La comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la resistencia de la planta frente a patógenos biotrofos es un campo de investigación complejo y en expansión donde se impone la identificación de nuevos reguladores. Previamente se había descrito en nuestro laboratorio el gen P69C que codifica una proteasa con homología a subtilisinas y cuya expresión se induce en el transcurso de la interacción planta-patógeno. Con el fin de estudiar nuevos componentes de la planta implicados en la señalización de la respuesta defensiva, se procedió al escrutinio de mutantes de Arabidopsis thaliana que de forma constitutiva y sin la existencia de ningún estímulo externo se encontrara activada la expresión del gen GUS dirigida por el promotor P69C. En la presente memoria de tesis se describe ampliamente la identificación y caracterización del mutante, csb3 (constitutive subtilisin3). Las plantas csb3 poseen elevados niveles de ácido salicílico (SA) y además expresan genes dependientes de la ruta de SA tales como PR-1, PR-2 y GST6. Por otra parte, el mutante csb3 exhibe una elevada resistencia al oomiceto patógeno Hyaloperonospora parasitica de naturaleza biotrofa y a la bacteria patógena también biotrofa Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000 (Pst) DC3000. Sin embargo, la resistencia a patógenos necrotrofos tales como Botrytis cinerea y Plectosphaerella cucumerina permanece inalterada en las plantas csb3. Para analizar la participación de los distintos componentes de la ruta de señalización dependiente de SA en la manifestación del fenotipo de resistencia de csb3, se procedió al análisis epistático entre csb3 y pad4, sid2, eds5, nahG, npr1, dth9 y cpr1. Estos estudios indican que la elevada resistencia frente a patógenos biotrofos de las plantas csb3 requiere de todos y cada uno de los componentes de la ruta de señalización dependiente del SA estudiados. El gen CSB3 identificado por clonaje posicional codifica la 1-hidroxi-2-metil-2-butenil 4-difosfato (HDS) sin / Gil Morrió, MJ. (2005). Disección genética del mecanismo de resistencia frente a patógenos biotrofos mediado por el gen CSB3 en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1870

La mancha bacteriana causada por el patógeno Pseudomonas syringae pv. tomato (P. s. tomato) es una de las enfermedades más devastadoras del cultivo del tomate. En este trabajo se demuestra que la sola inhibición de la expresión del gen Ep5C, que codifica una peroxidasa catiónica extracelular, es suficiente para conferir una marcada resistencia a P.s. tomato. Esta inhibición encontrada en las plantas de tomate produce una resistencia que no requiere la activación de las rutas de defensa descritas hasta ahora, controladas por el ácido salicílico y el ácido jasmónico. Así, la inhibición de este gen constituye una nueva herramienta genética para obtener plantas transgénicas resistentes a esta enfermedad. La temprana inducción del gen Ep5C está mediada por el H2O2, una especie reactiva de oxígeno generada durante el curso de u interacciones planta-patógeno. Los mecanismos que controlan la resistencia de las plantas a patógenos necrotrofos constituye uno de los aspectos menos estudiados en la actualidad. La búsqueda de nuevos componentes genéticos que participan en la cascada de señalización de las plantas frente a patógenos constituye uno de los retos de la biología molecular moderna. En este trabajo llevamos a cabo un escrutinio, utilizando plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana portadoras del gen de la B-glucoronidasa (GUS) como gen marcador bajo el control del promotor del gen Ep5C, en busca de mutantes alterados en la expresión de dicho gen. En el presente trabajo presentamos la identificación y caracterización de uno de los mutantes, en concreto el mutante ocp3 (overexpressor of cationic peroxidase 3), el cual presenta expresión constitutiva del gen GUS. Las plantas ocp3 muestran una elevada acumulación de H2O2, y se caracterizan por presentar expresión constitutiva de GST1 y PDF1.2, dos genes marcadores de la respuesta defensiva, pero sin embargo no muestra expresión de PR-1, un gen marcador dependiente de la ruta del ácido salicílico (SA). La característic / Coego González, A. (2006). Análisis funcional del gen Ep5C y su implicación en los mecanismos de defensa en plantas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1972

Genetically modified crops are submitted to strict regulation to ensure the safety of consumers and the environment. To complement the comparison between GM plants and their counterparts, in the present Thesis, we evaluated the possible unexpected effects of the transgene on the host plant, by means of transcriptomic technologies. More exactly, we studied three pathogen-resistant GM rice lines: S-afp, expressing constitutively the antifungal protein AFP; and S-bp217 and S-bp213, expressing undecapeptide BP100 derivatives, which were developed in the UdG in the context of this Thesis. Although the high phytotoxicity of the BP100 derivatives on the host plant the transcriptional changes observed in S-afp, S-bp217 and S-bp213 compared to the conventional line Senia were similar that those observed in other GM crops, of other species and with different transgenes, and only the half of them was attributed to the insertion and/or expression of the transgene. / Les plantes modificades genèticament (MG) destinades a comercialització estan sotmeses a estricta legislació per garantir la seguretat del consumidor i del medi ambient. Per complementar la comparativa entre plantes MG i convencionals, en aquesta tesi s’ha abordat l’avaluació dels possibles efectes no esperats del transgèn sobre la planta hoste, mitjançant tècniques de transcriptòmica. Concretament s’han estudiat línies d'arròs MG que presenten fenotips de resistència a patògens: S-afp, que expressa constitutivament la proteïna antifúngica AFP, i S-bp213 i S-bp217, que expressen derivats de l’undecapèptid BP100, desenvolupat a la UdG, que s’han obtingut també en el marc d’aquesta tesi. Malgrat l’elevada fitotoxicitat dels derivats de BP100 enfront la planta hoste, els canvis transcripcionals de S-afp, S-bp213 i S-bp217 respecte la línia convencional Senia són similars als observats en altres events MG, de diferents espècies i amb diferents transgens; i només la meitat d’ells s’ha atribuit a la presència o expressió del transgèn.

[ES] La seguridad alimentaria es una prioridad para la población y en la actualidad cobra mayor importancia por ciertas tendencias alimentarias como el consumo de alimentos crudos y la distribución generalizada de alimentos orgánicos, que pueden ser la causa de enfermedades transmitidas por alimentos. Para garantizar la seguridad alimentaria, la detección de estos microorganismos debe realizarse de manera rápida y eficiente. Par eso, el método de cultivo microbiológico se considera el oficial para la detección de estos patógenos. Sin embargo, adolece de importantes inconvenientes, ya que no solo requiere mucho tiempo, sino que también es laborioso y consume muchos recursos. Además, puede ser limitado con respecto a la detección de bacterias fisiológicamente alteradas y/o estresadas durante el almacenamiento y la conservación. En este trabajo se ha desarrollado un protocolo sencillo y rápido para la detección simultánea de E. coli, L. monocytogenes, S. aureus y S. enterica en alimentos, mediante la combinación de una etapa de co-cultivo en medio líquido y la detección por PCR múltiple. Se ha evaluado la eficiencia de varios medios de enriquecimiento y se seleccionó el agua de peptona tamponada como el medio óptimo para el co-cultivo de las cuatro bacterias diana. También se optimizaron las condiciones de PCR múltiple y se aplicaron tanto a co-cultivos como a muestras de alimentos inoculados artificialmente, lechuga orgánica y carne picada. Después de la optimización, la PCR múltiple desarrollada fue capaz de detectar las cuatro bacterias simultáneamente, hasta con una inoculación inicial de 10^0 UFC/mL. En presencia de ambas matrices alimentarias inoculadas, tras la etapa de co-cultivo, la PCR múltiple pudo detectar simultáneamente las 3 bacterias E. coli, S. enterica y L. monocytogenes, mientras que S. aureus se ha detectado por PCR simplex, a partir del mismo extracto de ADN del co-cultivo. Los resultados obtenidos permiten concluir que el uso de un paso de co-cultivo en Agua peptona tamponada, antes de la detección por PCR simple y múltiple, puede facilitar la detección simultánea de las cuatro bacterias potencialmente presentes en las matrices alimentarias. La presencia o ausencia de la bacteria diana en los alimentos se confirma en unas 30 horas, lo que reduce el tiempo requerido para la detección en comparación con el tiempo mínimo de 7 días por método cultural. Asimismo, permite reducir el número de medios de cultivo y reactivos, para el aislamiento e identificación de bacterias que no son detectadas por PCR y que no están presentes en las matrices alimentarias, lo que supone un importante ahorro económico. / [CA] La seguretat alimentària sempre és una prioritat per a la població i en l' actualitat cobra major importància per certes tendències alimentàries, com el consum d' aliments crus i la distribució generalitzada d' aliments orgànics, que poden ser la causa de malalties transmeses per aliments. Per garantir la seguretat alimentària, la detecció d' aquests microorganismes s' ha de realitzar de manera ràpida i eficient. Per a això, el mètode de cultiu microbiològic es considera l' oficial per a la detecció d' aquests patògens. Però, hi ha importants inconvenients, ja que no només requereix més temps, sinó que també és laboriós i consumeix molts recursos. A més, pot ser limitat pel que fa a la detecció de bacteris fisiològicament alterats i/o estressats durant l'emmagatzematge i la conservació. En aquest treball s'ha desenvolupat un protocol senzill i ràpid per a la detecció simultània d' E. coli, L. monocytogenes, S. aureus i S. enterica en aliments, mitjançant la combinació d' una etapa de co-cultiu en medi líquid i la detecció per PCR múltiple. S'ha avaluat l'eficiència de diversos mitjans d'enriquiment i s'ha seleccionat l'aigua de peptona tamponada com el medi òptim per al co-cultiu dels quatre bacteris diana. També es van optimitzar les condicions de PCR múltiple i es van aplicar tant a co-cultius com a mostres d'aliments inoculats artificialment, enciam orgànic i carn picada. Després de l'optimització, la PCR múltiple desenvolupada va ser capaç de detectar els quatre bacteris simultàniament, fins a una inoculació inicial de 10^0 UFC/mL. En presència d' ambdues matrius alimentàries inoculades, després l' etapa de co-cultiu, la PCR múltiple va poder detectar simultàniament els 3 bacteris: E. coli, S. enterica i L. monocytogenes, mentre que S. aureus s' ha detectat per PCR simple, a partir del mateix extracte d' ADN del co-cultiu. Els resultats obtinguts permeten concloure que l' ús d' un pas de co-cultiu en Aigua de peptona tamponada, abans de la detecció per PCR simple i múltiple, pot facilitar la detecció simultània dels quatre bacteris potencialment presents en les matrius alimentàries. La presència o absència del bacteri diana en els aliments es confirma en unes 30 hores, la qual cosa redueix el temps requerit per a la detecció en comparació amb el temps mínim de 7 dies per mètode cultural. Així mateix, permet reduir el nombre de mitjans de cultiu i reactius, per a l' aïllament i identificació de bacteris que no són detectats per PCR i que no estan presents en les matrius alimentàries, la qual cosa suposa un important estalvi econòmic. / [EN] Food safety is a priority for the population and is nowadays more important than ever due to certain dietary trends such as the consumption of raw foods and the widespread distribution of organic foods, which may be the cause of foodborne diseases. To ensure food safety, the detection of these microorganisms must be done quickly and efficiently. Although, the microbiological culture method is considered to be the official method for the detection of these food-borne pathogens, it suffers from significant drawbacks, such as time-consuming, laborious and expensive, in addition it may be limited regarding the detection of physiologically altered and/or stressed bacteria, during storage and preservation. In this work has been developed a simple and rapid protocol for the simultaneous detection of E. coli, L. monocytogenes, S. aureus and S. enterica in food, by combining a liquid co-culture step and detection by multiplex PCR. The efficiency of several enrichment media was evaluated and buffered peptone water was chosen as the optimal medium for the co-culture of the four target bacteria. Then, optimized multiplex PCR conditions were applied to both the co-cultures and the samples of artificially inoculated foods, organic lettuce and ground meat. After optimization, the developed multiplex PCR was able to simultaneously detect the four bacteria, up to an initial inoculation of 10^0 CFU/mL. In the presence of the two inoculated food matrices, after a co-culture step, the multiplex PCR could simultaneously detect the 3 bacteria: E. coli, S. enterica and L. monocytogenes, whereas, S. aureus has been detected by simplex PCR, from the same co-culture DNA template. The results obtained allow conclusion that the use of a co-culture step in Buffered Peptone Water, before detection by simplex and multiplex PCR, can facilitate the simultaneous detection of the four bacteria potentially present in the food matrices. The presence or the absence of the target bacteria in food is confirmed in approximately 30 hours, which reduce the time required for the detection compared to the minimum time of 7 days by cultural method. Also, it allows to reduce the number of culture media and reagents, for the isolation and identification of bacteria that are not detected by PCR and which are not initially present in the food matrices, which represents a significant economic savings. / Boukharouba, A. (2022). Isolation and Identification of Foodborne Pathogens of Special Interest in Food Safety [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182828