Durante uma infecção o número de linfócitos T aumenta dramaticamente. A fase de expansão clonal é seguida pela redução do nível de células T ativadas que depende, em parte, de um processo de morte celular induzida por ativação (AICD). Nosso grupo mostrou que APCs quando são estimuladas com LPS, um agonista de TLR4, produzem PGE2, que inibe a AICD de linfócitos T CD4+ através da supressão da expressão de CD95L (Weinlich et al, 2008). Porém, os efeitos da estimulação direta de TLR nos linfócitos T sobre o processo de AICD foram pouco elucidados. Sendo assim, o projeto tem como objetivo verificar se a estimulação dos diversos TLRs com seus agonistas é capaz de modular a AICD de hibridomas de linfócito T DO11.10. Inicialmente, demonstramos que este hibridoma expressa os TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 e 11. Dentre todos os agonistas utilizados somente o Imiquimod, um agonista de TLR7, reduziu a morte celular quando adicionado durante a indução de AICD. O efeito protetor desse agonista foi através da inibição da expressão de CD95L, tanto no nível de mRNA quanto protéico. / During an infection the number of T lymphocytes increases dramatically. The clonal expansion phase is followed by reducing the level of activated T cells that depends, in part, a process of cell death induced by activation (AICD). Our group showed that when APCs are stimulated with LPS, a TLR4 agonist, produce PGE2, which inhibits the AICD of CD4 + T cells by suppressing the expression of CD95L (Weinlich et al, 2008). However, the effects of direct stimulation of TLR on T cells on the process of AICD were little explained. Therefore, the project aims to determine whether the stimulation of different TLRs to their agonist is able to modulate AICD of T lymphocyte hybridoma DO11.10. Initially, we demonstrated that this hybridoma expresses TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 and 11. Among all agonists used only imiquimod, a TLR7 agonist, reduced cell death when added during the induction of AICD. The protective effect of this agonist was by inhibiting the expression of CD95L, both at the mRNA and protein.

La presencia de microorganismos patógenos en alimentos es uno de los problemas esenciales en salud pública, y las enfermedades producidas por los mismos es una de las causas más importantes de enfermedad. Por tanto, la aplicación de controles microbiológicos dentro de los programas de aseguramiento de la calidad es una premisa para minimizar el riesgo de infección de los consumidores. Los métodos microbiológicos clásicos requieren, en general, el uso de pre-enriquecimientos no-selectivos,enriquecimientos selectivos, aislamiento en medios selectivos y la confirmación posterior usando pruebas basadas en la morfología, bioquímica y serología propias de cada uno de los microorganismos objeto de estudio. Por lo tanto, estos métodos son laboriosos, requieren un largo proceso para obtener resultados definitivos y, además, no siempre pueden realizarse. Para solucionar estos inconvenientes se han desarrollado diversas metodologías alternativas para la detección identificación y cuantificación de microorganismos patógenos de origen alimentario, entre las que destacan los métodosinmunológicos y moleculares. En esta última categoría, la técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en la técnica diagnóstica más popular en microbiología, y recientemente, la introducción de una mejora de ésta, la PCR a tiempo real, ha producido una segunda revolución en la metodología diagnóstica molecular, como pude observarse por el número creciente de publicaciones científicas y la aparición continua de nuevos kits comerciales. La PCR a tiempo real es unatécnica altamente sensible -detección de hasta una molécula- que permite la cuantificación exacta de secuencias de ADN específicas de microorganismos patógenos de origen alimentario. Además, otras ventajas que favorecen su implantación potencial en laboratorios de análisis de alimentos son su rapidez, sencillez y el formato en tubo cerrado que puede evitar contaminaciones post-PCR y favorece la automatización y un alto rendimiento. En este trabajo se han desarrollado técnicas moleculares (PCR y NASBA) sensibles y fiables para la detección, identificación y cuantificación de bacterias patogénicas de origen alimentario (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y Salmonella spp.). En concreto, se han diseñado y optimizado métodos basados en la técnica de PCR a tiempo real para cada uno de estos agentes: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, y también se ha optimizado yevaluado en diferentes centros un método previamente desarrollado para Salmonella spp. Además, se ha diseñado y optimizado un método basado en la técnica NASBA para la detección específica de M. avium subsp. paratuberculosis. También se evaluó la aplicación potencial de la técnica NASBA para la detección específica de formas viables de este microorganismo. Todos los métodos presentaron una especificidad del 100 % con una sensibilidad adecuada para su aplicación potencial a muestras reales de alimentos. Además, se han desarrollado y evaluado procedimientos de preparación de las muestras en productos cárnicos, productos pesqueros, leche y agua. De esta manera se han desarrollado métodos basados en la PCR a tiempo real totalmente específicos y altamente sensibles para la determinación cuantitativa de L. monocytogenes en productoscárnicos y en salmón y productos derivados como el salmón ahumado y de M. avium subsp. paratuberculosis en muestras de agua y leche. Además este último método ha sido también aplicado para evaluar la presencia de este microorganismo en el intestino de pacientes con la enfermedad de Crohn's, a partir de biopsias obtenidas de colonoscopia de voluntarios afectados.En conclusión, este estudio presenta ensayos moleculares selectivos y sensibles para la detección de patógenos en alimentos (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) y para una rápida e inambigua identificación de Salmonella spp. La exactitud relativa de los ensayos ha sido excelente, si se comparan con los métodos microbiológicos de referencia y pueden serusados para la cuantificación de tanto ADN genómico como de suspensiones celulares. Por otro lado, la combinación con tratamientos de preamplificación ha resultado ser de gran eficiencia para el análisis de las bacterias objeto de estudio. Por tanto, pueden constituir una estrategia útil para la detección rápida y sensible de patógenos en alimentos y deberían ser una herramienta adicional al rango de herramientas diagnósticas disponibles para el estudio de patógenos de origen alimentario. / The presence of pathogens in foods is among the most serious public health concerns, and the diseases produced by them are a major cause of morbidity. Consequently, the application of microbiological control within the quality assessment programs in the food industry is a premise to minimize the risk of infection for the consumer. Classical microbiological methods involve, in general, the use of a non-selective pre-enrichment, selective enrichment, isolation on selective media, and subsequent confirmation using morphological, biochemical and/or serological tests. Thus, they are laborious, time consuming and not always reliable (e.g. in viable but non-culturable VBNC forms). A number of alternative, rapid and sensitive methods for the detection, identification and quantification of foodborne pathogens have been developed to overcome these drawbacks. PCR has become the most popular microbiological diagnostic method, and recently, the introduction of a development of this technique, RTi-PCR, has produced a second revolution in the molecular diagnostic methodology in microbiology. RTi-PCR is highly sensitive and specific. Moreover, it allows accurate quantification of the bacterial target DNA. Main advantages of RTi-PCR for its application in diagnostic laboratories include quickness, simplicity, the closed-tube format that avoids risks of carryover contaminations and the possibility of high throughput and automation.In this work, specific, sensitive and reliable analytical methods based on molecular techniques (PCR and NASBA) were developed for the detection, identification and quantification of foodborne pathogens (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and Salmonella spp.). Real-time PCR based methods were designed and optimised for each one of these target bacteria: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, and also a real-time PCR basedmethod previously described for Salmonella spp. was optimised and multicenter evaluated. In addition, an NASBA-based method was designed and optimised for the specific detection of M. avium subsp. paratuberculosis. The potential application of the NASBA technique for specific detection of viable M. avium subsp. paratuberculosis cells was also evaluated.All the amplification-based methods were 100 % specific and the sensitivity achieved proved to be fully suitable for further application in real food samples. Furthermore, specific pre-amplification procedures were developed and evaluated on meatproducts, seafood products, milk and water samples. Thus, fully specific and highly sensitive real-time PCR-based methods were developed for quantitative detection of L. monocytogenes on meat and meat products and on salmon and cold smoked salmon products; and for quantitative detection of M. avium subsp. paratuberculosis on water and milk samples. The M. avium subsp. paratuberculosis-specific real-time PCR-based method was also applied to evaluate the presence of this bacterium in the bowelof Crohn's disease patients using colonic biopsy specimens form affected and unaffected volunteers. In addition, fully specific and highly sensitive real-time NASBA-based methods were developed for detection of M. avium subsp. paratuberculosis on water and milk samples.In conclusion, this study reports selective and sensitive amplification-based assays for the quantitative detection of foodborne pathogens (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and) and for a quick and unambiguously identification of Salmonella spp. The assays had an excellent relative accuracy compared to microbiological reference methods and can be used for quantification of genomic DNA and also cell suspensions. Besides, in combination with sample pre-amplification treatments,they work with high efficiency for the quantitative analysis of the target bacteria. Thus, they could be a useful strategy for a quick and sensitive detection of foodborne pathogens in food products and which should be a useful addition to the range of diagnostic tools available for the study of these pathogens.

La enfermedad más grave de la etapa larval de las abejas (Apis mellifera L.) es la loque americana, causada por la bacteria esporulada Gram (+) Paenibacillus larvae. Es muy contagiosa y posee problemas únicos para su prevención y control debido a que las esporas bacterianas mantienen su capacidad infectiva durante tiempo prolongado y sobreviven bajo condiciones ambientales adversas, no existiendo brotes estacionales ya que se manifiesta en cualquier época del año con la condición que haya cría presente en la colmena. La enfermedad tiene difusión mundial y aparece en la lista de enfermedades de la OIE (Office International des Epizooties - Organización Mundial de la Salud Animal), que incluye enfermedades transmisibles que son consideradas de impacto socio-económico y/o de importancia para la salud pública entre países y que influyen negativamente en el comercio internacional de animales y productos de origen animal. En la Argentina se la detectó por primera vez en 1989 y actualmente está ampliamente diseminada en todas las áreas productoras de miel. Con el objeto de estudiar la diversidad de Paenibacillus larvae se aplicaron procedimientos de microbiología clásica y de biología molecular para caracterizar una colección de 455 cepas del patógeno. El cepario de trabajo se conformó con 106 aislamientos obtenidos de larvas de abejas con síntomas de la enfermedad, con 307 cepas aisladas de mieles contaminadas de distintos orígenes geográficos, 21 cepas provistas por otros laboratorios y 21 cepas de Colecciones Internacionales. Se identificaron 54 aislamientos de restos larvales y/o escamas con síntomas clínicos de la enfermedad y 252 aislamientos de mieles provenientes de distintas localidades de la Argentina. A partir de material de panales con síntomas clínicos remitidos por investigadores de otros países, se obtuvieron 52 aislamientos conformados por 3 aislamientos de Alemania, 5 de Francia, 5 de Italia, 9 de N. Zelanda, 6 de Polonia, 11 de Sudáfrica, 4 de Suecia, 1 de Túnez y 8 de Uruguay. Adicionalmente se aislaron 18 cepas de mieles de Italia, 17 de mieles de EE.UU., 7 de mieles de Francia, 5 de mieles de España, 3 de mieles de Canadá, 2 de mieles de Sudáfrica, 1 de miel de Brasil, 1 de miel de Túnez y 1 de miel de Panamá conformando un total de 55 cepas obtenidas de mieles de otros países productores. Fueron recibidas como cultivo 42 cepas: 2 de Argentina, 2 de Bélgica, 2 de Chile, 2 de Japón, 3 de Inglaterra, 4 de República Checa, 10 de EE.UU. y 13 de origen desconocido. Si bien la colección estuvo integrada por un alto número de cepas provenientes de Argentina (n= 308) el trabajo se realizó también sobre un número considerable de cepas (n=147) de otros orígenes que resultó adecuado para los estudios de diversidad. Adicionalmente, con el fin de incluir controles, se emplearon 5 cepas de Colecciones Internacionales que en la actualidad se clasifican como Paenibacillus larvae pero que pertenecían a la anterior subespecie Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens (1 de EE.UU., 1 de Canadá, 1 de Francia y 2 de origen desconocido). Otras cepas de este grupo proveniente de EE.UU. fueron gentilmente cedidas por el Dr. D. P. Stahly para los estudios con el bacteriófago PPL1c del capítulo III. Se constituyó un segundo cepario con una colección de 282 aislamientos bacterianos de otras especies esporuladas aerobias conformado por 129 aislamientos de Bacillus cereus, 62 de Paenibacillus alvei, 52 de Bacillus megaterium, 8 de Bacillus mycoides, 6 de Bacillus subtilis, 6 de Lysinibacillus sphaericus, 5 de Bacillus thuringiensis, 5 de Brevibacillus laterosporus, 5 de Bacillus circulans, 2 de Bacillus licheniformis, 1 de Bacillus polymyxa y 1 de Bacillus pumilus. Adicionalmente, se emplearon 41 cepas recibidas de Colecciones Internacionales y pertenecientes a distintas especies de los géneros Paenibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Lysinibacillus y Virgibacillus. En el Capítulo II se caracterizaron las 455 cepas de Paenibacillus larvae mediante técnicas microbiológicas. El agregado de ácido nalidíxico al medio de cultivo a una concentración final de 9 µg/ml resultó adecuado para la obtención de cultivos puros de Paenibacillus larvae evitando el sobredesarrollo del saprobio Paenibacillus alvei comúnmente presente en las larvas de abejas. Con respecto a los aislamientos provenientes de muestras de mieles, el agregado de la combinación de antibióticos ácido nalidíxico y ácido pipemídico al medio MYPGP permitió obtener colonias de Paenibacillus larvae y mayormente inhibió el desarrollo de otras especies esporuladas presentes en este tipo de muestras, ya que más del 80% de las muestras analizadas contenía más de una especie bacteriana resistente al tratamiento de shock térmico de 80 °C. Independientemente del origen geográfico y/o floral de las mieles analizadas aquí, las especies esporuladas aerobias encontradas con mayor frecuencia han sido Paenibacillus larvae, Paenibacillus alvei, Bacillus cereus, Bacillus megaterium y Bacillus pumilus. Paralelamente y, en menor proporción, se hallaron cepas de Brevibacillus laterosporus, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Paenibacillus polymyxa, Lysinibacillus sphaericus y Bacillus licheniformis. Mientras que Paenibacillus larvae y Paenibacillus alvei están asociados con enfermedades de las abejas, Bacillus cereus y Bacillus megaterium son especies ubicuas frecuentes en todo tipo de suelos, sus esporas sobreviven la distribución en polvos y aerosoles siendo vehiculizadas desde estos lugares a otros hábitats como las superficies florales. Paralelamente, Bacillus megaterium junto con Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Bacillus circulans y Paenibacillus alvei son las especies predominantes en los tractos digestivos de larvas, abejas adultas y heces de las mismas. También en este capítulo, se determinó que la configuración superficial de las esporas bacterianas vistas al MEB resultó coincidente con lo descripto por otros autores para cada una de las especies analizadas. En el capítulo III se demostró que el bacteriófago PPL1c resultó una herramienta útil para la identificación y diferenciación rápida de cepas de Paenibacillus larvae, como complemento de otras características fenotípicas. El fago mostró ser altamente específico a nivel de especie encontrándose un 98 % de cepas de Paenibacillus larvae susceptibles al mismo mientras que el resto de las especies de Paenibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Lysinibacillus y Virgibacillus resultaron resistentes. En el capítulo IV se estableció que la técnica de rep-PCR resultó adecuada para determinar la variabilidad de las poblaciones de Paenibacillus larvae dónde se halló una alta homogeneidad genética. El empleo de los cebadores BOX y REP reveló la existencia de 4 perfiles de fingerprints a los cuales denominamos A, B, C y D respectivamente, mientras que las cepas de colección pertenecientes al ex. grupo pulvifaciens mostraron el perfil distintivo E. Cuando se emplearon los cebadores ERIC, con excepción de algunas cepas provenientes de Colecciones Internacionales, todos los aislamientos obtenidos de larvas y mieles presentaron un perfil ERIC-I coincidente con lo descripto también por otros investigadores y sólo se halló el perfil ERIC-II en cepas pigmentadas enviadas de la Colección del SAG. Mientras que el perfil ERIC-I es el de mayor distribución a nivel mundial, el perfil ERIC-II ha sido citado en Alemania, Finlandia, Suecia y Austria y, muy recientemente, en muestras de Canadá y Nueva Zelanda. Las cepas pertenecientes al perfil ERIC I estudiadas en esta tesis a su vez se subdividían en alguno de los 4 perfiles BOX (A, B, C o D) y presentaban colonias "típicas" de Paenibacillus larvae no pigmentadas, de color entre blanquecino y grisáceo y formas ligeramente rugosas en agar MYPGP y en agar Columbia suplementado con sangre ovina (Capítulo II). Por otra parte las cepas de colección del grupo ex pulvifaciens, analizadas aquí (n=5) presentaron un perfil ERIC–IV / BOX-E. Si bien en este trabajo no se encontró ningún representante del genotipo ERIC-II, a excepción de los cultivos enviados por el SAG, el mismo pudo haber pasado inadvertido en el análisis de mieles debido a la alta contaminación de las mismas con otras especies esporuladas Gram (+) que hizo imprescindible someter a las muestras a un shock térmico previo al aislamiento en medios semi-selectivos. En el capítulo IV también se concluyó que el gen 16S rRNA es polimórfico entre las especies esporuladas aerobicas comúnmente presentes en la miel, no obstante, no se detectaron polimorfismos a nivel intra-especie en las cepas de Paenibacillus larvae de distintas regiones geográficas cuando se emplearon las endonucleasas (Alu I, Msp I, Hae III, CfoI, Rsa I y Taq I). En cuanto a las comparaciones entre perfiles de rep-PCR y RFLP se observó que los 4 patrones de BOX-PCR observados (A, B, C y D) y los fingerprints ERIC-I y ERIC-II se correlacionaron con el perfil A obtenido por HaeIII, mientras que las cepas de colección que mostraron un perfil BOX-E y un perfil ERIC-IV se correlacionaron con el perfil B obtenido con la endonucleasa HaeIII. Lo mismo ocurrió con la enzima HinfI dónde las cepas pertenecientes a los perfiles ERIC-III y BOX-E mostraron un patrón B y las cepas con perfiles ERIC-I o ERIC-II y BOX-A, BOX-B, BOX-Cy BOX-D no presentaron un sitio de corte con esta endonucleasa. En el capítulo V se seleccionó un subconjunto de aislamientos de Paenibacillus larvae de distintos orígenes geográficos y perfiles de fingerprints para determinar la sensibilidad/ resistencia a tetraciclina y oxitetraciclina mediante las técnicas de CIM y de difusión en agar. La distribución de la sensibilidad por CIMs de la población bacteriana analizada varió entre 0,062 y 128 µg/ml de Tc sugiriendo una distribución bimodal con dos sub-poblaciones que claramente difirieron en su sensibilidad, con 76% de cepas S (CIM entre 0,062 y 2 µg/ml) y 24 % de cepas dentro del rango de la zona I y R. Las cepas I provenían en su mayoría de Argentina y las S cuyos valores de CIM resultaron los más bajos, de países europeos, lo cual es esperable dado que en casi toda la UE está prohibido el uso de antibióticos en apicultura, mientras que en países como EE.UU., Canadá y Argentina, entre otros, es usual el empleo de OTC para el control de loque americana en las colmenas afectadas. Al comparar las CIM obtenidas por E-test con las obtenidas por dilución en agar, en el caso de agar Iso-Sensi Test hubo concordancia de categoría del 100 %, encontrándose la misma proporción de cepas susceptibles y resistentes que por la técnica de dilución en agar; pero al emplear MYPGP hubo concordancia de categoría del 81,81 %. Se concluye entonces que la combinación de las tiras de E-Test con el agar ISO-Sensi Test representa una alternativa válida para determinar las CIM de tetraciclina en cepas de Paenibacillus larvae. Es importante destacar que todas las cepas de Paenibacillus larvae ensayadas mostraron un desarrollo confluente en Iso-Sensi test, el cual podría usarse también como medio alternativo para el desarrollo de las células vegetativas de este patógeno. Se obtuvieron las secuencias completas de los plásmidos pPL373, pPL374 y pPL395. Dichas secuencias se depositaron en el GenBank con los números de acceso KF 433938 para pPL373, KF 536616 para pPL374 y KF440690 para pPL395, provenientes de las cepas PL373, PL374 y PL395, respectivamente que presentaban resistencia a Tc y OTC. Hemos demostrado experimentalmente la transferencia del plásmido pPL374 en la cepa de Bacillus subtilis m351 y del plásmido pPL373 en la cepa de Bacillus subtilis GSY1104 mediante conjugaciones en medio líquido. Al examinar ambas cepas dadoras de Paenibacillus larvae PL373 y PL374 mediante la técnica de lisis in situ se observaron dos plásmidos de aproximadamente 5.000 bp y 8.000 bp, pero sólo el plásmido más pequeño era el que contenía el gen de resistencia a Tc. Luego de efectuar la secuenciación completa de los plásmidos más pequeños obtenidos de las cepas pPL373 y pPL374, respectivamente confirmamos que el gen de resistencia es el tetL y no el tetK como creímos en un principio y que ambos replican por el mecanismo de círculo rodante encontrado en pequeños plásmidos movilizables de alto número de copias presentes en bacterias Gram (+). Todos los experimentos de movilización por conjugación empleando la cepa PL395 que contiene un único plásmido de 5.000 bp denominado pPL395 resultaron infructuosos, no obstante el ADN plasmídico obtenido de la cepa PL395 si pudo transferirse por electroporación a una cepa de Paenibacillus larvae TcS. Los plásmidos pPL373 y pPL374 también pudieron transferirse por electroporación a la misma cepa de Paenibacillus larvae TcS. En todos los casos los plásmidos se mantuvieron en forma estable en sus respectivos aceptores. Los plásmidos más grandes contenidos en las cepas PL373 y PL374, podrían codificar para funciones conjugativas y, al coexistir en la misma cepa bacteriana aportarían a los plásmidos movilizables pPL373 y pPL374 las funciones conjugativas necesarias para su movilización por conjugación; por lo que se justifica estudiarlos en profundidad y secuenciarlos para clarificar los mecanismos de transmisión plasmídica de Paenibacillus larvae en la naturaleza. La presencia de plásmidos con secuencias muy similares aislados de bacterias Gram (+) provenientes de distintas zonas geográficas y de distintos nichos ecológicos (suelo, hábitats marinos, alimentos) de los géneros Bacillus, Paenibacillus, Sporosarcina, Lactobacillus y Bhargavaea nos sugieren que los genes mob presentes en dichos plásmidos pueden estar involucrados en una exitosa THG. El uso extensivo de Tc y OTC para el control de loque americana en algunos países de América pudo haber contribuido al incremento del número de cepas resistentes de Paenibacillus larvae, favoreciendo la transferencia de estos plásmidos entre cepas del mismo patógeno o desde o hacia otras especies de bacterias Gram (+) de los géneros Lactobacillus, Bacillus y Paenibacillus que pertenecen a la microbiota de la colmena (miel, tractos digestivos de abejas adultas y larvas, superficies florales y polen). El uso prolongado de tetraciclina en las colmenas afectadas por loque americana y otras enfermedades bacterianas estaría favoreciendo la ocurrencia de eventos de transferencia genética horizontal como se demostró en cepas del patógeno provenientes de EE.UU.

Submitted by Johnny Rodrigues (johnnyrodrigues@ufcg.edu.br) on 2018-05-11T19:42:51Z No. of bitstreams: 1 WANNUBYA CAROLINE DE ALMEIDA NOBRE RAMALHO - DISSERTAÇÃO PPGHT 2014..pdf: 3037884 bytes, checksum: 7074077dbb30f142f093bc66ee56c6f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-11T19:42:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WANNUBYA CAROLINE DE ALMEIDA NOBRE RAMALHO - DISSERTAÇÃO PPGHT 2014..pdf: 3037884 bytes, checksum: 7074077dbb30f142f093bc66ee56c6f2 (MD5) Previous issue date: 2014-03-28 / Capes / bioma Caatinga é rico em biodiversidade. Muitas espécies de plantas são hospedeiras de patógenos que provocam doenças às culturas e em muitos casos até mesmo a morte das plantas e erradicação dos cultivos. O melão (Cucumis melo) e a melancia (Citrullus lanatus) são culturas de grande importância econômica no Nordeste brasileiro. Entretanto a ocorrência de patógenos radiculares causadores do declínio de ramas em cucurbitáceas resulta em perdas a essas culturas. Essa doença é associada ao fungo Monosporascus cannonballus que é considerado o agente causal, tendo sido recentemente detectado em solos não cultivados da Caatinga. Com a hipótese de que plantas nativas da Caatinga são hospedeiras alternativas deste fungo, o objetivo deste trabalho foi realizar um levantamento de plantas nativas da Caatinga como possíveis hospedeiras alternativas deste fungo. O experimento foi realizado no período de 06∕2013 a 02 ∕2014 com a prospecção das plantas nos estados do Rio Grande do Norte e Paraíba, posteriormente estas plantas foram levadas para os laboratórios de fitopatologia da Universidade Federal Rural do Semiárido e Centro de Ciências e Tecnologia Agroalimentar – Pombal onde foi realizada a identificação botânica e as análises de suas raízes para detectar a ocorrência do fungo. Em seguida realizou-se o isolamento dos fitopatógenos das raízes de todas as espécies coletadas, em um total de 500 plantas distribuídas em 10 áreas nos dois estados em estudo. Logo após o período de incubação foi realizada a identificação dos fungos patogênicos. Em nenhuma das espécies de plantas nativas da Caatinga foi detectada a presença do fungo Monosporascus cannonballus, no entanto foi constatado que das 22 espécies estudadas, 18 são hospedeiras de fitopatógenos causadores de doenças em cucurbitáceas. Os fungos encontrados foram Macrophomina phaseolina e Rhizoctonia solani. Em nenhuma das cinco áreas pertencentes ao estado do Rio Grande do Norte foi constatada a presença de Rhizoctonia solani nas raízes das espécies estudadas. / The Caatinga biome is rich in biodiversity. Many plant species are hosts of pathogens that cause diseases on crops and in many cases even death of plants and eradication of crops. Melon (Cucumis melo) and watermelon (Citrullus lanatus) are economically important crops in Brazilian Northeast. However the occurrence of pathogens causing root decline of foliages in cucurbits results in losses to these crops. This disease is associated with fungus Monosporascus cannonballus which is considered the causal agent, it has recently been detected in Caatinga’s soils no cultivated. With the hypothesis that Caatinga’s native plants are alternative hosts of this fungus, the objective of this study was to conduct a research Caatinga’s native plants as possible alternative hosts of this fungus. The experiment was conducted from 06/2013 to 02/2014 with the prospect of the plants in Rio Grande do Norte and Paraíba states later these plants were taken to the laboratories of plant pathology at Federal Rural University of Semi-Arid and Science Center and Agrifood technology - Pombal where the scientific identification and analysis of their roots to detect the occurrence of fungi was carried out. Then took place the isolation of pathogens from the roots of all species collected in a total of 500 plants in ten areas into two states. Immediately after the incubation period the identification of the pathogenic fungi was performed. In none of the species of plants native to the Caatinga was detected the presence of the fungus M. cannonballus, however it was found that of the 22 species studied, 18 are host to pathogens causing disease in cucurbits. Macrophomina phaseolina and Rhizoctonia solani were the fungi found. In none of the five areas belonging to the state of Rio Grande do Norte was found Rhizoctonia solani in the roots of the species.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Joice_Costa.pdf: 1218899 bytes, checksum: 93178d81a8f2ef95cc6d5f75deb0fef8 (MD5) Previous issue date: 2008-08-27 / There are different sorotypes of Escherichia coli responsable for enteric disfunctions, and in the most of time those are related with meat consume or contaminated food that had not been cooked with an efficient thermal treatment before been ingested. In Brazil there aren t inform data of possible outbreaks caused by E. coli O157:H7, but this pathogen has been frequently isolated from cattle s feces, and it was recently isolated from bovine carcass at two slaughterhouses in Goiás. The present study has the objective to characterize by ERIC-PCR E. coli and E. coli O157:H7 detected at bovine carcass surfaces and check the power of this methodology to identify different isolates of E. coli and E. coli O157:H7. ERIC-PCR was used to characterize 111 samples, and it was obtained 32 fingerprints separated in 90 isolates of E. coli and eight fingerprints separated in 16 isolates of E. coli O157:H7. From the total of 111 samples, two isolates of E. coli and five of E. coli O157:H7 were non-tipables. The fingerprints varies from one to 18 bands. The discrimination between the samples was high, showing the big power of ERIC-PCR to discriminate isolates from one specie. The discriminatory index between E. coli and E. coli O157:H7 obtained was 0,96. / São diferentes os sorotipos de Escherichia coli responsáveis por distúrbios entéricos, muitas vezes relacionados com o consumo de carne ou alimentos que foram contaminados e não passaram por tratamento térmico eficiente antes de serem ingeridos. No Brasil não há dados sobre possíveis surtos causados por E. coli O157:H7, mas este patógeno vem sendo frequentemente encontrado em fezes bovinas e recentemente foi isolado de meias carcaças quentes e resfriadas bovinas destinadas à exportação no Estado de Goiás. O presente trabalho objetivou identificar os perfis de ERIC-PCR em E. coli e E. coli O157:H7 isoladas de superfícies de meias-carcaças quentes e resfriadas de bovinos de dois matadouros-frigoríficos de Goiás além de verificar a capacidade de discriminação desta metodologia. A técnica de ERIC-PCR foi utilizada na caracterização molecular das 111 amostras analisadas, sendo obtidos 32 perfis distribuídos em 90 cepas de E. coli e oito perfis distribuídos em 16 cepas de E. coli O157:H7. De um total de 111 amostras, duas cepas de E. coli e cinco de E. coli O157:H7 eram não-tipáveis. Os perfis de ERIC-PCR de E. coli variavam de um a 18 fragmentos. A discriminação entre as cepas de E. coli e E. coli O157:H7 pela técnica utilizada foi alta, mostrando a grande capacidade da técnica de ERIC-PCR em discriminar cepas de uma mesma espécie. O índice de discriminação entre E. coli e E. coli O157:H7 foi de 0,96

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2014-11-06T20:32:32Z No. of bitstreams: 2 Dissertação- Liwcy Keller de Oliveira Lopes Lima- 2012.pdf: 870422 bytes, checksum: 431b648a9e85b9fc37769b57a0dc46e8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-11-10T20:09:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação- Liwcy Keller de Oliveira Lopes Lima- 2012.pdf: 870422 bytes, checksum: 431b648a9e85b9fc37769b57a0dc46e8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-10T20:09:55Z (GMT). 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The present study aimed to analyze the epidemiology of occupational accidents with exposure to BM among dental professionals and students in the State of Goias, and as specific goals, to ferify the frequency and profile of the accidents with biological material exposure among the dental care students and professionals enrolled in a reference hospital with service in compliance with occupational exposure to BM, to characterize the pre-and postexposure behavior and monitoring program recommended for this population and to analyze the socio-demographic and labor factors related to the accidents with BM by percutaneous exposure between dental care professionals and students assisted in a reference service. This is an epidemiological, retrospective and analytical study developed in a referral hospital for the treatment of occupational accidents with exposure to BM of the State of Goiás. All records of the accidents with BM between dental care professionals and students attended in this institution by December 2010 were analysed. Data were collected by completing a standardized form containing personal information, description of the accident, time elapsed between the accident and the first service, and post-exposure and prophylaxis procedures. The data were analyzed by SPSS 15.0 and the OpenEpi 2.3.1., Statistical analysis was performed by descriptive frequency measures and univariate analysis using qui-square and Fisher exact test. 628 accidents were recorded between dental care professionals and students from 1996, the year of first registration, to 2010, in which 77.1% were women. Some individuals reported more than one accident, totalling 701 accidents with exposure to BM that comprise the study population. Among the accidents, the majority (97, 13.8%) occurred in 2008 and 48.6% between dentists. In 92.2% of cases, hepatitis B vaccination status of the victims was described, and out of these, 70.8% received all three doses. In 84.9% of cases there was no record of the completion of anti-HBs by the victims. The accidents were predominantly (658, 93.9%) percutaneous, being the needle the instrument that caused the injury in 49.7%. Performing any dental care procedure was the most comum circumstance in which the accidents occurred most frequently (388, 55.4%), and the finger, the body area most affected (493, 70.3%). We highlight the lack of information in many cases, especially in relation to BM involved in the accident, the use of personal protective equipment at the time of the accident, where the victims performed their activities at the time of the accident and / or were linked and fullfilling of Work Accident Communication form. With the post-exposure procedures, the majority (635, 90.6%) of the institution accidents enrollments occurred within 72 hours, however only 44.9% were in the first two hours. The use of chemoprophylaxis and prophylaxis of hepatitis B in 14.8% and 12.8% of the cases, respectively were recommended. In 82.6% of the accidents, the patients were identified, and their HIV, HBV and HCV condition ignored in 93.6% of records. Among the accidents in which the victim must return to the intitution for the post-exposure follow up (264, 37.7%), only 20.8% returned and 3.8% were discharged. Accidents by percutaneous exposures showed a high prevalence for all variables analysed. It was observed that the higher is the demand for the service the less is the individual chance to undergo a percutaneous exposure (p = 0.000). The occurrence of accidents among dental auxiliaries was significant (p = 0.016) compared to dentists. The lack of data in the records of the institution reveals the need for greater disclosure of ministerial protocols for caring the victims of occupational accidents by BM among professionals responsible for this service. The integration of biosafety, infection control procedures for dental care practice and prevention and prophylaxis for BM accidents issues with undergraduate, graduate courses should develop and provide effective behavior changes. / A prática odontológica é caracterizada pela constante possibilidade de exposição tanto da equipe quanto dos pacientes a material biológico (MB) potencialmente contaminados com diversos agentes infecciosos, sendo necessário o conhecimento da epidemiologia dessas exposições para o desenvolvimento de medidas de gerenciamento de risco. O presente estudo teve como objetivo geral analisar a epidemiologia dos acidentes ocupacionais com exposição a MB entre profissionais e estudantes de odontologia em Goiás e como específicos verificar a frequência e o perfil dos acidentes com MB em estudantes e profissionais de odontologia atendidos em um serviço de referência para atendimento à exposição ocupacional com MB, caracterizar as condutas pré e pós-exposição e de acompanhamento recomendadas para essa população e analisar os fatores sociodemográficos e laborais associados à ocorrência de acidentes com MB por exposição percutânea entre profissionais e estudantes de odontologia atendidos em um serviço de referência. Trata-se de um estudo epidemiológico, retrospectivo e analítico desenvolvido em um hospital de referência para o atendimento de acidentes ocupacionais com exposição a MB do Estado de Goiás. Foram analisadas todas as fichas de registro de acidente com MB entre profissionais e estudantes de odontologia atendidos nessa instituição até dezembro de 2010. Os dados foram coletados por meio do preenchimento de um formulário padronizado contendo informações pessoais, descrição do acidente, tempo decorrido entre o acidente e o primeiro atendimento, condutas pós-exposição e medidas profiláticas. Os dados foram analisados pelo SPSS 15.0 e pelo OpenEpi 2.3.1., foi realizada análise estatística descritiva pelas medidas de frequência e análise univariada por meio de testes qui-quadrado e exato de Fisher. Foram notificados 628 acidentes entre profissionais e estudantes de odontologia no período de 1996, ano do primeiro registro, a 2010, sendo que 77,1% eram do sexo feminino. Alguns indivíduos relataram mais de um acidente, totalizando assim 701 acidentes com exposição a MB que compõem a população do estudo. No ano de 2008 houve a maior frequência de registros de acidentes (97; 13,8%) e desses 18,6% eram CD. Em 92,2% dos casos, a situação vacinal contra hepatite B dos acidentados foi descrita, sendo que desses 70,8% receberam as três doses. Em 84,9% dos casos não havia registro da realização do anti-HBs pelas vítimas. Os acidentes foram predominantemente (658; 93,9%) percutâneos, sendo a agulha o instrumento causador da lesão em 49,7%. Durante a realização de algum procedimento odontológico, foi a circunstância em que os acidentes mais ocorreram (388; 55,4%), e o dedo da mão a área corporal mais atingida (493; 70,3%). Destacou-se a ausência de informações em diversos casos, principalmente em relação ao MB envolvido no acidente, uso de equipamento de proteção individuaI no momento do acidente, instituições onde as vítimas exerciam suas atividades no momento do acidente e/ou eram vinculadas e o preenchimento da Comunicação de Acidente de Trabalho. Quanto às condutas pós-exposição, na maioria (635; 90,6%) dos acidentes, o atendimento na instituição ocorreu em até 72 horas, entretanto apenas 44,9% foram nas primeiras duas horas. Foi recomendado o uso de quimioprofilaxia e profilaxia da hepatite B em 14,8% e 12,8% dos casos, respectivamente. Em 82,6% dos acidentes, os pacientes-fonte eram passíveis de identificação, sendo a condição dos mesmos, quanto à infecção pelo HIV, HBV e HCV, ignorada em 93,6% dos registros. Entre os acidentes em que a vítima deveria retornar ao ambulatório para a realização do acompanhamento pós-exposição (264; 37,7%), apenas 20,8% retornaram e 3,8% receberam alta. Os acidentes por exposições percutâneas apresentaram alta prevalência para todas as variáveis analisadas. Observou-se que quanto maior a procura pelo atendimento, menor a chance do indivíduo ter sofrido uma exposição percutânea (p=0,000). A ocorrência de acidentes entre auxiliares de saúde bucal foi significativa (p=0,016) comparada às CD. A ausência de dados nos registros da instituição revela a necessidade de maior divulgação dos protocolos ministeriais para o atendimento às vítimas de acidentes ocupacionais por MB entre os profissionais responsáveis por esse atendimento. A inserção de conteúdos como prevenção e controle de infecção na prática odontológica e medidas pré e pósacidentes com MB, nos cursos de graduação, aperfeiçoamento e pós-graduação têm o potencial de resultar em mudanças efetivas nas condutas.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2016-09-09T17:59:04Z No. of bitstreams: 2 Tese - Zilah Cândida Pereira das Neves - 2016.pdf: 2900186 bytes, checksum: cfefb1ed9137da82dc5cb133b19682f5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-12T14:30:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Zilah Cândida Pereira das Neves - 2016.pdf: 2900186 bytes, checksum: cfefb1ed9137da82dc5cb133b19682f5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-12T14:30:18Z (GMT). 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The aims of this study were: to analyze the epidemiology of occupational accidents with biological material among health care workers of the metropolitan area of Goiania-GO (general); describe the socio-demographic and occupational profile of health care workers, victims of occupational accidents with biological material; describe the profile of accidents with biological material among health care workers; characterize the adoption of pre-exposure behaviours related to the latest accident; identify the serological status related to hepatitis B, C and HIV in victims of occupational accidents involving biological material and source patients, and establish the demographic and employment factors associated with the occurrence of multiple accidents among health care workers of the metropolitan area of Goiania-GO. Epidemiological Cross and analytical study which included all registration records of accidents involving biological material of HCW from two sources: A - records of injured HCW in a reference hospital for notification in Goiania, from the first record in 1989 to 2010, and B - records of Sinan, including the first record in 2006 until those available at 31/12/2014. Linkage of databases was performed and data analyzed using the Statistical Package for Social Sciences (SPSS). Socio-demographic and employment variables were the predictor variables and have suffered more than one accident, the outcome. Univariate analysis was performed and variables with P<0.10 were included in a logistic regression model. Ethical precepts were followed (Approval Ethics Committees: 033/2010 and 414.258/2013). A total of 11,536 accidents were recorded from 1989 to December 2014. Of these, 9,575 (83.0%) occurred among HCW and the majority was female. It was found that 665 (7.5%) of the HCW experienced more than one accident, while 70 (0.8%) experienced three or more accidents, totaling 8,825 victims. Nursing staff, auxiliary cleaning, physician, and dental and laboratory teams were the ones who were more frequently hurted, respectively. Most of the victims had completed high school (3,719 (48.0%). Blood/serum/plasma were the biological materials found to be the most involved (6,480/67.7%), at the time of administering medications/vascular access puncture occurring in 2.759 (28.9%), and involving needles with and without lumen in 6,097 (63.7%). A total of 6,653 (75.4%) HCW were vaccinated for hepatitis B. Incomplete information on Sinan records such as, use of PPE (gloves, masks, boots and safety glasses) and serological markers (HBsAg; Anti-HBs, Anti-HCV and Anti-HIV) was found to be the major factor that hampered data analysis. Age, type of material, and organic fluid were predictors risk factor for multiple accidents involving biological material among health care workers. / Os acidentes com material biológico são eventos de notificação compulsória. Os trabalhadores da área da saúde (TAS), vítimas desses acidentes, podem se expor aos vírus das hepatites B e C e HIV, dentre outros. Foram objetivos deste estudo: analisar a epidemiologia dos acidentes ocupacionais com material biológico entre trabalhadores de serviços de saúde, da região metropolitana de Goiânia-GO (geral); descrever o perfil sociodemográfico e laboral dos trabalhadores de serviços de saúde, vítimas de acidentes ocupacionais com material biológico; descrever o perfil dos acidentes com material biológico entre trabalhadores dos serviços de saúde; caracterizar a adoção das condutas pré-exposição relacionadas ao último acidente; identificar a situação sorológica referente às hepatites B, C e HIV, das vítimas de acidentes ocupacionais com material biológico e dos pacientes-fonte e estabelecer os fatores sociodemográficos e laborais associados à ocorrência de múltiplos acidentes entre trabalhadores de serviços de saúde da região metropolitana de Goiânia-GO (específicos). Estudo epidemiológico, transversal e analítico no qual foram incluídas todas as fichas de registro de acidentes de trabalho com material biológico de TAS a partir de duas fontes, A prontuários de TAS acidentados em um hospital de referência para notificação no município de Goiânia, desde o primeiro registro em 1989 até 2010 e B - fichas do Sinan, incluindo o primeiro registro em 2006, até os disponíveis em 31/12/2014. Foi realizado o Linkage dos bancos de dados que foram processados e analisados no Statistical Package for the Social Sciences (SPSS). As variáveis sociodemográficas e laborais foram as variáveis preditoras e ter sofrido mais de um acidente, o desfecho. Foi realizada a análise univariada, e as variáveis que apresentaram valor de p < 0,10 foram incluídas em um modelo de regressão logística. Preceitos éticos foram seguidos (aprovações em Comitês de Ética: 033/2010 e 414.258/2013). Foram registrados 11.536 acidentes, no período de 1989 a dezembro de 2014. Destes registros, 9.575 (83,0%) ocorreram entre os trabalhadores da área de saúde e a maioria era do sexo feminino. Verificou-se que 665 (7,5%) TAS sofreram mais de um acidente, 70 (0,8%) apresentaram três ou mais acidentes, perfazendo 8.825 vítimas. A equipe de enfermagem, o auxiliar de limpeza, médicos e a equipe de odontologia e de laboratório foram os que mais se acidentaram, respectivamente. A maioria das vítimas possuía o ensino médio completo 3.719 (48,0%). O sangue/soro/plasma foram os materiais biológicos mais envolvidos 6.480(67,7%), no momento de administrar medicamentos/punção de acesso vascular em 2.759 (28,9%), com o envolvimento de agulhas com e sem lúmen em 6.097 (63,7%). Em 6.653 (75,4%) dos TAS vacinaram para hepatite B. Para várias informações, predominou a falta de registro nas fichas do Sinan que dificultou a análise: uso dos EPI (luvas, máscaras, botas e óculos) e marcadores sorológicos (HBSAG; Anti-HBs, AntiHCV e o Anti-HIV). Verificou-se que idade, tipo de material, fluido orgânico foram fatores de risco preditores para múltiplos acidentes envolvendo material biológico, entre os trabalhadores dos serviços de saúde.

A citricultura destaca-se dentro do agronegócio brasileiro gerando dividendos diretos com exportações e empregos, e indiretos com arrecadação de impostos. No entanto, ainda padece com problemas fitossanitários, com destaque para o HLB (Huanglongbing, HLB, ex-greening), que nos últimos dez anos tem dizimado pomares e provocado o abandono da cultura por muitos produtores. Causada no Brasil pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus e Ca. Liberibacter americanus, é uma doença sistêmica, restrita aos vasos do floema, e induz ao aparecimento de sintomas semelhantes àqueles causados por deficiência de nutrientes em folhas e ramos, frutos com tamanhos reduzidos e assimétricos e coloração amarelada das plantas, tornando-as economicamente inviáveis. A transmissão da doença acontece naturalmente pelo inseto Diaphorina citri, e artificialmente por meio de borbulhas contaminadas. Todas as variedades de citros e rutáceas próximas são comprovadamente suscetíveis ao HLB; entretanto, há diferenças marcantes entre níveis de suscetibilidade entre os genótipos, como Poncirus trifoliata, que apresenta certa resistência ou tolerância à doença. Os mecanismos de patogenicidade de Ca. Liberibacter spp. e a resposta molecular da planta à infecção ainda não estão bem definidos e o estudo da ativação dos mecanismos de defesa da planta induzidos por hormônios vegetais é um importante foco na elucidação deste complexo patossistema. Diante deste panorama, este estudo propôs avaliar o perfil de expressão de genes associados às vias do jasmonato e do etileno em plantas de Citrus sinensis L. Osb. (suscetível) e Poncirus trifoliata (L.) Raf. (resistente ou tolerante) em resposta à infecção pelas duas espécies de bactérias causadoras do HLB no Brasil, separadamente. Os perfis transcricionais dos genes avaliados não foram estatisticamente distintos, mas mereceram destaque os genes de biossíntese e metabolismo de jasmonato LOX2, AOC3 e JMT, os genes sinalizadores da via de jasmonato JAZ2 e MYC2, o gene de biossíntese de etileno SAM1, os receptores de etileno ETR1, ERS1 e EIN4, o regulador negativo de etileno CTR1, o regulador positivo da sinalização de etileno EIN2, os fatores de transcrição EIN3, EIL1, ERF1, ERF2, ERF/AP2, uma MAPkinase MAPK6 e uma proteína PR PR-4. Estes resultados mostram que as vias sinalizadas por jasmonato e etileno são modificadas pelas bactérias Ca. Liberibacter spp. No entanto, não foi possível comprovar a importância destas vias na resposta diferencial de genótipos suscetível e resistente/ tolerante de citros ao HLB. / The citrus industry stands out in the Brazilian agribusiness generating direct and indirect jobs and significant revenues. However, the citrus crop faces several diseases, especially the HLB (Huanglongbing, ex-greening), which, in the last ten years, have caused severe losses to growers. In Brazil, HLB is caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus and Ca. Liberibacter americanus, which are restricted to the phloem and induce symptoms similar to those caused by nutrient deficiency in citrus leaves and branches. Fruits are of reduced size and asymmetrical, and the plants tend to show overall yellowing. These symptoms altogether lead to the economical death of the plant. Transmission of the pathogens occurs naturally by the Asian citrus psyllid Diaphorina citri, or by contaminated buds. All citrus varieties and relatives are considered susceptible to HLB; however, there are clear differences in levels of susceptibility among genotypes. Poncirus trifoliata, for instance, exhibits some resistance or tolerance to the disease. The mechanisms involved in the pathogenesis of Ca. Liberibacter spp. and the molecular responses of the hosts to the infection are still unknown, but emphasis has been given to the defense mechanisms induced by plant hormones in order to try to elucidate the interactions of such complex pathosystem. Based on this scenario, this study aimed to evaluate the expression profile of Citrus sinensis (L.) Osb. (susceptible) and Poncirus trifoliata (L.) Raf. (resistant or tolerant) genes associated with the jasmonate and ethylene pathways in response to infection by both species of Ca. Liberibacter spp. causing HLB in Brazil, separately. The transcriptional profiles did not differ statistically, for the evaluated genes, including those in the jasmonate biosynthesis and metabolism (LOX2, AOC3 and JMT), signaling pathway (JAZ2 and MYC2), biosynthesis of ethylene (SAM1), ethylene receptors (ETR1, ERS1 and EIN4), negative regulator of ethylene (CTR1), positive regulator of ethylene signaling (EIN2), transcription factors (EIN3, EIL1, ERF1, ERF2, ERF/AP2), a MAPkinase (MAPK6) and a PR protein (PR-4). These results suggest that the jasmonate and ethylene pathways exhibit some modulation caused by the bacteria Ca Liberibacter spp. However, it does not seem that these pathways are relevant for the differential response of susceptibility or resistance/ tolerance of the citrus genotypes to HLB.

Durante uma infecção o número de linfócitos T aumenta dramaticamente. A fase de expansão clonal é seguida pela redução do nível de células T ativadas que depende, em parte, de um processo de morte celular induzida por ativação (AICD). Nosso grupo mostrou que APCs quando são estimuladas com LPS, um agonista de TLR4, produzem PGE2, que inibe a AICD de linfócitos T CD4+ através da supressão da expressão de CD95L (Weinlich et al, 2008). Porém, os efeitos da estimulação direta de TLR nos linfócitos T sobre o processo de AICD foram pouco elucidados. Sendo assim, o projeto tem como objetivo verificar se a estimulação dos diversos TLRs com seus agonistas é capaz de modular a AICD de hibridomas de linfócito T DO11.10. Inicialmente, demonstramos que este hibridoma expressa os TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 e 11. Dentre todos os agonistas utilizados somente o Imiquimod, um agonista de TLR7, reduziu a morte celular quando adicionado durante a indução de AICD. O efeito protetor desse agonista foi através da inibição da expressão de CD95L, tanto no nível de mRNA quanto protéico. / During an infection the number of T lymphocytes increases dramatically. The clonal expansion phase is followed by reducing the level of activated T cells that depends, in part, a process of cell death induced by activation (AICD). Our group showed that when APCs are stimulated with LPS, a TLR4 agonist, produce PGE2, which inhibits the AICD of CD4 + T cells by suppressing the expression of CD95L (Weinlich et al, 2008). However, the effects of direct stimulation of TLR on T cells on the process of AICD were little explained. Therefore, the project aims to determine whether the stimulation of different TLRs to their agonist is able to modulate AICD of T lymphocyte hybridoma DO11.10. Initially, we demonstrated that this hybridoma expresses TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 and 11. Among all agonists used only imiquimod, a TLR7 agonist, reduced cell death when added during the induction of AICD. The protective effect of this agonist was by inhibiting the expression of CD95L, both at the mRNA and protein.

A cana-de-açúcar, é atualmente a cultura mais plantada no estado de São Paulo, apresentando grande importância no setor agrícola. Assim como qualquer outra cultura, é hospedeira de uma série de patógenos que podem limitar sua produção. A bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é o agente causal do raquistismo-das-soqueiras (RSD) em canade- açúcar cujo o principal sintoma é a redução acentuada do crescimento observada em plantas adultas. Essa doença é de difícil diagnose pois a evolução dos sintomas é lenta devido à natureza fastidiosa da bactéria. Lxx pode ser considerada como um endófíto obrigatório que cresce a níveis patogênicos nos tecidos da planta dependendo de estímulos bióticos e abióticos. Devido à importância da cultura e aos danosoCasionados pela Lxx, este trabalho apresentou dois enfoques principais: o primeiro foi o desenvolvimento de um protocolo para quantificação de Lxx em tecido de cana-de-açúcar por meio da técnica de PCR quantitativo em tempo real; o segundo foi o estudo da interação entre cana-de-açúcar e Lxx, em busca de uma melhor compreensão da evolução desse processo através da identificação de proteínas que apresentaram alteração em abundância ao longo do tempo em função da colonização pela bactéria em duas variedades de cana (RB835486 e SP80-3280) e em seguida enfatizando o sistema antioxidante nesta relação. Para isso, foram desenvolvidos primers específicos para detecção de Lxx que permitiram quantificar baixos níveis bacterianos em tecido foliar, revelando diferenças entre variedades segundo a cinética do crescimento bacteriano. Plantas com diferentes títulos bacterianos obtidas mediante inoculação artificial ou não foram submetidas à análise proteômica por meio da técnica de 2D-DIGE, uma vez que para o RSD, os danos estão relacionados à alta colonização de Lxx em seus tecidos. Os resultados alcançados com o sequenciamento de proteínas que apresentaram alteração em abundância revelaram que, em plantas da variedade RB835486 observou-se repressão de proteínas da via de estresse oxidativo e metabolismo primário, em contraste com a variedade SP80-3280, que apresentou aumento da abundância de proteínas relacionadas à via de estresse oxidativo, ambas para o mesmo tratamento, em plantas não inoculadas artificialmente. Já em plantas inoculadas com Lxx foram identificadas alteração na abundância de proteínas relacionadas ao crescimento da planta, ciclo celular, vias de sinalização celular e hormonal, esses resultados são consistentes com o principal sintoma da doença, o raquitismo, pois indica que as alterações temporais observadas na expressão de proteínas relacionadas com o aumento do título de Lxx in planta podem resultar em alterações do equilíbrio hormonal e menor crescimento da planta. Alguns resultados observados com a análise bioquímica corroboram com os dados acima descritos, pois a variedade RB835486 apresentou uma resposta precoce ao estresse oxidativo e mostrou maior controle do crescimento bacteriano, o que pode estar relacionado ao balanço de ERO\'s (espécies reativas de oxigênio) utilizadas pelo metabolismo como sinalizador celular na interação planta-patógeno. Em contraste, a variedade SP80-3280, em sua maioria, apresentou indução da atividade de enzimas antioxidantes mais tardiamente, momento em que a bactéria Lxx apresentou os maiores títulos de crescimento. / Sugarcane is currently the most grown crop in the state of São Paulo, with great importance in the agricultural sector. Like every crop, sugarcane is host to a number of pathogens that may limit its production. The fastidious bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is the causal agent of ratoon stunting in sugarcane (RSD), which the main symptom is a sharp reduction in growth observed in adult plants, this disease is difficult to diagnose because the evolution is slow due to nature of fastidious bacteria. Lxx can be considered as an obligatory endophyte that grows at pathogen levels in plant tissues depending on biotic and abiotic stimuli. Due to the importance of culture and the damage caused by the Lxx, this work presents two main approaches: the first one was the development of a protocol for the quantification of Lxx in sugarcane tissue by quantitative real time PCR; the second one was to study the interaction between sugarcane and Leifsonia xyli subsp. xyli aiming to a better understanding of the evolution of this process, identifying alterations in abundance of proteins over time depending on the bacterial colonization in the two varieties of sugarcane (RB835486 and SP80-3280) and then, emphasizing the antioxidant system in this relationship. Thus, we developed specific primers that enabled Lxx quantification at low bacterial levels in leaf tissue. The assay showed differences among sugarcane varieties according to the kinetics of bacterial growth. Plants that presented different titers of bacteria were obtained by artificial inoculum or not were selected to proteomic analysis by 2D-DIGE technique, since for RSD, the damage is related to high colonization in plant tissues. The identification of sugarcane proteins revealed that for variety RB835486 were observed a repression of stress proteins and proteins related to primary metabolism, in contrast with SP80-3280 variety, which it was identified high abundance of proteins of oxidative stress pathway, in not inoculated plants, for both varieties. However in inoculated plants it was identified a change in the abundance of proteins related to plant growth, cell cycle, cell signaling and hormonal pathways. These results corroborate with the main symptom of the disease, ratton, and suggest that temporal changes in expression of sugarcane cited proteins by increasing title of Lxx can result in hormonal imbalance and the decrease of plant growth. The major part of biochemistry analyzes corroborate with previous data obtained in proteomic approach. The RB835486 variety showed an early response to oxidative stress and suggests a greater control of bacterial growth in its tissues, which may be related to the balance of ERO\'s in signaling metabolism in plant pathogen interaction. While the SP80-3280, showed a later induction of antioxidant enzymes, when the bacterium Lxx had the highest titer of bacteria.