Le vieillissement de la peau et l'exposition cumulative aux UVs au sein d'une vie affecte un certain nombre d'acteurs de la matrice extracellulaire, majoritairement le collagène, l'élastine, les glycanes et les biomolécules qui leurs sont associés (métalloprotéinases et leurs inhibiteurs, hyaluronidases, etc...) qui peuvent être modifiés en terme de concentration, de structure et/ou de répartition. L'organisation hydrique est également perturbée lors de ce phénomène et l'ensemble de ces modifications aboutit à une perte de fonction de la matrice et à l'apparition de manifestations cliniques du vieillissement. L'objectif de ce travail de thèse effectuée en partenariat avec le Centre de Recherche sur la peau (Pierre Fabre Dermo-Cosmétique) est d'analyser les modifications du derme et de l'organisation hydrique au sein de la matrice, avec l'âge et sous l'effet des UVs, de façon à mieux comprendre les altérations de la peau dans ces conditions. Compte tenu des différentes échelles à explorer - de l'Angstrom au micron -, la combinaison d'un ensemble de techniques est nécessaire pour disposer de lois de comportement de dynamique macromoléculaire qui permettent l'interprétation des résultats. Nous avons tout d'abord validé l'utilisation de la spectroscopie infra-rouge (IRTF), de l'analyse calorimétrique diatherme (ACD) et de la technique des courants thermostimulés (CTS) pour analyser des biopsies cutanées humaines. Ces techniques se sont révélées adaptées pour sonder le derme sur une large gamme d'échelle, et pour apporter des informations pertinentes sur les principales macromolécules du derme et sur son organisation hydrique. Nous avons ensuite suivi l'évolution des réponses thermiques, diélectriques et vibrationnelles du derme au cours du vieillissement chronologique et du photo-vieillissement via une étude clinique portant sur des sujets de deux groupes d'âge (20-30 ans et supérieur à 60 ans). Ce travail a permis d'extraire des marqueurs du vieillissement intrinsèque et extrinsèque. L'évolution de ces réponses a aussi été suivie dans une étude ex vivo portant sur les effets de l'exposition du derme aux UVs, afin de contribuer à la compréhension des différents mécanismes mis en jeu lors du vieillissement chronologique et du photo-vieillissement. / Skin aging and cumulative exposure to UVs within a lifetime affects a number of actors in the extracellular matrix such as collagen, elastin, glycans and associated biomolecules (metalloproteinases and their inhibitors, hyaluronidases, etc). The concentration, structure and / or distribution, and the hydric organization are modified by this phenomenon. All these modifications result in a loss of function of the matrix and the clinical manifestations of aging. The aim of this thesis, carried out in collaboration with the Skin Research Center of Pierre Fabre Dermo-Cosmétique, is to analyze the changes in the dermis and the hydric organization within the matrix with age and under the effect of UVs to help the knowledge of skin alteration under these conditions. Given the different scales to be explored - from Angstrom to the micron - a combination of different techniques is necessary to reach the macromolecular dynamics via behavior laws. Firstly, we validated the use of infrared spectroscopy (FTIR), differential scanning calorimetry (DSC) and thermostimulated Currents (TSC) techniques to analyze human cutaneous biopsies. These techniques were proven to be suitable to scan the dermis over a wide range of scales and to provide relevant information on the main macromolecules of the dermis and the different water structures. Then we studied the evolution of thermal, dielectric and vibrational signatures of the dermis during chronological aging and photo-aging via a clinical study involving subjects from two age groups (20-30 years and over 60 years). Markers of intrinsic and extrinsic aging have been extracted from this work. The evolution of these signatures was also studied in an ex vivo study on the effects of UV exposure of dermis, leading to a better understanding of the different mechanisms involved in chronological aging and photo-aging.

Les actinides sont des radioéléments couramment manipulés par les travailleurs de l'industrie nucléaire et font partie de la menace NRBC (nucléaire, radiologique, biologique, chimique). La contamination cutanée représente une voie d'exposition majeure de ces agents radiologiques. La décontamination de la peau est donc cruciale pour empêcher une dispersion de la contamination et l'absorption systémique du contaminant par la peau. Ce travail s'est attaché à évaluer les profils de pénétration cutanée de deux actinides : l'américium et le plutonium, sous différentes formes, dans un modèle d'étude ex vivo, la peau d'oreille de porc. L'efficacité de décontamination de différents produits usuels a également été testée sur ce modèle, mais aussi sur un modèle in vitro de poudre de couche cornée bovine. Pour compléter l'étude de la décontamination, l'efficacité d'une formulation d'hydrogel de DTPA a également été testée. La détermination de la distribution de la contamination dans la peau a été réalisée à l'aide de différentes techniques d'imagerie : l'autoradiographie par émulsion, le TASTRAK ou encore l'iQID camera. Les résultats ont montré une grande différence dans les profils de pénétration et de rétention des actinides lorsqu'ils sont en solution aqueuse modérément soluble ou en solution organique dans un mélange de solvant. De plus, cette dernière forme modifie fortement la structure cutanée, menant à une forte augmentation de la pénétration cutanée. Les résultats des protocoles de décontamination montrent une efficacité égale du savon (Trait rouge®) comparé au DTPA, qui est le traitement décorporant utilisé également en décontamination. La formulation en hydrogel présente une efficacité supérieure pour le traitement de solutions organiques et met en évidence l'intérêt de développer d'autres formulations galéniques / Actinides are alpha-emitting radioactive elements handled by nuclear industry workers and are part of the NRBC threat (nuclear, radiological, biological, and chemical). Skin contamination represents a major exposure route for these radioelements. Skin decontamination is therefore essential to prevent any dispersion of contamination and systemic absorption through the skin. This work focused the evaluation of skin penetration behavior of two actinides: americium and plutonium, in different forms, in an ex vivo model, pig ear skin. The decontamination efficacy of various products was tested on this model as well as an in vitro model of bovine hide powder. The efficacy of a new DTPA hydrogel formulation was also tested. The localization of in different skin layers was carried out using various imaging techniques: emulsion autoradiography, solid track autoradiography, TASTRAK or iQID camera. Data showed differences in penetration, retention and localization profiles of the different actinides used in moderately soluble aqueous solution or in a solvent mixture. In addition, the latter modifies skin structure that is associated with an increase in skin penetration. Radioactivity activity measurements in skin layers agreed well with distribution as shown by the different autoradiography techniques. The results of decontamination protocols showed an equal efficacy of the soap (Trait rouge®) as compared to DTPA, that is used for decorporation therapy and also for decontamination. The hydrogel formulation showed a superior efficacy for the treatment of organic solutions and demonstrates the interest for development of other pharmaceutical formulations

C'est la pluralité des modèles d'études associés à l'utilisation de techniques variées qui permet aujourd'hui de mieux appréhender le caractère multifactoriel du vieillissement et d'en mieux caractériser les mécanismes-clés : dérégulation de la sensibilité aux nutriments, dysfonctionnement des mitochondries, instabilité génomique, raccourcissement des télomères, altérations épigénétiques, modifications post-traductionnelles non-enzymatiques des protéines, altération des cellules souches, sénescence cellulaire et altération de la communication intercellulaire. Dans un premier temps, nos travaux de recherche in vivo sur le vieillissement du cheveu, chez l'homme et chez la femme, ont permis de caractériser de nouveaux marqueurs cliniques précoces de l'alopécie androgénétique, tels que les signes péripilaires et la diversité des diamètres, et d'établir un lien avec des paramètres biologiques, infiltrats inflammatoires et miniaturisation des follicules pileux, respectivement. De plus, chez la femme non ménopausée, chez qui l'alopécie peut être difficile à diagnostiquer de par son caractère multifactoriel, nous avons pu établir un lien entre le statut en fer et la chute des cheveux. Dans un second temps, nos travaux in vivo sur le vieillissement de la peau chez la femme ménopausée ont permis d'attribuer une signature biologique aux effets cliniques de la DHEA (déhydroépiandrostérone) en application topique, aussi bien au niveau du derme que de l'épiderme. Nous avons aussi caractérisé l'effet d'un C-Xyloside, précurseur de glycosaminoglycane, sur les 3 compartiments de la peau. / Today, the numerous study models associated with the use of various techniques allow a better understanding of the multifactorial nature of aging and a better characterization of the key mechanisms, including deregulated nutrient sensitivity, mitochondrial dysfunction, genomic instability, telomere shortening, epigenetic alterations, non-enzymatic post translational modification of proteins, alterations of stem cells, cellular senescence and impaired intercellular communication. Initially, our in vivo research studies on the aging hair in man and women have revealed new early clinical markers of androgenic alopecia such as peripilar signs and hair diameter diversity, and established a link with biological parameters, as inflammatory infiltrates and miniaturization of hair follicles, respectively. Furthermore, in pre-menopausal women in whom alopecia can be difficult to diagnose due to its multifactorial nature, we could establish a link between iron status and hair loss. Second, our in vivo studies on the aging skin in menopausal woman in whom the effects of age are particularly accentuated allowed to assign a biological signature to the clinical response to topical application of DHEA (dehydroepiandrosterone), both at the dermal and epidermal level of the skin. We also characterized the effect of a glycosaminoglycan C-Xyloside precursor on the 3 compartments of the skin.

L'exposition aux rayons ultraviolets (UV) est essentielle à la vie et bénéfique pour la santé humaine. Cependant, la surexposition aux UV solaires, en particulier aux UVB, rayons les plus énergétiques atteignant la surface terrestre, peut entrainer des cancers de la peau chez l'être-humain comme les cancers de la peau de type non-mélanome (NMSC). La capacité des UVB à initier des NMSC provient principalement de leurs habilités à causer des dommages directs à l'ADN, tels que les dimères cyclobutyliques de pyrimidine (CPD) et les produits pyrimidine-pyrimidone (6-4PP), qui sont pris en charge par le mécanisme de réparation par excision de nucléotide (NER). L'incidence croissante de NMSC chez les patients déficients pour l'une des protéines de la NER souligne l'importance d'un processus fonctionnel. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la NER permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement des cancers de la peau. L'une des premières réponses cellulaires aux dommages CPD/6-4PP induits par UVB dans la peau des mammifères est l'activation de l'enzyme nucléaire poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP1) qui catalyse la formation de polymères d'ADP-ribose. Les précédents travaux de notre laboratoire et d'autres équipes ont démontré que PARP1 et son activité enzymatique facilitent la NER en collaboration avec la protéine UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), qui va aussi s'accumuler rapidement aux sites CPD/6-4PP pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN de la NER. Cependant, plusieurs aspects des interactions de PARP1 avec DDB2 et avec les dommages directs à l'ADN sont inconnus. Ainsi, le premier objectif de mon projet de doctorat a été de caractériser précisément la nature de la liaison de PARP1 aux dommages CPD/6-4PP induits par UV vis-à-vis la protéine DDB2. Mes recherches ont mis en évidence l'empreinte asymétrique formée par PARP1 de -12 à +9 nucléotides de chaque côté des dommages CPD/6-4PP en présence ou en absence de DDB2. Nous avons également démontré que PARP1 augmente l'affinité de DDB2 pour les dommages CPD/6-4PP. De plus, les résultats de notre étude indiquent un rôle de PARP1 indépendant de DDB2 pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN. Cibler PARP1 et son rôle dans les voies de réparation des dommages à l'ADN est l'une des stratégies les plus efficaces développées ces dernières années pour le traitement des cancers des ovaires et du sein. L'application translationnelle de mon projet de doctorat a alors été de comprendre le rôle de PARP1 dans la NER dans le contexte des NMSC. À cet égard, nous avons développé un modèle PARP1-KO dans la lignée de souris SKH-1, qui est un modèle largement adopté pour étudier les NMSC induits par UVB. Puisque les souris SKH-1 développent principalement des carcinomes spinocellulaires (CSC) cutanés après une exposition chronique aux UVB, notre étude rapporte le rôle de PARP1 dans le développement des CSC. En utilisant les souris nouvellement créées SKH-1 PARP1-KO et les souris SKH-1 PARP1-WT avec ou sans application topique d'inhibiteurs de PARP, nous avons mis en évidence que l'absence de PARP1 ou de son activité dans la peau des souris SKH-1 mâles et femelles réduit significativement le fardeau tumoral des CSC et prolonge la période de latence du développement tumoral. L'étude hebdomadaire de l'apparition et de la croissance de tumeurs tout au long du protocole révèlent aussi que cibler PARP1 est très efficace pour ralentir, à l'étape pré-maligne, le développement de CSC. Nos résultats sont surprenants à la lumière des propriétés onco-suppressives rapportées de PARP1 et de son activité catalytique dans des cas de cancérogenèse induits par des dommages à l'ADN causés par des agents alkylants, ainsi que de la susceptibilité croissante des souris knock-out pour d'autres protéines de la NER à développer des CSC induits par UVB. Le rôle de PARP1 dans les mécanismes cellulaires induits par UVB autres que la NER, comme la mort cellulaire et les modulations immunes, pourrait expliquer nos observations. Alors que d'autres analyses sont nécessaires pour comprendre le rôle de PARP1 dans ces mécanismes, notre étude met en avant l'utilisation potentielle d'inhibiteurs de PARP comme nouvel agent chimiopréventif contre les CSC induits par UVB. / The exposure to solar ultraviolet radiation (UV) is essential to life and beneficial to human health. However, an overexposure to terrestrial solar UV, especially its most energetic component UVB, can cause skin cancers including the non-melanoma skin cancers (NMSC) in humans. The NMSC initiating properties of UVB arise predominantly from their ability to cause direct DNA damage such as cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and 6-4photoproducts (6-4PP), which are repaired via nucleotide excision repair (NER) pathway. The increased incidence of NMSC in patients with hereditary defects in NER pathway proteins underscores the importance of efficient NER in humans. Therefore, detailed understanding of the molecular operation of NER pathway can provide novel therapeutic targets for the prevention or treatment of skin cancers. One of the earliest responses of the mammalian skin cells to UVB-induced CPD or 6-4PP is the activation of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1), which catalyzes the formation of polymers of ADP-ribose (PAR). The previous work from other teams and our laboratory have shown that PARP1 and its enzymatic activity facilitate NER in collaboration with UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), which also rapidly accumulates at the CPD/6-4PP site during the DNA damage recognition stage of NER. However, many aspects of interaction of PARP1 with DDB2 and direct DNA damage are not understood. Therefore, the first aim of my doctoral project was to characterize the precise nature of binding of PARP1 vis-à-vis DDB2 at UV-induced CPD/6-4PP. My doctoral research demonstrates that PARP1 casts asymmetric footprint from −12 to +9 nucleotides on either side of the CPD/6-4PP in presence or absence of DDB2. We also demonstrated that PARP1 facilitates the binding of DDB2 to CPD/6-4PP. Moreover, our study reports DDB2-independent role of PARP1 during the DNA damage recognition phase in NER. Targeting the role of PARP1 in DNA strand break repair pathways has emerged as one of the successful strategies for the treatment of ovarian and breast cancers in last decade. Consequently, the ultimate translational goal of my doctoral project was to understand the implication of NER facilitating role of PARP1 in NMSC. In this regard, we first developed a PARP1-KO model in the albino hairless SKH-1 mouse strain, which is a widely adopted mouse model to study UVB-induced NMSC. Since SKH-1 mice mainly develop cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) upon chronic UVB-exposure, our present study reports the role of PARP1 in development of SCC. Using the newly developed PARP1-KO and PARP1-WT SKH-1 mice with or without topical application of PARP inhibitor, we report that the absence of PARP1 or its activity in skin of both male and female SKH-1 mice significantly reduces the SCC tumor burden and prolongs the tumor latency period. The analyses of appearance and growth of individual tumors on a weekly basis during this protocol also revealed that targeting of PARP1 was most effective in suppressing the premalignant stage of the SCC development. Our results are surprising in light of the reported onco-suppressive property of PARP1 and its catalytic activity in alkylating DNA damage-induced tumorigenesis and the increased susceptibility of other NER protein knock-out mice to UVB-induced SCC. We reason that the roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes other than NER, such as cell death and immune modulations, can account for our observation. While further studies are required to understand these roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes, our study underscores the potential for use of PARP inhibitors as a novel chemopreventive agents against UVB-induced SCC.

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Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / Les propriétés biomécaniques des tissus produits par génie tissulaire sont une des caractéristiques qui permet d'évaluer leur fonctionnalité. Ces propriétés peuvent dépendre, entre autres, de la méthode de fabrication utilisée lors de l'assemblage des tissus, du type de cellules utilisé lors de la reconstruction des tissus et des facteurs environnementaux cellulaires et tissulaires en présence lors de la culture des tissus. Dans le but de produire des tissus possédant des propriétés optimales pour d'éventuelles applications cliniques, il est important d'analyser et de comprendre le comportement biomécanique des tissus et de développer des méthodes de fabrication qui permettent de les produire de façon fiable et reproductible. L'objectif principal de cette thèse de doctorat était d'optimiser la fabrication des substituts vasculaires et cutanés reconstruits par la méthode d'auto-assemblage, par la compréhension de leur comportement biomécanique. Les travaux ont d'abord été dirigés vers le développement d'une nouvelle méthode de fabrication qui a permis d'augmenter l'efficacité de la production des substituts vasculaires et d'améliorer leurs propriétés mécaniques et viscoélastiques. Par la suite, des travaux ont été réalisés dans le but d'optimiser la production des substituts cutanés. Les résultats obtenus ont démontré qu'il était possible, par de nouvelles méthodes d'assemblage, d'augmenter la surface des substituts cutanés sans influencer leur structure ni leur contractilité. Un autre objectif poursuivi était de déterminer si l'utilisation de diverses sources cellulaires pouvait avoir une incidence sur les caractéristiques structurales et biomécaniques des substituts vasculaires. Ces travaux ont montré que les cellules artérielles et veineuses permettaient de produire des substituts vasculaires adéquats et que ceux produits à partir de cellules artérielles possédaient des propriétés mécaniques et élastiques supérieures à celles de tissus produits à partir de cellules veineuses. Dans le but de poursuivre l'optimisation de la fonctionnalité et des propriétés biomécaniques des tissus reconstruits, des méthodes permettant de stimuler mécaniquement les tissus pendant leur culture ont été développées. L'étude de la structure et des propriétés mécaniques des tissus résultant de cette culture dynamique a démontré une orientation axiale des composantes tissulaires, en plus d'une augmentation de la production des éléments de la matrice extracellulaire et d'une amélioration des propriétés mécaniques des tissus. En conclusion, le développement de ces nouvelles méthodes de fabrication a permis d'optimiser et de mieux définir certaines propriétés biomécaniques des substituts vasculaires et cutanés et a ainsi contribué à en améliorer leur fonctionnalité pour d'éventuelles applications cliniques.

L'exposition aux rayons ultraviolets (UV) est essentielle à la vie et bénéfique pour la santé humaine. Cependant, la surexposition aux UV solaires, en particulier aux UVB, rayons les plus énergétiques atteignant la surface terrestre, peut entrainer des cancers de la peau chez l'être-humain comme les cancers de la peau de type non-mélanome (NMSC). La capacité des UVB à initier des NMSC provient principalement de leurs habilités à causer des dommages directs à l'ADN, tels que les dimères cyclobutyliques de pyrimidine (CPD) et les produits pyrimidine-pyrimidone (6-4PP), qui sont pris en charge par le mécanisme de réparation par excision de nucléotide (NER). L'incidence croissante de NMSC chez les patients déficients pour l'une des protéines de la NER souligne l'importance d'un processus fonctionnel. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la NER permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement des cancers de la peau. L'une des premières réponses cellulaires aux dommages CPD/6-4PP induits par UVB dans la peau des mammifères est l'activation de l'enzyme nucléaire poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP1) qui catalyse la formation de polymères d'ADP-ribose. Les précédents travaux de notre laboratoire et d'autres équipes ont démontré que PARP1 et son activité enzymatique facilitent la NER en collaboration avec la protéine UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), qui va aussi s'accumuler rapidement aux sites CPD/6-4PP pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN de la NER. Cependant, plusieurs aspects des interactions de PARP1 avec DDB2 et avec les dommages directs à l'ADN sont inconnus. Ainsi, le premier objectif de mon projet de doctorat a été de caractériser précisément la nature de la liaison de PARP1 aux dommages CPD/6-4PP induits par UV vis-à-vis la protéine DDB2. Mes recherches ont mis en évidence l'empreinte asymétrique formée par PARP1 de -12 à +9 nucléotides de chaque côté des dommages CPD/6-4PP en présence ou en absence de DDB2. Nous avons également démontré que PARP1 augmente l'affinité de DDB2 pour les dommages CPD/6-4PP. De plus, les résultats de notre étude indiquent un rôle de PARP1 indépendant de DDB2 pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN. Cibler PARP1 et son rôle dans les voies de réparation des dommages à l'ADN est l'une des stratégies les plus efficaces développées ces dernières années pour le traitement des cancers des ovaires et du sein. L'application translationnelle de mon projet de doctorat a alors été de comprendre le rôle de PARP1 dans la NER dans le contexte des NMSC. À cet égard, nous avons développé un modèle PARP1-KO dans la lignée de souris SKH-1, qui est un modèle largement adopté pour étudier les NMSC induits par UVB. Puisque les souris SKH-1 développent principalement des carcinomes spinocellulaires (CSC) cutanés après une exposition chronique aux UVB, notre étude rapporte le rôle de PARP1 dans le développement des CSC. En utilisant les souris nouvellement créées SKH-1 PARP1-KO et les souris SKH-1 PARP1-WT avec ou sans application topique d'inhibiteurs de PARP, nous avons mis en évidence que l'absence de PARP1 ou de son activité dans la peau des souris SKH-1 mâles et femelles réduit significativement le fardeau tumoral des CSC et prolonge la période de latence du développement tumoral. L'étude hebdomadaire de l'apparition et de la croissance de tumeurs tout au long du protocole révèlent aussi que cibler PARP1 est très efficace pour ralentir, à l'étape pré-maligne, le développement de CSC. Nos résultats sont surprenants à la lumière des propriétés onco-suppressives rapportées de PARP1 et de son activité catalytique dans des cas de cancérogenèse induits par des dommages à l'ADN causés par des agents alkylants, ainsi que de la susceptibilité croissante des souris knock-out pour d'autres protéines de la NER à développer des CSC induits par UVB. Le rôle de PARP1 dans les mécanismes cellulaires induits par UVB autres que la NER, comme la mort cellulaire et les modulations immunes, pourrait expliquer nos observations. Alors que d'autres analyses sont nécessaires pour comprendre le rôle de PARP1 dans ces mécanismes, notre étude met en avant l'utilisation potentielle d'inhibiteurs de PARP comme nouvel agent chimiopréventif contre les CSC induits par UVB. / The exposure to solar ultraviolet radiation (UV) is essential to life and beneficial to human health. However, an overexposure to terrestrial solar UV, especially its most energetic component UVB, can cause skin cancers including the non-melanoma skin cancers (NMSC) in humans. The NMSC initiating properties of UVB arise predominantly from their ability to cause direct DNA damage such as cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and 6-4photoproducts (6-4PP), which are repaired via nucleotide excision repair (NER) pathway. The increased incidence of NMSC in patients with hereditary defects in NER pathway proteins underscores the importance of efficient NER in humans. Therefore, detailed understanding of the molecular operation of NER pathway can provide novel therapeutic targets for the prevention or treatment of skin cancers. One of the earliest responses of the mammalian skin cells to UVB-induced CPD or 6-4PP is the activation of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1), which catalyzes the formation of polymers of ADP-ribose (PAR). The previous work from other teams and our laboratory have shown that PARP1 and its enzymatic activity facilitate NER in collaboration with UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), which also rapidly accumulates at the CPD/6-4PP site during the DNA damage recognition stage of NER. However, many aspects of interaction of PARP1 with DDB2 and direct DNA damage are not understood. Therefore, the first aim of my doctoral project was to characterize the precise nature of binding of PARP1 vis-à-vis DDB2 at UV-induced CPD/6-4PP. My doctoral research demonstrates that PARP1 casts asymmetric footprint from −12 to +9 nucleotides on either side of the CPD/6-4PP in presence or absence of DDB2. We also demonstrated that PARP1 facilitates the binding of DDB2 to CPD/6-4PP. Moreover, our study reports DDB2-independent role of PARP1 during the DNA damage recognition phase in NER. Targeting the role of PARP1 in DNA strand break repair pathways has emerged as one of the successful strategies for the treatment of ovarian and breast cancers in last decade. Consequently, the ultimate translational goal of my doctoral project was to understand the implication of NER facilitating role of PARP1 in NMSC. In this regard, we first developed a PARP1-KO model in the albino hairless SKH-1 mouse strain, which is a widely adopted mouse model to study UVB-induced NMSC. Since SKH-1 mice mainly develop cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) upon chronic UVB-exposure, our present study reports the role of PARP1 in development of SCC. Using the newly developed PARP1-KO and PARP1-WT SKH-1 mice with or without topical application of PARP inhibitor, we report that the absence of PARP1 or its activity in skin of both male and female SKH-1 mice significantly reduces the SCC tumor burden and prolongs the tumor latency period. The analyses of appearance and growth of individual tumors on a weekly basis during this protocol also revealed that targeting of PARP1 was most effective in suppressing the premalignant stage of the SCC development. Our results are surprising in light of the reported onco-suppressive property of PARP1 and its catalytic activity in alkylating DNA damage-induced tumorigenesis and the increased susceptibility of other NER protein knock-out mice to UVB-induced SCC. We reason that the roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes other than NER, such as cell death and immune modulations, can account for our observation. While further studies are required to understand these roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes, our study underscores the potential for use of PARP inhibitors as a novel chemopreventive agents against UVB-induced SCC.

Le traitement des maladies de la peau ainsi que des plaies étendues chroniques ou aiguës par thérapie cellulaire sont révolutionnaires. La préservation des cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes et lors de la production de substituts cutanés est cruciale au succès clinique de ces traitements. L'objectif général de ce projet de doctorat était d'approfondir les connaissances sur la préservation de ces cellules souches. D'abord, les travaux décrits dans cette thèse ont permis de mieux comprendre quels facteurs contribuent à l'établissement d'une niche et donc à la préservation des cellules souches épithéliales dans des substituts cutanés. Ceci a été accompli par une revue systématique des études cliniques décrivant la greffe de substituts cutanés bilamellaires sur des sujets humains au cours des dernières décennies. J'ai trouvé que, bien que plusieurs combinaisons de conditions de culture et de méthodes de production de substituts cutanés puissent mener à l'établissement d'une niche, deux facteurs semblent avoir plus d'importance. Mes résultats indiquent effectivement que l'utilisation d'une couche nourricière ainsi que de sérum - ou d'un remplacement de sérum, tel que de l'extrait de glande pituitaire bovine - dans le milieu de culture sont associés à une meilleure persistance de greffe à long terme. Par la suite, j'ai démontré que l'utilisation d'une couche nourricière d'origine humaine plutôt que murine permettait de maximiser le potentiel prolifératif et la clonogénicité de kératinocytes primaires humains en culture. Cette divergence pourrait s'expliquer par l'activation des voies signalétiques impliquant Akt, STAT5, p53 et AMPKα1. J'ai aussi investigué l'effet du type d'inducteur d'AMP cyclique sur les cultures de kératinocytes et étudié s'il était dépendant du type de couche nourricière employé. Bien que je n'aie pas détecté d'effet d'interaction entre ces facteurs, mes travaux ont cimenté l'isoprotérénol plutôt que la toxine du choléra comme inducteur d'AMP cyclique de choix pour les applications de recherche fondamentale au LOEX. Mes travaux ont ensuite mené à la mise au point d'un système de culture de kératinocytes et de production de substituts cutanés humains avec un milieu sans sérum. En effet, en l'absence d'un milieu sans sérum commercial capable de préserver efficacement les cellules souches épithéliales en culture, mon équipe et moi avons développé ab initio notre propre milieu de culture que nous avons appelé Surge SFM. Contrairement à la norme, ce milieu a été développé pour être utilisé conjointement à une couche nourricière humaine. J'ai démontré que Surge SFM peut être utilisé pour cultiver des kératinocytes fraîchement isolés ainsi que pour amplifier des kératinocytes ayant préalablement été cryopréservés après avoir été cultivés avec du sérum. De plus, mes résultats suggèrent qu'il y a très peu de différences au niveau transcriptomique entre des kératinocytes cultivés avec Surge SFM et le milieu conventionnel avec sérum. D'ailleurs, selon des analyses in silico, ces quelques différences pourraient s'expliquer par une modulation en amont de l'expression d'EHF, un facteur de transcription régulant plus de 400 gènes impliqués dans la différentiation des kératinocytes humains et la formation de l'épiderme. J'ai ensuite montré que ce milieu permet de préserver les populations de cellules souches épithéliales en culture par des essais de clonogénicité et de cytométrie en flux. Finalement, j'ai démontré que ce nouveau milieu chimiquement défini peut être utilisé pour la production de substituts cutanés par autoassemblage et que ces derniers persistent au moins jusqu'à 6 mois après leur greffe sur des souris athymiques, démontrant encore une fois que les cellules souches épithéliales peuvent être préservées avec ce nouveau milieu. Dans l'ensemble, les travaux de cette thèse ont permis de mieux comprendre les facteurs et les conditions favorables à la préservation des populations de cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes primaires humains. Ceci a mené au développement d'un nouveau milieu de culture sans sérum permettant la préservation des cellules souches épithéliales lors de la culture de kératinocytes en monocouche et lors de la production de substituts cutanés bilamellaires, ce qui représente une avancée importante dans le domaine du génie tissulaire cutané.

L’inflammation neurogène est un processus inflammatoire induisant la libération de neuropeptides, en particulier la Substance P et le Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP), par les neurones sensoriels. Lors de ce processus, l’angiogenèse et la réépithélialisation, sont essentielles pour que l’inflammation diminue suite à une lésion. Dans le cadre de pathologies telle que le diabète, les patients sont souvent atteints de neuropathies en plus de souffrir d’une mauvaise guérison des plaies où l’angiogenèse est diminuée. Pour mieux comprendre ses phénomènes, deux modèles ont été reconstruits par génie tissulaire à partir d’éponge de collagène et de chitosane : l’un permettant de mimer un derme endothélialisé innervé reconstruit, et le second est un modèle permettant de suivre la réépithélialisation dans un modèle glyqué par du glyoxal, au cours du temps. À la vue de nos résultats, la Substance P semble être un neuropeptide jouant un rôle majeur dans l’angiogenèse et la réépithélialisation. / Neurogenic inflammation is an inflammatory process, characterized by the release of neuropeptides, particularly substance P and Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP), in sensory neurons. During this process, angiogenesis and reepithelialization following an injury are essential to reduce inflammation. Within certain diseases, such as diabetes, angiogenesis is diminished, and patients are often suffering of diabetic neuropathies and poor wound healing. To understand that process, two models were reconstructed using tissue engineering with a collagen and chitosan sponge: one model mimics a reconstructed endothelialized and innervated dermis, and the second one follows over time re-epithelialization in a glycated model using glyoxal. Based on our results, substance P seems to be a neuropeptide playing a major role in both mechanisms.

La méthode d’auto-assemblage développée au Laboratoire d’Organigénèse Expérimentale (LOEX) est très efficace afin de produire des substituts cutanés autologues absents d’agents exogènes. Une adaptation possible de cette méthode permet d’obtenir un substitut cutané présentant un phénotype psoriasique. L’objectif de ce travail a été de poursuivre la validation du modèle de substitut cutané produit par la méthode d’auto-assemblage en évaluant la capacité métabolique des substituts via l’emploi de molécules antipsoriasiques comme le tazarotène. Pour ce faire, des tests de perméabilité cutanée combinés à une détection par chromatographie ultra performante ont été envisagés afin d’évaluer d’une part les structures adéquates des peaux reconstruites et d’autre part d’établir des liens avec ces résultats et les capacités de métabolisation du modèle. Les résultats obtenus démontrent une capacité métabolique chez les substituts cutanés. De plus, des différences au niveau de la perméabilité sont observées entre les différents types de peau utilisés, confirmant que le modèle est de plus en plus représentatif. / The self-assembly method developed at the LOEX is very effective to produce autologous skin substitutes free of exogenous agents. A possible adaptation of this method allows the reconstruction of a skin substitute having many features of a psoriatic phenotype. The objective of this work was to follow the validation of the skin substitutes produced by the self-assembly method by the evaluation of the skin substitutes metabolism using antipsoriatic molecules like tazarotene. Percutaneous absorption combined with an ultra performance liquid chromatography has been selected in order to evaluate on one hand the appropriate structures of the reconstructed skins and on the other hand, to establish some links with these results and their capacity of metabolism. Results obtained from shown that metabolization has been detected in skin substitutes. Moreover, permeability differences have been observed of each kind of skin used on this study. This confirms that our skin model is more and more representative.