these genes was followed by an increase of the capacity of the studied strains to form a biofilm as well as a change in the composition of the induced biofilm extracellular matrix. These results suggest that sub-MICs of PG seem to act as activators signal towards biofilms of A. pleuropneumoniae. Finally, experiments to establish the involvement of the biofilm in the immune evasion of A. pleuropneumoniae have shown that biofilm cells have weaker ability to stimulate innate immune cells compared to planktonic bacteria. Using mass spectrometry, we demonstrated a different distribution of structures of lipid A of LPS between planktonic bacteria and those of the biofilm. These structural changes in the lipid A could explain, at least in part, the reduction of the inflammatory response following exposure of macrophages to A. pleuropneumoniae biofilm cells compared to their planktonic counterparts. During this project, we were able to identify new factors important for biofilm formation of A. pleuropneumoniae allowing us to better understand the biofilm formation and its involvement in pathogenicity.

Chez des patients allergiques, il est possible de retrouver dans leur sérum desanticorps spécifiques du médicament (IgE) et dans leur sang des lymphocytes T spécifiquesdu médicament. La présence de LT spécifiques du médicament chez des patients allergiquessuggère la présentation du médicament par des cellules présentatrices d'antigène telles queles cellules dendritiques.Nous nous sommes alors intéressés à mieux comprendre l'implication deslymphocytes T et des cellules dendritiques dans le développement des allergies auxantibiotiques comme la pénicilline G (ou Benzyl-Pénicilline) ou le sulfaméthoxazole.Ce travail de thèse a permis: i) de démontrer la présence de lymphocytes Tspécifiques de la pénicilline G dans le sang périphérique de donneurs non allergiques à unefréquence mesurable, ii) de développer deux approches expérimentales et de modélisationpour l'identification des épitopes potentiellement présentés aux lymphocytes T et iii)d'étudier l'effet des médicaments sur les cellules dendritiques.Les perspectives de ce travail sont de mieux comprendre les mécanismes impliquésdans les allergies médicamenteuses au niveau des lymphocytes T et des cellules dendritiqueset de développer des tests de prédiction du " potentiel allergique " des médicaments, afinde mieux prédire les allergies médicamenteuses lors du développement des médicaments.

Ce travail concerne la réalisation d'une électrode enzymatique utilisable pour le suivi en ligne (<i>on-line</i>) d'un procédé de fermentation. Cette étude a nécessité la mise au point d'une nouvelle technique d'immobilisation, applicable à différentes enzymes. Elle est basée sur la formation de liaisons covalentes entre l'enzyme et l'agent portant: le glutaraldéhyde. La méthode consiste en une adsorption de l'enzyme suivie du dépôt, par vaporisation, de l'agent réticulant sur l'extrémité sensible des électrodes de pH en verre. Ce procédé d'immobilisation assure un temps de réponse extrêmement court du biocapteur. Cette performance est un avantage indéniable pour des mesures en continu, tel qu'un système d'analyse par injection en flux continu (FIA). Par la suite, nous avons développé des systèmes FIA incorporant trois différents types de cellules de détection appropriées aux besoins analytiques. Des électrodes à pénicillinase et à uréase, préparées selon la méthode décrite ci-dessus, ont été installées et utilisées dans ces cellules. Les systèmes biocapteurs-FIA, ainsi conçus, ne nécessitent alors ni réacteur enzymatique, ni réactif. De plus, le temps de réponse très court du biocapteur allie aux avantages de la FIA et aux spécificités des cellules a permis d'obtenir une cadence de mesure très élevée. Ce système d'analyse a été applique aux mesures en ligne de la concentration de pénicilline au cours de sa production fermentaire et aux mesures automatiques de l'urée dans les échantillons de sérum humain. Pour cela, nous avons automatise le système biocapteur-FIA et conçu une nouvelle cellule a écoulement agite pour l'installation des électrodes à uréase et a pénicillinase. Ce système biocapteur-FIA donne des résultats satisfaisants pour la détermination de l'urée et surtout s'est révélé extrêmement performant pour le suivi hors ligne et en ligne de la concentration de pénicilline pendant plusieurs fermentations d'une durée de 250 heures environ. Dans ce dernier cas, la comparaison des mesures effectuées avec le système biocapteur-FIA et une méthode classique de dosage (HPLC) est favorable à l'analyseur biocapteur-FIA qui assure des mesures en ligne avec une bonne fiabilité et a un moindre cout, mais aussi en raison de sa simplicité. En rendant possible une exploitation immédiate des mesures en ligne de la concentration en pénicilline par l'ordinateur central de l'installation fermentaire, le système biocapteur-FIA présente un pas important dans l'amélioration du contrôle et/ou de la modélisation des bioprocédés.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Chez des patients allergiques, il est possible de retrouver dans leur sérum desanticorps spécifiques du médicament (IgE) et dans leur sang des lymphocytes T spécifiquesdu médicament. La présence de LT spécifiques du médicament chez des patients allergiquessuggère la présentation du médicament par des cellules présentatrices d’antigène telles queles cellules dendritiques.Nous nous sommes alors intéressés à mieux comprendre l’implication deslymphocytes T et des cellules dendritiques dans le développement des allergies auxantibiotiques comme la pénicilline G (ou Benzyl-Pénicilline) ou le sulfaméthoxazole.Ce travail de thèse a permis: i) de démontrer la présence de lymphocytes Tspécifiques de la pénicilline G dans le sang périphérique de donneurs non allergiques à unefréquence mesurable, ii) de développer deux approches expérimentales et de modélisationpour l’identification des épitopes potentiellement présentés aux lymphocytes T et iii)d’étudier l’effet des médicaments sur les cellules dendritiques.Les perspectives de ce travail sont de mieux comprendre les mécanismes impliquésdans les allergies médicamenteuses au niveau des lymphocytes T et des cellules dendritiqueset de développer des tests de prédiction du « potentiel allergique » des médicaments, afinde mieux prédire les allergies médicamenteuses lors du développement des médicaments. / In allergic patients, antibodies like IgE or T-lymphocytes specific for the drugimplicated can be detected and measured. Presence of T-lymphocytes specific for the drugin allergic patients suggested the presentation of the culprit drug to T-lymphocytes byantigen presenting cells like dendritic cells.We were interested in better understanding the implication of T-lymphocytes anddendritic cells in the development of antibiotics allergies such as penicillin G (or Benzyl-Penicillin) or sulfamethoxazole.The results obtained in this work allowed us: i) to demonstrate the presence ofbenzyl-penicillin-specific T cells in the peripheral blood of non-allergic donors, at adetectable frequency; ii) to develop two approaches: one experimental and one usingmodelisation for the identification of epitopes potentially presented to T-lymphocytes andiii) to study the effect of drugs on DC.The perspectives of this research work are to better understand the mechanismsimplicated in drug allergies and to develop predictive tests for “drug allergic potential", inorder to be able to better predict drug allergies during drug development.

Streptococcus pneumoniae, le pneumocoque, est une bactérie pathogène qui entraîne le décès de plus d'un million et demi de personnes dans le monde chaque année. Les β-lactamines sont très utilisées pour traiter les infections à pneumocoques. Ces antibiotiques inhibent la synthèse du peptidoglycane, une molécule géante constituant un réseau de chaînes glycopeptidiques qui englobe la cellule, lui confère sa forme et lui permet de maintenir son intégrité face à la pression osmotique. Le mécanisme d'action des β-lactamines est bien connud'un point de vue biochimique. En revanche, la réponse physiologique empêchant la multiplication des bactéries traitées est mal connue. Au cours de ma thèse, j'ai étudié les mécanismes moléculaires de la morphogenèse du pneumocoque par des approches de biochimie et de microbiologie. Un modèle de morphogenèse est proposé intégrant mes résultats à la littérature et permettant de formuler des hypothèses sur la réponse physiologique de S. pneumoniae aux β-lactamines. / Streptococcus pneumoniae, the pneumococcus, is a bacterial pathogen that causes more than 1.5 million deaths each year in the world. β-Lactams are widely used to treat patients with pneumococcal infections. These antibiotics inhibit the synthesis of the peptidoglycan, a giant molecule constituting a mesh of aminosugar strands encasing the cell. This main constituent of the cell wall allows cells to maintain their integrity under the turgor pressure, and endows bacteria with their shape. The action of β-lactams is well understood from a biochemical point of view. However, a complete understanding of the physiological response of treated bacteria remains elusive. In this thesis, I investigated the molecular mechanisms of the morphogenesis of S. pneumoniae using methods of biochemistry and microbiology. A morphogenesis model is built based on my results and the literature, which permits to emit hypotheses concerning the response of the pneumococcus to β-lactams.