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Participação do TLR9 na atividade fungicida de células dendríticas humanas desafiadas com o Paracoccidioides brasiliensis / Participation of TLR9 on fungicidal activity of human dendritic cells challenged with Paracoccidioides brasiliensisVieira, Ivy Rafacho [UNESP] 20 January 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-01-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, endêmica na América Latina, causada pela inalação de propágulos micelianos do fungo termodimórfico do gênero Paracoccidioides spp.(Pb). Dentre os mecanismos de resposta imune contra o fungo, destacam-se os exercidos pelas células fagocitárias como os macrófagos, neutrófilos e células dendríticas (DCs). Além do importante papel efetor, isto é, de destruição do fungo, essas células, por terem capacidade de produzir citocinas tanto pró como anti-inflamatórias, desempenham um importante papel modulador da resposta imune inata, assim como de instrução da resposta imune adaptativa que será gerada posteriormente. Para essa última função, as células dendríticas merecem destaque por constituírem a população de células fagocitárias mais adaptada ao processo de ligar, fagocitar, destruir, processar microrganismos e após migrarem aos órgãos linfóides periféricos, locais onde elas maturam para desenvolver o processo de apresentação de antígeno, desencadear e instruir a resposta imune adaptativa. No entanto, de forma similar às outras células fagocíticas, as DCs são capazes de liberar potentes moléculas citotóxicas que as capacita a destruírem eficientemente os microrganismos. Essa capacidade, embora necessária ao papel modulador das DCs citado acima, representa um mecanismo efetor importante durante a resposta imune inata. A maior ou menor capacidade das DCs destruírem os vários microrganismos pode resultar em diferenças na disseminação dos mesmos durante a migração dessas células da periferia até os órgãos linfóides secundários. Neste contexto, em estudo anterior avaliamos se DCs humanas exercem atividade fungicida contra o P. brasiliensis e se esse processo envolve a ativação do sistema NADPHoxidase com consequente produção de H2O2, o metabolito envolvido na destruição do P. brasiliensis. Detectamos que as DCs não liberam níveis adequados de H2O2 e consequentemente não desenvolvem atividade fungicida contra o P. brasiliensis. Em outro estudo observamos que a interação das DCs com o Pb não resulta em maturação eficiente dessas células. O tipo de receptor de reconhecimento padrão (PRR) ao qual o fungo se liga pode determinar o seu destino no interior das células fagocitárias. Estudos têm mostrado que enquanto alguns deles estão envolvidos na replicação dos microrganismos no interior das células fagocíticas, ao contrário, outros participam da destruição dos mesmos. Nesse sentido, estudos sugerem que a estimulação de TLR9 através do ligante agonista CpG-ODN culmina com ativação do metabolismo oxidativo e consequente destruição de patógenos. Corroborando com esses estudos, detectamos que a incubação de DCs humanas com um agonista do TLR9 induziu um aumento significativo na atividade fungicida dessa células contra o P.brasiliensis . No entanto, esse efeito não esteve associado à um aumento da produção de H2O2. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis, endemic to Latin America, caused by the inhalation of mycelial propagules of the thermodymorphic fungus of the genus Paracoccidioides spp. (Pb). Among the mechanisms of immune response against the fungus, we highlight those exerted by phagocytic cells such as macrophages, neutrophils and dendritic cells (DCs). In addition to their important effector role, that is, fungus destruction, these cells, due to the capacity to produce both pro and anti-inflammatory cytokines, play an important role in modulating the innate immune response, as well as instructing the adaptive immune response. For this latter function, DCs deserve special attention, as they are the phagocytic cells population more adapted to the process of binding, phagocytizing, destroying, processing microorganisms and after migrate to the peripheral lymphoid organs, where they mature and instruct the adaptive immune response. However, similarly to other phagocytic cells, DCs are able to release potent cytotoxic molecules that enable them to efficiently destroy microorganisms. This ability, although necessary to their modulatory role cited above, represents an important effector mechanism during the innate immune response. The higher or lower capacity of DCs to destroy the various microorganisms may result in differences in dissemination of the infection during the migration of these cells from the periphery to the secondary lymphoid organs. In this context, in a previous study we evaluated whether human DCs exert fungicidal activity against P. brasiliensis and whether this process involves the activation of the NADP oxidase system with consequent H2O2 production, the metabolite involved in the P. brasiliensis killing. We have detected that DCs do not release adequate levels of H2O2 and consequently do not exert fungicidal activity against P. brasiliensis. In another study, we observed that the interaction of DCs with Pb does not result in efficient maturation of these cells. The type of pattern recognition receptor (PRR) to which the fungus binds can determine its fate within the phagocytic cells. Studies have shown that while some PRRs are associated to the replication of microorganisms within the phagocytic cells, other, on the contrary, are involved in the mechanisms of pathogens killing. In this sense, studies suggested that TLR9 stimulation by the agonist CpG-ODN culminates with oxidative metabolism activation and pathogens elimination. Accordinly, in our study we detected that human DCs incubation with a TLR9 agonist results in a significant increase of the fungicidal activity of these cells against P.brasiliensis. However, this effect was not associated with an increase in H2O2 production.
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Clamidósporos do Paracoccidioides brasiliensis : isolamento e estudo da infecticidade em modelo experimental murino /Minatel, Igor Otavio. January 2011 (has links)
Resumo: Este trabalho objetivou desenvolver um protocolo para produção, isolamento e purificação de clamidósporos do P. brasiliensis (Pb) e estudar seu potencial infectante em camundongos. A cepa Bt83 foi cultivada em meio líquido por 14 dias à temperatura de 25 ºC e posteriormente incubada por 36 horas a 32°C para a produção de clamidósporos. Os clamidósporos foram liberados por agitação magnética e sonicação. A purificação foi realizada em gradiente de concentração com Percoll a 95%, resultando em suspensão de clamidósporos com viabilidade de 90% e com poucos (8%) fragmentos miceliais. Para avaliar seu potencial infectante, os clamidósporos foram inoculados em camundongos por via intranasal, e os animais eutanasiados após 24h, 1, 2 e 4 semanas de infecção foram estudados através da histologia e quantificação da carga fúngica pela contagem de unidades formadoras de colônia dos pulmões, baço e fígado. Vinte e quatro horas pós-infecção observaram-se no pulmão focos de broncopneumonia contendo grande número de leveduras, algumas em brotamento múltiplo. Nos períodos subseqüentes observaram-se lesões granulomatosas, com presença de fungos, principalmente nos pulmões. A disseminação para baço e fígado foi precoce, iniciando na 1ª semana de infecção. Neste trabalho demonstramos que os clamidósporos do Pb podem ser, fácil e rapidamente, produzidos e isolados. Também mostramos que estes esporos são altamente infectantes e capazes de disseminação precoce. Os resultados indicam que os clamidósporos podem desempenhar um importante papel na infecção e desenvolvimento da paracoccidioidomicose / Abstract: This study aimed at development a protocol for production, isolation and purification of chlamydospores of P. brasiliensis (Pb) and study their potential infectious in mice. Bt83 strain was grown in liquid medium for 14 days at 25 °C and then incubated for 36 hours at 32°C to produce chlamydospores. The chlamydospores were released by magnetic stirring and sonication. The purification was performed in concentration gradient with Percoll to 95%, resulting in a suspension of chlamydospores 90% viable and few (8%) mycelia non-viable fragments. To assess their potential infectious the chlamydospores, mice were inoculated intranasally and euthanized after 24 h, 1, 2 and 4 weeks of infection and their lungs, spleen and liver studied histologically and quantified the fungal burden by colony forming units counting. Twenty-four hours postinfection, multiple foci of bronchopneumonia were seen containing many multibudding yeast cells. In subsequent periods there were granulomatous lesions with the presence of fungi, mainly in the lungs. Dissemination to the spleen and liver was an early event, starting at 1 week of infection. This work provided evidences that the chlamydospores of Pb can be quickly and easily produced and isolated. It was also shown that these spores are highly infectious and have great ability to disseminate soon after infection. These results indicate that chlamydospores might be elected as an important infectious particle in paracoccidioidomycosis / Orientador: Denise Fecchio / Coorientador: Julio Defaveri / Banca: Angela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Terezinha Inez Estivalet Svidzinski / Mestre
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Morfologia e mecânica pulmonares no curso da infecção experimental induzida pelo Paracoccidioides brasiliensis em camundongosRomão, Juliana de Faria Fracon e January 2007 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2009-08-06T14:04:46Z
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Previous issue date: 2007 / No presente trabalho, camundongos BALB/c foram infectados por via endovenosa com leveduras viáveis do P. brasiliensis e foram analisadas a morfologia e a mecânica pulmonares no curso da infecção experimental causada pelo fungo, em diferentes ocasiões (15, 30, 45 e 60 dias após a infecção). Os animais foram sedados, anestesiados e ventilados mecanicamente e foram mensuradas as elastâncias estática (Est), dinâmica (Edyn) e a diferença entre elas ( E), bem como as pressões resistivas ( P1), viscoelásticas/inomogêneas ( P2) e a variação total das pressões ( Ptot) dos pulmões, obtidas pelo método de oclusão ao final da inspiração. Foram coletadas amostras de sangue arterial para análise através da gasometria arterial dos parâmetros: potencial hidrogeniônico (pH), pressão parcial do oxigênio arterial (PaO2), pressão parcial do gás carbônico arterial (PaCO2), percentagem de hemoglobina saturada pelo oxigênio (SaO2), excesso de base (BE) e íon bicarbonato (HCO3). Após as coletas os animais foram sacrificados e os pulmões foram retirados e enviados para a análise histopatológica e para a dosagem de quimiocinas. A análise histopatológica revelou resposta inflamatória progressiva, de padrão granulomatoso, com aumento na quantidade de fungos e formação de tecido fibroso, graduais ao desenvolvimento da infecção, comprometendo o tecido pulmonar. A dosagem de quimiocinas detectou a presença de MIP-1?, RANTES, MIG e KC, com aumento significativo diretamente proporcional ao tempo de infecção. A presença de acidose mista seguida de acidose metabólica, com alterações mais acentuadas na fase aguda, foram observadas no sangue arterial. Na avaliação da mecânica respiratória evidenciou-se aumento das elastâncias estática e dinâmica, da pressão viscoelástica/inomogênea e da variação total das pressões pulmonares. Os resultados indicam que o comprometimento pulmonar é progressivo, com o estabelecimento de fibrose tecidual, determinando um padrão pulmonar provavelmente do tipo restritivo como conseqüência da redução da distensibilidade tecidual. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In the present work, mice BALB/c were infected intravenously with variable
yeast cells of P. brasiliensis and were analyzed the morphology and pulmonary
mechanics in the course of the experimental infection caused by the fungus, at
different occasions (15, 30, 45 and 60 days after infection).Mice were sedated, anesthetized and mechanically ventilated and static (Est) and dynamic (Edyn) elastances, their differences (~E) and resistive (~P1) and viscoelastic/inhomogeneous (~P2) pressures and the total variation of pressures (~Ptot) of the lungs, were obtained by end-inflation occlusion method. Arterial blood samples were collected for arterial blood gas analysis of the parameters: hidrogenionic potential (pH), partial pressures of oxygen (Pa02), and carbon dioxide (PaC02), oxygen saturation (Sa02), base excess (BE) and bicarbonate (HC03). After the collecting data the animais were sacrificed and the lungs were removed and sent for histopathology and for the analysis of the concentration of chemokines.Histopathology revealed progressive inflammatory response, leading to granuloma formation, with increase in the fungus counts and formation of fibrosis,
gradual to the development of infection, compromising the pulmonary tissue. The
dosage of chemokines detected the presence of: MIP-1 a, RANTES, MIG and KC, demonstrating significant increase Directly proportional to the time of infection. The
presence of mist acidosis followed by metabolic acidosis, indicating alterations more pronounced in the acute phase, were observed in the arterial blood. In the avaliation of pulmonary mechanics showed increases in static and dynamic elastances and increases in viscoelastic/inhomogeneous pressure and in the total variation of
pressures of the lungs. Results indicate that the lung injury is progressive, with the establishment of tissue fibrosis, robably determining a restrictive functional pattern as a result of lower distensibility of lung tissue.
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Proteinas de superficie de Paracoccidioides brasiliensisCastro, Nadya da Silva 05 1900 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-09-15T19:37:58Z
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2008_NadiaSilvaCastro.pdf: 1694398 bytes, checksum: 0128cdccb93616f46069ecd716dbb71a (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-09-21T12:39:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2008-05 / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, agente etiológico da paracoccidioidomicose. Em humanos, a infecção inicia-se pela inalação de propágulos fúngicos que alcançam os pulmões. A parede dos microrganismos constitui um importante reservatório de macromoléculas imunoreativas e um potencial alvo para a procura de candidatos a vacinas. Em muitos patógenos, as proteínas com âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI) mostraram-se imunogênicas e importantes fatores de virulência. Assim, com o objetivo de estudar as proteínas de superfície foram efetuadas análises no banco de dados do transcriptoma de P. brasiliensis, onde pesquisou-se por proteínas GPI-ancoradas localizadas na membrana plasmática ou parede celular, bem como por proteínas que estivessem envolvidas na síntese, ligação e clivagem da âncora de GPI. Estas proteínas foram identificadas em várias categorias funcionais, tais como: (i) enzimas: glicanosiltransferases (1-3), (ii) prováveis antígenos de superfície, (iii) proteínas com papel estrutural e envolvidas na biossíntese da parede celular. Foram identificados transcritos codificantes para proteínas da via de biossíntese e hidrolise da âncora de GPI. Visando o conhecimento de mecanismos moleculares que participem da montagem e morfogênese da parede celular de P. brasiliensis, foi realizado o estudo de ?-1,3-glicanosiltransferas e 3 (PbGel3). PbGel3 mostrou-se em cópia única no genoma deste fungo com maiores níveis do transcrito e de proteína na fase miceliana. A proteína foi imunolocalizada na superfície de células leveduriformes e de micélio de P. brasiliensis. O potencial papel de PbGel3p na biossíntese e remodelamento foi evidenciado pela habilidade em recuperar o fenótipo do mutante gas1? de Saccharomyces cerevisiae. O homólogo da proteína DFG5 (deficiente para o crescimento filamentoso 5) de P. brasiliensis, uma proteína glicosilada provavelmente ligada à parede celular pela rede de ?-glicana foi estudado. Estudos de interação demonstraram que a proteína PbDfg5p recombinante se liga aos componentes da matriz extracelular, sugerindo um papel importante nos passos iniciais de colonização e aderência de P. brasiliensis aos tecidos do hospedeiro. Em função de seu papel biológico, bioquímica única, organização estrutural e a ausência da maioria de seus constituintes em células de mamíferos, a parede celular é um alvo atraente para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos e essencial para o entendimento da patogênese fúngica. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a temperature dependent dimorphic fungus, the etiological agent of paracoccidioidomycosis. In human, infection starts by inhalation of fungal propagules reaching the pulmonary epithelium, where the morphogenetic conversion is correlated with changes in the cell wall composition, organization and structure. The cell wall constitute an important reservoir of immunoreactive molecules and potential target for the search of vaccine candidates. In many pathogens, the proteins with glicosilfosfatidilinositol (GPI)-anchors are immunogenic and important virulence factors. Thus, P. brasiliensis transcriptome data were analyzed for potential GPI-anchored proteins localized in plasma membrane or cell wall, as well as for proteins involved in synthesis, attachment and cleavage of the GPI anchor. The proteins were identified in several functional categories: (i) enzymes: glucanosyltransferases(1- 3), (ii) probable surface antigens, (iii) proteins involved in cell wall biosynthesis and structural role. It was identificated transcript encoding to proteins involved in GPI anchor biosynthesis and hydrolysis. In an effort to elucidate the molecular mechanisms involved in the fungus cell wall-assembling and morphogenesis it was performed the study of the B-1,3-glucanosyltransferase 3 (PbGel3). PbGel3 showed one copy in genome of this fungus with the highest level of transcript and protein in the mycelium phase. The protein was immunolocalized at the surface in both mycelium and yeast phase. The potential role of PbGel3p in cell wall biosynthesis and remodeling was evidenced by its ability to rescue the phenotype of the Saccharomyces cerevisiae gas1 mutant. The DFG5 (defective in filamentous growth) homologue of P. brasiliensis, a probably glicosylated and B-glucan linked cell-wall protein was also studied. Studies demonstrated that the recombinant PbDfg5p binds to extracellular matrix components, indicating that it can be important for initial steps leading of P. brasiliensis attachment and colonization of host tissues. Because of its essential biological role, unique biochemistry, structural organization and the absence of the most of their constituents in mammalians cells, the cell wall is an attractive target for the development of new antifungal agents and essential for understanding the fungal pathogenesis.
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Peptideos derivados da gp43 de Paracoccidioides brasiliensis inibem a fagocitose / Peptides derived from the Paracoccidioides brasiliens gp43 sequence inhibit macrophage functionsKonno, Adriana Yumi de Camargo [UNIFESP] January 2008 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica
causada pelo fungo dimórfico térmico Paracoccidioides brasiliensis. O principal
antígeno desse fungo é uma glicoproteína de 43-KDa. Gp43 possui diferentes
funções: participa do mecanismo de evasão durante a instalação da infecção
primária e estimula formação de granuloma in vitro, apresentando epítopos
reconhecidos por células T que induzem resposta protetora contra o P.
brasiliensis. Aqui, investigamos quais epítopos da gp43 poderiam diminuir a
função fagocítica de macrófagos e a reação inflamatória correspondente.
Diferentes peptídeos da gp43 foram adicionados a culturas de macrófagos
derivados de medula óssea. Posteriormente, foram desafiados com zymosan e os
índices fagocíticos foram determinados. A expressão dos peptídeos na superfície
da molécula foi determinada por análises gráficas usando o módulo Protean;
DNAstar Inc. Dois peptídeos que diminuíram índices fagocíticos e estavam
expressos na superfície da gp43, P4 e P23, foram selecionados para ensaios
posteriores. Mostramos que ambos, P4 e P23 inibiram a liberação de NO por
macrófagos estimulados com zymosan enquanto aumentaram liberação de H2O2.
A liberação de TNF-α no sobrenadante de cultura de testes fagocíticos in vitro
também foi inibida na presença dos peptídeos. Ensaios in vivo com
Mycobacterium bovis - bacillus Calmette-Guérin (BCG) demonstraram que estes
peptídeos também apresentaram propriedades antiinflamatórias não-específicas a
PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease
caused by Paracoccidioides brasiliensis, a thermal dimorphic fungus. Its major
antigen is a 43-kDa glycoprotein. Gp43 embodies different functions: it participates
in the evasion mechanisms during the installation of primary infection and
stimulates granuloma-like formation in vitro, presenting T-cell epitopes that induce
protective response against the fungus. Here, we investigated which epitopes from
gp43 could inhibit both, macrophage functions and inflammatory reaction. Different
gp43 peptides, spanning the entire sequence of the molecule, were added to
cultures of bone marrow-derived macrophages. After challenge with zymosan,
phagocytic indexes were measured. Peptides expressed on the molecule surface
were determined by graphic analysis using the Protean module; DNAstar Inc. Two
peptides which decreased phagocytic index and were expressed in surface of
molecule, P4 e P23, were selected for further studies. It was shown that both, P4 e
P23 inhibited the release of NO by zymosan stimulated macrophages while
enhancing release of H2O2. The release of TNF-α in culture supernatants from in
vitro phagocytic tests was also inhibited in their presence. In vivo assays with
Mycobacterium bovis - bacillus Calmette-Guérin (BCG) demonstrated that these
peptides also presented non-specific anti-inflammatory property. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Clonagem e caracterização do gene que codifica a glicoproteína de 70 kDa (gp70) de Paracoccidioides brasiliensis / Cloning and characterization of the gene that encodes the glycoprotein of 70 kDa from Paracoccidioides brasiliensisMaricato, Juliana Terzi [UNIFESP] 28 October 2010 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2010-10-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Paracoccidiodes brasiliensis é o fungo termodimórifco patogênico causador da Paracoccidioidomicose (PCM). Esse agente infeccioso produz antígenos importantes como a gp43, já bem caracterizada, e a glicoproteína de 70 kDa (gp70) que é reconhecida por 96% dos soros de pacientes com PCM. No presente estudo reportamos que o gene codificador do antígeno gp70 possui uma fase de leitura aberta de 2.154 pares de bases. A estratégia utilizada na clonagem do gene PbGP70 incluiu análises in silico de sequências contidas no banco de dados de sequências expressas de P. brasiliensis (P. brasiliensis’ Expressed Sequence Tags Databank) e sequenciamento por meio da técnica de primer-walking. A análise da sequência da proteína deduzida mostrou a presença de dois motivos para Nglicosilação, epítopos para células B e T com putativas funções antigênicas e protetoras, respectivamente. Análises comparativas in silico classificaram a proteína pertencente à família das flavoproteínas monoxigenases. Muitas proteínas dessa família possuem funções antioxidativas em diversos modelos biológicos e são compostos bioativos importantes. Anticorpos policlonais produzidos contra gp70 recombinante foram capazes de reconhecer a proteína nativa no extrato celular total de P. brasiliensis. A proteína recombinante parcial foi reconhecida por 5 de 7 soros de pacientes com PCM e pelo anticorpo monoclonal previamente produzido contra gp70 nativa (MAb C5F11). Experimentos de microscopia confocal com o anticorpo policlonal anti-gp70 recombinante e o MAb C5F11 mostraram co-localização da marcação citoplasmática, como esperado para gp70. Análises da expressão gênica por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram baixos níveis de expressão do gene PbGP70 em condições normais, porém sob condições de estresse oxidativo, induzido pela adição de H2O2 e durante o crescimento do fungo, a expressão foi significativamente aumentada. Por fim, após incubação de células leveduriformes de P. brasiliensis com macrófagos derivados de medula óssea, foi observado aumento da expressão gênica nas leveduras aderidas ou fagocitadas após 24 horas e, nas leveduras não aderidas, a expressão foi aumentada após 48 horas. Esses achados sugerem que a gp70 possa desempenhar um papel duplo na biologia e infecção por P. brasiliensis. Por um lado, a molécula estimula resposta imune celular e humoral no hospedeiro e por outro protege o fungo do estresse oxidativo gerado por células fagocíticas. / Paracoccidioides brasiliensis is a thermodimorphic pathogenic fungus that
causes Paracoccidioidomycosis (PCM). This infectious agent produces important
antigens as gp43, already fully characterized, and a 70 kDa glycoprotein (gp70)
recognized by 96% PCM patients’ sera. In the present study, we report that the gene
encoding gp70 antigen has an open reading frame in a 2,154 base pair fragment.
The gp70 gene in P. brasiliensis (PbGP70) has been cloned using in silico screening
of the P. brasiliensis' Expressed Sequence Tag databank and primer-walking
sequencing approach. In the deduced protein sequence, we found two motifs for Nglycosilation,
B and T-cell epitopes, with putative antigenic and protector functions,
respectively. Comparative in silico analysis showed that this protein belongs to
flavoprotein monooxygenasis family. Many proteins of this family show anti-oxidative
functions in several biologic models thus, being important bioactive compounds. Antirecombinant
gp70 polyclonal antibodies recognized the native protein in the total cell
extract of P. brasiliensis. Moreover, the partial recombinant protein was recognized
by 5 out of 7 PCM pacients’ sera and by the gp70 C5F11 monoclonal antibody
previously produced against native gp70. Confocal microscopy with polyclonal
antibodies anti-gp70 recombinant and C5F11 MAb anti-native gp70, showed colocalization
in the cell cytoplasm, as expected for gp70. Gene expression analysis
using Real-Time PCR showed low levels of gp70 gene expression in normal
conditions, but under oxidative stress induced by H2O2 and during the fungal growth,
expression is significantly increased. Finally, when we incubated P. brasiliensis with
bone-marrow derived macrophages, the phagocyted or attached cells showed
increased gp70 gene expression at 24 hours and, in the non-phagocyted cells, the
expression was increased after 48 hours. These findings suggest that gp70 might
play a dual role in P. brasiliensis, both eliciting immune cellular and humoral
responses in the host and protecting the fungus from oxidative stress generated by
phagocytic cells. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Espécies crípticas em Paracoccidioides brasiliensis: diferenciação antigênica e de resposta a fatores estressantesMachado, Gabriel Capella [UNESP] 29 April 2011 (has links) (PDF)
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machado_gc_me_botib.pdf: 359425 bytes, checksum: 96a3b6e269405927664fd4f77072b888 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O fungo termodimórfico Paraccocidiodes brasiliensis, em sua fase leveduriforme, é o agente etiológico de uma das mais importantes micoses sistêmicas da América Latina, a paracoccidioidomicose. A doença pode ser fatal em sua forma aguda, além de gerar, na forma crônica, lesões principalmente de ordem dermatológica e pulmonar. O fato de P. brasiliensis ser considerado uma única entidade biológica vem sendo questionado pelos recentes achados de filogenia molecular. Atualmente acredita-se que P. brasiliensis seja um complexo de quatro espécies crípticas, S1, PS2, PS3 e P. lutzii, sendo esta última a mais distante filogeneticamente. É possível que o fato esteja interferindo em aspectos relacionados à doença, como, por exemplo, a positividade do diagnóstico sorológico. Além disso, tal especiação pode significar diferenças na biologia do fungo, em aspectos como sua morfologia, fisiologia e ocupação de nichos ecológicos.A primeira frente deste trabalho visou produzir e caracterizar antígenos a partir de cepas pertencentes às diferentes espécies de P. brasiliensis, e avaliar o desempenho das mesmas em testes de imunodifusão (ID) contra pacientes das diferentes regiões do Brasil. Melhores resultados foram obtidos com o antígeno produzido por filtrado de cultura de um isolado pertencente ao grupo PS3, o qual apresentou altas taxas do antígeno imunodominante, a glicoproteína gp43, detectável por SDS-PAGE, e apresentou boa positividade nas IDs quando cruzados com soros de pacientes da região de Botucatu, reagindo inclusive com alguns soros falso-negativos para o antígeno considerado padrão, produzido pela cepa B-339. Entretanto, este antígeno, bem como outros aqui avaliados, não foi capaz de apresentar desempenho satisfatório frente a soros de pacientes da Região Centro-Oeste, justamente os que apresentam maiores taxas de negatividade, provavelmente por serem... / The thermo-dimorphic fungus Paraccocidiodes brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis, one of the most important systemic mycosis in Latin America. The disease can be fatal in its acute form, besides causing important lesions especially in lungs and skin when occurs in its chronic form. The fact that P. brasiliensis is considered a single biological entity has been challenged by the recent findings in molecular phylogenetics. Currently, it has been observed that P. brasiliensis is a complex of four cryptic species, S1, PS2, PS3 and Pb01-like, which is the most distantly related, being proposed as new formal species, P. lutzii. It is possible that these facts are interfering with the host/pathogen interactions, as well as with the results of serological diagnosis. Furthermore, this speciation could reflect differences in the biology of the fungus, especially on their morphology, physiology and occupation of ecological niches.The first approach of this work was to produce and characterize antigens from strains belonging to different species of P. brasiliensis, and evaluate their performance in immunodiffusion tests (ID) against sera of pacients from different regions of Brazil. The better results were obtained with the antigen produced by culture filtrate of an isolate belonging to the PS3, AgEpm83, which showed high positivity rates in IDs, against sera of patients from Botucatu. This antigen, in addition, presented high levels of the glycoprotein gp43, the immunodominant component, detectable by SDS-PAGE. However, this antigen, as well as other here evaluated, was unable to provide satisfactory performance against the sera of patients from the Brazilian Midwest Region, probably because they are infected with P. lutzii isolates. The in silico analysis of exon2 of the gene that encodes gp43 indicated that this gene is under purifying selection both... (Complete abstract click electronic access below)
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Identificação e purificação de prostaglandinas e leucotrienos produzidos por Paracoccidioides brasiliensisBiondo, Guilherme Augusto [UNESP] 19 April 2013 (has links) (PDF)
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000733096.pdf: 1684706 bytes, checksum: f3187a023c62c55ced4cacb9d3f6028c (MD5) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis. O estabelecimento da paracoccidioidomicose-infecção ou paracoccidioidomicose-doença depende das interações parasita-hospedeiro que podem resultar em uma resposta imune mais ou menos eficaz por parte deste último. Embora vários dos mecanismos decorrentes dessa interação já estejam descritos, estudos sobre a participação de outros fatores potenciais podem ampliar sobremaneira o nosso entendimento sobre a imunopatogênese da PCM. Nesse sentido, os eicosanóides como as prostaglandinas (PGs) e leucotrienos (LTs) devem ser avaliados. Em trabalhos anteriores detectamos que o fungo induz a produção de PGs e LTs por monócitos humanos que, de uma forma autócrina, suprimem ou aumentam respectivamente, as atividades antifúngicas dessas células. No entanto, os estudos têm mostrado que além de induzir a produção de eicosanóides, os próprios fungos podem produzir esses mediadores, revelando um mecanismo de virulência que tem potencialmente grandes implicações para o entendimento dos mecanismos das infecções fúngicas. Baseados nesses estudos detectamos que o P. brasiliensis produz tanto PGs como LTs, usando fontes endógenas e exógenas de ácido araquidônico, e que ambos são importantes para a manutenção da viabilidade do fungo. Adicionalmente, os resultados sugeriram que o fungo utiliza as vias metabólicas da ciclooxigenase (COX) para a produção de PGs e da lipoxigenase (5-LO) para LTs. No presente trabalho, aprofundamos esses estudos objetivando avaliar se o fungo produz outras classes de eicosanóides, além da PGE2 e LTB4, se as PGs e LTs liberados pelo P. brasiliensis podem ser considerados como PGE2 e LTB4 autênticos, isto é semelhantes aos detectados para os mamíferos, assim como estabelecer de uma forma definitiva se a COX e a 5-LO são as vias metabólicas utilizadas... / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. The establishment of paracoccidioidomycosis-infection or the evolution to paracoccidioidomycosis-disease in its more or less severe forms, primarily depends on complex host-parasite interaction, in which immune response mechanisms play an essential role. While many of these mechanisms have been elucidated, studies on the participation of other potential factors can greatly expand our understanding of PCM immunopathogenesis. Accordingly, eicosanoids such as prostaglandins (PGs) and leukotrienes (LTs) should be evaluated. In previous studies we found that the fungus induces the production of prostaglandins and leukotrienes by human monocytes that in an autocrine way suppress and increase, respectively, the antifungal activities of these cells. However, studies have shown that in addition to inducing the production of eicosanoids, fungi themselves can produce these mediators, showing a mechanism for virulence that has potentially important implications for understanding the mechanisms of fungal pathogenicity. Based on these studies, we found that P. brasiliensis produces both PGs and LTs, using exogenous and endogenous sources of arachidonic acid and that both are important for fungus viability. Additionally, the results suggested that the fungus uses cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (5-LO) metabolic pathways for PGs and LTs production, respectively. Here, we profound these studies evaluating whether PGs and LTs released by P. brasiliensis can be considered as authentic LTB4 and PGE2, i.e. similar to those detected for mammals. We also asked whether the fungus, in addition to PGE2 and LTB4, produces other classes of eicosanoids. Finally, we intended to definitively determine whether COX and 5-LO are the metabolic pathways used for this production. We found that fungus PGE2 and LTB4 ...
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Detecção molecular de Paracoccidioides brasiliensis em amostras de tecido e sangue periférico de pacientes portadores de Pacoccidioidomicose: correlação com perfis histopatológico, sorológicos e produção de TNF-αSiqueira, Keila Zaniboni [UNESP] 25 July 2008 (has links) (PDF)
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siqueira_kz_dr_botfm.pdf: 354096 bytes, checksum: d00ae8c0bad924914a08763aaa47a5e3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, causada pelo Paracoccidioides brasiliensis, um fungo imperfeito e termodimórfico. Embora o contágio ocorra principalmente pela via aérea, as vias transcutânea e mucosa não devem ser desconsideradas, devido à possibilidade de invasão através de pele ou mucosas. No presente estudo, a detecção molecular de P. brasiliensis por Nested- PCR foi realizada em fragmentos de biópsias de lesões cutâneo-mucosas de pacientes com PCM ativa e comparada a outras técnicas utilizadas como rotina no diagnóstico dessa micose. Para tanto, amostras de 29 pacientes atendidos no Serviço de Dermatologia, da Faculdade de Medicina de Botucatu/UNESP, foram coletadas no período de abril/2004 a abril/2007. Na análise histopatológica observou-se granulomas compactos bem organizados, algumas vezes ao lado de áreas contendo granulomas frouxos mal definidos. Tal técnica foi positiva em todas as amostras avaliadas, com presença de grande quantidade de células fúngicas em 65,5% dos casos, algumas com multi-brotamentos. Para as análises sorológicas, na técnica de ELISA, 74,1% dos casos apresentaram títulos de 1/12800, 11,1% apresentaram 1/3200, 3,7% apresentaram 1/800 e 11,1% foram negativos. Já para imunodifusão (ID), 3,5% apresentaram título de 1/512, 55,1% apresentaram títulos de 1/32, 3,5% apresentaram 1/16, 3,5% apresentaram 1/8, 10,3% apresentaram 1/4, 6,9% apresentaram 1/2 e 17,2% foram negativos. Foi observado um aumento nos níveis de TNF- , nos pacientes na forma grave, produzido por monócitos não estimulados, em comparação à forma leve e moderada, e ao controle. A produção desta citocina por monócitos estimulados com LPS também se mostrou gradativamente maior quanto maior a gravidade dos pacientes. Além disso, na análise do seguimento dos pacientes nota-se uma diminuição significativa... / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica, causada pelo Paracoccidioides brasiliensis, fungo imperfeito e termodimórfico (Franco et al., 1987, 1989). Com distribuição endêmica no Brasil e outros países da América Latina (Restrepo et al., 1973; Restrepo, 1985; Wanke & Londero, 1994), esse agente etiológico apresenta-se sob a forma de levedura em tecidos do hospedeiro ou quando cultivado à temperatura de 35-37°C, e sob a forma de micélio à temperatura ambiente (4-28°C) (Restrepo, 1985; San- Blas & San-Blas, 1985), As lesões primárias da PCM ocorrem com mais freqüência nos pulmões, dando origem a infecção subclínica, que pode evoluir para cura ou tornar-se latente na presença de resposta imune eficiente, ou ainda, disseminar para outros órgãos, por via hematogênica ou linfática, causando doença grave (Giraldo et al., 1976; Londero & Severo, 1981; Restrepo, 1988; Montenegro & Franco, 1994; Bethlem et al., 1999). A PCM tem como apresentações clínicas as formas aguda-subaguda e crônica (Franco et al., 1987). A primeira, também chamada juvenil, ocorre predominantemente em crianças, adolescentes e adultos jovens. Geralmente se desenvolve a partir de lesão primária não detectada, que se dissemina rapidamente pelas vias linfática e hematogênica para órgãos linfóides e hematopoiéticos, constituindo quadro infeccioso grave (Mendes et al., 1988). A forma crônica da doença é mais freqüente e se desenvolve a partir do complexo primário ou do foco quiescente (reinfecção endógena). Esta geralmente afeta adultos do sexo masculino, com idade superior a 30 anos. Apresenta quadro clínico de duração prolongada, normalmente acima de seis meses, onde se pode dizer que o comprometimento pulmonar é constantemente observado e o tegumentar (cutâneo e/ou mucoso) é freqüente (Marques et al., 1994)... (Complete abstract click electronic access below)
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Avaliação da associação sulfametoxazol-trimetropim no tratamento da paracoccidioidomicose experimental murinaCarvalho, Fabiana Moura de [UNESP] 28 November 2006 (has links) (PDF)
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carvalho_fm_me_botfm.pdf: 667343 bytes, checksum: cf2805112d3bb1292cba3553dd03ef7c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Gap / O tratamento da PCM, micose sistêmica causada Paracoccidioides brasiliensis, continua sendo objeto de pesquisa clínica e experimental. Este trabalho avaliou a eficácia de diferentes esquemas terapêuticos com cotrimoxazol (CMX), na dose diária de 200 mg/kg de peso corporal, em dose diária única, no tratamento da PCM murina. Os resultados revelaram que o tratamento com CMX por tempo prolongado foi eficaz quando iniciado precoce ou tardiamente. O tratamento com curta duração foi ineficaz, pois não determinou diminuição da carga fúngica, durante as 20 semanas de seguimento. O efeito do CMX foi o mesmo em pulmões e baço, nos diferentes esquemas terapêuticos utilizados, eficazes ou não. A mortalidade cumulativa entre os grupos 1, 2 e 4 não diferiram entre si, os grupos 3 e 5 apresentaram a melhor taxa de sobrevida. Os níveis séricos de anticorpos específicos foram detectados a partir da segunda semana, apresentando maiores índices nos animais do G2, sendo que nesses os níveis aumentaram até a oitava semana e permanecendo estáveis por todo o experimento. No G3 houve uma flutuação durante todo o experimento apresentando níveis altos na 20a semana. Os grupos 4 e 5 permaneceram estáveis durante todo o experimento. Os efeitos benéficos do tratamento foram observados com a administração de CMX em dose única diária, cujos níveis séricos se mantiveram adequados por menos de 12 horas. Esses resultados, bastante satisfatórios, demonstram que o modelo experimental murino é bom método de avaliação da eficácia do CMX no tratamento da PCM e sugerem a avaliação de outros esquemas terapêuticos, como a administração a cada 12 horas. / Paracoccidioidomicosis (PCM) treatment, a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis, has been a clinical and experimental research issue. This work evaluated the efficacy of different therapeutic protocols with cotrimoxazole (CMX) on a daily dosage of 200mg/kg body weight, in a single daily dosage on murine PCM treatment. The results showed that CMX treatment for a prolonged period was efficient when started early or late. The short duration treatment was inefficient once it did not determine fungus load decrease during 20 weeks of following. CMX effect was the same in lungs and spleen under different therapeutic protocols used, whether efficient or not. Cumulative death tends to be different among studied groups. Death frequency was smaller in prolonged treated groups with an early or late protocol starting. Specific antibodies blood levels were detected from the second week and did not differ among experimental groups. Beneficial effects of treatment were observed with CMX administration on a daily single dosage and blood levels remained satisfactory for less than 12 hours. These results, quite satisfactory, show that murine experimental protocol is a good evaluation method of MCX effectiveness on PCM treatment and it suggests the evaluation of other therapeutic protocols, as an administration at every 12 hours.
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