[ES] A medida que aumenta la conciencia climática y se buscan reducir las emisiones globales, se están realizando esfuerzos para producir tecnologías que permitan desarrollar motores más limpios y amigables con el medio ambiente. Los sistemas GDI (inyección directa de gasolina) tienen el potencial de cumplir con los cada vez más estrictos estándares de emisiones y, al mismo tiempo, mejorar el consumo de combustible. El espacio limitado dentro de la cámara de combustión hace que el impacto del chorro con la pared sea un fenómeno común en los motores de inyección directa de gasolina. Este fenómeno tiene un efecto significativo en el desarrollo del chorro y su interacción con el aire en la cámara. En condiciones de arranque en frío, las bajas presiones y temperaturas en la cámara facilitan la deposición del combustible en la superficie del pistón, lo que conduce a un aumento considerable en la formación de hollín y en los hidrocarburos sin quemar. Esta tesis busca proporcionar información sobre las características más relevantes de la interacción chorro-pared en sistemas de inyección directa de gasolina en condiciones de arranque en frío y otras condiciones evaporativas. Para ello, se utilizó una pared plana ubicada a diferentes distancias de impacto y ángulos con respecto a la punta del inyector. Se empleó un inyector solenoide fabricado por Continental y el inyector "Spray G", utilizando iso-octano como combustible inyectado. El estudio se llevó a cabo en diversas instalaciones experimentales cubriendo varias técnicas ópticas. El estudio de la interacción chorro-pared se llevó a cabo utilizando tres campañas experimentales. En la primera, se utilizó una pared de cuarzo transparente para analizar las características macroscópicas del chorro al impactar la pared, observándola lateral y frontalmente con el uso de tres cámaras de alta velocidad gracias a los accesos ópticos de la instalación experimental. En la segunda, se empleó una pared termorregulada de acero inoxidable para medir el efecto que tienen las condiciones de operación y ambientales sobre la transferencia de calor entre la pared y el chorro durante el evento de inyección de combustible. Se observó que la penetración del chorro libre y el desarrollo del chorro sobre la pared son influenciados por la presión de inyección y el ángulo de inclinación de la pared. El ancho del chorro medido después del impacto fue afectado principalmente por la distancia entre el inyector y la pared y por el ángulo de la pared pero más aún por la distancia respecto al punto de impacto sobre la cual fue medida. La semi área de impacto es susceptible a cambios en el ángulo de la pared y la distancia inyector-pared teniendo un papel fundamental en el arrastre de aire entre el chorro y el ambiente. No se encontraron diferencias significativas entre las fases líquida y vapor tanto para la penetración de chorro libre como para el desarrollo del chorro sobre la pared a temperatura ambiente. Por el contrario, con la pared calentada, se obtuvieron diferencias entre la fase líquida y vapor, destacando la contribución de la evaporación de combustible causada por el incremento en la temperatura de la pared. Respecto a la pared instrumentada, tanto la temperatura del combustible como de la pared produjeron los picos más significativos en términos del flujo de calor superficial. Órdenes de magnitud similares respecto al flujo de calor superficial fueron encontrados entre las campañas experimentales de la pared instrumentada y la termografía infrarroja. La aparición del flash boiling en condiciones de menor contrapresión ambiental y mayor temperatura del combustible modificó la morfología del chorro en términos de anchura , lo que tuvo repercusiones significativas en el parámetro R (que depende de la penetración del chorro) y en el número de gotas de líquido presentes en el chorro, afectando tanto a los perfiles de extinción de la luz como a los perfiles del flujo de calor superficial. / [CA] A mesura que augmenta la consciència climàtica i es busquen reduir les emissions globals, s'estan fent esforços per a produir tecnologies que permeten desenvolupar motors més nets i amigables amb el medi ambient. Els sistemes GDI (injecció directa de gasolina) tenen el potencial de complir amb els estrictes estàndards d'emissions i, al mateix temps, millorar el consum de combustible. L'espai limitat dins de la cambra de combustió fa que l'impacte del doll amb la paret siga un fenomen comú en els motors d'injecció directa de gasolina. Aquest fenomen té un efecte significatiu en el desenvolupament del doll i la seua interacció amb l'aire en la cambra. La interacció doll-paret és un fenomen interessant i difícil de comprendre que ocorre durant el procés de combustió. En condicions d'arrancada en fred, les baixes pressions i temperatures en la cambra faciliten la deposició del combustible en la superfície del pistó, la qual cosa condueix a un augment considerable en la formació de sutge i en els hidrocarburs sense cremar. Aquesta tesi busca proporcionar informació sobre les característiques més rellevants de la interacció doll-paret en sistemes d'injecció directa de gasolina en condicions d'arrancada en fred i altres condicions evaporatives. Per a això, es va utilitzar una paret plana situada a diferents distàncies d'impacte i angles respecte a la punta de l'injector. Es va emprar un injector solenoide fabricat per Continental i l'injector "Spray G", utilitzant iso-octà com a combustible injectat. L'estudi es va dur a terme en diverses instal·lacions experimentals cobrint diverses tècniques òptiques. L'estudi de la interacció doll-paret es va dur a terme utilitzant tres campanyes experimentals. En la primera, es va utilitzar una paret de quars transparent per a analitzar les característiques macroscòpiques del doll en impactar la paret, observant-la lateral i frontalment amb l'ús de tres càmeres d'alta velocitat gràcies als accessos òptics de la instal·lació experimental. En la segona, es va emprar una paret termorregulada d'acer inoxidable per a mesurar l'efecte que tenen les condicions d'operació i ambientals sobre la transferència de calor entre la paret i el doll durant l'esdeveniment d'injecció de combustible. Es va observar que la penetració del doll lliure i el desenvolupament del doll sobre la paret són influenciats per la pressió d'injecció i l'angle d'inclinació de la paret. L'ample del doll mesurat després de l'impacte va ser afectat principalment per la distància entre l'injector i la paret i per l'angle de la paret però més encara per la distància respecte al punt d'impacte sobre la qual va ser mesurada. La semi àrea d'impacte és susceptible a canvis en l'angle de la paret i la distancia injector-paret tenint un paper fonamental en l'arrossegament d'aire entre el doll i l'ambient. No es van trobar diferències significatives entre les fases líquida i vapor tant per a la penetració de doll lliure com per al desenvolupament del doll sobre la paret a temperatura ambient. Per contra, amb la paret calfada, es van obtindre diferències entre la fase líquida i vapor, destacant la contribució de l'evaporació de combustible causada per l'increment en la temperatura de la paret. Respecte a la paret instrumentada, tant la temperatura del combustible com de la paret van produir els pics més significatius en termes del flux de calor superficial. Ordres de magnitud similars respecte al flux de calor superficial van ser trobats entre les campanyes experimentals de la paret instrumentada i la termografia infraroja. L'aparició del flaix boiling en condicions de menor contrapressió ambiental i major temperatura del combustible va modificar la morfologia del doll en termes d'amplària, la qual cosa va tindre repercussions significatives en el paràmetre R i en el nombre de gotes de líquid presents en el doll, afectant tant els perfils d'extinció de la llum com als perfils del flux de calor superfial. / [EN] Fuel injection is one of the most important factor that must be considered to achieve cleaner and more efficient internal combustion engines. Its role is more evident when direct injection strategies are used. As awareness of climate change and global emission reduction policies increase, efforts are being made to develop new technologies that enable cleaner and more environmentally friendly engines. The gasoline direct injection systems can fulfill strict emission standards and improve fuel consumption. Because of the space constraints inside the combustion chamber for spray penetration, collision and interaction with the wall are common events in direct injection engines, considerably influencing spray formation and air-spray interaction inside the chamber. In cold-start engine conditions, the lower injection pressures and temperatures in the combustion chamber enhance the fuel deposition over the piston surface, incrementing the soot and the unburned hydrocarbon formation. The present work highlights the fundamental aspects of the spray-wall interaction for the gasoline direct injection (GDI) system under cold-start and other evaporative conditions. For that, a flat wall is located several distances and at different wall angles to the injector tip. Also, this thesis involves using a solenoid injector produced by Continental and the well-known "Spray G" injector using iso-octane as injected fuel covering several techniques and experimental facilities. To analyze the spray-wall interaction, three experimental approaches were used: The first used three high-speed cameras and a quartz wall inside the test rig vessel to study the macroscopic characteristics of the spray, which was observed lateral and frontal by using the optical accesses of the vessel. The second approach used a stainless steel wall to catch the effect of the operating and ambient conditions over the heat flux between the wall and the spray during the fuel injection event and determine how the spray development is affected by the cold-start realistic engine conditions and other evaporative conditions that were included in the test matrix. This wall was coupled with sensors to control the initial surface temperature and to compute the temperature variation in time and the surface heat flux using high-speed thermocouples. The spray under free-jet conditions was also analyzed as a comparison point with the spray-wall interaction conditions. The free spray penetration and the spray spreading over the wall were influenced mainly by the injection pressure and the wall angle. The spray thickness measured after the SWI was affected primarily by the wall-to-tip distance and the wall angle but even more by the distance from the impact point in which it is measured. The semi-circle impact area was susceptible to wall angles and wall-to-tip distance variations, essential in the spray-air entrainment. No remarkable differences were found between the liquid and vapor phases for the free jet or the isothermal wall configuration. In contrast, some differences were obtained for the instrumented and thermoregulated wall, remarking the contribution of fuel evaporation caused by the wall temperature increase. Regarding the thermoregulated wall, the fuel and wall temperatures produced the most important peaks in terms of surface heat flux. A similar order of magnitude regarding the surface heat flux was found between the thermoregulated wall and infrared thermography experimental campaigns. The flash boiling appearance for the lower ambient back pressure and higher fuel temperature condition changed the spray morphology in terms of the width (spray angle), having significant repercussions over the R-parameter (which depends on the spray penetration) and in the number of liquid droplets present in the spray affecting both the light extinction profiles and the surface heat flux profiles. / Esta tesis se ha desarrollado en el marco de una ayuda para la Formación de Personal Investigador (FPI) Subprograma 1 (PAID-01-19) financiada por la Universitat Politècnica de València. / Carvallo García, CL. (2023). Experimental study of the behavior of gasoline direct injection GDI sprays during wall impingement under realistic engine conditions [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/195027

El present treball de recerca s'emmarca en un projecte Europeu anomenat E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), l'objectiu del qual és la identificació de nous enzims vegetals per entendre amb major profunditat els processos de formació i modificació de les fibres vegetals per abordar en el futur la millora dels paràmetres de qualitat d'aquestes fibres, mitjançant la generació de línies transgèniques de plantes. En el present projecte es pretén aprofundir en el coneixement de les xiloglucà endotransglicosilases (XET), enzims claus en la construcció i modificació controlada de la xarxa de xiloglucà cel·lulosa, estudiant el seu mecanisme d'acció i la seva especificitat per substrat. En aquest treball s'estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretament la XET16A (Ptt-XET16A). Es dissenya i es valida un nou assaig enzimàtic mitjançant electroforesis capil·lar (HPCE), que permet l'estudi cinètic de les XET, emprant oligosacàrids de baix pes molecular de xiloglucà amb una estructura coneguda. Aquest substrats han estat sintetitzats en el present treball i també per l'equip del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Es determina que el màxim d'activitat de la Ptt-XET16A es dóna entre pH 5 i 5.5 i entre 30 i 40 ºC. Es demostra que aquest enzim actua mitjançant un mecanisme cinètic bi-bi ping-pong, en el que l'acceptor actua com a inhibidor competitiu del donador unint-se a l'enzim lliure i en el que, depenent del donador emprat, aquest també poc actuar com a inhibidor competitiu de l'acceptor, unint-se als subsetis positius de l'intermedi glicosil-enzim i donant diferent reaccions secundàries com són la polimerització del donador o l'elongació del producte, només en el cas que el donador presenti un grup glucosil en l'extrem no reductor. S'avalua un llibreria de xilogluco-oligosacàrids sintetitzada per l'equip del Dr. Driguez al CERMAV-CNRS com a donadors de la Ptt-XET16A. D'aquesta forma s'aprofundeix en el coneixement de l'activitat de les XTH, en el coneixement de la seva especificitat per substrat i es realitza un mapeig del centre actiu, obtenint la contribució dels diferents subsetis de la Ptt-XET16A en l'estabilització de l'estat de transició de la reacció de transglicosidació catalitzada per l'enzim estudiat. Finalment, s'ha dissenyat un substrat bifluorogènic derivat del tetradecasacàrid emprat com a substrat estàndard en el present treball, per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs mitjançant fluorescence resonance energy transfer (FRET). El substrat bifluorogènic ha estat obtingut i caracteritzat, tanmateix, no s'ha pogut demostrar si aquest substrat és adequat per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs ja que les propietats fluorescents del marcador s'han perdut en el procés de síntesis del substrat. / El presente trabajo de investigación se enmarca en un proyecto Europeo llamado E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), el objetivo del cual es la identificación de nuevos enzimas vegetales para entender con mayor profundidad los procesos de formación y modificación de las fibras vegetales para abordar en el futuro la mejora de los parámetros de calidad de estas fibras, mediante la generación de líneas transgénicas de plantas. En el presente proyecto se pretende profundizar en el conocimiento de las xiloglucano endotransglicosilasas (XET), enzimas claves en la construcción y modificación controlada de la red de xiloglucano-celulosa, estudiando su mecanismo de acción y su especificidad por sustrato. En este trabajo se estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretamente la XET16A (Ptt-XET16A). Se diseña y se valida un nuevo ensayo enzimático mediante electroforesis capilar (HPCE), que permite el estudio cinético de las XET, utilizando oligosacáridos de xiloglucano de bajo peso molecular y de estructura conocida como sustratos. Estos sustratos han estado sintetizados en el presente trabajo y también por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Se determina que el máximo de actividad de la Ptt-XET16A se da entre pH 5 y 5.5 y entre 30 y 40 ºC. Se demuestra que este enzima actúa mediante un mecanismo cinético bi-bi ping-pong, en el que el aceptor actúa como inhibidor competitivo del dador uniéndose al enzima libre y en el que, dependiendo del dador utilizado , éste también puede actuar como inhibidor competitivo del aceptor uniéndose en los subsitios positivos del intermedio glicosilo-enzima y dando diferentes reacciones secundarias como son la polimerización del dador o la elongación del producto, solamente si el dador presenta un grupo glucosilo en el extremo no reductor. Se evalúa una librería de xilogluco-oligosacáridos sintetizada por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS como dadores de la Ptt-XET16A. De esta forma se profundiza en el conocimiento de la actividad de las XTHs, en el conocimiento de su especificidad por sustrato y se realiza un mapeo del centro activo del enzima, obteniéndose la contribución de los diferentes subsitios de la Ptt-XET16A en la estabilización del estado de transición de la reacción de transglicosidación catalizada por el enzima estudiado. Finalmente, se ha diseñado un sustrato bifuorogénico derivado del tetradecasacárido utilizado como sustrato estándar en el presente trabajo para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasa de las XETs mediante fluorescence resonance energy transfer (FRET). El sustrato biofluorogénico ha sido obtenido y caracterizado, sin embargo no se ha podido demostrar si este sustrato es adecuado para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasas de las XETs, ya que las propiedades fluorescentes del marcador se han perdido durante la síntesis del sustrato. / The present work is part of an European project named E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443). The general objective of the project is to identify novel plant enzymes for deeper understanding of the process of fiber formation and modification for future improvement of the quality parameters of wood fibers. The present project pretends to increase the knowledge about xyloglucan endotransglycosylases (XET), which are thought to be key enzymes in the construction and controlled modification of the xyloglucan¬cellulose network. It is pretended to study the mechanism of action and the substrate specificity of a XET from Populus tremula x tremuloides, concretely XET16A (Ptt-XET16A). A new enzymatic assay based on capillary electrophoresis is designed and validated. This assay allows the kinetic study of XETs using as substrates, low molecular mass xyloglucan oligosaccharides with defined structures. These substrates have been synthesized in the present work and also in collaboration with Dr. Driguez team from CERMAV-CNRS. It is concluded that the maximum of activity of Ptt-XET16A is between pH 5 and 5.5 and 30 and 40 ºC. It is demonstrated that Ptt-XET16A follows a bi-bi ping-pong kinetic mechanism, in which the acceptor acts as competitive inhibitor of the donor binding to the free enzyme and depending on the donor used, this one can act also as competitive inhibitor of the acceptor binding to the acceptor subsites of the glycosyl-enzyme intermediate giving rise to side reaction such as donor polymerization and product elongation only in case that the donor shows a glucosyl residue in the non reducing end. A library of xylogluco-oligosaccharides, synthesized in CERMAV-CNRS by Dr. Driguez team, is evaluated as Ptt-XET16A donors. With this studies we are able to deeper understand the activity of XETs, their substrate specificity and a subsite maping of the binding cleft is done, obtaining the contribution of different subsites of Ptt-XET16A to the stabilization of the transition state of the transglycosylation reaction catalyzed by the studied enzyme. Finally, a bifluorogenic substrate derived from the tetradecasacharide used as standard substrate in this project has been designed to measure hydrolase and transferase activities of XET enzymes by fluorescense resonance energy transfer (FRET). The bifluorogenic substrate was obtained, however, it could not be demonstrated if it is an adequate substrate to measure hydrolase and transferase activities because the fluorescent properties of the label were lost during substrate synthesis.

[ES] Los dobles haploides son una gran herramienta para la mejora genética de híbridos debido a que se puede alcanzar la homocigosis completa en una sola generación. Entre las técnicas usadas para obtener estas plantas, la inducción de la embriogénesis de microsporas, mediante el cultivo de anteras o de microsporas, es la más eficiente y la más usada. La embriogénesis de microsporas es también un ejemplo de totipotencia de las células vegetales gracias a su habilidad de reprogramar su desarrollo gametofítico hacia una ruta esporofítica, donde las células proliferan de forma organizada para crear un nuevo organismo. Como en muchos otros procesos in vitro, las condiciones de cultivo deben ser optimizadas para incrementar la eficiencia. En la presente Tesis Doctoral, hemos usado dos especies como sistemas experimentales para estudiar y optimizar el cultivo de microsporas. Por un lado, usamos berenjena (Solanum melongena) como un ejemplo de cultivo de importancia económica en el que los protocolos todavía tienen mucho margen de mejora. La optimización de la densidad celular y los reguladores de crecimiento han demostrado ser útiles para modificar la eficiencia del cultivo de microsporas de berenjena. Por otra parte, hemos utilizado el cultivo de microsporas de Brassica napus para estudios básicos puesto que ha sido ampliamente usado como modelo para entender procesos celulares que ocurren durante este cambio en el desarrollo. Se detalla un protocolo estandarizado para el cultivo de microsporas de B. napus, el cual ha sido utilizado en todos los cultivos en esta Tesis para explorar una serie de procesos y estructuras celulares potencialmente implicados en el cambio de desarrollo hacia embriogénesis. Estos procesos incluyen estrés del retículo endoplásmico, muerte celular programada, autofagia y estructura y composición de la pared celular. Estudiamos en paralelo el cultivo de microsporas de dos genotipos de B. napus con diferente respuesta androgénica en condiciones estándar y añadiendo Tricostatina A, un modulador epigenético que ha mostrado ser beneficioso para la respuesta androgénica en algunos casos. En conjunto, esta Tesis representa un avance en la optimización del cultivo de microsporas en estas especies y arroja luz sobre el papel de algunos procesos en el contexto de embriogénesis de microsporas. / [CA] Els dobles haploides són una gran eina en millora vegetal per a la producció d'híbrids, a causa de la seua total homozigosi, que es pot aconseguir en només una generació in vitro. Entre les diverses tècniques que s'utilitzen per tal d'obtenir aquestes plantes, la inducció de l'embriogènesi de microspores, mitjançant cultiu d'anteres o microspores, és la més comuna i eficient. L'embriogènesi de microspores també és un exemple de la totipotència de les cèl·lules vegetals, capaços de reprogramar-se d'una via gametofítica a una via esporofítica, on proliferen de manera organitzada per crear un nou organisme. Com en moltes altres tecniques in vitro, s'han d'optimitzar les condicions del cultiu per tal d'augmentar l'eficiència. En la present Tesi Doctoral, hem utilitzat dues espècies de plantes com a sistemes experimentals per estudiar i optimitzar el cultiu de microspores. Per una banda, hem utilitzat l'albergínia (Solanum melongena) com a exemple de cultiu d'importància econòmica on els protocols encara tenen marge per a l'optimització. La optimització de la densitat de cèl·lules en cultiu i la concentració de reguladors de creixement van demostrar ser útils per modificar l'eficiència de la resposta dels cultius de microspores d'albergínia. D'altra banda, hem utilitzat cultius de microspores de Brassica napus principalment per a estudis bàsics, ja que s'utilitza àmpliament com a model per entendre els processos cel·lulars que es produeixen durant aquest canvi de desenvolupament. Es detalla un protocol estandarditzat per al cultiu de microspores de B. napus, que s'ha utilitzat en tots els cultius inclosos en aquesta Tesi per explorar una sèrie de processos i estructures cel·lulars potencialment implicades en el canvi de desenvolupament cap a l'embriogènesi. Aquests inclouen l'estrès del reticle endoplasmàtic, la mort cel·lular programada, l'autofàgia i l'estructura i composició de la paret cel·lular. Vam estudiar en paral·lel cultius de microspores de dos genotips de B. napus amb diferent resposta androgènica, cultivats en condicions estàndard i afegint-hi Tricostatina A, un modulador epigenètic que s¿ha demostrat beneficiós per a la resposta androgènica en alguns casos. En conjunt, aquesta Tesi representa un avanç en l'optimització dels cultius de microsporas en aquestes espècies i aporta llum sobre el paper d'alguns processos en el context de l'embriogènesi de microspores. / [EN] Doubled haploids are a great tool for hybrid breeding due to their complete homozygosity achievable in only one in vitro generation. Among the several techniques used to obtain these plants, induction of microspore embryogenesis, via anther or microspore culture, is the most common and efficient approach. Microspore embryogenesis is also an example of totipotency of plant cells due to their ability to reprogram themselves from a gametophytic to a sporophytic pathway, where cells proliferate in an organized way to create a new organism. As in many other in vitro procedures, culture conditions must be optimized in order to increase efficiency. In the present Doctoral Thesis, we used two plant species as experimental systems to study and optimize microspore culture. On one hand, we used eggplant (Solanum melongena) as an example of economically important crop where protocols have still room for optimization. Optimization of cell density and growth regulators demonstrated to be useful to modify the efficiency of eggplant microspore cultures. On the other hand, we used B. napus microspore cultures principally for basic studies since it is widely used as a model to understand cellular processes occurring during this developmental switch. A standardized protocol for Brassica napus microspore culture is detailed, which was used in all the cultures included in this Thesis to explore a series of processes and cellular structures potentially involved in the developmental switch towards embryogenesis. These included endoplasmic reticulum stress, programmed cell death, autophagy, and cell wall structure and composition. We studied in parallel microspore cultures from two B. napus genotypes with different androgenic response cultured in standard conditions and adding Trichostatin A, a epigenetic modulator shown to be beneficial for the androgenic response in some cases. Together, this Thesis represents an advance in the optimization of microspore cultures in these species, and sheds light on the role of some processes within the context of microspore embryogenesis. / Thanks are due to the Electron Microscopy Service of Universitat Politècnica de València, Marisol Gascón (IBMCP Microscopy Service). This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MICINN jointly funded by FEDER and by a Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (656579) to PC-M This work was supported by grant AGL2017-88135-R to JMSS from MINECO jointly funded by FEDER. / Camacho Fernández, C. (2021). Microspore embryogenesis: cell wall dynamics and reprogramming of cell fate [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/163698 / TESIS

Las pérdidas causadas por podredumbres durante la post-cosecha de frutos cítricos suelen suponer entre un 5 y un 10 % de la producción, siendo Penicillium digitatum el principal hongo patógeno, responsable de hasta el 80 % de las pérdidas causadas por podredumbres en frutos almacenados a temperatura ambiente. A pesar de la importancia económica de este patógeno nuestro conocimiento sobre los mecanismos de patogenicidad/ virulencia son muy escasos, en contraste con el avance experimentado en los últimos años en el conocimiento de las respuestas de defensa del fruto a la infección por este patógeno. Así, en el grupo de Fisiología y Biotecnología Postcosecha del IATA se está trabajando en la caracterización a nivel bioquímico y molecular de las respuestas de los frutos cítricos frente a la infección por P. digitatum y en el proceso de inducción de resistencia en frutos cítricos frente a la infección. Por este motivo en esta Tesis se han desarrollado un conjunto de herramientas esenciales para poder abordar la caracterización funcional de genes involucrados en virulencia/patogenicidad: transformación de P. digitatum mediada por Agrobacterium tumefaciens, utilización de la proteína verde fluorescente como marcadora, metodología para la obtención de mutantes de deleción de genes específicos, incluyendo mutantes nulos ¿ku80, vectores para silenciamiento génico mediante RNAi y la construcción de una genoteca de DNA genómico de P. digitatum. Se ha secuenciado y analizado el factor de transcripción PacC, que controla la expresión de un grupo de genes regulados por el pH ambiental. En P. digitatum se produce una acidificación del medio para adaptarlo al pH óptimo de su arsenal de enzimas. Se han obtenido mutantes de expresión constitutiva de PacC que presentan una disminución la capacidad infectiva en un 20 %. Mediante el empleo de técnicas de alto rendimiento se ha construido una genoteca substractiva de cDNA para obtener fragmentos de genes de P. digitatum que se inducen durante la infección de frutos de naranja y se ha analizado la expresión génica de los mismos y se ha elaborado una macromatriz conteniendo más de 1330 clones de la genoteca. El grupo de genes con mayor representación en la genoteca y con altos valores de inducción, corresponde a genes que codifican cinco proteasas diferentes. Además, en la genoteca substractiva también hay una alta representación de genes que codifican enzimas de degradación de la pared celular, y otras proteínas implicadas en glucólisis, respuesta a estrés o detoxificación. La ya demostrada importancia de las enzimas de degradación de la pared celular en la virulencia de hongos fitopatógenos, su abundancia y niveles de inducción en la macromatriz nos llevaron a estudiar más en profundidad algunos de estos genes (dos poligalacturonasas y una pectin liasa). Para comprobar su implicación en el proceso de infección se secuenciaron y se obtuvieron mutantes de P. digitatum en los que se eliminó el gen. La disminución de la virulencia de estos mutantes sobre frutos de naranja con respecto a la cepa silvestre fue de aproximadamente un 25 %. Del conjunto de genes relacionados con el metabolismo redox se seleccionó por su patrón de expresión el gen ris1, que codifica una naftaleno dioxigenasa posiblemente implicada en la detoxificación de compuestos aromáticos. A diferencia de los mutantes nulos en los genes de las poligalacturonasas o de la pectin liasa, los mutantes nulos ¿ris1 no presentaron ninguna alteración en su capacidad patogénica. / López Pérez, M. (2013). Estudio de los factores de patogenicidad/virulencia de Penicillium digitatum sobre frutos cítricos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34176