Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-27Bitstream added on 2014-06-13T20:41:50Z : No. of bitstreams: 1 000741932.pdf: 2507197 bytes, checksum: f30c63e246b50ee2a82790109f418fe8 (MD5) / O Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. Dentre os vários mecanismos da resposta inata contra esse fungo, os envolvendo as células fagocitárias desempenham papel central na contenção do processo infeccioso, com destaque para a participação na atividade fungicida e modulação da resposta inflamatória. As funções das células fagocitárias contra os diversos microrganismos, incluindo os fungos, são iniciadas a partir de mecanismos de ativação dessas células, gerados após o reconhecimento dos mesmos por receptores de reconhecimento de estruturas moleculares padrões (PRRs) que reconhecem estruturas moleculares compartilhadas por determinados grupos de microrganismos, os chamados padrões moleculares associados à patógenos (PAMPS). Nosso estudo objetivou estudar a participação dos receptores TLR2, TLR4, receptor de manose (MR) e dectina-1, na produção de citocinas pró e anti-inflamatórias e dos eicosanóides PGE2 e LTB4, por monócitos e neutrófilos humanos em resposta a cepas de P. brasiliensis de alta (Pb18) e baixa virulência (Pb265). Verificamos que as duas cepas do fungo, mas principalmente a Pb265 são capazes de induzir a produção de TNF- por monócitos. TLR2 e TLR4 foram os receptores que se mostraram mais envolvidos nesse processo. Adicionalmente, mostramos a capacidade de essas células liberarem IL-12 em resposta ao fungo, sendo os maiores níveis detectados para a cepa Pb265 e ocorrendo um importante papel do TLR4 e MR. Altos níveis de IL-10 também foram detectados, principalmente em resposta à cepa Pb18 para a qual houve um envolvimento do TLR2 e do MR. Para a cepa 265, o receptor de maior envolvimento foi o TLR2. As duas cepas, de forma semelhante, foram capazes de induzir uma maior produção de PGE2 e LTB4 pelos monócitos. No entanto, nenhum dos PRRs mostrou-se envolvido na produção dos... / Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidiodomycosis, the most prevalent deep mycosis in Latin America. During the innate immune response of the host against this fungus, phagocytic cells play an essential role, highlighting their participation in fungicidal activity and modulation of the inflammatory response. The functions of phagocytic cells against various microorganisms, including fungi, are initiated by the recognition of patterns molecular structures, shared by a group of microorganisms, called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), by pattern recognizing receptors (PRRs) expressed by these cells. In this study, we assessed the involvement of the PRRs : TLR2, TLR4, mannose receptor (MR) and dectin-1, in the production of pró and anti-inflammatory cytokines and the eicosanoid PGE2 and LTB4, by human monocytes and neutrophils in response to high- (Pb18) and a low- (Pb265) virulence strain of P. brasiliensis. We showed that monocytes produce TNF-alpha and IL-12 in response to both strains, but with higher levels to Pb 265. TLR2 and TLR4 were the main receptors involved in TNF-alpha production, while for IL-12, the participation of TLR4 and MR was detected. High levels of IL-10 were also observed, mainly in response to Pb18, with involvement of TLR2 and MR. For Pb265, the receptor responsible was TLR2. Boths strains were able to induce PGE2 and LTB4 by monocytes. However, none of the studied receptors was shown to be involved in this production. Neutrophils did not produce TNF-alpha in response to both strains. On the other hand, these cells produce IL-12, mainly in response to Pb265, with participation of TLR2, dectin-1 and TLR4. These cells also produce L-10, whose levels were higher for Pb18 with involvement of TLR2 and MR and only TLR2 for Pb265. The production of PGE2 and LTB4 was also detected for these cells, similarly for the two strains. For PGE2, it ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-05Bitstream added on 2014-06-13T20:04:05Z : No. of bitstreams: 1 nascimento_mpp_dr_botfm.pdf: 257230 bytes, checksum: 279e4c7577f3c5e9014f50d0a8e75ddc (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Células gigantes multinucleadas (CGM) são células características, presentes em lesões granulomatosas, induzidas por agentes infecciosos e, sua formação pode ser modulada por citocinas produzidas por células da resposta imune. No presente trabalho avaliou-se o efeito modulador de citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ e TNF-α) e anti-inflamatórias (IL-10 e TGF-β1) na formação de CGM in vitro, a partir de monócitos humanos, estimulados com antígenos de Paracoccidioides brasiliensis (AgPb) e sobre a atividade fungicida dessas células desafiadas com a cepa Pb18 de P.brasiliensis. Monócitos do sangue periférico de indivíduos saudáveis foram cultivados na ausência de estímulo (controle), com AgPb (100ug/mL) ou com associações de AgPb e GM-CSF (100 U/ml) com as citocinas: IFN-γ (300UI/mL), IL-10 (50U/mL), TGF- β1 (250pg/mL) ou TNF-α (50U/mL). A formação de CGM foi avaliada após três dias de cultivo, estabelecendo-se o índice de fusão (IF) e a percentagem de CGM após fixação e coloração das células com May-Grunwald-Giemsa. Além disso, a atividade fungicida dessas células foi avaliada após 4 h de co-cultivo das CGM com 4 x 104 células leveduriformes viáveis da cepa Pb18 de P. brasiliensis, por plaqueamento das co-culturas em meio BHI-ágar e determinação da recuperação de fungos viáveis. O método estatístico empregado para comparação dos resultados foi análise de variância, com nível de significância de 5%. Os resultados mostraram que a incubação de monócitos com AgPb+GM-CSF+IFN-γ induziu IF significativamente mais elevados em relação a todas as demais culturas: controle, apenas estimulados com AgPb ou AgPb adicionado das demais citocinas. A adição de TNF- α+AgPb+GM-CSF não resultou em IF maiores do que os obtidos na cultura estimulada apenas com o AgPb, enquanto as citocinas IL-10 e TGF-β1 apresentaram efeito supressor... / Multinucleated giant cells (MGC) are characteristics cells present in granulomatous lesions induced by infectious agents and also may be modulated by cytokines produced by cells of the immune response. The present study evaluated the modulatory effect of interferon-gamma (IFN-γ) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) pro-inflammatory cytokines, and interleukin-10 (IL-10) and transforming growth factor beta (TGF-β1) anti-inflammatory cytokines on in vitro formation of MGC derived from human monocytes, stimulated with Paracoccidioides brasiliensis antigen (PbAg) and on fungicidal activity of these cells challenged with the Pb18 strain of P.brasiliensis. Peripheral blood monocytes obtained from healthy individuals were cultured for three days without stimulus (control) or with PbAg (100 ug/mL) or with association of PbAg and granulocyte macrophage colony stimulator factor (GMCSF (100 U/mL) with the following cytokines: IFN-γ (300 UI/mL), IL-10 (50 UI/mL), TGF-β1 (250 pg/mL) or TNF-α (50 UI/mL). The generation of MGC was evaluated by fusion index (FI) and the percentage of MGC formation after cell fixing and May-Grumwald-Giensa staining. Fungicidal activity of monocytederived MGC was evaluated 4h after co-culture of MGC with 4 x 104 viable yeast cells of Pb18 strain, by plating the cultures in BHI-agar and determination of viable fungi recovery. The statistical method employed for the comparison of the results was analysis of variance with the significance set at p< 0.05. The results showed that the incubation of monocytes with PbAg+GM-CSF+IFN-γ induced FI significantly higher than those observed in all the other cultures, such as control cultures, cultures stimulated with PbAg only or cultures stimulated with PbAg associated with the other cytokines. Stimulation with PbAg+TNF+GM-CSF did not result in FI higher than those obtained in the culture stimulated with PbAg only... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-07-29T15:56:28Z No. of bitstreams: 1 2012_PauloAntonioAlvarez.pdf: 2479176 bytes, checksum: 131c372971163154ba6bf20da667bbce (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2013-08-06T20:48:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_PauloAntonioAlvarez.pdf: 2479176 bytes, checksum: 131c372971163154ba6bf20da667bbce (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T20:48:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_PauloAntonioAlvarez.pdf: 2479176 bytes, checksum: 131c372971163154ba6bf20da667bbce (MD5) / O Paracoccidioides lutzii é o agente causador da Paracoccidioidomicose (PCM), uma doença endêmica em áreas rurais da América Latina que afeta cerca de 10 milhões de indivíduos. Neste trabalho realizamos a primeira reconstrução in silico em larga escala da rede metabólica desse fungo, com o objetivo de integrar e disponibilizar mais informações sobre a biologia molecular de P. lutzii.

Orientador: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Gil Benard / Resumo: A interleucina-15 (IL-15) é uma citocina pró-inflamatória produzida principalmente por monócitos e macrófagos em resposta a agentes infecciosos, desempenhando importante papel modulador na imunidade inata e adaptativa. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da IL-15 sobre a atividade fungicida, metabolismo oxidativo e a produção de citocinas por monócitos humanos, infectados in vitro com cepa virulenta de Paracoccidioides brasiliensis (Pb18). Monócitos de sangue periférico, obtidos de indivíduos saudáveis, foram préincubados na ausência ou presença de IL-15 (12,5, 25 e 50 ng/mL) por 24 h a 37oC e infectados com Pb18 na proporção de 50 monócitos para uma célula fúngica durante 4 h e 18 h. A atividade fungicida de monócitos foi determinada após 4 h pela recuperação de fungos viáveis por plaqueamento das co-culturas em meio BHI-ágar. O metabolismo oxidativo foi avaliado pela liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2) e de ânion superóxido (O2 -) nas culturas desafiadas com Pb18 e estimuladas com phorbol myristate acetate (PMA) durante 60 mim. A produção de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a), IL-6, IL-10 e IL-15 foi determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA) nos sobrenadantes das coculturas obtidos após 4 e 18 h de incubação. Os resultados mostraram que a préincubação de monócitos com IL-15 induziu aumento significativo na atividade fungicida contra Pb18 de maneira dose-dependente, sendo esse efeito neutralizado pela adição de anticorpo monoclonal anti-IL-15. O tratamento com IL- 15 não interferiu na capacidade de liberação de H2O2 e O2 - por monócitos desafiados com Pb18 sugerindo que a atividade fungicida estimulada por IL-15 ocorre por mecanismos independentes do metabolismo oxidativo. Monócitos infectados com o fungo, na ausência de IL-15, produziram níveis de TNF-a, IL-6 e IL-10... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Interleukin-15 (IL-15) is a pro-inflammatory cytokine especially produced by monocytes and macrophages against infectious agents and that play a pivotal role in teh innatte and adaptive immune response. The aim of this study was to analyze the effects of IL-15 on fungicidal activity, oxidative metabolism and cytokine production by human monocytes challenged in vitro with a virulente strain of Paracoccidioides brasiliensis (Pb18). Peripheral blood monocytes obtained from healthy individuals were pre-incubated for 24h with or without human recombinant IL-15 (12.5,25 and 50 ng/mL), and then challenged with Pb18 in a ratio of 50:1 monocytes:fungi. Fungicidal activity of monocytes against Pb18 was assessed by viable fungi recovery from 4 h co-cultures after plating in BHI-agar. Oxidative metabolism was evaluated by hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide anion (O2 -) release in the monocyte cultures challenged by Pb18 and stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) for 60 min. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-a), IL-6, IL-10 and IL-15 production by monocytes were determined in culture supernatants by enzyme immunoassay (ELISA). The results showed that IL-15 ehanced fungicidal activity against Pb18 in a dose-dependent pattern. This effect was abrogated by additon of anti-IL-15 monoclonal antibody to the co-cultures. No significant effect of IL-15 on H2O2 and O2 - release by monocytes was observed suggesting that the fungicidal activity was independent of oxidative metabolism activation. Monocytes infected with P. brasiliensis in the absence of IL-15, produced significantly higher levels of TNF-a, IL-6 and IL-10 after 18 h of coculture in comparison to experiments of 4h-incubation with the fungus. The pretreatment of monocytes with IL-15 induced significant higher levels of TNF-a, IL-10 and IL-15 production by these cells challenged with the fungus... (Complete abstract click eletronic address below) / Mestre

Orientador: Rinaldo Poncio Mendes / Banca: Eva Burger / Banca: Roberto Martinez / Resumo: O tratamento da PCM, micose sistêmica causada Paracoccidioides brasiliensis, continua sendo objeto de pesquisa clínica e experimental. Este trabalho avaliou a eficácia de diferentes esquemas terapêuticos com cotrimoxazol (CMX), na dose diária de 200 mg/kg de peso corporal, em dose diária única, no tratamento da PCM murina. Os resultados revelaram que o tratamento com CMX por tempo prolongado foi eficaz quando iniciado precoce ou tardiamente. O tratamento com curta duração foi ineficaz, pois não determinou diminuição da carga fúngica, durante as 20 semanas de seguimento. O efeito do CMX foi o mesmo em pulmões e baço, nos diferentes esquemas terapêuticos utilizados, eficazes ou não. A mortalidade cumulativa entre os grupos 1, 2 e 4 não diferiram entre si, os grupos 3 e 5 apresentaram a melhor taxa de sobrevida. Os níveis séricos de anticorpos específicos foram detectados a partir da segunda semana, apresentando maiores índices nos animais do G2, sendo que nesses os níveis aumentaram até a oitava semana e permanecendo estáveis por todo o experimento. No G3 houve uma flutuação durante todo o experimento apresentando níveis altos na 20a semana. Os grupos 4 e 5 permaneceram estáveis durante todo o experimento. Os efeitos benéficos do tratamento foram observados com a administração de CMX em dose única diária, cujos níveis séricos se mantiveram adequados por menos de 12 horas. Esses resultados, bastante satisfatórios, demonstram que o modelo experimental murino é bom método de avaliação da eficácia do CMX no tratamento da PCM e sugerem a avaliação de outros esquemas terapêuticos, como a administração a cada 12 horas. / Abstract: Paracoccidioidomicosis (PCM) treatment, a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis, has been a clinical and experimental research issue. This work evaluated the efficacy of different therapeutic protocols with cotrimoxazole (CMX) on a daily dosage of 200mg/kg body weight, in a single daily dosage on murine PCM treatment. The results showed that CMX treatment for a prolonged period was efficient when started early or late. The short duration treatment was inefficient once it did not determine fungus load decrease during 20 weeks of following. CMX effect was the same in lungs and spleen under different therapeutic protocols used, whether efficient or not. Cumulative death tends to be different among studied groups. Death frequency was smaller in prolonged treated groups with an early or late protocol starting. Specific antibodies blood levels were detected from the second week and did not differ among experimental groups. Beneficial effects of treatment were observed with CMX administration on a daily single dosage and blood levels remained satisfactory for less than 12 hours. These results, quite satisfactory, show that murine experimental protocol is a good evaluation method of MCX effectiveness on PCM treatment and it suggests the evaluation of other therapeutic protocols, as an administration at every 12 hours. / Doutor

Orientador: Angela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Eduardo Bagagli / Banca: Adriana Pardini Vicentini Moreira / Resumo: Paracoccidioides brasiliensis, é o agente da paracoccidioidomicose, a micose profunda endêmica na América Latina. Produção de eicosanóides, como prostaglandinas e leucotrienos, durante as infecções fúngicas tem mostrado desempenhar um papel crítico na sobrevivência e/ou crescimento fúngico, bem como na modulação da resposta imune do hospedeiro. As células hospedeiras são uma fonte desses mediadores, porém outra fonte em potencial pode ser o próprio fungo. O objetivo do nosso estudo foi avaliar se cepas do P. brasiliensis com diferentes graus de virulência (Pb18, Pb265, BT79, Pb192) produzem, prostaglandina E2 (PGE2) e leucotrieno B4 (LTB4). Além disso, verificamos se P. brasiliensis pode usar fontes exógenas de ácido araquidônico (AA), bem como as vias metabólicas dependentes das enzimas cicloxigenase (COX) e lipoxigenase (5-LO), para a produção de PGE2 e LTB4, respectivamente. Finalmente, uma possível associação entre esses eicosanóides e a viabilidade do fungo também foi avaliada. Demonstramos, usando ensaios de Elisa, que todas as cepas de P. brasiliensis, independente do seu grau de virulência, produzem altos níveis de PGE2 e LTB4 após 4h cultura que foram reduzidos após 8h. No entanto, em ambos os tempos da cultura, foram detectados níveis mais elevados de eicosanóides, quando as culturas foram complementadas com uma fonte exógena de AA. Diferentemente, o tratamento com indometacina, um inibidor da COX, ou MK886, um inibidor da 5-LO, induz a uma redução nos níveis de PGE2 e LTB4, respectivamente, bem como a viabilidade do fungo. Os dados fornecem evidências de que P. brasiliensis tem a capacidade de metabolizar, tanto AA endógeno como exógeno por vias dependentes da COX e 5-LO enzimas que participam da produção de PGE2 e LTB4, respectivamente, que são indispensáveis para a sua viabilidade. / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis, is the agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent deep mycosis in Latin America. Production of eicosanoids, such as prostaglandins and leukotrienes, during fungal infections is theorized to play a critical role on fungal survival and/or growth as well as on host immune response modulation. Host cells are one source of these mediators; however another potential source may be the fungal itself. The purpose of our study was to assess whether P. brasiliensis strains with different degree of virulence (Pb18, Pb265, PbBT79, Pb192) produce both, prostaglandin E2 (PGE2) and leukotriene B4 (LTB4). Moreover, we asked if P. brasiliensis can use exogenous sources of arachidonic acid (AA), as well as metabolic pathways dependent on cyclooxygenase ( COX) and lipooxygenase (5-LO ) enzymes, for PGE2 and LTB4 production , respectively. Finally, a possible association between these eicosanoides and fungus viability was assessed. We have demonstrated, using Elisa assays, that all P. brasiliensis strains, independently of their virulence degree, produce high PGE2 and LTB4 levels on 4h culture that were reduced after 8 h. However, in both culture times, higher eicosanoides levels were detected when culture medium was supplemented with exogenous AA. Differently, treatment with indomethacin, a COX inhibitor, or MK886, a 5-LO inhibitor, induces a reduction on PGE2 and LTB4 levels, respectively, as well as in fungus viability. The data provide evidence that P. brasiliensis has the capacity to metabolize either endogenous or exogenous AA by pathways dependent on COX and 5-LO enzymes for producing PGE2 and LTB4, respectively, that are critical for its viability. / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências Biológicas, 2014. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2014-08-13T13:24:07Z No. of bitstreams: 1 2014_DiogoMagnaboscodeAlmeidaGomes_Parcial.pdf: 2936989 bytes, checksum: efbdbdb843f99d312bd84a42e9123e7f (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-08-14T12:45:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_DiogoMagnaboscodeAlmeidaGomes_Parcial.pdf: 2936989 bytes, checksum: efbdbdb843f99d312bd84a42e9123e7f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-14T12:45:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_DiogoMagnaboscodeAlmeidaGomes_Parcial.pdf: 2936989 bytes, checksum: efbdbdb843f99d312bd84a42e9123e7f (MD5) / Paracoccidioides brasiliensis é um parasita intracelular facultativo que apresenta-se sob a forma de micélio à temperatura ambiente e se diferencia para forma de levedura quando submetido à temperatura de 37°C ou durante a invasão aos tecidos de hospedeiros. P. brasiliensis não necessita do hospedeiro mamífero para completar seu ciclo biológico. Apesar disso, o fungo é capaz de sobreviver e se replicar nos tecidos do hospedeiro com o estabelecimento da doença. Em face desse paradoxo, questiona-se porque tais estratégias de sobrevivência se originaram e foram mantidas pela evolução nesse organismo. A hipótese proposta para vários fungos patogênicos é que fatores de virulência possam ter se desenvolvido como uma resposta à interação com predadores presentes no ambiente. Tais estudos utilizaram a ameba de solo Acanthamoeba castellanii, e mostraram quão expressivas são as similaridades nas estratégias fagocitárias de amebas e macrófagos. O objetivo geral desse trabalho é analisar a interação entre P. brasiliensis e A. castellanii, identificando os principais efeitos dessa interação na viabilidade dos organismos e na virulência desse fungo. Avaliando a interação entre P. brasiliensis e A. castellanii podemos constatar que a ameba é capaz de internalizar células do fungo. A cinética de fagocitose nos mostra que a porcentagem de amebas com fungos internalizados aumenta até 2 h após o início da coincubação e se mantem até 6 h. Analisando resultados da mortalidade de A. castellanii e P. brasiliensis quando coincubados por 24h observamos que a ameba é capaz de sobreviver e eliminar o fungo. Porém acreditamos que o fungo possa aumentar sua virulência quando recuperado após a coincubação com ameba, o que corrobora com resultados de testes similares feitos em macrófagos e nos dão fortes indícios de que esses protozoários estão intimamente ligados com o aparecimento de fatores de virulência em P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis is a facultative intracellular parasite and presents itself in the form of mycelium at room temperature and as yeast at 37°C or during invasion of host tissues. P. brasiliensis does not require a mammalian host to complete its life cycle. Nonetheless, the fungus is able to survive and replicate in the host tissues with the development of the disease. In view of this paradox, it is questioned why such survival strategies were originated and maintained in that organism. To try to answer this question Steenbergen et al (2001) and Casadevall et al (2003) created a hypothesis that virulence factors may have developed in some virulent fungi in response to interaction with predators in the environment. Such studies used the soil amoeba Acanthamoeba castellanii, and showed how significant are the similarities in the phagocytic strategies from amoebae and macrophages. The aim of this study is to analyze the interaction between P. brasiliensis and A. castellanii, identifying the main effects of this interaction in the viability of these two organisms and virulence of this fungus. Evaluating the interaction between P. brasiliensis and A. castellanii we observed that amoeba is capable of internalizing fungal cells. The kinetics of phagocytosis shows that the percentage of amoeba with internalized fungi increases within 2h after the start of coincubation and keeps up to 6h. Analyzing mortality results of A. castellanii and P. brasiliensis after coincubation for 24h we observed that amoeba is capable of surviving and kill the fungus. However, we believe that the fungus can increase its virulence when recovered after coincubation with amoebae, in agreement with results of similar tests on macrophages and gives us strong evidence that this protozoa is closely related with the emergence of virulence factors in P. brasiliensis.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-12-07T14:22:53Z No. of bitstreams: 1 2012_AnaCamilaOliveiraSouza.pdf: 9707081 bytes, checksum: f668245bede41d667195b70bc7cc3cbe (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-12-10T10:11:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AnaCamilaOliveiraSouza.pdf: 9707081 bytes, checksum: f668245bede41d667195b70bc7cc3cbe (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-10T10:11:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AnaCamilaOliveiraSouza.pdf: 9707081 bytes, checksum: f668245bede41d667195b70bc7cc3cbe (MD5) / O desenvolvimento de nanopartículas poliméricas tem se tornado uma importante estratégia para otimização da eficácia terapêutica de inúmeros fármacos, podendo ampliar sua atividade e reduzir sua toxicidade. A nanoestruturação da Anfotericina B (NANO-D-AMB), importante antifúngico usado no tratamento de algumas micoses sistêmicas, como a paracoccidioidomicose e a candidíase, apresentou eficácia no tratamento da paracoccidoidomicose (PCM) experimental, com atividade antifúngica similar à da anfotericina B deoxicolato (D-AMB) e possibilitando um menor número de aplicações. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi determinar a capacidade antifúngica e biocompatibilidade desta nova formulação in vitro, bem como comparar a eficácia terapêutica de diferentes doses de NANO-D-AMB com D-AMB e Ambisome® no combate a PCM murina. Para isso, determinou se in vitro a concentração mínima inibitória de NANO-D-AMB em leveduras de Paracoccidioides brasiliensis e avaliou-se sua capacidade hemolítica e citotóxica em macrófagos peritoniais. Realizou se também a infecção de camundongos BALB/c e posteriormente o tratamento com as nanopartículas em diferentes doses, D- AMB e Ambisome®. Foi observado que NANO-D-AMB apresentou eficácia antifúngica in vitro similar a Ambisome®, bem como menor indução de hemólise e menor citotoxicidade em comparação a D-AMB. Além disso, foi observada similar capacidade antifúngica in vivo em relação à D-AMB e Ambisome®, sem indução de alterações histológicas e nas funções renais e hepáticas, com a vantagem de permitir uma diminuição em 25% na quantidade de anfotericina B injetada. O tratamento com NANO-D-AMB e Ambisome® ajudaram a modular positivamente a resposta imunológica em favor do hospedeiro. Além disso, verificou-se que o uso de sobredoses não provocou toxicidade aguda. Juntos esses resultados sugerem NANO-D-AMB como uma alternativa ao uso de D-AMB e Ambisome®. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The development of polymeric nanoparticles has become an important strategy for optimizing the therapeutic efficacy of many drugs, as it may expand their activities and reduce their toxicity.- The nanostructuring of Amphotericin B (NANO-D-AMB), an important antifungal agent used to treat some systemic mycoses such as paracoccidioidomycosis and candidiasis, showed efficacy in treating experimental paracoccidoidomicose (PCM), with antifungal activity similar to that of amphotericin B deoxycholate (D-AMB) and allowing a fewer number of applications. In this context, the aim of this study was to determine the antifungal activity of this new formulation and its biocompatibility in vitro and to compare the efficacy of different doses of NANO-D-AMB between D-AMB and Ambisome® in combating murine PCM. For this, it was determined in vitro minimum inhibitory concentration of NANO-D-AMB in Paracoccidioides brasiliensis yeasts, and it was evaluated its hemolytic and cytotoxic activities in peritoneal macrophages. Also, BALB/c mice were infected and then treated with the nanoparticles in different doses, D-AMB and Ambisome®. It was observed that NANO-D-AMB exhibited in vitro antifungal efficacy similarly to Ambisome® and induced lower hemolysis and cytotoxicity compared to D-AMB. Moreover, it was observed similar in vivo antifungal capacity in relation to D-AMB and Ambisome® without inducing changes in renal and hepatic histology and function, with the advantage of a 25% decrease in the amount of amphotericin B injected. Treatment with NANO-D-AMB and Ambisome® helped to positively modulate the immune response in favor of the host. Furthermore, it was found that the use of overdoses did not cause acute toxicity. Together, these results suggest NANO-D-AMB as an alternative to the use of D-AMB and Ambisome®.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-03-04T12:17:39Z No. of bitstreams: 1 2012_LuanaCastroOliveira.pdf: 2841384 bytes, checksum: 0632b4b2ba99fc494aa9ce5971604fd2 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2013-03-06T14:00:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LuanaCastroOliveira.pdf: 2841384 bytes, checksum: 0632b4b2ba99fc494aa9ce5971604fd2 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-06T14:00:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LuanaCastroOliveira.pdf: 2841384 bytes, checksum: 0632b4b2ba99fc494aa9ce5971604fd2 (MD5) / O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica humana mais comum na América Latina. O local de contato inicial entre o fungo P. brasiliensis e o hospedeiro é o epitélio respiratório. A resistência do hospedeiro à PCM está associada à ativação de células fagocíticas ao longo da infecção. Os antifúngicos atualmente utilizados no combate à PCM apresentam desvantagens como a alta incidência de efeitos colaterais e o aumento de casos de resistência. A epigenética refere-se a modificações nos padrões de expressão gênica herdáveis ao longo de sucessivas divisões celulares ou de sucessivas gerações de um indivíduo, e que não envolvem mudanças na sequência de nucleotídeos do DNA. As principais marcas epigenéticas envolvem a metilação de citosinas em ilhas CpG no DNA e as modificações pós-traducionais de histonas. Drogas como a 5-aza-2’-deoxi-citidina (5-AZA, inibidor de DNA metiltransferases), tricostatina A (TSA) e butirato de sódio (BS, inibidores de histona desacetilases) vêm sendo empregadas para modular estados epigenéticos. Em fungos patogênicos como C. albicans e C. neoformans, a administração de moduladores epigenéticos levou a uma diminuição no crescimento e viabilidade das leveduras. No presente estudo, avaliamos os efeitos biológicos de 5-AZA, TSA e BS sobre leveduras de P. brasiliensis e sobre uma linhagem de macrófagos murinos. As mais altas concentrações de drogas que não interferiram no crescimento celular foram definidas como BS 1 mM, TSA 20 nM e 5-AZA 1 µM, para macrófagos J774, e BS 10 mM, TSA 1,5 µM e 5-AZA 2 µM para leveduras de P. brasiliensis. 5-AZA provocou um aumento do índice de internalização das leveduras pelas células J774 com 2h e 6h de infecção, enquanto BS provocou aumento em 2h e TSA não afetou esse índice. A análise do acúmulo de mensageiros de genes relacionados à resposta imune revelou uma diminuição dos níveis de transcritos de MyD88 em macrófagos tratados com BS, ao passo que 5-AZA elevou os níveis de transcritos desse adaptador. O acúmulo de transcritos NF-κB diminuiu quando os macrófagos foram infectados e tratados com 5-AZA e BS, enquanto TSA não teve efeito. O mensageiro de TNF-α, em macrófagos infectados tratados com 5-AZA, também teve aumento significativo de acúmulo, o que não aconteceu no tratamento com TSA ou BS. Os níveis do transcrito de IL-6 foram afetados apenas pela administração de TSA, que elevou o acúmulo dos mensageiros dessa interleucina. Nas culturas infectadas e tratadas com TSA observou-se uma diminuição do nível de TNF-α secretado, enquanto o tratamento com BS provocou um aumento dessa citocina no sobrenadante. Nossos dados indicam que alterações epigenéticas possam participar da regulação da resposta de fagócitos quando em contato com células fúngicas, e que mais de uma via de sinalização pode estar relacionada a essa resposta. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiologic agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent deep mycosis in Latin America. The first contact between the fungus and the host is the respiratory epithelium. The host resistance to PCM is related to the activation of phagocytic cells during the course of the infection. The antifungals used against PCM show many disadvantages, as high incidence of side effects and increasing fungal resistance. The term epigenetic refers to modifications in the genetic expression patterns, heritable through cell divisions or individuals generations, which do not implicate in changes in the sequence of nucleotides of the DNA. The main epigenetic marks are the cytosine methylation in DNA CpG islands and histones post-translational modifications. Drugs such as 5-aza-2’-deoxy-cytidine (5-AZA, methyltransferase inhibitor), trichostatin A (TSA) and sodium butyrate (SB, histone desacetylase inhibitors) have been used to modulate epigenetic states. In pathogenic fungi such as C. albicans and C. neoformans, the use of epigenetic modulators led to a lower growth rate and yeasts viability. In the present work we evaluated the biological effects of 5-AZA, TSA and SB on P. brasiliensis yeast cells and on a lineage of murine macrophages. The highest drug concentrations that did not affect cell growth were SB 1 mM, TSA 20 nM and 5-AZA 1 µM, to the macrophages, and SB 10 mM, TSA 1,5 µM and 5-AZA 2 µM, to P. brasiliensis yeast cells. 5-AZA induced a higher internalization yeasts index by the macrophages within 2h and 4h of infection, while SB had the same effect with 2h of infection and TSA did not affect this index. The transcripts accumulation analysis of genes related to the immune response showed a down modulation of the MyD88 transcript levels in macrophages treated with SB, whilst 5-AZA up regulated the transcript levels of this gene. The NF-κB transcript level was lower when macrophages were infected and treated with 5-AZA and SB, while TSA did not show any effect. TNF-α transcripts accumulation was also upregulated in macrophages infected and treated with 5-AZA, what was not observed with TSA or SB. IL-6 transcripts level was only affected by the TSA administration, which upregulated it. In cultures infected and treated with TSA, there was a lower level of secreted TNF-α, while SB had the opposite effect, increasing this cytokine in the supernatant. Our data indicate that epigenetic modifications can participate in the regulation of the phagocytes response to fungal cells and that alternative signaling pathway can be related to this answer.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-06-04T11:38:29Z No. of bitstreams: 1 2012_CamiladeArrudaSaldanha.pdf: 96942110 bytes, checksum: 18a4e202aea1b4948fd6301cc224ad19 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-04T12:52:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_CamiladeArrudaSaldanha.pdf: 96942110 bytes, checksum: 18a4e202aea1b4948fd6301cc224ad19 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-04T12:52:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_CamiladeArrudaSaldanha.pdf: 96942110 bytes, checksum: 18a4e202aea1b4948fd6301cc224ad19 (MD5) / A paracoccidioidomicose, Pbmicose, é uma micose sistêmica autóctone da América central e do sul, de caráter endêmico entre as populações de zona rural. Dentre os fármacos mais utilizados no tratamento da Pbmicose destacam-se o Itraconazol e a Anfotericina B. Este último possui amplo espectro antifúngico e potente atividade fungicida. Apesar disso, induz em humanos diversos efeitos adversos, principalmente a nefrotoxicidade. Nesse contexto, novas estratégias tais como a ligação da Anfotericina B a estruturas biocompatíveis têm sido desenvolvidas para diminuir a sua concentração no plasma sanguíneo e aumentar nos órgãos alvos da terapia e, assim, reduzir os efeitos colaterais induzidos por esse fármaco. Dentre essas estruturas destacam-se os materiais nanoestruturados como as nanopartículas magnéticas. Entretanto, para serem utilizadas na biomedicina essas nanopartículas devem ser biodegradáveis, hemocompatíveis e não tóxicas ao organismo. Para tal, é importante que elas sejam recobertas por substâncias estabilizantes. Nesse sentido, a fim de desenvolver um sistema controlado de entrega de drogas e de reduzir os efeitos colaterais da Anfotericina B, conjugou-se esse fármaco a nanopartículas magnéticas estabilizadas com bicamada de ácido láurico. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia da Anfotericina B quando conjugada a nanopartículas magnéticas estabilizadas com bicamada de ácido láurico, FM-BlaAmB, no tratamento da Pbmicose experimental. Inicialmente, fez-se necessário avaliar se a Anfotericina B nesse complexo mantinha atividade antifúngica e se era tóxica para células de mamíferos. Assim, o fungo Paracoccidioides brasiliensis, isolado virulento 18 (Pb18) e células mesangiais humanas e macrófagos peritoneais murinos foram tratadas, in vitro, com FM-BlaAmB. Os resultados demonstram que a Anfotericina B no complexo FM-BlaAmB mantém a atividade antifúngica similar a Ambisome® e não é tóxica para células de mamíferos. Diante desses dados promissores decidiu-se realizar ensaios in vivo de modo a verificar se a Anfotericina B no complexo FM-BlaAmB era eficaz na Pbmicose experimental, sem, entretanto, ser tóxica para o hospedeiro. Para tal, camundongos BALB/c foram infectados com o fungo III Pb18 e tratados com o complexo durante as formas aguda e crônica da doença, por 30 e 60 dias. A determinação da carga fúngica no pulmão, a histopatologia dos órgãos pulmão, baço, fígado e rim, além da quantificação de citocinas e do DNA fragmentado em células de medula óssea foram realizadas 24 horas após o último tratamento. Os resultados mostram que a Anfotericina B no complexo é eficaz contra a paracoccidioidomicose experimental na infecção aguda, mas não na infecção crônica e não induz alterações bioquímicas e clínicas nem histopatológicas no fígado, nos rins nem no baço de camundongos BALB/c. Ela também não induz efeitos genotóxicos em células da medula óssea desses animais. Assim sendo, é plausível acreditar que a Anfotericina B quando conjugada a nanopartículas magnéticas estabilizadas com bicamada de ácido láurico, por apresentar similar capacidade antifúngica e não induzir efeitos adversos em doses terapêuticas na infecção aguda, além de permitir a diminuição do número de aplicações no tratamento da Pbmicose murina, possa ser uma alternativa ao uso das formulações de Anfotericina B deoxicolato e Ambisome®. Porém estudos posteriores são necessários para melhorar a eficácia no tratamento da infecção crônica. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioidomycosis, PCM, systemic mycosis is a native of Central and South America, the endemic among rural populations. Among the most commonly used drugs in the treatment of PCM stand out Itraconazole and Amphotericin B. The latter has broad spectrum antifungal and potent fungicidal activity. Nevertheless, induces several side effects in humans, particularly nephrotoxicity. In this context, new strategies such as the binding of amphotericin B to biocompatible structures have been developed to reduce its concentration in blood plasma and increase in target organs of therapy and thereby reduce the side effects induced by this drug. Among these structures stand out nanostructured materials as magnetic nanoparticles. However, for use in biomedicine these nanoparticles should be biodegradable and non-toxic hemocompatíveis the body. For this it is important that they are coated by stabilizing substances. Accordingly, in order to develop a system controlled delivery of drugs and reduce side effects of Amphotericin B, this drug is conjugated to magnetic nanoparticles stabilized bilayer lauric acid. This study aimed to evaluate the efficacy of amphotericin B when coupled to magnetic nanoparticles stabilized bilayer lauric acid, FM-BlaAmB in experimental treatment of PCM. Initially, it was necessary to assess whether this Complex Amphotericin B had antifungal activity and was toxic to mammalian cells. Thus, Paracoccidioides brasiliensis, virulent isolate 18 (Pb18), and human mesangial cells and murine peritoneal macrophages were treated in vitro with FM-BlaAmB. The results show that the amphotericin B in the complex FM-BlaAmB mantéma antifungal activity similar to Ambisome ® and is not toxic to mammalian cells. Given these encouraging data was decided to conduct in vivo tests to verify that the Amphotericin B in the complex FM-BlaAmB was effective in experimental Pbmicose, without, however, be toxic to the host fungus. To this end, BALB / c mice were infected with the fungus Pb18 and treated with the compound during the acute and chronic forms of the disease for 30 and 60 days. The determination of the fungal load in the lung histopathology of organs such as lung, spleen, liver and kidney in addition to the quantification of cytokines and the fragmented DNA into bone marrow cells were performed 24 hours after the last treatment. The results show that the amphotericin B in the complex is effective against paracoccidioidomycosis infection in experimental acute, but not chronic infection and does not induce clinical or biochemical and histopathological liver, kidney or spleen of BALB / c mice. It also does not induce genotoxic effects in bone marrow cells of these animals. Therefore, it is reasonable to believe that the Amphotericin B when coupled to magnetic nanoparticles stabilized bilayer lauric acid, by having similar antifungal capacity and do not induce adverse effects at therapeutic doses in acute infection and also allows reducing the number of applications in the treatment of PCM murine, can be an alternative to the use of the formulations of amphotericin B deoxycholate and Ambisome ®. But further studies are needed to improve effectiveness in the treatment of chronic infection.