Resumo: O gene GPD2 de Saccharomyces cerevisiae, que codifica a enzima glicerol-3- fosfato desidrogenase (G3PDH; EC 1.1.1.8; NAD+: oxidoredutase) foi clonado na levedura Pichia pastoris para expressar extracelularmente a enzima em meio de cultura. Essa enzima apresenta aplicação prática em diversos sistemas acoplados para determinação quantitativa de triacilglicerol, glicerol, ácido fosfatídico e outros fosfolipidios também podendo ser usada para medir atividades enzimáticas em diversos tipos de amostras. Para que a atividade extracelular fosse suficiente em ensaios industriais e biológicos, um estudo de indução da expressão da enzima foi realizado no presente trabalho, que consistiu em escolher o clone que melhor secreta a enzima e estudar o meio de crescimento (BMGY), a densidade inicial celular (0,05 mg/mL), o meio de indução enzimática (BMMY), a natureza do tampão (tampão fosfato), o pH (6,0), o tempo de produção da proteína (4 dias), a concentração da enzima através de membrana filtrante (120 vezes), a melhor fonte de peptona (Acumédia), o estudo de pré-indução celular por estresse osmótico (atividade de 0,477 ± 0,0 U/mL em 24 horas com NaCl 0,35M). O processo de produção da G3PDH mostrou que a máxima produtividade enzimática (795 U/mL e atividade específica de 44,49 U/mg) e biomassa final de 17,75 mg/mL foi obtida com as seguintes condições experimentais: 48 horas de indução com meio BMMY, utilizando 1% de metanol, 1% de glicerol, densidade inicial celular de 0,05 mg/mL, pH 5,0 e sobrenadante concentrado 120 vezes em membrana filtrante. / Abstract: The GPD2 gene from Saccharomyces cerevisiae, which encodes the enzyme glycerol-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH, EC 1.1.1.8, NAD +: oxidoredutase) was cloned in the yeast Pichia pastoris to express the enzyme extracellularly in the culture medium. The enzyme G3PDH has practical application in various systems coupled to quantitative determination of triacylglycerol, glycerol, phosphatidic acid and other phospholipids. It can also be used to measure the enzymatic activities in diverse types of samples. For the application of the enzyme extracellular in industrial and biological tests, a study of induction of expression of the enzyme was accomplished in the present work, that consisted of to choose of clone that more expressing the enzyme, the growth medium (BMGY), the cellular initial density (0.05 mg/mL), the medium of enzymatic induction (BMMY), the buffer nature (phosphate potassium), pH (6.0), the time of production of the protein (4 days), the concentration of the protein (120-fold), the peptone source (Acumédia), the study of pre-induction cellular for osmotic stress (activity of 0.477 ± 0.0 U/mL in 24 hours with NaCl 0.35M). The study of the variable determinative in the process of production of the G3PDH it showed that the maximum enzymatic productivity (0.795 U/mL and 44.49 U/mg of specific activity) and final biomass of 17.75 mg/mL was obtained with the following experimental conditions: 48 hours of induction with medium BMMY, using 1% methanol, 1% glycerol, cellular initial density of 0.05mg/mL, pH 5.0 and the supernatant concentrated 120-fold in filter menbrane. / Orientador: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Coorientador: Maristela de Freitas Sanches Peres / Banca: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Banca: José Roberto Ernandes / Banca: Luiz Henrique Souza Guimarães / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Adalberto Pessoa Junior / Banca: Mario Tyago Murakami / Banca: Gustavo O. Bonilla Rodriguez / Banca: Aliandra Maura Gibertoni Malaman / Resumo: Os microrganismos termofilicos são de grande interesse biotecnológico, não apenas por tolerar altas temperaturas, mas também por secretarem proteínas de maior estabilidade, com características bioquímicas e estruturais importantes de múltiplas aplicações na indústria. A linhagem do fungo termofílico Myceliophthora heterothallica F.2.1.4, isolada de camas de frango, apresentou alta atividade da enzima β-1,4-endoglucanase (31 U/ml). O gene codificante da β-1,4-endoglucanase de F.2.1.4 foi identificado e expresso em leveduras Pichia pastoris e em bactéria Escherichia coli. A caracterização do gene permitiu identificar esta enzima como membro da família glicosídeo hidrolase 5 (GH5), nomeada neste estudo como Mh_GH5. A enzima apresenta na região N-terminal um módulo de ligação ao substrato (CBM) pertencente a família 1. As enzimas expressas em P. pastoris e em E. coli foram purificadas e submetidas à caracterização bioquímica. A caracterização bioquímica demonstrou que as enzimas recombinantes apresentaram ótimos de temperatura de 55°C (P. pastoris) e 60°C (E. coli) e pH ótimo de 4,0 para ambos os sistemas heterólogos. A análise da estabilidade das enzimas demonstrou que as enzimas expressas por Pichia pastoris apresentaram-se estáveis em temperaturas mais elevadas (70°C), indicando que a glicosilação teria papel essencial na termoestabilidade de enzimas recombinantes. A determinação estrutural em alta resolução foi realizada para o domínio catalítico desta nova β-1,4-endoglucanase GH5 de M. heterothallica expressa em E. coli. A estrutura foi determinada à 1.1 Å e apresenta uma arquitetura frequentemente encontrada dentre os membros da família de GH5, (β/α)8 TIMbarrel. Os dados obtidos neste estudo podem contribuir para a determinação de características envolvidas na termoestabilidade de enzimas provenientes de... / Abstract: Thermophilic microorganisms have gain attention in the last years because of the biotechnological interest. Essentially these organisms secrete thermostable proteins displaying suitable features, such as biochemical and structural, for industrial platforms. The thermophilic fungus Myceliophthora heterothallica F.2.1.4, isolated from poultry litter, showed high activity for β-1,4- endoglucanase (31 U/ml). A new sequence enconding for glycoside hydrolase was identified and expressed in Pichia pastoris and Escherichia coli. Sequence analysis allowed to classify this new β-1,4-endoglucanase as a member of the glycoside hydrolase 5 (GH5). The enzyme, named Mh_GH5, has N-terminal family 1 carbohydrate binding module (CBM1). The recombinant enzymes expressed in Pichia pastoris and Escherichia coli were purified and subjected to biochemical characterization. Recombinant endoglucanases showed optimal temperature of 55°C (P. pastoris) and 60°C (E. coli) and optimal pH of 4,0 for both heterologous systems. The thermostability of these new enzymes were evaluated and demonstrated that post-translational modifications, such as glycosylation, found on Pichia pastoris heterologous enzymes, contributed to higher thermostability. Structural analysis of the catalytic domain of the new GH5 from M. heterothallica expressed in E. coli was solved at 1.1 Å resolution and shows a common (β/α)8 TIM-barrel fold found in members of GH5 family. Based on the biochemical and structural information we have obtained for Mh_GH5 it is possible to suggest potential features involved in the thermostability of proteins from thermophilic microorganisms and might contribute for the development of new efficient biocatalysts required for biomass conversion to bioethanol and/or ... / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-26Bitstream added on 2014-06-13T20:16:38Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_mcm_me_jabo.pdf: 755871 bytes, checksum: 00a7ca290b99eaeb7742fdd22cdc3c6c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A glicoproteína S1 do vírus da broquite infecciosa (VBI) além de ser altamente variável é responsável pela adsorção com os receptores das células hospedeiras e pela indução de anticorpos vírus-neutralizantes e inibidores da hemaglutinação em galinhas. A disponibilidade desse tipo de proteína pode contribuir com o imunodiagnóstico e com a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa aviária. O presente estudo foi conduzido com a finalidade de fazer a clonagem e a expressão do gene da glicoproteína S1 derivada da estirpe M41 do VBI no sistema constituído pelo vetor pFLDa – Picchia pastoris. O cDNA completo do gene S1 foi preparado a partir do RNA extraído do líquido alantóide infectado com a estirpe M41 do VBI e o amplicon obtido pela PCR foi clonado no vetor de expressão pFLDa. O plasmídeo foi linearizado e usado na transformação da linhagem GS115 de Picchia pastoris por eletroporação. Foi avaliada a influência da composição do meio de cultura sobre a produção de biomassa e a expressão da proteína recombinante S1 durante a fase de indução. A produção da proteína S1 recombinante foi detectada somente no compartimento intracelular, embora o vetor pFLDa seja capaz de direcionar a síntese de uma proteína heteróloga para a via secretora. A proteína recombinante foi caracterizada imunoquimicamente como uma banda de aproximadamente 90 kDa e com reatividade específica para os anticorpos monoclonais anti-polihistidina. Concluindo, o sistema hospedeiro de células da levedura P. pastoris com o vetor pFLDa usado nesse estudo comprovou ser um método eficaz para a produção no compartimento intracelular da proteína recombinante S1 da estirpe M41 do VBI, com potencial para futura utilização em técnicas de imuno-diagnóstico da bronquite infecciosa aviária. / The glycoprotein (S1) of infectious bronchitis virus (IBV) has been shown to be highly variable and responsible for attachment to the receptor in host cellular membrane, induction of neutralizing and haemagglutination-inhibiting antibodies in chickens. Thus, the availability of such protein can contribute to the immuno-diagnosis and immunoprofilaxis of avian infectious bronchitis. The present study was carried out aiming to clone and to express the gene of S1 glycoprotein from M41 strain fo IBV in the system constituted by pFLDa vector – Picchia pastoris. Full length cDNA of IBV S1 glycoprotein was prepared from RNA extracted from infected allantoic fluid and the amplicon generated by PCR was cloned into yeast expression vector pFLDa to construct the plasmid of pFLDa - S1 - IBV. This plasmid was linearized and then transformed in Picchia pastoris GS115 by electroporation. The recombinant yeast clones were cultivated and selected. The influence of media composition on biomass and in the production of recombinant S1 during induction phase was studied. The production of recombinant S1 protein was detected only in the intra-cellular compartment, though the pFLDa vector would direct the synthesis for the secretor pathway. The recombinant protein was characterized by SDS-PAGE and Western-Blotting as a band of a molecular weight of approximately 90 kDa with specific reactivity against anti-Histidina monoclonal antibodies. The use of complex media promotes an increase in biomass, but no soluble S1 recombinant protein was produced. Concluding, the yeast system composed by pFLDa - P. pastoris was efficient to express intra-cellularly the recombinant S1 protein of M41 strain of IBV which has a potential to be used in the immuno-diagnosis of avian infectious bronchitis.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-06-10T19:08:01Z No. of bitstreams: 1 ArianeFerreiraLacerda_TESE.pdf: 2669795 bytes, checksum: 86dd6a13d7f026cc0544d3cb0e76e5f1 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-06-13T20:26:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ArianeFerreiraLacerda_TESE.pdf: 2669795 bytes, checksum: 86dd6a13d7f026cc0544d3cb0e76e5f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-13T20:26:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ArianeFerreiraLacerda_TESE.pdf: 2669795 bytes, checksum: 86dd6a13d7f026cc0544d3cb0e76e5f1 (MD5) Previous issue date: 2015-06-30 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / A inefic?cia de pesticidas qu?micos no controle de fungos fitopatog?nicos na agricultura e a frequente incid?ncia de doen?as humanas causadas por bact?rias resistentes a antibi?ticos levam ? busca por compostos antimicrobianos alternativos. Neste contexto, defensinas vegetais constituem uma promissora ferramenta no controle de agentes patog?nicos tanto de plantas quanto de humanos. Defensinas de plantas s?o pept?deos cati?nicos com aproximadamente 50 res?duos de amino?cidos, ricas em ciste?nas e cuja estrutura tridimensional ? bastante conservada entre as diferentes esp?cies vegetais. Estas mol?culas de a??o antimicrobiana representam um importante componente inato da resposta de defesa vegetal contra pat?genos e s?o expressas em diversos tecidos da planta, como folhas, tub?rculos, flores, vagens e sementes. O presente trabalho teve por finalidade a avalia??o da atividade antimicrobiana de duas defensinas vegetais contra diferentes esp?cies de fungos fitopatog?nicos e bact?rias patog?nicas ao homem. A defensina Drr230a, cujo gene foi isolado de ervilha (Pisum sativum) e a defensina CD1, cujo gene foi identificado no transcriptoma de caf? (Coffea arabica) foram subclonadas em vetor de express?o de levedura e expressas em Pichia pastoris. O gene cd1 foi subclonado em duas formas recombinantes: CD1tC, contendo uma sequ?ncia codificante para seis histidinas (6xHis) na regi?o C-terminal do pept?deo e CD1tN, contendo sequ?ncia codificante para 6xHis na regi?o N-terminal. No caso da defensina Drr230a, a sequ?ncia codificante para 6xHis foi inserida apenas na regi?o N-terminal da prote?na. Ensaios de atividade antimicrobiana das prote?nas recombinantes purificadas rDrr230a e rCD1 contra Phakopsora pachyrhizi, agente causal da ferrugem asi?tica da soja, foram realizados para analisar a inibi??o da germina??o de esporos in vitro e a severidade da doen?a causada pelo fungo in planta. As duas defensinas recombinantes testadas foram capazes de inibir a germina??o de uredosporos de P. pachyrhizi, n?o havendo diferen?a entre a a??o antimicrobiana de CD1tC e CD1tN. Ademais, rDrr230a e rCD1 reduziram drasticamente a severidade da ferrugem asi?tica da soja, conforme demonstrado em ensaios in planta. Apesar de rCD1 n?o ter sido capaz de inibir a prolifera??o das bact?rias patog?nicas humanas Staplylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae, rCD1 mostrou-se capaz de inibir o crescimento do fungo fitopatog?nico Fusarium tucumaniae, causador da s?ndrome da morte s?bita da soja. Os resultados obtidos mostram que tais defensinas vegetais s?o candidatas ?teis para serem utilizadas em programas de engenharia gen?tica de plantas para controlar doen?as f?ngicas impactantes na agricultura. / The inefficiency of chemical pesticides to control phytopathogenic fungi in agriculture and the frequent incidence of human diseases caused by bacteria which are resistant to antibiotics lead to the search for alternative antimicrobial compounds. In this context, plant defensins are a promising tool for the control of both plant and human pathogenic agents. Plant defensins are cationic peptides of about 50 amino acid residues, rich in cysteine and whose tridimensional structure is considerably conserved among different plant species. These antimicrobial molecules represent an important innate component from plant defense response against pathogens and are expressed in various plant tissues, such as leaves, tubers, flowers, pods and seeds. The present work aimed at the evaluation of the antimicrobial activity of two plant defensins against different phytopathogenic fungi and pathogenic bacteria to humans. The defensin Drr230a, whose gene was isolated from pea (Pisum sativum), and the defensin CD1,whose gene was identified within coffee (Coffea arabica) transcriptome, were subcloned in yeast expression vector and expressed in Pichia pastoris. The gene cd1 was subcloned as two different recombinant forms: CD1tC, containing a six-histidine sequence (6xHis) at the peptide C-terminal region and CD1tN, containing 6xHis coding sequence at the N-terminal region. In the case of the defensin Drr230a, the 6xHis coding sequence was inserted only at the N-terminal region. Assays of the antimicrobial activity of the purified recombinant proteins rDrr230a and rCD1 against Phakopsora pachyrhizi, causal agent of soybean Asian rust, were performed to analyze the in vitro spore germination inhibition and disease severity caused by the fungus in planta. Both recombinant defensins were able to inhibit P. pachyrhizi uredospore germination, with no difference between the antimicrobial action of either CD1tC or CD1tN. Moreover, rDrr230a and rCD1 drastically reduced severity of soybean Asian rust, as demonstrated by in planta assays. In spite of the fact that rCD1 was not able to inhibit proliferation of the human pathogenic bacteria Staplylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae, rCD1 was able to inhibit growth of the phytopathogenic fungus Fusarium tucumaniae, that causes soybean sudden death syndrome. The obtained results show that these plant defensins are useful candidates to be used in plant genetic engineering programs to control agriculture impacting fungal diseases.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-18T13:46:49Z No. of bitstreams: 2 TESE Jackeline Gomes da Silva Araujo.pdf: 1816435 bytes, checksum: 302ef3838fff12047ef9cfd5cdd9cc4d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-18T13:46:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Jackeline Gomes da Silva Araujo.pdf: 1816435 bytes, checksum: 302ef3838fff12047ef9cfd5cdd9cc4d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / O Circovírus Suíno (CVS) é um vírus de DNA fita simples, que pertence à família Circoviridae, com genoma de 1,7kilobases. Apresenta dois tipos principais, o CVS1 e o CVS2. O CVS1 não é patogênico, enquanto que o CVS2 está associado a um conjunto de doenças como a Síndrome Multissistêmica do Definhamento de Suínos (SMDS). Estes tipos virais possuem a proteína Rep, essencial para replicação e a proteína Cap, formadora do capsídeo. A pCap possui epítopos imunoreativos e imunodominantes e tem sido utilizada como um antígeno tanto para o diagnóstico, quanto para aplicação vacinal, contra infecções causadas pelo CVS2. Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica que utiliza metanol como única fonte de carbono e tem sido utilizada para expressar genes heterólogos por apresentar vantagens como, a realização de modificações pós-traducionais e sua fácil manipulação. Objetivou-se nesse estudo expressar o gene Cap códon-otimizado do CVS2 para expressar em Pichia pastoris, visando a produção secretória da pCap e sua aplicação como antígeno recombinante em imunoensaios. Para tanto, a construção pPICZαA/CVS2Capo obtida após clonagem gênica foi inserida no genoma da levedura por eletroporação e o sistema foi induzido com metanol, sob o controle do promotor AOX1, por 72h. Os clones expressos positivamente foram identificados em Colony blot e Dot blot, após a reação dos clones com anticorpo-antiHis. A rCap foi detectada com massa molecular de ~39 kDa em sobrenadante da P. pastoris por SDS-PAGE e Western blot. Neste último, a detecção foi feita pelo reconhecimento da rCap por anticorpos anti-CVS2 de soros de animais com histórico de SMDS. A rCap testada em ELISA indireto contra soros de animais sabidamente negativos e positivos, previamente determinados pela imunoperoxidase (IP), mostrou alta eficiência discriminatória com alta razão positivo/negativo de 597. Após análise preliminar de parâmetros concordantes e discordantes, entre o IP e ELISA, observou-se uma alta concordância entre eles. Os resultados representam a efetiva produção da rCap pela via secretória de P. pastoris, com sugestiva preservação dos epítopos imunoreativos na mesma. Isto demonstra a viabilidade do sistema eucarioto de expressão utilizado e o potencial uso da rCap para detecção de anticorpos anti-CVS2 como ferramenta auxiliar no diagnóstico de doenças causadas pelo CVS2 como a SMDS.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-14T17:39:52Z No. of bitstreams: 1 Luciana Cavalcanti Arruda Coutinho.pdf: 1249795 bytes, checksum: d8c5b0923169bdb4b101bcf96c920d9f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-14T17:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana Cavalcanti Arruda Coutinho.pdf: 1249795 bytes, checksum: d8c5b0923169bdb4b101bcf96c920d9f (MD5) Previous issue date: 2011-02-22 / Equine Infectious Anemia (EIA) is an important lentivirose in horses, characterized by a chronic and degenerative profile, causing many economic losses. It is considered that animals exposed to the virus and underwent serological evidence, when considered positive, remain so throughout life, which justifies the great concern and disease surveillance. The aim of this study was to use Pichia pastoris yeast cells for protein production of p26 gag region of Equine Infectious Anemia Virus (EIAV) for diagnostic purposes. The p26 gene of EIAV was optimized through the codon usage strategy to be expressed in cells of the Pichia pastoris yeast. The insert was cloned into pPICZαA expression vector after appropriate enzymatic digestion. P. pastoris transformed with the construction pPICZαAp26 were induced to express the p26 recombinant protein under the regulation of AOX1 promoter by adding methanol to the culture medium. The p26 recombinant protein was identified by RT-PCR and Dot blotting assay using anti-His antibody. Further studies are needed to optimize bioprocesses involved in this system in order to obtain a stable, purified and useful antigen for diagnostic purposes. / A Anemia Infecciosa Equina (AIE) é uma importante lentivirose em equídeos, caracterizada por causar um quadro crônico e degenerativo, trazendo muitos prejuízos econômicos. Considera-se que animais expostos aos vírus e submetidos à prova sorológica, quando considerados positivos, assim permanecerão por toda vida, fato que justifica a grande preocupação e vigilância da doença. Neste trabalho objetivou-se utilizar células da levedura Pichia pastoris para produção da proteína p26 da região gag do vírus da anemia infecciosa equina (VAIE) para fins de diagnóstico. O gene da proteína p26 do VAIE foi sintetizado e otimizado por meio da utilização de códons preferenciais para ser expresso em célula da levedura Pichia pastoris. O inserto foi subclonado em vetor de expressão pPICZαA após digestão enzimática apropriada. Células de P. pastoris transformadas com a construção pPICZαAp26 foram induzidas a expressarem a proteína recombinante p26 sob regulação do promotor AOX1 através da adição de metanol ao meio de cultura. A análise quanto à produção da proteína recombinante e sua identificação foram realizadas através de RT-PCR e Dot blotting utilizando anticorpo anti-His.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-18T13:57:04Z No. of bitstreams: 1 Luiz Cosme da Silva Junior.pdf: 2139311 bytes, checksum: 61623be0472d19428bedbc6968b00716 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-18T13:57:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiz Cosme da Silva Junior.pdf: 2139311 bytes, checksum: 61623be0472d19428bedbc6968b00716 (MD5) Previous issue date: 2013-02-25 / Aujeszky's disease (AD) is caused by Suid Herpesvirus 1 (SHV1) and affects a wide variety of animals, the pig being the most important host. The DA has caused considerable direct and indirect economic losses to the pig industry worldwide, from the impact on production. The use of control measures using diagnostic test able to differentiate infected animals from vaccinated animals and removal of positive animals in the squad is key to controlling the spread of the virus. The use of vaccines for the gE gene deleted of SHV1 has been used to decrease clinical signs and virus transmission. Although some epitopes gE gene has already been cloned into the Pichia pastoris expression system, relative to the portion extramembranares epitopes using synthetic sequence (gEs) yeast codon optimized for this has not yet been cloned in this system. In this work this sequence was cloned and expressed in P. pastoris, which produced the recombinant antigen gEr. The gEs was cloned in strains X-33 and KM71H this yeast. The two strains were induced to express cloned gEr. The recombinant protein was detected in both clones by colony blot and visualized on SDS-PAGE gel, revealing a protein of approximately 50 kDa. / A Doença de Aujeszky (DA) é causada pelo Herpesvírus Suino 1 (SHV1), que acomete uma ampla variedade de animais, sendo o suíno o hospedeiro principal. A DA tem causado consideráveis perdas econômicas diretas e indiretas à indústria suinícola mundial, decorrentes do impacto na produção. O emprego de medidas de controle utilizando teste diagnóstico capaz de diferenciar os animais infectados dos animais vacinados e a retirada dos animais positivos do plantel é fundamental para controlar a disseminação do virus. O uso de vacinas deletadas para o gene gE do SHV1 tem sido utilizada para diminuir os sinais clínicos e a transmissão do vírus. Apesar de alguns epítopos do gene gE já terem sido clonados no sistema de expressão Pichia pastoris, a porção referente aos epítopos extramembranares, utilizando sequência sintética (gEs) códon otimizada para esta levedura, ainda não foi clonada neste sistema. Neste trabalho essa sequência foi clonada e expressa em P. pastoris, que produziu o antígeno recombinante gEr. O gEs foi clonado nas linhagens X-33 e KM71H dessa levedura. As duas linhagens clonadas foram induzidas a expressar gEr. A proteína recombinante foi identificada em ambos os clones por colloning blot e visibilizada em gel SDS-PAGE, revelando uma proteína de aproximadamente 50 kDa.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2827_1.pdf: 3255075 bytes, checksum: 22005ee118cfc8ca27010124cd458070 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Leveduras vêm sendo utilizadas como sistemas de expressão para produção de proteínas de interesse biotecnológico. Dentre as diversas aplicações das proteínas heterólogas, as produzidas com finalidade terapêutica e para diagnóstico clínico vêm recebendo grande destaque, como por exemplo, a lectina frutalina e a oncoproteína E7 do Papilomavírus Humano (HPV). A frutalina, lectina extraída das sementes da fruta-pão, tem sido descrita como importante ferramenta no diagnóstico do câncer devido ao seu tropismo com células tumorais. Enquanto, a oncoproteína viral do HPV, E7, por ser encontrada em células tumorais relacionadas à infecção pelo HPV, torna-se um importante alvo para o desenvolvimento de vacinas profiláticas e terapêuticas contra esta infecção. Neste trabalho utilizamos as leveduras Pichia pastoris KM71H e Pichia pastoris GS115 como sistemas de expressão para a produção das proteínas frutalina e E7 do HPV16, respectivamente. A influência da fonte de carbono e do estresse iônico na produção da enzima β-galactosidase pela Kluyveromyces lactis DSM 3795 foi avaliada em diferentes condições de cultivo. Neste trabalho os níveis de frutalina recombinante (13,4 mg.L-1), obtidos pelo processo de batelada alimentada, foi 4 vezes maior que em testes com frascos aerados e a suplementação com elementos traços permitiu o aumento de 2.5 vezes na produção da proteína recombinante. Enquanto, o gene de E7 do HPV16 foi corretamente clonado e integrado ao genoma da P.pastoris GS115, sendo produzido 218,9mg.L-1 da proteína E7 com o peso molecular de 27KDa. A avaliação da influência da fonte de carbono e do estresse iônico na atividade da enzima β-galactosidase pela K. lactis DSM 3795 permitiu selecionar a lactose como a fonte de carbono ideal, pois favoreceu maior atividade específica da enzima (271,0 U.mg-1). Enquanto que, os cátions Na+, K+, Mg2+ potencializaram a atividade da enzima (410,4; 440,1; and 734.71 U.mg-1, respectivamente), o Ca2+ inibiu parcialmente a produção da β-galactosidase. Por fim, apesar da P. pastoris ter se mostrado um sistema eficiente para a produção de proteína heterólogas, ela ainda apresenta algumas limitações. Dessa maneira, o desenvolver estratégias que permitam a otimização de vetores para a produção dessas proteínas, representa um importante alvo no desenvolvimento de produtos para o diagnóstico, prevenção e tratamento do câncer

Submitted by isabel silva (isabel_manaus@yahoo.com.br) on 2017-06-22T15:28:22Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-06-23T13:18:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-06-23T13:18:48Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-23T13:18:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) CLONAGEM E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA DE UMA LIPASE ISOLADA DE UMA BIBLIOTECA METAGENÔMICA DE TERRA PRETA DE ÍNDIO_Edson J1.pdf: 508907 bytes, checksum: 6b77566991052362063c90de82c2af97 (MD5) Previous issue date: 2017-04-05 / CAPES / The advancement of molecular technologies in the scientific field has enabled the development of various forms of access to the genetic material of organisms in order to locate, map, isolate, characterize and decode the target genes of a particular individual or a set of individuals coexisting in a specific environment. Metagenomic studies are very promising in several areas of biotechnology, such as the discovery of new molecules of industrial biotechnological interest, the investigation of new antibiotics and drugs, the bioremediation of environments impacted with toxic metals and the prospection of various enzymes. The objective of this work was characterize enzymatically a previously screened lipase enzyme from Metagenomic Library of Terra Preta de Índio. Lipase gene sequence was isolated from the metagenomic library and expressed in Pichia pastoris under control of PGK promoter. Recombinant lipase was characterized by hydrolysis activity of lipid substrates and synthesis ability in organic solvent. In silico analyzes infer the identification of extracellular lipase belonging to the lipase family, superfamily -hydrolase and lipase activity molecular function. Enzyme was efficiently produced in P. pastoris and recombinant lipase showed activity of 374.59 U/mL hydrolyzing p-nitrophenyl palmitate, Vmax (ap.) 143,4 U/mL.min-1, Km (ap.) 1,4 mM and Kcat (ap.) 103,7 S-1. Enzyme had maximum activity at pH 8.0, temperature 90 ºC and remained stable at high temperatures. Synthesis ability was evaluated by the formation of ethyl laurate by esterification reaction of lauric acid with ethanol, yielding 70% conversion in 45 minutes. Recombinant protein is characterized as an alkaline, thermotolerant, activated by calcium, EDTA e detergents. / O avanço das tecnologias moleculares no campo científico, possibilitou o desenvolvimento de diversas formas de acesso ao material genético dos organismos, de forma a ser possível localizar, mapear, isolar, caracterizar e decodificar os genes alvo de um indivíduo particular ou de um conjunto de indivíduos coexistentes em um ambiente específico. Estudos metagenômicos são bastante promissores em diversas áreas da biotecnologia, como nas descobertas de novas moléculas de interesse biotecnológico industrial, na investigação de novos antibióticos e fármacos, na biorremediação de ambientes impactados com metais tóxicos e na prospecção de enzimas diversas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar enzimaticamente uma enzima lipase previamente rastreada de uma Biblioteca Metagenômica de Terra Preta de Índio. A sequência correspondente ao gene de lipase foi isolada da biblioteca metagenômica, clonada e expressada em Pichia pastoris sob controle do promotor PGK. A lipase recombinante foi caracterizada pela atividade de hidrólise de substratos lipídicos e capacidade de síntese em solvente orgânico. Análises in silico da sequência proteica inferem a identificação de uma lipase extracelular pertencente à / - hidrolase e com função molecular para atividade lipásica. A enzima foi produzida eficientemente em P. pastoris e a lipase recombinante apresentou atividade de 374,59 U/mL hidrolisando p-nitrofenil palmitato, Vmax(ap.) 143,4 U/mL.min-1, Km(ap.) 1,4 mM e Kcat(ap.) 103,7 S-1. A enzima possuiu atividade máxima em pH 8,0, temperatura 90 ºC e se manteve estável em altas temperaturas. A capacidade de síntese foi avaliada pela formação de laurato de etila pela reação de esterificação do ácido láurico com etanol apresentando rendimento de 70% em 45 minutos de reação. A proteína recombinante se caracteriza como uma enzima alcalina, termotolerante, ativada por cálcio, EDTA e detergentes.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:04:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6203_1.pdf: 1326366 bytes, checksum: 5cd77ce2de56aff15acaf6fb51f8cd1f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Os papilomavírus constituem um grupo de pequenos vírus de DNA de dupla fita caracterizados por induzirem a formação de lesões que são em geral benignas, podendo regredir naturalmente ou se transformar em tumores malignos. Dentre eles se encontra o papilomavírus bovino (BPV). Até o momento são bem caracterizados seis diferentes tipos de BPV (BPV de 1-6) e recentemente outros dois novos tipos (BPVs 7 e 8) foram descritos. Na região Nordeste do Brasil, em especial no Estado de Pernambuco (região da Zona da Mata), a incidência de papilomatose bovina é muito alta provocando grandes perdas econômicas para os criadores. No momento não há tratamento com eficácia comprovada. A proteção contra infecção é conferida por anticorpos neutralizantes direcionados proteína estrutural L1. Estes anticorpos podem ser eficientemente induzidos por imunização com virus-like particles (VLP), que se formam espontaneamente após a expressão de L1 em vetores recombinantes. A levedura metilotrófica Pichia pastoris emergiu como um sistema heterólogo, eficiente e de baixo custo para a produção de proteínas. Neste trabalho foi avaliada a produção da proteína L1 de BPV-4 por células de P. pastoris. O gene L1 foi amplificado e clonado no vetor de expressão pPICZA (Invitrogen). As células de P. pastoris foram transformadas com pPICZAL1B4. Os transformantes de P. pastoris obtidos foram analisados para expressão do gene L1 por RT-PCR e Dot blot. Os transformantes analisados mostraram transcrição do gene L1 e conseqüente produção da proteína