As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.

As fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de efeitos tóxicos ocasionados por estas proteínas. Através de dois métodos cromatográficos (troca-iônica em CM-Sepharose e hidrofóbica em Phenyl-Sepharose) foi isolada uma isoforma de fosfolipase A2 ácida presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni, denominada de BmooPLA2. Quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, BmooPLA2 apresentou massa molar relativa de aproximadamente 14.000. A proteína isolada, BmooPLA2, possui uma única cadeia polipeptídica, pI~5,2, é rica em aminoácidos hidrofóbicos, ácidos e possui 14 resíduos de cisteína. Esta isoforma pH-termoestável apresentou alta atividade fosfolipásica. A enzima induziu edema moderado in vivo, na concentração de 25 g. Além disso, a BmooPLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária de modo dose dependente e induzir efeito hipotensor nas concentrações de 15 e 30 g . Foi realizada também a construção da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha da serpente Bothrops moojeni, onde o cDNA que codifica a proteína BmooPLA2 foi clonado e a proteína recombinante expressa em E. coli. Todos os ESTs (Expressed Sequence Tags) foram classificados de acordo com a homologia de sua estrutura primária com sequências conhecidas. As sequencias codificando para toxinas representaram cerca de 30% do total de sequências identificadas. De acordo com o transcriptoma, as toxinas mais expressas pela serpente Bothrops moojeni são as metaloproteases (SVMP), as quais correspondem a aproximadamente 77% das toxinas encontradas. A proteína recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa BmooPLA2, sugerindo que a recBmooPLA2 foi expressa, purificada e reenovelada em sua forma ativa. Como nenhum estudo abordou a participação das PLA2s ácidas de Bothrops nos processos inflamatórios e os mecanismos envolvidos na liberação desses mediadores, particularmente os prostanóides, as toxinas nativa e recombinante foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a resposta inflamatória (ensaios sobre leucócitos in vitro), avaliando a expressão da enzima COX-2 e liberação do prostanóide PGE2, além de outros mediadores como TXB4 e LTB2, após a incubação com macrófagos isolados, in vitro. Com estes resultados foi possível uma melhor compreensão da composição da peçonha desta serpente, bem como um melhor entendimento da participação das PLA2s ácidas envenenamento ofídico, abrindo novas perspectivas para sua aplicação biotecnológica. / The phospholipase A2 (PLA2s) are enzymes that induce various pharmacological effects and usually correspond to a higher percentage of the protein content of snake venoms. Thus, isolation, biochemical, functional and structural characterization of PLA2s may generate important information for a better understanding of the pharmacological effects and toxicity induced by these proteins. Through two chromatographic steps (ion exchange on CMSepharose and hydrophobic in Phenyl-Sepharose) an acidic phospholipase A2 isoform was isolated from the venom of the snake Bothrops moojeni and named BmooPLA2. Its biochemical and partial functional characterization were also performed. When submitted to electrophoresis on polyacrylamide gel with denaturing agent (SDS-PAGE), BmooPLA2 presented relative molar mass of approximately 14,000. The isolated protein, BmooPLA2, has a single polypeptidic chain, pI ~ 5.2, is rich in hydrophobic amino acids and has 14 cysteine residues. This pH-thermostable isoform showed high phospholipasic activity. The enzyme induced moderate edema in vivo, at the concentration of 25 g. In addition, BmooPLA2 was able to inhibit platelet aggregation in a dose dependent manner and showed hypotensive effect at different concentrations (15 and 30 g). It was also carried out the construction of the cDNA library from the venom gland of the snake Bothrops moojeni, where the cDNA encoding the protein BmooPLA2 was cloned and a recombinant protein expressed in E. coli. All ESTs (Expressed Sequence Tags) were classified according to their primary structure homology with known sequences. The sequences coding for toxins accounted for approximately 30% of all identified sequences. According to the transcriptome, the majority of the toxins expressed by the snake Bothrops moojeni are metalloproteases (SVMP), which correspond to approximately 77% of the toxins found. The recombinant protein presented the same amino acid sequence, phospholipase activity and inhibitory effect on platelets, observed for the native BmooPLA2, suggesting that recBmooPLA2 was expressed, purified and refolded in its active form. Since no study has addressed the involvement of acidic PLA2s from Bothrops genus upon inflammatory processes and the mechanisms involved in the release of such mediators, particularly prostanoids, native and recombinant toxins were evaluated for their effects on the inflammatory response (essays on leukocytes in vitro), evaluating the expression of COX-2 and prostanoid release of PGE2, as well as other mediators as TXB4 and LTB2, after incubation with isolated macrophages, in vitro. With these results it was possible to better understand the composition of the venom of this snake, and a better understanding of the role of acidic PLA2s on the snake envenomation, opening new perspectives for its biotechnological application.

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:37Z : No. of bitstreams: 1 000849914.pdf: 1571481 bytes, checksum: a13d0db3f8c4f4bc8ed5e8460b1d9f2d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-09-10Bitstream added on 2014-06-13T18:20:27Z : No. of bitstreams: 1 gasparotto_vpo_me_botfm.pdf: 823732 bytes, checksum: 72bbebb42d3239b78a28393a5aa3b0b7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O estudo avaliou a viabilidade in vitro do biomaterial “Selante de Fibrina derivado de veneno de serpente” (SF), como arcabouço para células tronco mesenquimais (CTMs) de ratos. O SF é um material caracterizado como adesivo biológico, e foi produzido e fornecido pelo Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, CEVAP, Brasil. As CTMs foram coletadas a partir da medula óssea de fêmures e tíbias de ratos e foram caracterizadas por meio de citometria de fluxo com auxilio de marcadores positivos: CD 44 e CD 90 (CTMs) e marcador negativo: CD 34 (células tronco hematopoiéticas). Cultivos foram induzidos para diferenciarem-se em linhagens específicas (osteogênico, condrogênico e adipogênico). Para avaliação do crescimento in vitro e a viabilidade celular em conjunto ao biomaterial foram utilizadas microscopia óptica de luz invertida, microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura e transmissão. O SF em contato com as CTMs não induziu a diferenciação espontânea para as linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. As diferentes técnicas de avaliação microscópica utilizadas mostraram que o SF foi capaz de realizar a captura e manutenção das CTMs e houve interação das células com o interior e superfície do biomaterial. Portanto, a coleta, o cultivo e a caracterização das CTMs de ratos foram possíveis. O SF mostrou-se eficiente como arcabouço biológico e interagiu com as células tronco mesenquimais mantendo-as viáveis, oferecendo-se como uma ferramenta de uso clínico-cirúrgico alternativa para processos regenerativos visando terapias mais eficientes / This study evaluated the in vitro viability of biomaterial Fibrin Sealant (FS) derived from snake venom as a scaffold for rat mesenchymal stem cells (MSCs). The FS is characterized as a biological adhesive material, and is produced and was supplied by the Center for the Study of Venoms and Venomous Animals, CEVAP, Brazil. MSCs were collected from the bone marrow of femurs and tibias of rat and were characterized using flow cytometry with CD 44 and CD 90 positive markers (MSC) and CD34 negative marker (mononuclear stem cells). Cultivations were induced to differentiate into specific cell lineage (osteogenic, chondrogenic and adipogenic). To evaluate the in vitro growth and cell viability with the biomaterial were used inverted light optical microscopy, fluorescence microscopy and scanning electron microscopy and transmission. The SF did not cause the spontaneous differentiation in contact with MSCs to osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineage. Different microscopy techniques showed that the SF was able to accomplish the capture and maintenance of MSCs and there was interaction with the cell interior and surface of the biomaterial. Finally, the collection, cultivation and characterization of rat MSCs were possible. The SF was effective as a biological scaffold and interacted with the MSCs keeping them viable offering itself as a tool for clinical and surgical alternative providing clinical and surgical therapies more efficient for regenerative processes

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / CHAPTER II: Toxoplasmosis affects a third of world population with high incidence in tropical areas. Since this disease has great relevance in health public, the search for new therapeutic approaches has been considered. Here, we report the antiparasitic effects of BnSP-­7 toxin, a Lys49 phospholipase A2 homologue from Bothrops pauloensis snake venom, on Toxoplasma gondii. BnSP-­7 presented activity against HeLa host cells in higher doses (200 μg/mL to 50 μg/mL) by MTT assay, whereas in lower doses (25 μg/mL to 1.56 μg/mL) does not interfere with HeLa viability. Also, the toxin did not presented effects on T. gondii tachyzoite viability as carried out by trypan blue exclusion, but decreased both adhesion and parasite proliferation, when tachyzoites were treated before infection. We also performed cytokine measurements from supernatants collected from HeLa cells infected with T. gondii tachyzoites previously treated with RPMI or BnSP-­7. MIF and IL-­6 productions by HeLa cells were increased by BnSP-­7 treatment. These data suggest that the BnSP-­7 toxin is an important tool for the discovery of new parasite targets that can be exploited to develop new drugs for toxoplasmosis treatment. / CAPÍTULO II: A toxoplasmose afeta um terço da população mundial com alta incidência em áreas tropicais. Uma vez que esta doença tem grande relevância na saúde pública, a busca por novas abordagens terapêuticas são constantemente exigidas. Neste trabalho nós relatamos os efeitos antiparasitários da toxina BnSP-­7, uma fosfolipase A2 Lys49 homóloga da peçonha de Bothrops pauloensis, em Toxoplasma gondii. BnSP-­7 apresentou citotoxicidade contra células HeLa em doses mais elevadas (200 μg/mL a 50 ug/ ml), enquanto que em doses mais baixas (25 ug/ml a 1,56 ug/ml), a toxina não interferiu na viabilidade da HeLa. A toxina não alterou a viabilidade de formas taquizotas de T. gondii, realizado pelo ensaio de exclusão de azul de tripan, mas diminuiu tanto a adesão quanto à proliferação desses parasitas, quando foram tratados antes da infecção. Também foi realizado a dosagem de citocinas a partir de sobrenadantes recolhidos a partir de células HeLa infectadas com formas taquizoítas de T. gondii previamente tratados com meio RPMI ou BnSP-­7. A produção de MIF e IL-­6 foram aumentadas pelas células HeLa após o tratamento com BnSP-­7. Estes dados sugerem que a toxina BnSP-­7 é uma ferramenta importante para a descoberta de novos alvos de parasitas que podem ser explorados para desenvolver novos fármacos para o tratamento da toxoplasmose. / Mestre em Genética e Bioquímica

Interest in research about Bothrops snake is growing, since the venom of these animals are used for therapeutic purposes. This study aimed to determine the bacteria in the oral cavity and venom in snakes of the species Bothrops atrox of a commercial breeding. We used 12 samples taken with the aid of sterile swab in the sheath region of prey, in animals with stomatitis, 30 samples of secretion in the mouth of healthy snakes and their dehydrated venom. The Samples were plated on agar- agar XLD blood and subsequently held If Gram staining and catalase tests and mannitol for Gram positive bacteria identification. For the identification of Gram negative bacteria was employed biochemical screening with Rugai medium Lysine. In the 30 healthy animals and six samples of venom the following Gram negative bacteria were isolated: Proteus spp (34.15%), Escherichia coli (26.84%), Citrobacter spp (14.63%), Serratia spp (9.75 %) and Enterobacter spp (7.31%) and Gram positive: Staphylococcus spp (4.88%) and Bacillus cereus (2.44%). In the 12 snakes with stomatitis Escherichia coli was isolated (26.31%), Citrobacter spp (21.05%), Proteus spp (15.78%), Salmonella (10.52%), and Staphylococcus spp (26.31%). Fisher\'s exact test showed a significant difference between samples of Staphylococcus spp from healthy snakes and serpents with stomatitis, suggesting that this microrganism is related to the cases of stomatitis in Bothrops atrox. / O interesse por pesquisas com serpentes do gênero Bothrops está em crescimento, já que a peçonha destes animais é utilizada para fins terapêuticos. Objetivou-se avaliar as bactérias presentes na cavidade oral e na peçonha em serpentes da espécie Bothrops atrox de um criatório comercial. Utilizaram-se 12 amostras colhidas com auxílio de swab esterilizado na região da bainha da presa, em animais que apresentavam estomatite, 30 amostras de secreção da cavidade oral em serpentes saudáveis e as respectivas peçonhas desidratadas, totalizando seis amostras de peçonha. As amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Doenças Infectocontagiosas em meio de transporte Stuart. As amostras foram semeadas em Ágar-sangue e Ágar XLD, posteriormente realizou-se Coloração de Gram e provas de Catalase e Manitol para identificação de bactérias Gram positivas, já para identificação das bactérias Gram negativas empregou-se triagem bioquímica com o Meio de Rugai com Lisina, Kit comercial para identificação de Enterobactérias. Nos 30 animais saudáveis e seis amostras de peçonha foram isoladas as seguintes bactérias Gram negativas: Proteus spp (34,15%), Escherichia coli (26,84%), Citrobacter spp (14,63%), Serratia spp (9,75%) e Enterobacter spp (7,31%) e Gram positivas: Staphylococcus spp (4,88%) e Bacillus cereus (2,44%). Nas 12 serpentes com estomatite isolou-se Escherichia coli (26,31%), Citrobacter spp (21,05%), Proteus spp (15,78%), Salmonella spp (10,52%) e o Staphylococcus spp (26,31%). Através do Teste exato de Fisher encontrou-se diferença significativa de Staphylococcus spp entre amostras de serpentes saudáveis e serpentes com estomatite, o que sugere que este microrganismo está relacionado com os casos de estomatite em Bothrops atrox. / Mestre em Ciências Veterinárias

As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.

As fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de efeitos tóxicos ocasionados por estas proteínas. Através de dois métodos cromatográficos (troca-iônica em CM-Sepharose e hidrofóbica em Phenyl-Sepharose) foi isolada uma isoforma de fosfolipase A2 ácida presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni, denominada de BmooPLA2. Quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, BmooPLA2 apresentou massa molar relativa de aproximadamente 14.000. A proteína isolada, BmooPLA2, possui uma única cadeia polipeptídica, pI~5,2, é rica em aminoácidos hidrofóbicos, ácidos e possui 14 resíduos de cisteína. Esta isoforma pH-termoestável apresentou alta atividade fosfolipásica. A enzima induziu edema moderado in vivo, na concentração de 25 g. Além disso, a BmooPLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária de modo dose dependente e induzir efeito hipotensor nas concentrações de 15 e 30 g . Foi realizada também a construção da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha da serpente Bothrops moojeni, onde o cDNA que codifica a proteína BmooPLA2 foi clonado e a proteína recombinante expressa em E. coli. Todos os ESTs (Expressed Sequence Tags) foram classificados de acordo com a homologia de sua estrutura primária com sequências conhecidas. As sequencias codificando para toxinas representaram cerca de 30% do total de sequências identificadas. De acordo com o transcriptoma, as toxinas mais expressas pela serpente Bothrops moojeni são as metaloproteases (SVMP), as quais correspondem a aproximadamente 77% das toxinas encontradas. A proteína recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa BmooPLA2, sugerindo que a recBmooPLA2 foi expressa, purificada e reenovelada em sua forma ativa. Como nenhum estudo abordou a participação das PLA2s ácidas de Bothrops nos processos inflamatórios e os mecanismos envolvidos na liberação desses mediadores, particularmente os prostanóides, as toxinas nativa e recombinante foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a resposta inflamatória (ensaios sobre leucócitos in vitro), avaliando a expressão da enzima COX-2 e liberação do prostanóide PGE2, além de outros mediadores como TXB4 e LTB2, após a incubação com macrófagos isolados, in vitro. Com estes resultados foi possível uma melhor compreensão da composição da peçonha desta serpente, bem como um melhor entendimento da participação das PLA2s ácidas envenenamento ofídico, abrindo novas perspectivas para sua aplicação biotecnológica. / The phospholipase A2 (PLA2s) are enzymes that induce various pharmacological effects and usually correspond to a higher percentage of the protein content of snake venoms. Thus, isolation, biochemical, functional and structural characterization of PLA2s may generate important information for a better understanding of the pharmacological effects and toxicity induced by these proteins. Through two chromatographic steps (ion exchange on CMSepharose and hydrophobic in Phenyl-Sepharose) an acidic phospholipase A2 isoform was isolated from the venom of the snake Bothrops moojeni and named BmooPLA2. Its biochemical and partial functional characterization were also performed. When submitted to electrophoresis on polyacrylamide gel with denaturing agent (SDS-PAGE), BmooPLA2 presented relative molar mass of approximately 14,000. The isolated protein, BmooPLA2, has a single polypeptidic chain, pI ~ 5.2, is rich in hydrophobic amino acids and has 14 cysteine residues. This pH-thermostable isoform showed high phospholipasic activity. The enzyme induced moderate edema in vivo, at the concentration of 25 g. In addition, BmooPLA2 was able to inhibit platelet aggregation in a dose dependent manner and showed hypotensive effect at different concentrations (15 and 30 g). It was also carried out the construction of the cDNA library from the venom gland of the snake Bothrops moojeni, where the cDNA encoding the protein BmooPLA2 was cloned and a recombinant protein expressed in E. coli. All ESTs (Expressed Sequence Tags) were classified according to their primary structure homology with known sequences. The sequences coding for toxins accounted for approximately 30% of all identified sequences. According to the transcriptome, the majority of the toxins expressed by the snake Bothrops moojeni are metalloproteases (SVMP), which correspond to approximately 77% of the toxins found. The recombinant protein presented the same amino acid sequence, phospholipase activity and inhibitory effect on platelets, observed for the native BmooPLA2, suggesting that recBmooPLA2 was expressed, purified and refolded in its active form. Since no study has addressed the involvement of acidic PLA2s from Bothrops genus upon inflammatory processes and the mechanisms involved in the release of such mediators, particularly prostanoids, native and recombinant toxins were evaluated for their effects on the inflammatory response (essays on leukocytes in vitro), evaluating the expression of COX-2 and prostanoid release of PGE2, as well as other mediators as TXB4 and LTB2, after incubation with isolated macrophages, in vitro. With these results it was possible to better understand the composition of the venom of this snake, and a better understanding of the role of acidic PLA2s on the snake envenomation, opening new perspectives for its biotechnological application.

As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.

A peçonha de anêmonas do mar é uma fonte conhecida de compostos bioativos, incluindo peptídeos, que atuam em canais voltagem-dependentes. Foram descritos 4 tipos de neurotoxinas de anêmonas do mar, que atuam em canais NaV e 4 tipos que atuam em canais KV. Essas toxinas têm permitido discriminar subtipos de canais voltagem-dependentes, estreitamente relacionados, e constituem poderosas ferramentas para estudar o funcionamento e estrutura desses canais. Neste estudo, foram isolados e caracterizados três peptídeos da fração neurotóxica da anêmona do mar Anthopleura cascaia. Esses peptídeos foram nomeados como AcaIII1425, AcaIII2970 e AcaIII3090, onde Aca faz referência a espécie e os números seguem os resultados obtidos nas etapas de purificação. A peçonha foi extraída por meio de estímulos elétricos e purificada por gel-filtração (Sephadex G-50) e fase reversa por HPLC (C-18). As massas moleculares foram obtidas por meio de MALDI-TOF, apresentando 3337,4 Da para a AcaIII1425, 4881,7 Da para a AcaIII2970 e 4880,5 Da para AcaIII3090. Através da técnica de voltage-clamp, esses peptídeos foram testados em diferentes subtipos de canais NaV e KV expressados em ovócito de Xenopus. As toxinas AcaIII2970 e AcaIII3090 retardam, de maneira seletiva, a inativação rápida dos subtipos rNaV1.3, mNaV1.6 e hNaV1.5, enquanto que as outras isoformas testadas permaneceram inalteradas. É importantemente salientar que, a AcaIII2970 e AcaIII3090 também foram examinadas no canal de inseto DmNaV1, revelando uma clara \"filo-seletividade\" na eficácia da atividade das toxinas. A AcaIII2970 e AcaIII3090 inibem fortemente a inativação do canal NaV de inseto, resultando em um aumento na amplitude do pico da corrente e removendo completamente a inativação rápida. Para quantificarmos essa \"filo-seletividade\", foram construídas curvas da dependência da concentração no retardo da inativação induzida pelas toxinas AcaIII2970 e AcaIII3090 nos canais em que apresentaram maior eficácia. Os IC50 foram obtidos após a plotagem dos dados em uma curva sigmoidal. Para a AcaIII2970, os seguintes valores de IC50 foram obtidos: DmNaV1 = 162,19 ± 11,22 nM, mNaV1.6 = 645,92 ± 18,52 nM, rNaV1.3 = 572,56 ± 44,96 nM. Para a AcaIII3090, os seguintes valores de IC50 foram obtidos: DmNaV1 = 99,03 ± 9,25 nM, mNaV1.6 = 158,30 ± 33,86 nM, rNaV1.3 = 371,60 ± 6,48 nM. A AcaIII1425 atua, bloqueando, de modo seletivo os subtipos rKV1.1, rKV1.6 e rKV4.3, enquanto que as outras isoformas testadas permaneceram inalteradas. Devido à maior especificidade da toxina AcaIII1425 pelos subtipos rKV1.1 e rKV1.6, foram realizados ensaios de bloqueio da corrente do canal em função da concentração da toxina (curva dose-resposta). Os valores de IC50 para os subtipos rKV1.1 e rKV1.6 são de 7642,98 ±1601,65 nM e 241,65 ±4,27 nM, respectivamente. Desta forma, a AcaIII1425 é cerca de 32 vezes mais potente em canais do subtipo rKV1.6 do que em relação aos canais do subtipo rKV1.1. A estrutura primária das toxinas foram determinadas por degradação de Edman. A sequência parcial da AcaIII2970 e AcaIII3090 revelou que estas são similares a toxinas de canal de sódio do tipo1 de anêmonas do mar. A sequência completa da AcaIII1425 não apresenta similaridade com toxinas de anêmonas do mar, mas é similar a toxinas de Conus e aranha que possuem um motivo estrutural conhecido como ICK. Dessa forma, propomos que a AcaIII1425 seja um novo grupo de toxinas de anêmonas do mar que bloqueiam KV. Dado o ineditismo da toxina AcaIII1425, foram feitos experimentos in silico para obtermos um maior refinamento do mecanismo de interação entre a toxina e o canal rKV1.6. Estes experimentos indicaram que diferentes regiões dos canais KV são importantes para a seletividade e potência da toxina, corroborando com as propostas que vem sendo descritas / The venom of sea anemones is a known source of bioactive compounds, including peptides that act on voltage-gated ion channels. Four types of neurotoxins from sea anemones, acting on NaV channels, and four types acting on KV channels, have been reported. These toxins have developed the ability to discriminate closely related subtypes of voltage-gated channels, making them powerful tools to studying the function and structure of these channels. In this study, we isolated and characterized three peptides of the neurotoxic fraction from the venom of the sea anemone Anthopleura cascaia. These peptides were named as AcaIII1425, and AcaIII2970 AcaIII3090, where Aca refers to the species and the following numbers refer to results obtained in the purification steps. The venom was milked by electric shock and purified by molecular exclusion (Sephadex G-50) and reverse phase HPLC (C-18). Their molecular weights are 3337.4 Da to AcaIII1425, 4881.7 Da to AcaIII2970 and 4880.5 Da to AcaIII3090, obtained through a MALDI-TOF. Using the voltage-clamp technique, we have assayed the effects of these peptides on different subtypes of NaV and KV channels expressed in Xenopus oocytes. AcaIII2970 and AcaIII3090 toxins selectively slow down the fast inactivation of rNaV1.3, mNaV1.6 and hNaV1.5 subtypes, while the other mammalian isoforms remained unaffected. Importantly, AcaIII2970 and AcaIII3090 were also examined in insect DmNaV1 channel, revealing a clear phyla-selectivity with regards to the efficacy of the toxin. AcaIII2970 and AcaIII3090 strongly inhibit the inactivation of the insect NaV channel, resulting in an increase in the amplitude of the peak current, and complete removal of the fast and steady-state inactivation. In order to quantify this \"phyla-selectivity\", curves of the concentration dependence of the delayed inactivation induced by AcaIII2970 and AcaIII3090 toxins channels with higher efficacy, were built. After plotting the data on a sigmoidal curve the IC50 values were obtained. For AcaIII2970, the following IC50 values were obtained: DmNaV1 = 162.19 ± 11.22 nM, mNaV1.6 = 645.92 ± 18.52 nM and rNaV1.3 = 572.56 ± 44.96 nM. For AcaIII3090, the following IC50 values were obtained: DmNaV1 = 99.03 ± 9.25 nM, mNaV1.6 = 158.30 ± 33.86 nM and rNaV1.3 = 371.60 ± 6.48 nM. AcaIII1425 acts, selectively, blocking rKV1.1, rKV1.6 and rKV4.3 subtypes, while the others isoforms tested remained unaltered. Due the higher specificity of AcaIII1425 to rKV1.1 and rKV1.6 subtypes, assays were performed to evaluate the blocking channel current versus toxin concentration (dose-response curve). IC50 values for the subtypes rKV1.6 and rKV1.1 are 7642.98 ± 1601.65 nM and 241.65 ± 4.27 nM, respectively. Thus, AcaIII1425 is about 32 times more potent in the rKV1.6 than in the rKV1.1 channel. The primary structure of the toxins was determined by the Edman degradation. The partial sequence of AcaIII2970 and AcaIII3090 revealed that these toxins are similar to the type 1 sodium channel sea anemones neurotoxins. The complete sequence of AcaIII1425 has no similarity with other sea anemone toxins, but is similar to the Conus and spider neurotoxins which have a structural motif known as ICK. Thus, we propose that AcaIII1425 comprises a new group of sea anemones toxins that block KV channels. Given the unprecedented nature of the toxin AcaIII1425, in silico assays were carried out in order to further refining the proposed mechanism underlying the interaction between the toxin and the rKV1.6 channel. The results indicate that, in agreement to what has been proposed elsewhere, different regions of the KV channels are important for the toxin selectivity and potency