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Caracterização da proteina LaRbp38: mapeamento do domínio de interação com ácidos nucléicos e identificação de possíveis proteínas parceiras

Perez, Arina Marina [UNESP] 19 February 2009 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-19Bitstream added on 2014-06-13T20:33:39Z : No. of bitstreams: 1 perez_am_me_botib.pdf: 10680809 bytes, checksum: b87b752e56e77d065385e0c67b7da6a0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho teve por objetivo mapear os domínios de interação da proteína LaRbp38 (RNA binding protein 38 KD) de Leishmania amazonensis com ácidos nucléicos e a identificação de proteínas parceiras que formassem possíveis complexos com ela nos telômeros do parasita. LaRbp38 é uma proteína exclusiva de protozoários tripanosomatídeos, entre os quais estão os agentes etiológicos da leishmaniose, uma doença endêmica presente em diversas regiões do Brasil. Novos casos da doença vêm aumentando progressivamente, principalmente entre indivíduos imunocomprometidos e por isso a Organização Mundial da Saúde tem incentivado a busca de novos alvos para desenvolver drogas que eliminem eficazmente o parasita. LaRbp38 é uma proteína codificada por um gene nuclear, que parece exercer diferentes funções nas maquinarias de replicação nuclear e mitocondrial. Foi primeiramente descrita como proteína estabilizadora de RNA mitocondrial e parece estar envolvida com a replicação de DNA mitocondrial. Em Leishmania, LaRbp38 também interage in vivo com DNA mitocondrial, com seqüências ricas em GT e com DNA telomérico simples e dupla fita. A análise estrutural da proteína não indica a presença de nenhum domínio canônico de interação a ácidos nucléicos. Para dar inicio aos experimentos, a primeira estratégia foi desenhar mutantes delecionais da proteína de L. amazonensis (LaRbp38) de forma que cada um representa uma sobreposição do outro. Cada mutante, nomeados mut1, mut2, mut3, mut4 e mut5, foram subclonados em vetor de expressão bacteriano para produção de polipeptídios recombinantes. Em seguida os polipeptídios foram purificados e testados em western blotting, que mostra tanto LaRbp38 quantos os 5 mutantes sendo reconhecidas pelo soro antLLaRbp38. Ensaios in vitro de interação proteína-DNA (EMSA), usando DNA telomérico simples fita Te11, dupla fita... / Recent results demonstrated that Rbp38 is a protein exclusively expressed in trypanosomatid parasites, which includes the genus Leishmania. Rbp38 is a multifunctional protein exerting functions in the kinetoplast, such as the stabilization of mitochondrial RNAs and in the nucleus, as a protein that binds in vivo kDNA, the double-stranded (LaTel) and the G-rich telomeric DNAs (Tel1). The trypanosomatid Rbp38 does not share sequénce or functional/structural similarities with any other protein deposited in the public data bank. The present work has the aim of mapping the boundaries of the DNA-binding domain of LaRBP38, since using the available in silico tools, we were not able to define any known nucleic acid binding domain in this protein. Therefore, we constructed truncated overlapping mutants of LaRbp38 in order to map the boundaries of its DNA binding domain. These mutant proteins were expressed in a bacterial system and were produced in high amounts as shown by SDS-PAGE and Western blotting analyses. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were done in order to test the ability of each mutant to bind in vitro the G-rich telomeric DNA, double-stranded telomeric DNA and kDNA. EMSA and competition assays confirmed that LaRbp38 has at least one DNA binding domain (DBD), centrally located, between amino acid residues 141 and 235. This DBD, interacts with distinct affinities with ali DNAs tested. Our results suggested that this binding domain has at least two extensions one towards the N-terminus of mut2 (aa 95 and 141), which showed binding affinity to LaTel and kDNA and other towards the C-terminus of mut3 (aa 235 to283) that strongly interacted with kDNA. However, we can not discard that others parts of the protein may also contribute to these interactions. Other controversial point about LaRbp38 is whether this protein has nuclear and mitochrondrial subcelular localization... (Completo abstract click electronic access below)
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Dinâmica populacional de minicírculos de cinetoplastos em Leishmania infantum chagasi

Gushi, Letícia Tsieme [UNESP] 25 July 2012 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-25Bitstream added on 2014-06-13T19:02:42Z : No. of bitstreams: 1 gushi_lt_dr_botib.pdf: 860668 bytes, checksum: f4640ec40c34a33b45f1c604d7f189d2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Leishmaniose Visceral Americana (LVA) é uma doença tropical negligenciada em expansão no Brasil, ocorrendo em áreas onde antes não havia registro. Seu agente etiológico e a Leishmania chagasi um protozoário pertencente à classe Kinetoplastida caracterizada por uma organela denominada cinetoplasto a qual possui um DNA organizado em uma rede contendo maxicírculos, responsáveis pelas funções respiratórias e minicírculos, envolvidos na pordução de RNAs-guia, os quais possuem um papel importante na edição dos RNAs dos maxicírculos. Os minicírculos são divididos em uma região convervada de aproximadamente 120 p.b. e uma região variável de aproximadamente 600 p.b. O foco desse estudo está na análise das seqüências da região variável a fim de entender sua distribuição nos diferentes estágios de vida da L. chagasi. As amostras foram coletadas de cães e pacientes sintomáticos por aspiração dos linfonodos e, em alguns casos, foram obtidas culturas primárias. A extração do DNA foi realizada com o kit comercial Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) seguindo as instruções do protocolo. O kDNA foi amplificado por PCR, utilizando o par de oligonucleotídeos LIN R4 - forward (5’-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) e LIN 19 - reverse (5’-GAA CGC CCC TAC CCG-3’), produzindo um fragmento de aproximadamente 720 p.b. Os produtos da PCR foram clonados no vetor pTZ57R/T de acordo com o protocolo do InsTAclone PCR cloning kit. As seqüências (aproximadamente 182) foram individualmente comparadas com as depositadas no GenBank, alinhadas com o software Clustal X2 e tiveram uma árvore filogenética construída utilizando o software MEGA 4.0 adotando o algoritmo UPGMA e escolhendo um bootstrap com 1000 replicatas. A distribuição entre os diferentes hospedeiros foi homogênea. A princípio, um lato polimorfismo é observado, mas... / American Visceral Leishmaniasis (AVL) is a neglected tropical disease in expansion in Brazil currently occurring in areas where there has never been reports. Its etiologic agent is Leishmania chagasi, a protozoan belonging to the order Kinetoplastida characterized by an organelle named kinetoplast wich has a DNA organized in a network containing maxicircles, responsible for respiratory functions and minicircles, involved in the production of guide RNAs, which play a role in the RNA editing of maxicircles. The minicircles are divided into an approximately 120 b.p. conserved region and an approximately 600 b.p. variable region. The focus of this study is on the sequence analysis of the minicircles variable region in order to understand its distribution on different life stages of L. chagasi. Samples were collected from dogs and symptomatic patients by lymphonod aspiration and, in some cases, primary cultures were obtained. DNA extraction was carried out with the commercial kit Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) following its protocol. kDNA was amplified by PCR, using a pair of oligonucleotides LIN R4 - forward (5’-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) and LIN 19 - reverse (5’-GAA CGC CCC TAC CCG-3’), producing a fragment of 720 b.p. PCR products were cloned in pTZ57R/T vector according to the InsTAclone PCR cloning kit protocol. Sequences (182) were individually compared with the ones deposited at the GENBANK, aligned with Clustal X2 software and had a phylogenetic tree constructed utilizing MEGA 4.0 software adopting UPGMA algorithm and choosing bootstrap with 1000 replicates. Sequences distribution among different hosts was homogeneous. At first, high polymorphism is observed but, when analyzed in more detail, i.e. by branch, sequences proved to be conserved and minimal SNP (Single Nucleotide Polymorphism) was found... (Complete abstract click electronic access below)
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Perfil de suscetibilidade in vitro e caracterização molecular de leveduras do gênero Candida isoladas de pacientes com vulvovaginite

Fornari, Gheniffer January 2013 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Flávio Queiroz Telles Filho / Co-orientadores : Profª Drª Vania Aparecida Vicente e Profº. Drº. Newton Sérgio de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 21/03/2013 / Inclui bibliografias / Área de concentração: Microbiologia / Resumo: A candidíase vulvovaginal afeta mulheres em idade reprodutiva representando aproximadamente 15 a 25% dos casos de vaginites. As diferentes espécies de Candida relacionadas à infecção podem ser encontradas na mucosa vaginal como colonizadoras e, em condições apropriadas, aceleram o processo de multiplicação e expressam fatores de virulência. O objetivo deste trabalho foi isolar leveduras de pacientes com ausência de sintomas clínicos (grupo colonizado) e de portadores da infecção. O perfil de sensibilidade in vitro destes isolados foi estabelecido e marcadores moleculares utilizados para identificar a distribuição das espécies. Um total de 40 isolados foram obtidos e identificados através do Cromoagar, sistema API20aux e pelo seqüenciamento das regiões ITS e D1/D2 do gene DNAr. Diferentes isolados de C. albicans foram genotipados pelo sistema ABC. A análise multilocus confirmou isolados das espécies Candida albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. kefyr e Saccharomyces cerevisiae. A espécie prevalente foi a C. albicans. No grupo colonizado foi encontrado C. albicans (60%), C. glabrata (25%), C. guilliermondii (5%), C. kefyr (5%) e Saccharomyces cerevisiae (5%). No grupo com infecção não complicada todos os isolados eram C. albicans (100%) e no grupo de infecção complicada a maioria eram C. albicans (90,9%), seguido de C. dubliniensiis (9,1%). Os diferentes isolados de C. albicans foram divididos em dois grupos genotípicos (A e B). Em relação ao perfil de sensibilidade in vitro dos isolados das diferentes espécies de Candida procedentes dos diferentes grupos estudados, pode se afirmar que os isolados obtidos a partir do grupo com infecção complicada apresentaram resistência a nistatina e eram sensíveis ao fluconazol, anfotericina B e cetoconazol, enquanto que os isolados do grupo com infecção não complicada e colonizada e individuos colonizados apresentaram sensibilidade dose dependente aos antifúngicos fluconazol, anfotericina B e cetoconazol. Os isolados de C. albicans pertencentes aos diferentes grupos genotípicos (A e B) não apresentaram correlação com os testes de suscetibilidade in vitro. Palavras-chave: candidíase vulvovaginal; suscetibilidade in vitro; variabilidade genética. / Abstract: Vulvovaginal candidiasis affects women of reproductive age representing aproximatedly 15 to 25% of vaginitis cases. Different Candida species related to infection can be found colonizing the vaginal mucosa, and under appropriate conditions boost the reproduction process and express virulence factors. This study aimed to isolate yeasts of patients with clinical symptoms absence (colonized group) and also the ones with infection. The susceptibility of in vitro profile from these isolates was stablished and molecular markers were used to identify the species distribution. A total of 40 isolates were obtained and identified through the Cromoagar API20aux system and by sequencing of ITS regions and D1/D2 from the DNAr gene. Different C. albicans strains were genotyped by the ABC system. The multilocus analysis confirmed Isolates of Candida albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. kefyr and Saccharomyces cerevisiae. The most prevalent species was C. albicans. In the colonized group it was found C. albicans (60%), C glabrata (25%), C guilliermondii (5%), C kefyr (5%) and Saccharomyces cerevisiae (5%). In the uncomplicated infection group all isolates were C. albicans (100%) and in the complicated infection group most of the isolates were C. albicans (90.9%), followed by C. dubliniensiis (9.1%). The different isolates of C. albicans were diveded into two genotypic groups (A and B). Regarding the profile of sensibility in vitro of the isolates of different species of Cândida derived from distinct groups that were studied, it can be confirmed that the isolated obtained from the complicated infection group present resistance to nystatin and were sensitive to fluconazole, amphotericin B and ketoconazole, while the colonized presented dose-dependent sensitivty to the antifungal agents fluconazole, amphotericin B and ketoconazole. The C. albicans isolates which belong to different genotypic groups (A and B) did not show any correlation with the susceptibility tests in vitro. key-words: vulvovaginal candidiasis; susceptibility in vitro; variability genetic.
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Estratégias de controle e identificação de fungos produtores de ocratoxina A

Almeida, Angela Bozza de January 2015 (has links)
Orientadora : Profª. Drª. Ida Chapaval Pimentel / Coorientadora : Profª. Drª. Patricia do Rocio Dalzoto / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 26/03/2015 / Inclui referências : f. 82-107 / Resumo: A ocratoxina A (OTA) é uma micotoxina encontrada em vários alimentos como, por exemplo, cereais, café, cacau, uva, especiarias, cerveja, vinho, ovos e carnes, sendo produzida por fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. O Brasil é o maior produtor e exportador de café, entretanto, a OTA tem sido avaliada com níveis de contaminação variando significativamente no país. Atualmente, muitos países possuem legislações estabelecendo limites máximos de OTA em vários alimentos. Na tentativa de minimizar as concentrações desta micotoxina nos alimentos, são utilizados métodos de controle físicos, químicos ou biológicos. Embora, métodos físicos e químicos de desintoxicação tenham sido testados, nenhum possui realmente a eficácia e segurança necessárias. Dessa forma, recentemente, pesquisas tem relatado a utilização de micro-organismos e extratos de plantas como possíveis controladores da OTA. Neste sentido, os objetivos do presente trabalho foram avaliar fungos isolados de grãos de café na inibição de crescimento e produção de OTA pelos fungos Aspergillus ochraceus, Aspergillus westerdijkiae, Aspergillus niger e Aspergillus carbonarius; avaliar o potencial de extratos de erva mate na inibição de crescimento dos mesmos fungos produtores de OTA; e utilizar a técnica da espectroscopia no infravermelho para a elaboração de um modelo quimiométrico eficiente na identificação das espécies de Aspergillus produtoras de OTA. Os testes de inibição de crescimento foram realizados pela técnica do crescimento radial. Para a quantificação de OTA, três plugs de 6mm do meio de cultivo foram retirados, após o teste de crescimento, e extraídos com metanol, em seguida avaliados por Cromatrografia Líquida de Alta eficiência (CLAE). Para as análises da espectroscopia no infravermelho os fungos foram crescidos por 4 dias a 28±0,5°C, o micélio foi raspado e em seguida os espectros foram capturados no modo transmitância com intervalo espectral de 4000 a 400 cm-1. O modelo quimiométrico desenvolvido com base na espectroscopia no infravermelho foi capaz de distinguir corretamente as espécies altamente relacionadas, tais como A. niger e A. carbonarius. No entanto, a diferenciação de A. ochraceus e A. westerdijkiae não foi possível em todos os casos. Em relação à inibição de crescimento e produção de OTA por fungos, todos os fungos testados foram capazes de inibir tanto o crescimento quanto a produção de OTA. As porcentagens de inibição de crescimento variaram de 18,30% a 100% e porcentagens de inibição da produção de OTA variaram de 43,45% a 100%. A linhagem A. niger C187 não toxigênica, apresentou os melhores resultados para ambos os testes. A utilização de extratos de erva-mate na inibição de crescimento de fungos produtores de OTA, apresentou uma inibição discreta para os fungos A. westerdijkiae e A. ochraceus (0,54% a 13,27%) com extratos nas concentrações de 0,1g/L, 0,5g/L e 10g/L. Para as espécies A. niger e A. carbonarius não foi observado inibição em nenhuma das concentrações e extratos testados. Os fungos isolados de grãos de café apresentaram-se como uma alternativa no controle da OTA em alimentos. Palavras chave: Aspergillus; Espectroscopia no infravermelho; Modelo quimiométrico; Inibição; Ocratoxina A. / Abstract: Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin found in several foods, such as cereals, coffee, cocoa, grapes, spices, beer, wine, meat and eggs, being produced by fungi Aspergillus and Penicillium genera. Brazil is the leading producer and exporter of coffee, however, the OTA have been evaluated with levels varying significantly in the country. Currently, many countries have legislation setting maximum limits of OTA in several foods. Control methods are used in order to minimize the concentrations of this mycotoxin in foods, the methods used may be physical, chemical or biological. Although physical and chemical methods of detoxification have been tested, none really has the necessary effectiveness and safety. Thus, recently, studies have reported the use of microorganisms, and plant extracts as possible controllers of OTA. In this regard, the aims of this study were to assess fungi isolated from coffee beans in growth and OTA production inhibition by Aspergillus ochraceus, Aspergillus westerdijkiae, Aspergillus niger and Aspergillus carbonarius; to evaluate the potential of yerba mate extract in inhibiting growth of the same OTA producing fungi; and to use infrared spectroscopy technique for the development of an efficient chemometric model to identify the Aspergillus species producing OTA. Growth inhibition test were performed by the radial growth technique. For the quantification of OTA, three plugs 6mm culture medium were removed after growth test, extracted with methanol and then analyzed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). For the analysis of infrared spectroscopy, fungi were grown for 4 days at 28 ± 0.5°C, the mycelium was then scraped and the spectra were captured in transmittance mode with a spectral range 4000-400 cm-1. The chemometric model developed based on infrared spectroscopy was able to correctly distinguish the highly related species, such as A. niger and A. carbonarius. However, the differentiation of A. ochraceus and A. westerdijkiae was not possible in all cases. With regard, growth and production OTA inhibition by fungi, all the fungi tested were able to inhibit growth and production OTA. The percentage growth inhibition ranged from 18.3% to 100% and the percentage inhibition OTA production ranged from 43.45% to 100%. The strain A. niger C187 non-toxigenic, showed the best results for both tests. The use of yerba mate extracts in growth inhibition of OTA producers fungi has shown a slight inhibition to fungi A. westerdijkiae and A. ochraceus (0.54% to 13.27%) with extracts at concentrations of 0.1g/L, 0.5g/L and 10g/L. For A. niger and A. carbonarius inhibition was not observed in any of the tested concentrations and extracts. The fungi isolated from coffee beans are presented as an alternative to control the OTA food. Keywords: Aspergillus; Infrared Spectroscopy; Chemometric model; Inhibition; Ochratoxin A.
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Análise in vitro do efeito do sevelamer na disfunção endotelial causada por produtos de glicação avançada (AGEs)

Gregório, Paulo Cezar January 2016 (has links)
Orientadora : Profª. Drª. Andréa Emilia Marques Stinghen / Coorientador : Prof. Dr. Fellype de Carvalho Barreto / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 17/02/2016 / Inclui referências : f. 58-70 / Área de concentração / Resumo: Os produtos de glicação avançada (AGEs) são toxinas urêmicas com vários efeitos deletérios no organismo, envolvidos na disfunção endotelial e doença cardiovascular em pacientes com doença renal crônica (DRC). No presente trabalho, investigou-se in vitro em células endoteliais humanas, a capacidade de ligação dos AGEs ao Sevelamer, como possível estratégia terapêutica. Desta forma utilizou-se o receptor para AGEs (RAGE) e a interleucina-8 (IL-8) como biomarcadores de disfunção endotelial. Os AGEs foram preparados por glicação da albumina e caracterizados por absorbância e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os níveis de endotoxinas dos AGEs sintetizados, foram mensurados pelo método de Limulus Amebocyte Lysate (LAL). As amostras apresentam-se livres de endotoxinas. Células endoteliais humanas foram incubadas em meio de cultura contendo AGEs (0,2 mg/mL) com ou sem Sevelamer (3%). O efeito dos AGEs sobre a viabilidade celular foi avaliado pelo ensaio de MTT. Realizou-se o ensaio de ressonância magnética nuclear (RMN), em sobrenadante celular contendo fosfato (Pi), a fim de validar o efeito quelante in vitro do Sevelamer sobre o Pi. Da mesma forma, os níveis de IL-8 foram analisados no sobrenadante por meio do ELISA. A expressão de RAGE foi avaliada por imunocitoquímica e Western blot. A propriedade quimiotática do sobrenadante celular após a exposição aos AGEs com ou sem Sevelamer, foi avaliada em monócitos humanos (Células U-937) usando o ensaio de migração com auxílio da câmara de Boyden. A exposição aos AGEs não afetou a viabilidade celular, mas induziu significativamente a expressão de RAGE quando comparados com as células controle (P<0,005); ainda, a expressão de RAGE diminuiu após tratamento com Sevelamer em relação ao tratamento somente com AGEs (P<0,05). O Sevelamer diminuiu significativamente os níveis de Pi, confirmando sua propriedade in vitro. Os níveis de IL-8 aumentaram significativamente após 6h de tratamento com AGEs quando comparado ao controle (17,14 ± 3,1 vs 8,2 ± 1,0 pg/mL; P<0,005); enquanto um aumento significativo foi observado nos níveis de IL-8 quando comparado as células tratadas somente com AGEs em relação com AGEs mais Sevelamer (17,14 ± 3,1 vs 27,6 ± 2,2 pg/mL; P<0,05). Quando os AGEs foram adicionados no meio de cultura, o sobrenadante de células endoteliais induziu a quimiotaxia de monócitos (402,3 ± 163,8%; P<0,05) , que foi reduzido (402,3 ± 163,8 vs 33,3 ± 7,4%; P<0,05) após o tratamento com Sevelamer. O tratamento com Sevelamer reduziu a expressão de RAGE e migração de monócitos e aumentou a expressão de IL-8, uma interleucina descrita como anti-inflamatória, que hipoteticamente pode levar a diminuição de moléculas de adesão. Nossos resultados sugerem que o Sevelamer é capaz de se ligar a outras toxinas urêmicas além do Pi, tais como os AGEs. Esse efeito pleiotrópico pode contribuir para a proteção do endotélio, entretanto experimentos adicionais são necessários para um melhor entendimento dos mecanismos relacionados à disfunção endotelial mediada por AGEs e o potencial papel protetor do Sevelamer. Palavras-chave: Doença renal crônica, disfunção endotelial, AGEs, Sevelamer, IL-8 e RAGE. / Abstract: Advanced glycation end products (AGEs) are uremic toxins with several pro-inflammatory effects, which have been implicated in the development of endothelial dysfunction and cardiovascular diseases in patients with chronic kidney disease (CKD). We sought to investigate the in vitro AGEs-binding capacity of Sevelamer, as a potential anti-inflammatory strategy, using human endothelial cells. For this purpose we chose the receptor for AGE (RAGE) and the interleukin-8 (IL-8) as biomarkers of endothelial dysfunction. The AGEs were prepared through the method of albumin glycation and characterized by absorbance and polyacrylamide gel electrophoresis. The AGEs endotoxin levels were measured through the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) method. The samples were free of endotoxins. The human endothelial cells were incubated in a culture media containing AGEs (0.2 mg/mL) with or without Sevelamer (3%). The effect of AGEs on cell viability was assessed by MTT assay. A nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the levels of phosphate in samples, was performed in order to verify Sevelamer's phosphate binder function in vitro. In addition, IL-8 levels were analyzed in cell supernatant, through enzyme linked immunosorbent assay. RAGE expression was evaluated through immunocytochemistry and Western blot. The chemotactic property of the endothelial cell supernatant after exposure to AGEs, with or without Sevelamer, was evaluated in human monocytes (U-937 cells) using Boyden chamber migration assay. Although the AGEs exposure did not affect the cell viability, it induced significantly RAGE expression when compared to control cells (P<0.005); moreover RAGE was significantly decreased after the Sevelamer treatment, if compared to the treatment with AGEs (P<0.05). The Sevelamer significantly decreased phosphate levels, therefore confirming its property in vitro. IL-8 levels significantly increased after 6h AGEs treatment when compared to control cells (17.14 ± 3.1 vs 8.2 ± 1.0 pg/mL; P<0.005); while a significant increase was observed in IL-8 levels in cells treated only with AGEs when compared to the treatment of AGEs with Sevelamer (17.14 ± 3.1 vs 27.6 ± 2.2 pg/mL; P<0.05). When AGEs were added to the culture media, the endothelial cell supernatant induced significantly monocytes chemotaxis (402.3 ± 163.8%; P<0.05) which was significantly reduced (402.3 ± 163.8 vs 33.3 ± 7.4%; P<0.05) after the Sevelamer treatment. The Sevelamer reduces RAGE expression and monocytes migration, while increasing IL-8 expression, an interleukin described as anti-inflammatory, which hypothetically could lead to the decrease in adhesion molecules. Our results suggest that the Sevelamer is capable of binding to other uremic toxins besides phosphate, such as the AGEs. This pleiotropic effect may contribute to its role on the endothelium protection. Additional experiments are necessary for a better understanding of the mechanisms related to the AGEs mediated endothelial dysfunction and the Sevelamer potential protective role. Keywords: Chronic kidney disease, endothelial disfuncion, AGEs, Sevelamer, IL-8 e RAGE.
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Avaliação do efeito neurotóxico da proteína prion em linhagens celulares e sua modulação pelas co-chaperonas CHIP/Stub1 e STI1

Santos, Nathly Xavier dos January 2017 (has links)
Orientadora : Profª Drª Adriana Frohlich Mercadante / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 10/03/2017 / Inclui referências / Área de concentração / Resumo: A proteína prion celular (PrPC) e uma glicoproteina extracelular, ancorada na membrana plasmática por uma molécula de glicofosfatidilinositol (GPI). A conversão de PrPC em uma isoforma patologica (PrPSc), a partir de modificações estruturais, e responsável pelo desenvolvimento das encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs) ou doenças periódicas. Vários trabalhos indicam que formas citosólicas de PrP podem ser formadas durante erros na sua biossintese. Os príons citosólicos (CytPrP) são gerados por meio de duas vias: ERAD (ER-associated Degradation) e ineficiência do peptídeo sinal. Alguns estudos demonstram que estas formas de príons citosólicos exercem função neurotoxica, contribuindo para a manifestação das doenças periódicas. Trabalhos anteriores do nosso grupo, foram capazes de identificar uma interação entre PrPC e CHIP/Stub1. CHIP/Stub1 e uma proteína citoplasmática o qual funciona como um co-chaperona molecular e apresenta atividade ubiquitina E3- ligase, participando do controle de qualidade das proteínas desde o dobramento ate a fase de degradação. Ainda, CHIP/Stub1 e homologa a proteína STI1/Hop, uma cochaperona e um ligante bem estabelecido de PrPC. O objetivo desse trabalho foi avaliar em diferentes linhagens celulares se o efeito neurotoxico de PrP citosólico, ja descrito para algumas células, era capaz de ser modulado através dessas co-chaperonas. Em nossos resultados mostramos por diferentes ensaios de viabilidade celular, tais como MTT, vermelho neutro, que CytPrP reduziu de 30-50% a viabilidade celular de três linhagens neuronais testadas: N2a, SH-SY5Y e CF10. Esse mesmo efeito nao foi observado para linhagem renal HEK293T. A expressão das co-chaperonas CHIP e STI-1 foi capaz de reverter a toxicidade do CytPrP em todas linhagens neuronais. Nossos resultados ainda mostraram que mutantes de CHIP e STI-1 com domínios deletados também foram capazes de reverter o efeito neurotoxico causado pela CytPrP. Ensaios utilizando o inibidor MG132 e hidroxicloroquina sugerem que essa reversao do efeito neurotoxico de CytPrP por CHIP e STI-1 parece não ser dependente da via de degradação por proteossomo, nem por lisossoma. Assim, um mecanismo através do qual as co-chaperonas exercem seu efeito de proteção da neuroxicidade ainda esta sendo investigado. Os dados obtidos nesse trabalho poderão contribuir para elucidar os possíveis mecanismos da neurotoxicidade de prions, permitindo um auxilio futuro no desenvolvimento de alvos terapêuticos relacionadas a doenças prionicas. Palavras-chave: PrP citosólico. Neurotoxicidade. CHIP/Stub1. STI1. Prion. / Abstract: The cellular prion protein (PrPC) is an extracellular glycoprotein, anchored to the plasma membrane by a glycophosphatidylinositol (GPI) molecule. The conversion of PrPC to a pathological isoform (PrPSc), through structural modifications, is responsible for the development of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases. Several data indicate that cytosolic forms of PrP can be formed during errors in its biosynthesis. Cytosolic prions (CytPrP) are generated by two pathways: ERAD (ER-associated Degradation) and signal peptide inefficiency. Some studies have shown that these forms of cytosolic prions exert neurotoxic function, contributing to the manifestation of prion diseases. Previous work by our group was able to identify an interaction between PrPC and CHIP/Stub1. CHIP/Stub1 is a cytoplasmic protein, identified as a co- chaperone with E3 ligase activity, participating in the quality control of proteins, from folding to the degradation phase. Still, CHIP/Stub1 is homologous to STI1 (stress - inducible protein 1 ), a co-chaperone and a well-established PrPC bind protein. The objective of this work was to evaluate in different cell lines whether the neurotoxic effect of cytosolic PrP, already described for some cells, was able to be modulated through these co-chaperones. In our results we showed by different cell viability assays, such as MTT, neutral red, that CytPrP reduced from 30% to 50% the cell viability of three tested neuronal lines: N2a, SH-SY5Y and CF10. This same effect was not observed for HEK293T renal lineage. Our results also show that CHIP and STI-1 mutants with deleted domains were also capable of reversing the neurotoxic effect caused by CytPrP in all neuronal lines. Assays using the proteasome inhibitor MG132 and Hydroxychloroquine suggest that this reversal of the neurotoxic effect does not appear to be dependent of the proteosome or lysosomal degradation pathways. Thus, a mechanism through which co-chaperones exert their protective effect of CytPrP neuroxicity is still being investigated. The data obtained in this work may contribute to elucidate possible mechanisms of neurotoxicity of prions, allowing future aid in the development of therapeutic targets related to prion diseases. Keywords: cytosolic PrP. Neurotoxicity. CHIP/Stub1. STI1. Prion
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Leishmaniose tegumentar americana em cães no Estado do Paraná, Brasil. Avaliação do risco epidemiológico usando como ferramenta a reação em cadeia pela polimerase (PCR)

Marquez, Ellen de Souza January 2010 (has links)
Orientador : Profª. Drª. Vanete Thomaz Soccol / Co-orientador : Prof. Dr. ItaLmar Teodorico Navarro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 07/07/2010 / Inclui referências : f. 18-21-52-58-81-88-115-119 / Área de concentração: Saúde Humana e Animal / Resumo
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Prevalência de Giardia sp. e Cryptosporidium spp. em populações de cães de diferentes regiões do município de Porto Alegre, RS, Brasil

Silva, Sonia Maria Mottin Duro da January 2010 (has links)
Este estudo objetivou identificar a prevalência de cistos de Giardia sp. e oocistos de Cryptosporidium spp. em amostras de fezesde cães do município de Porto Alegre. As amostras foram analisadas através do método de Faust e cols, para pesquisa de Giardia e esfregaços de fezes corados com Zieh-Neelsen para pesquisa de Cryptosporidium. Foram comparadas as prevalências destes parasitos entre duas populações de cães: cães com proprietário provenientes de comunidades econômica e socialmente vulneráveis de Porto Alegre cães errantes recolhidos ao canil municipal. Foram avaliadas também as prevalênciasem duas faixas etárias: filhotes (idade até 12 meses) e adultos (12 meses ou mais) e quanto ao sexo. Através da aplicação de um questionário epidemiológico algumas variáveis ambientais e de manejo, como acesso à via pública, convivência com outros animais no domicílio e higiene do ambiente onde o animal vive, também puderam ser avaliadas. Das 454 amostras de fezes de cães examinadas, 18,5 %, apresentaram cistos de Giardia, não sendo identificada diferença significativa entre os cães com e sem proprietário. Na pesquisa de Cryptosporidium a prevalência foi de 6,34% nas 410 amostras analisadas. A prevalência encontrada em cães com proprietário foi maior 9,85 % do que os cães de rua 2,89 %. Comparando as faixas etárias, ambos os parasitos apresentaram maior ocorrência em filhotes, 32,65% positivo para Giardia e 11, 36% para Cryptosporidium. Quanto ao sexo não houve diferença significativa em ambos os parasitos. Na análise de variáveis ambientais e de manejo, foi observado que a convivência com outros animais no domicílio e o acesso à via pública não se constituíam como fator de risco para a ocorrência de ambos os parasitos estudados. No entanto, a condição de higiene do domicílio apresentou significativa associação com a ocorrência de cistos de Giardia, que não foi observado na ocorrência de oocistos de Crytposporidium spp. A prevalência de ambos os parasitos em cães assintomáticos coincide com o que é apresentado na bibliografia, que nos cães o significado patogênico das infecções por Giardia e Cryptosporidium é pequeno. Animais assintomáticos podem eliminar cistos de Giardia e oocistos de Cryptoporidium em quantidade significativa, no presente estudo (18,5% e 6,34 %, respectivamente) podendo atuar como fonte de infecção para outros animais, contaminando o ambiente e podendo, em situações especiais, vir a contaminar seres humanos (transmissão zoonótica). / This study aimed at identifying the prevalence of cysts of Giardia sp. and oocysts of Cryptosporidium spp. in dogs of the municipality of Porto Alegre. The samples were analyzed by the method of Faust et al for the search of Giardia and fecal smear stained by Zieh-Neelsen technique for the search of Cryptosporidium. The prevalence of these parasites was compared between two populations of dogs: dogs with owners from economically and socially vulnerable communities of Porto Alegre and wandering dogs which had been taken to the Municipal Kennel. It was also evaluated the prevalence of the parasites in two age groups - puppies (age up to 12 months) and adults (12 months or more), and regarding their sex. By applying an epidemiological survey, some environmental and handling variables, such as management, access to public roads, coexistence with other animals at home and the hygiene of the place where the animals live could also be assessed. Of the 454 dog feces samples examined, 18,5%showed cysts of Giardia, not being identified significant differences between tne dogs with and without owners. In the search of Cryptosporidium the prevalence was of 6,34% of the 410 samples analyzed. The prevalence in dogs with owners was 9,85 % greater than in the street dogs 2,89%. Comparing the age groups , both parasites showed greater occurrence in puppies, 32,65% positive for Giardia and 11,36 % for Cryptosporidium. Regarding sex, there was no significant difference for both parasites. In the analysis of environmental and handling variables it was noted that the coexistece with other animals at home and the access to public roads did not constitute a risk factor for the occurrence of both parasites studied . However, the condition of hygiene of the domicile presented significant association with the occurrence of cysts of Giardia, which was not observed in oocysts occurence of Cryptosporidium. The prevalence of both parasites in asymptomatic dogs coincides with what it is found in the bibliography tha in dogs the pathogenic infection by Giardia and Cryptosporidium is small. Asymptomatic animals can eliminate cysts of Giardia and oocystis of Cryptosporidium in significant amount. In this study, 18,5% and 6,34%, respectively and they can act as a source of infection to the other animals, contaminating the environment which may, in special cases, come to infect human beings (zoonotic transmission).
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Diversidade e potencial zoonótico de parasitos de Didelphis albiventris Lund, 1841 (Marsupialia: Didelphidae)

Antunes, Gertrud Müller January 2005 (has links)
Didelphis albiventris, gambá-de-orelha-branca, é um marsupial de hábitos crepusculares e noturnos que se alimenta de frutos, insetos, pequenos répteis e anfíbios, filhotes de aves e pequenos mamíferos. Com a destruição de seu “habitat” natural devido às queimadas e desmatamentos, esses animais têm-se aproximado, cada vez mais, das regiões peridomiciliar e domiciliar, onde procuram abrigo e alimentos. Com o objetivo de conhecer a diversidade de parasitos de D. albiventris e relatar os que apresentam potencial zoonótico, foram examinados 30 exemplares desta espécie, através de necropsia, para coleta de ectoparasitos da superfície externa do corpo e helmintos dos órgãos e conteúdos estomacal e intestinal. Os sifonápteros foram removidos da superfície externa dos animais, conservados em álcool etílico a 70°GL, clarificados em líquido de Nesbitt, desidratados em etanol, diafanizados em creosoto de Faya e montados em lâminas com bálsamo do Canadá para identificação. Os carrapatos foram removidos da superfície externa dos animais, conservados em álcool etílico a 70°GL e identificados ao estereomicroscópio, segundo chaves específicas de Aragão & Fonseca (1961) e Guimarães et al (2001). Os helmintos foram recolhidos com auxílio de estiletes e pinças, clarificados em lactofenol e montados entre lâminas e lamínulas com bálsamo do Canadá para identificação ao microscópio. Do total de animais examinados, 70% estavam infestados com pulgas das espécies Polygenis (Neopolygenis) atopus, Polygenis (Polygenis) rimatus, Polygenis (Polygenis) roberti roberti, Polygenis (Polygenis) sp., Craneopsylla minerva minerva e Ctenocephalides felis felis, todas essas registradas pela primeira vez sobre D. albiventris e, exceto C. felis felis, são também registradas pela primeira vez no estado do Rio Grande do Sul. Carrapatos foram encontrados em 43,33% dos animais examinados, representados pelas espécies Ixodes loricatus, Amblyomma aureolatum e Amblyomma sp, sendo A. aureolatum registrado pela primeira vez parasitando D. albiventris no Brasil. Os helmintos encontrados foram: Filo Nematoda - Capillaria spp. (esôfago, traquéia, faringe e pulmão), Didelphostrongylus hayesi (pulmão), Turgida turgida (estômago), Gnathostoma sp. (estômago e fígado), Travassostrongylus orloffi, Viannaia hamata e Trichuris minuta no intestino delgado e Trichuris didelphis, Cruzia tentaculata e Aspidodera raillieti no intestino grosso; Classe Trematoda – Echinostoma revolutum, Plagiorchis didelphidis, Rhopalias coronatus, R. baculifer, Brachylaema migrans e Didelphodiplostomum variabile, todos no intestino delgado; Classe Cestoda – exemplares da família Diphyllobotriidae, no intestino delgado; e Filo Acanthocephala – Hamanniella microcephala e Centrorhynchus sp., ambos no intestino delgado. Dos helmintos encontrados, os que apresentam potencial zoonótico segundo a literatura são T. turgida, Gnathostoma sp., Capillaria spp., B. migrans, E. revolutum e Família Diphyllobotriidae. Além disso, os sifonápteros e ixodídeos encontrados são potenciais vetores de patógenos que infectam humanos. D. albiventris, portanto, apresenta grande diversidade parasitária, incluindo espécies que podem potencialmente atingir o homem, alertando para a importância destes marsupiais na disseminação de doenças entre animais e humanos.
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Efeito da liraglutida sobre a metilação do DNA e a expressão de marcadores da transição epitélio-mesênquima em linhagens tumorais de mama

Toledo, Mariana Busato January 2017 (has links)
Orientadora : Profª Drª Giseli Klassen / Coorientadora : Profª Drª Edneia A. S. R. Cavalieri / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia). Defesa: Curitiba, 22/03/2017 / Inclui referências : f. 65-73 / Resumo: O câncer de mama é o mais diagnosticado e a principal causa de morte por câncer no mundo entre as mulheres. A propagação metastática das células tumorais é responsável por aproximadamente 90% das mortes por este câncer. A progressão dos carcinomas, que culminam nas metástases, está associada com a perda de características epiteliais e a aquisição de fenótipo mesenquimal pelas células tumorais, processo este denominado de transição epitélio-mesênquima (TEM). A identificação de fármacos já aprovados em novas indicações terapêuticas para outras doenças, como o câncer, é conhecida como reposição de fármacos. Isto é possível devido às origens moleculares comuns de diversas doenças. Estudos recentes mostram que agonistas do receptor de GLP-1, como a exenatida, apresentam efeitos pró-apoptóticos e seletivos em células tumorais, especialmente em linhagens tumorais de mama. A liraglutida é um análogo de GLP-1 mais estável que a exenatida, utilizada na terapia da diabetes mellitus do tipo 2. Diante disso, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito in vitro da liraglutida em células tumorais de câncer de mama. A viabilidade celular com este fármaco foi testada nas concentrações de 10, 30, 50, 70 e 100 nM tanto nas linhagens tumorais de mama, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436, como na linhagem normal de mama HB4a. A liraglutida não apresentou efeito inibitório de viabilidade nas linhagens. A partir deste teste, foram feitos os ensaios de migração celular, análises de expressão gênica dos marcadores da TEM, como o CDH1, marcador epitelial, e o VIM, marcador mesenquimal, assim como para as análises de metilação do promotor desses genes, com a concentração de 30 nM de liraglutida. Os resultados mostraram que a liraglutida diminuiu em aproximadamente 40% a migração das linhagens mesenquimais MDA-MB- 231 e MDA-MB-436. Em ambas as linhagens houve aumento significativo da expressão de CDH1, associada com a desmetilação do promotor deste gene. Além disso, foi feito a indução da TEM na linhagem epitelial MCF-7, após exposição com o fator de crescimento epidermal (EGF), e este ensaio apresentou aumento da migração celular, juntamente com o aumento da expressão dos genes VIM e SNAIL e diminuição de CDH1, alterações estas características da indução da TEM. O tratamento na linhagem MCF-7 com liraglutida, nas células tratadas com EGF, inibiu a motilidade celular e a expressão de CDH1, revertendo a indução da TEM causada pelo EGF. Como conclusão, os dados obtidos mostram que a liraglutida afeta o potencial migratório das linhagens tumorais de mama, pela redução de migração celular e pelo aumento da expressão de CDH1. Palavras-chave: Câncer de mama; TEM; Liraglutida. / Abstract: Breast cancer is the most commonly diagnosed cancer and the main cause of cancer death in the world among women. The propagation of metastatic tumor cells is responsible for approximately 90% of human breast cancer death. Carcinoma progression, which results in metastasis, is associated with the loss of epithelial features, and the acquisition of a mesenchymal phenotype by tumor cells, and this process is called of epithelial mesenchymal transition (EMT). Drug repurposing is the identification of new therapeutic indications for already approved drugs in others pathologies, like cancer. This is possible because of the common molecular origins of diverse diseases. Recent studies with Glucagon-like-peptide-1 (GLP-1) receptor agonists, as exenatide, has showed pro-apoptotic and selective effects in tumor cells, especially in breast cancer cell lines. Liraglutide is a human GLP-1 analogue more stable than exenatide, used in type 2 diabetes mellitus therapy. Then, the aim of this study was to evaluate the in vitro effects of liraglutide on breast cancer cell lines. The cell viability with liraglutide was tested in the concentrations of the 0, 10, 30, 50, 70 and 100 nM both in breast cancer, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436, and normal breast, HB4a, cell lines. Liraglutide does not affect the cell viability in the cell lines. From this assay, the following assays were done with 30 nM of liraglutide: wound healing, analyses of gene expression of EMT markers, like CDH1 epithelial marker and VIM mesenchymal marker and DNA methylation of promoter from CDH1 and VIM. The results showed that liraglutide decreased nearly 40% the cell migration of the mesenchymal cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-436. These two cell lines had up regulation of CDH1, associated with demethylation of this gene. Furthermore, the epithelial cell line MCF-7 was induced to EMT, after stimulation with epidermal growth factor (EGF), and it resulted in an increased cell motility and up regulation of mesenchymal markers VIM and SNAIL and decreased of CDH1, these alterations are characteristics of EMT. Treatment of MCF-7 cells with a combined stimulation of EGF and liraglutide inhibited the motility and decreased levels of CDH1, reverting EGFinduced EMT. In summary, these data showed that liraglutide affects the migratory behavior of the breast cancer cell lines by the reduction of cell migration and up regulation of CDH1. Key words: Breast cancer; EMT; Liraglutide.

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