Ureases (EC 3.5.1.5) são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. Elas têm sido isoladas de uma ampla variedade de organismos incluindo plantas, fungos e bactérias, porém não são sintetizadas por animais. As sementes de Canavalia ensiformis são ricas em isoformas de urease, tal como a Canatoxina (CNTX) e JBU (jackbean urease, do inglês). A CNTX é uma proteína neurotóxica, causando diversos efeitos biológicos após injeção por via intraperitoneal em ratos e camundongos, entre eles, atividades pró- inflamatórias e indutora de agregação plaquetária, convulsões, e finalmente, morte dos animais. A CNTX também apresenta efeitos inseticida e antifúngico, potencialmente relevantes para a defesa da planta de origem. Após anos de estudos com a CNTX, verificou-se que JBU também compartilha essas atividades biológicas, como efeitos inseticida e fungitóxico, ativação de plaquetas e de células inflamatórias, incluindo letalidade em ratos e camundongos (por via intravenosa). Na busca pelo mecanismo de ação inseticida, identificou-se um fragmento da urease com efeito letal em insetos, denominado Jaburetox (Jbtx). Indícios da interação desses polipeptídeos com membranas lipídicas nos levou a estudar de que forma esse fenômeno ocorre. Fragmentos do Jbtx originados de mutações sítio-dirigidas foram testados a fim de investigar a relação estrutura X função. Foram usados neste estudo, além de JBU e Jbtx, a porção amino-terminal do Jbtx isolada, chamada de Jbtx N-ter, a sua região carboxi-terminal, ou Jbtx C-ter, e ainda o peptídeo com a região do grampo beta removida, ou Jbtx Δ-β. Por meio de ensaios com lipossomos, foi possível certificar-se que todas as proteínas ligam-se e interagem com as vesículas de maneira muito similar. A capacidade das moléculas de inserção em bicamadas lipídicas foi confirmada através da técnica de planar lipid bilayer, determinando-se as propriedades biofísicas dos canais formados, e sugerindo que o peptídeo Jbtx representa a principal região da JBU capaz de interagir com membranas biológica. Os resultados contribuem para a compreensão mais aprofundada dos mecanismos de ação de ureases e peptídeos derivados, assim como das relações estrutura x função implicadas nesses mecanismos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are niquel dependent enzymes that hydrolyse urea into ammonium and carbon dioxide. They have been isolated from many organisms, including plants, fungi and bacteria, but are not synthesized by animals. Canavalia ensiformis seeds are source of urease isoforms, like Canatoxin (CNTX) and jackbean urease (JBU). CNTX is a neurotoxic protein, displaying several biological effects after intraperitoneal injection in rats or mice, including proinflammatory and platelet aggregation activity, and convulsions followed by death of the animals. CNTX also presents insecticidal and fungitoxic effects, which are probably relevant for defense mechanisms of the source plant. After some years of studies, it was found that JBU also share these biological activities, such as entomotoxic and antifungal effects, activation of platelets and inflammatory cells, including lethality in rats and mice (intravenously). In the search for the insecticidal mode of action, an urease fragment lethal to insects was identified and named Jaburetox (Jbtx). Evidence of the interaction of these polypeptides with lipid membranes led us to investigate how this phenomenom takes place. Site-directed mutagenesis to obtain Jbtx fragments was applied in the search for structure X function relationships. Besides JBU and Jbtx, a peptide corresponding to Jbtx’s amino-terminal half (Jbtx N-ter), a peptide corresponding to Jbtx’s carboxi-terminal half (Jbtx C-ter) and a mutant with deletion of a beta hairpin motif (Jbtx Δ-β) were used in the present study. Working with liposomes it was possible to verify that all proteins bind and interact with vesicles, in a similar way. The ability of these molecules to insert into lipid bilayers was confirmed through the planar lipid bilayer technique. The biophysical properties of the ion channels formed by each polypeptide were characterized, suggesting that Jbtx is the main region from JBU able to interact with lipid membranes. The results contribute to deepen our understanding of the modes of action of JBU and derived peptides, as well as of the structure X function relationships involved in these mechanisms.

Ureases (EC 3.5.1.5) são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. Elas têm sido isoladas de uma ampla variedade de organismos incluindo plantas, fungos e bactérias, porém não são sintetizadas por animais. As sementes de Canavalia ensiformis são ricas em isoformas de urease, tal como a Canatoxina (CNTX) e JBU (jackbean urease, do inglês). A CNTX é uma proteína neurotóxica, causando diversos efeitos biológicos após injeção por via intraperitoneal em ratos e camundongos, entre eles, atividades pró- inflamatórias e indutora de agregação plaquetária, convulsões, e finalmente, morte dos animais. A CNTX também apresenta efeitos inseticida e antifúngico, potencialmente relevantes para a defesa da planta de origem. Após anos de estudos com a CNTX, verificou-se que JBU também compartilha essas atividades biológicas, como efeitos inseticida e fungitóxico, ativação de plaquetas e de células inflamatórias, incluindo letalidade em ratos e camundongos (por via intravenosa). Na busca pelo mecanismo de ação inseticida, identificou-se um fragmento da urease com efeito letal em insetos, denominado Jaburetox (Jbtx). Indícios da interação desses polipeptídeos com membranas lipídicas nos levou a estudar de que forma esse fenômeno ocorre. Fragmentos do Jbtx originados de mutações sítio-dirigidas foram testados a fim de investigar a relação estrutura X função. Foram usados neste estudo, além de JBU e Jbtx, a porção amino-terminal do Jbtx isolada, chamada de Jbtx N-ter, a sua região carboxi-terminal, ou Jbtx C-ter, e ainda o peptídeo com a região do grampo beta removida, ou Jbtx Δ-β. Por meio de ensaios com lipossomos, foi possível certificar-se que todas as proteínas ligam-se e interagem com as vesículas de maneira muito similar. A capacidade das moléculas de inserção em bicamadas lipídicas foi confirmada através da técnica de planar lipid bilayer, determinando-se as propriedades biofísicas dos canais formados, e sugerindo que o peptídeo Jbtx representa a principal região da JBU capaz de interagir com membranas biológica. Os resultados contribuem para a compreensão mais aprofundada dos mecanismos de ação de ureases e peptídeos derivados, assim como das relações estrutura x função implicadas nesses mecanismos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are niquel dependent enzymes that hydrolyse urea into ammonium and carbon dioxide. They have been isolated from many organisms, including plants, fungi and bacteria, but are not synthesized by animals. Canavalia ensiformis seeds are source of urease isoforms, like Canatoxin (CNTX) and jackbean urease (JBU). CNTX is a neurotoxic protein, displaying several biological effects after intraperitoneal injection in rats or mice, including proinflammatory and platelet aggregation activity, and convulsions followed by death of the animals. CNTX also presents insecticidal and fungitoxic effects, which are probably relevant for defense mechanisms of the source plant. After some years of studies, it was found that JBU also share these biological activities, such as entomotoxic and antifungal effects, activation of platelets and inflammatory cells, including lethality in rats and mice (intravenously). In the search for the insecticidal mode of action, an urease fragment lethal to insects was identified and named Jaburetox (Jbtx). Evidence of the interaction of these polypeptides with lipid membranes led us to investigate how this phenomenom takes place. Site-directed mutagenesis to obtain Jbtx fragments was applied in the search for structure X function relationships. Besides JBU and Jbtx, a peptide corresponding to Jbtx’s amino-terminal half (Jbtx N-ter), a peptide corresponding to Jbtx’s carboxi-terminal half (Jbtx C-ter) and a mutant with deletion of a beta hairpin motif (Jbtx Δ-β) were used in the present study. Working with liposomes it was possible to verify that all proteins bind and interact with vesicles, in a similar way. The ability of these molecules to insert into lipid bilayers was confirmed through the planar lipid bilayer technique. The biophysical properties of the ion channels formed by each polypeptide were characterized, suggesting that Jbtx is the main region from JBU able to interact with lipid membranes. The results contribute to deepen our understanding of the modes of action of JBU and derived peptides, as well as of the structure X function relationships involved in these mechanisms.

Ureases (EC 3.5.1.5) são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. Elas têm sido isoladas de uma ampla variedade de organismos incluindo plantas, fungos e bactérias, porém não são sintetizadas por animais. As sementes de Canavalia ensiformis são ricas em isoformas de urease, tal como a Canatoxina (CNTX) e JBU (jackbean urease, do inglês). A CNTX é uma proteína neurotóxica, causando diversos efeitos biológicos após injeção por via intraperitoneal em ratos e camundongos, entre eles, atividades pró- inflamatórias e indutora de agregação plaquetária, convulsões, e finalmente, morte dos animais. A CNTX também apresenta efeitos inseticida e antifúngico, potencialmente relevantes para a defesa da planta de origem. Após anos de estudos com a CNTX, verificou-se que JBU também compartilha essas atividades biológicas, como efeitos inseticida e fungitóxico, ativação de plaquetas e de células inflamatórias, incluindo letalidade em ratos e camundongos (por via intravenosa). Na busca pelo mecanismo de ação inseticida, identificou-se um fragmento da urease com efeito letal em insetos, denominado Jaburetox (Jbtx). Indícios da interação desses polipeptídeos com membranas lipídicas nos levou a estudar de que forma esse fenômeno ocorre. Fragmentos do Jbtx originados de mutações sítio-dirigidas foram testados a fim de investigar a relação estrutura X função. Foram usados neste estudo, além de JBU e Jbtx, a porção amino-terminal do Jbtx isolada, chamada de Jbtx N-ter, a sua região carboxi-terminal, ou Jbtx C-ter, e ainda o peptídeo com a região do grampo beta removida, ou Jbtx Δ-β. Por meio de ensaios com lipossomos, foi possível certificar-se que todas as proteínas ligam-se e interagem com as vesículas de maneira muito similar. A capacidade das moléculas de inserção em bicamadas lipídicas foi confirmada através da técnica de planar lipid bilayer, determinando-se as propriedades biofísicas dos canais formados, e sugerindo que o peptídeo Jbtx representa a principal região da JBU capaz de interagir com membranas biológica. Os resultados contribuem para a compreensão mais aprofundada dos mecanismos de ação de ureases e peptídeos derivados, assim como das relações estrutura x função implicadas nesses mecanismos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are niquel dependent enzymes that hydrolyse urea into ammonium and carbon dioxide. They have been isolated from many organisms, including plants, fungi and bacteria, but are not synthesized by animals. Canavalia ensiformis seeds are source of urease isoforms, like Canatoxin (CNTX) and jackbean urease (JBU). CNTX is a neurotoxic protein, displaying several biological effects after intraperitoneal injection in rats or mice, including proinflammatory and platelet aggregation activity, and convulsions followed by death of the animals. CNTX also presents insecticidal and fungitoxic effects, which are probably relevant for defense mechanisms of the source plant. After some years of studies, it was found that JBU also share these biological activities, such as entomotoxic and antifungal effects, activation of platelets and inflammatory cells, including lethality in rats and mice (intravenously). In the search for the insecticidal mode of action, an urease fragment lethal to insects was identified and named Jaburetox (Jbtx). Evidence of the interaction of these polypeptides with lipid membranes led us to investigate how this phenomenom takes place. Site-directed mutagenesis to obtain Jbtx fragments was applied in the search for structure X function relationships. Besides JBU and Jbtx, a peptide corresponding to Jbtx’s amino-terminal half (Jbtx N-ter), a peptide corresponding to Jbtx’s carboxi-terminal half (Jbtx C-ter) and a mutant with deletion of a beta hairpin motif (Jbtx Δ-β) were used in the present study. Working with liposomes it was possible to verify that all proteins bind and interact with vesicles, in a similar way. The ability of these molecules to insert into lipid bilayers was confirmed through the planar lipid bilayer technique. The biophysical properties of the ion channels formed by each polypeptide were characterized, suggesting that Jbtx is the main region from JBU able to interact with lipid membranes. The results contribute to deepen our understanding of the modes of action of JBU and derived peptides, as well as of the structure X function relationships involved in these mechanisms.

OLIVEIRA, S.T. Uso do peptídeo sintético Lys-a1 no favorecimento da atividade antimicrobiana de ciprofloxacina contra Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. 2014. 89 f. Dissertação (MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2014. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-01T13:21:48Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_stdoliveira.pdf: 2487485 bytes, checksum: d0cf8dea8b60a03dcd5bf061b1c033af (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-10-03T14:48:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_stdoliveira.pdf: 2487485 bytes, checksum: d0cf8dea8b60a03dcd5bf061b1c033af (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-03T14:48:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_stdoliveira.pdf: 2487485 bytes, checksum: d0cf8dea8b60a03dcd5bf061b1c033af (MD5) Previous issue date: 2014 / Most microorganism lies embedded in communities called "biofilms". Among these stand out Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen of plants, animals and humans, frequently associated with nosocomial infections difficult to be eradicated due to the presence of biofilm. The fluoroquinolone antibiotics such as ciprofloxacin (CIP) against this bacterium are used, however, the mechanism of resistance has been developed for this microorganism. Thus, new forms of microbial control have been the subject of numerous studies in order to replace or enhance conventional methods. For this purpose, antimicrobial peptides (AMPs) obtained from various living beings represent an alternative to the development of new drugs. Synthetic forms analogous to Hylin a1 AMP (Hy-a1), isolated from species Hypsiboas albopunctatus, has shown excellent antimicrobial efficacy, among which stand out the peptide Lys-[Trp6]hy-a1 (Lys-a1). Thus, the aim of this work was to verify the influence of the peptide Lys-a1 in antimicrobial activity of CIP against pathogenic microorganism Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) and the curve death were determined to CIP and Lys-a1 separately. The influence of Lys-a1 in the antimicrobial activity of the CIP has been verified by the checkerboard method to quantify the biomass and the number of viable cells in biofilms by crystal violet staining and counting of colony forming units (CFU), respectively. The MIC and MBC values of Lys-a1 was 125 μg.mL-1 and the CIP was 0.24 and 0.48 μg.mL-1, respectively. The data showed that both the CIP as Lys-a1 are potent antibiotics against P. aeruginosa is able to inhibit both the planktonic growth and biofilm development. The interaction of substances interpreted by the fractional inhibitory concentration index (FICI) and showed an additive effect, establishing a decrease of 16 times the MIC and MBC of the CIP, when combined with the Lys-a1. This effect was also observed in the kinetics of death and antibiofilm activity. In conclusion, the additive effect of the Lys-a1 and CIP in antimicrobial activity suggests that the peptide has potential as a therapeutic agent and an adjuvant for the treatment of infectious diseases caused by P. aeruginosa can enable the use of lower concentrations of the antibiotic. / A maioria dos micro-organismos encontra-se integrados em comunidades denominadas “biofilme”. Dentre estes se destaca a Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista de vegetais, animais e humanos, frequentemente associado à infecções nosocomiais difíceis de serem erradicadas devido à presença de biofilme. Os antibióticos fluoroquinolonas, tais como a ciprofloxacina (CIP), são utilizados contra esta bactéria, entretanto, mecanismos de resistência vem sendo desenvolvidos por este micro-organismo. Assim, novas formas de controle microbiano têm sido alvo de inúmeras pesquisas a fim de substituir ou potencializar os métodos convencionais. Para esse fim, peptídeos antimicrobianos (AMPs) obtidos de diversos seres vivos representam uma alternativa para o desenvolvimento de novas drogas. Formas sintéticas análogas ao AMP Hilina a1 (Hy-a1), isolado da espécie Hypsiboas albopunctatus, tem demonstrado excelente eficácia antimicrobiana, dentre os quais se destacam o peptídeo Lys-[Trp6]hy-a1 (Lys-a1). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi verificar a influência do peptídeo Lys-a1 na atividade antimicrobiana de CIP contra o micro-organismo patogênico Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. A concentração inibitória mínima (CIM), a concentração bactericida mínima (CBM) e a curva de morte foram determinadas para a CIP e a Lys-a1, separadamente. A influência da Lys-a1 na atividade antimicrobiana da CIP foi verificada pela metodologia checkerboard com quantificação da biomassa e do número de células viáveis do biofilme através da coloração pelo cristal violeta e contagem de unidades formadoras de colônia (UFC), respectivamente. Os valores de CIM e CBM da Lys-a1 foi de 125 μg.mL-1, e para a CIP foi de 0,24 e 0,48 μg.mL-1, respectivamente. Os dados mostraram que tanto a CIP quanto a Lys-a1 são potentes antimicrobianos contra P. aeruginosa, sendo capazes de inibir tanto o crescimento planctônico como o desenvolvimento do biofilme. A interação das substâncias foi interpretada pelo índice de concentração inibitória fracional (ICIF) e mostrou um efeito aditivo, estabelecendo uma diminuição de 16 vezes da CIM e da CBM da CIP, quando combinada com a Lys-a1. Esta influência foi observada também na cinética de morte e na atividade antibiofilme. Em conclusão, o efeito aditivo entre a Lys-a1 e a CIP na atividade antimicrobiana sugere que o peptídeo tem potencial como um agente terapêutico e adjuvante para o tratamento de doenças infecciosas causadas por P. aeruginosa, podendo habilitar o uso de concentrações menores do antibiótico.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-10-16T15:09:11Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 989533 bytes, checksum: 691738d9623dc109309055a3300f56c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-16T15:09:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 989533 bytes, checksum: 691738d9623dc109309055a3300f56c3 (MD5) Previous issue date: 2015-03-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O vírus da Dengue é um arbovírus da família Flaviviridae que acomete grande parte da população mundial, possuindo quatro sorotipos (1-4), os quais ocasionam respostas imunes duradouras, mas diferentes. São vírus de RNA fita simples com polaridade positiva de aproximadamente 11Kb, codificando 10 proteínas, sendo 3 delas estruturais e 7 não estruturais. Estudos revelam que peptídeos de secreção de anfíbios possuem várias funções, dentre elas estão atividades antiviral e antimicrobiana, com isso, sequências destes peptídeos vêm sendo sintetizadas e testadas in vitro, a fim de obter compostos ativos para a fabricação de drogas de amplo espectro e de múltipla aplicabilidade. Os peptídeos de atividade antimicrobiana (PAM) são os mais estudados e eles devem apresentar uma toxicidade seletiva e rápida ação frente aos microorganismos. Por não existir nenhuma droga antiviral eficaz conta o vírus em questão, temos por objetivo avaliar a atividade antiviral de um peptídeo sintético, denominado HS-1, onde sua sequência foi obtida previamente da secreção do anfíbio anuro Hypsiboas semilineatus. Após realizar um teste de citotoxicidade, foram realizados ensaios de neutralização a fim de se investigar seu mecanismo de ação contra o vírus da dengue. Com o intuito de verificar uma possível proteção dos receptores celulares, o peptídeo foi incubado previamente com as células, em um ensaio posterior o peptídeo foi incubado previamente com o vírus, para verificar se o PAM agia sobre a partícula viral e em seguida foram realizados ensaios para verificar se o peptídeo tinha ação sobre a adsorção, internalização e replicação viral. Os resultados foram promissores, pois mostraram que o peptídeo em questão age sobre a partícula viral dos 4 sorotipos da dengue de uma forma muito eficaz, sendo que nas maiores concentrações a inibição chega a 100%, além de ter efeito sobre a inibição da adsorção, o que foi observado para os sorotipos 2 e 3. / Dengue virus is an arbovirus of Flaviviridae family, which has been the most within the world population. There are four serologic types of dengue virus (DENV 1-4), which cause long lasting, though different, immune responses. They are single positive-strand RNA viruses with of approximately 11Kb in length. This RNA is responsible for encoding 10 proteins, 3 structural and 7 non-structural. Several studies reveal that some peptides from skin of amphibians have antimicrobial and antiviral activities. Therefore, sequences of these peptides were synthesized and tested in vitro in order to obtain biologically active compounds to develop drugs with wide spectrum and multiple applicability. The antimicrobial peptides are the most studied and they must present a selective toxicity and quick action against microorganism. Effective drugs against dengue virus haven’t been developed yet. Thereat, the present study aimed to evaluate the antiviral activity against dengue virus of the synthetic peptide HS-1, which sequence was previously obtained from the skin of the anuran Hypsiboas semilineatus. In the cytotoxicity assay, and afterwards neutralization assays were performed to investigate the mechanism of action of the HS-1 peptide against Dengue virus. The first neutralization assay was carried out to determine whether the HS-1 peptide could confer protection to cell receptors against viral infection. For this, the peptide was pre-incubated with VERO cells. In the second neutralization assay the peptide was pre-incubated with Dengue virus to evaluate the ability of this peptide to act directly on viral particle. The subsequent assays were performed in order to determine whether the peptide would act over adsorption, internalization and virus replication. The results were promising; they showed that the peptide in question acts on the viral particle of the four dengue serotypes in a very effective manner. With higher concentrations of peptide, the inhibition reached 100%. In addition, it was found very promising results against inhibition adsorption to serotypes 2 and 3.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-08-22T13:09:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertacao_DiogoCavalcanti_BC.pdf: 3366342 bytes, checksum: 1cb002141032824ff8d879898ca1256e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-22T13:09:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertacao_DiogoCavalcanti_BC.pdf: 3366342 bytes, checksum: 1cb002141032824ff8d879898ca1256e (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / FACEPE / O aumento da produtividade agrícola é impactado negativamente por estresses bióticos e abióticos, que são os principais responsáveis pela drástica redução da produção do feijão-caupi (Vigna unguiculata). Para se defender dos estresses bióticos, os vegetais desenvolveram sofisticados mecanismos, incluindo o sistema de defesa pré-invasivo, localizado nas partes externas dos vegetais e impedindo a entrada do patógeno, e a imunidade inata, que reconhece estruturas fundamentais dos microorganismos e induz a produção de proteínas de combate aos patógenos. Dentre elas as defensinas, que inviabilizam o estabelecimento de agentes invasores. Por sua vez, o melão-de-são-caetano (Momordica charantia) dispõe de transcriptoma sequenciado e destaca-se pelo seu potencial antimicrobiano. A partir de análises in silico no transcriptoma dessa espécie foram selecionados cinco genes-candidatos da classe das defensinas. Destes, o gene McDef1 apresentou domínio conservado completo com predição de atividade antifúngica. A defensina McDef1 exibe regiões conservadas na maioria das defensinas de plantas incluindo oito cisteínas, uma serina na posição 8, um aminoácido aromático na posição 11 e resíduos de glicina nas posições 13 e 34. Após análise fenéticas a McDef1 foi agrupada com outras defensinas já descritas com atividades antifúngicas in vitro e/ou in vivo, o que reforça a predição revelada pelas análises in silico. Um vetor pAHASMCDEF1, portando o gene McDef1 e Atahas, que confere resistência ao herbicida Imazapyr, foi construído e utilizado para bombardear 880 embriões de feijão-caupi através da técnica de biobalística. Destes, sete plantas transformadas foram geradas, com eficiência de transformação semelhante àquela de trabalhos anteriores com feijão-caupi. As próximas etapas compreendem a multiplicação das plantas transformadas até a geração T3, após o que as mesmas serão inoculadas com fungos fitopatogênicos, os quais podem causar perdas de até 50% na produção em feijão-caupi. / Increased agricultural productivity is negatively impacted by biotic and abiotic stresses, that are responsibles for the drastic reduction in cowpea (Vigna unguiculata) production. To defend against biotic stresses, plants have developed sophisticated mechanisms including a pre-invasive defense system, located in the external parts of plants to prevent pathogenic entry, and the innate immunity, which recognizes fundamental structures of microorganisms and induces proteins production that avoid the pathogen establishment. Among them defensins, that prevent the establishment of invading agents. In turn, the bitter melon (Momordica charantia) disposes a sequenced transcriptome and stands out for its antimicrobial potential. After an in silico analysis of M. charantia transcriptome, five defensin gene candidates were selected. Of these, McDef1 gene exhibited a complete conserved domain with prediction of its antifungal activity. The McDef1 defensin displayed conserved regions similar to most plant defensins including eight cysteines, a serine at position 8, an aromatic amino acid at position 11 and glycine residues at positions 13 and 34. After phenetic analyzes, McDef1 was grouped with other defensins previously described with in vitro and/or in vivo antifungal activity, reinforcing the in silico prediction analysis. A pAHASMCDEF1 vector was constructed, bearing the McDef1 and Atahas gene, which confers resistance to the herbicide Imazapyr, being used for bombardment of 880 cowpea embryos by biolistic technique. Of these, seven transformed plants were generated, with transformation efficiency similar to previous reports for cowpea. The next steps include the multiplication of transformed plants up to the T3 generation, after which they will be inoculated with pathogenic fungi, which can cause losses of up to 50% in cowpea production.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T13:02:02Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3228996 bytes, checksum: 780644153c363d1add4ea91f8694ce39 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T13:02:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3228996 bytes, checksum: 780644153c363d1add4ea91f8694ce39 (MD5) Previous issue date: 2003-03-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte da população humana. Esse fato é causado, em grande parte, pelo surgimento de microrganismos multi-resistentes aos antibióticos. Portanto, apesar da disponibilidade de um grande número de antibióticos de última geração, torna-se ainda fundamental buscar compostos que possam atuar como novas drogas a serem utilizadas no combate as doenças infecciosas. Em plantas, a atividade antimicrobiana pode ser demonstrada por vários tipos de moléculas, como as proteínas relacionadas com a patogenicidade, os componentes orgânicos das plantas, as famílias de peptídeos antimicrobianos e as espécies ativas de oxigênio e nitrogênio. Atualmente, peptídeos antimicrobianos de origem vegetal estão sendo utilizados como modelos para o desenho de novas drogas com aplicação nas áreas agrícolas e de saúde. Deste modo, nosso trabalho objetivou a determinação da metodologia mais eficaz para a purificação dos peptídeos catiônicos, presentes em sementes maduras de soja, com atividade antimicrobiana ou outras, e a caracterização bioquímica destes peptídeos visando à obtenção de informações de importância para a elucidação de suas funções biológicas. Os peptídeos de semente madura de soja foram extraídos, na proporção de 1:5 (gramas semente : mL tampão), em tampão fosfato de sódio 25 mM, pH 7,4, contendo KCl 100 mM, EDTA 2 mM, PVP 1,5% (p/v), tiouréia 2 mM, PMSF 1 mM e benzamidina 1 mM por homogeneização do extrato durante 2 h a 4 °C, em banho de gelo. O extrato obtido foi centrifugado a 20.300 x g a 4 °C e o sobrenadante obtido após o final da extração foi fracionado com sulfato de amônio sólido 35% sat. e centrifugado sob as mesmas condições. O sobrenadante foi aquecido a 80°C por 15 min e novamente centrifugado sob as mesmas condições. Após a diálise do extrato em membrana de exclusão de 1.000 Da, foram realizadas as cromatografias de troca aniônica, em coluna DEAE- Sepharose equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; a de exclusão molecular, em coluna Superdex Peptide equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, contendo 150 mM de NaCl; e a de fase reversa, em coluna C 18 equilibrada com acetonitrila 80% e TFA 0,1%, para obtenção dos peptídeos catiônicos purificados. A análise em espectrômetro de massa das frações eluídas do HPLC indicou a presença de compostos de massas moleculares menores do que 500 Da, 678,61 Da e 700,60 Da, a presença de peptídeos com massas moleculares de 5.809,11 Da, 8.526,97 Da e 14.113,18 Da. A seqüência de aminoácidos do peptídeo de 5.809,11 Da foi determinada e mostrou alta homologia com as cadeias B da pró-insulina humana e de vários outros organismos, da insulina bovina e da insulina de feijão-de-porco (Canavalia ensiformes). Os compostos presentes em dois pools eluídos da cromatografia de exclusão molecular, pool 2 e pool 3, inibiram o crescimento da bactéria Gram-negativa Ralstonia solanacearum, enquanto que, para a bactéria Gram-positiva Clavibacter michiganensis, somente o pool 3 exerceu alguma ação, mas com a inibição do crescimento muito menor do que a obtida para a Ralstonia solanacearum. Assim, estes compostos apresentam potencial antimicrobiano a ser explorado na indústria agrícola. / The infectious diseases are among the main causes of death of the human population. That fact occurs, mainly, for the appearance of multi-resistant microrganisms to the antibiotics. Therefore, in spite of the readiness of a great number of antibiotics of last generation, it becomes still important to look to substances new that can act as new drugs it be used in the combat the infectious diseases. In plants, the antimicrobial activity can be demonstrated by several types of molecules, as the proteins related with the patogenicity, the organic components from the plants, the families of antimicrobial peptides and the active species of oxygen and nitrogen. Now, antimicrobial peptides of vegetable origin are being used as models for the drawing of new drugs with application in the agricultural areas and health. In this way, our work objectified the determination of the most effective methodology for the purification of the cationic peptides, presents in mature seeds of soybean, with antimicrobial activity or other, and the biochemical characterization of these peptides seeking to the obtaining importance information for the elucidation of its biological functions. The peptides of mature seed of soybean was extracted, in the proportion of 1:5 (grams seed: mL), in 25 mM buffer phosphate, pH 7.4, with 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 1.5% (p/v) PVP, 2 mM thioureia, 1 mM PMSF and 1 mM benzamidine for stirring of the extract during 2 h at 4 °C and centrifuged (20,300 x g, 4 °C). As the first steps of purification, proteins were recovered from a 35% sat. ammonium sulfate precipitation (2h, 4 o C) after centrifugation, incubated at 80 o C for 15min and centrifuged again. After the dialysis of the extract in membrane of 1,000 Da, they were accomplished the chromatography of anion exchangers, in DEAE-Sepharose column equilibrated in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0; the one of gel filtration, in Superdex Peptide column equilibrated in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, with 150 mM of NaCl; and the one RP- HPLC, in C18 column equilibrated with acetonitrile 80% and TFA 0,1%, for obtaining of the cationic peptides purified. The analysis in mass spectrometer of the fractions eluted from HPLC indicated the presence of composed of smaller molecular mass than 500 Da, 678.61 Da and 700.60 Da, the peptides presence with molecular mass of 5,809.11 Da, 8,526.97 Da and 14,113.18 Da. The sequence of amino acids of the peptide of 5,809.11 Da was determined and it showed high homology with the chain B of the human pro-insulin and of several other organisms, of the bovine insulin and of jack bean insulin (Canavalia ensiformes). The present compositions in two pools eluted of the chromatography of molecular exclusion, pool 2 and pool 3, inhibited the growth of the bacteria Gram-negative Ralstonia solanacearum, while, for the bacteria Gram-positive Clavibacter michiganensis, only the pool 3 exercised some action, but with the inhibition smaller growth than obtained it for the Ralstonia solanacearum. Thus, these matters own antimicrobial potential to be explored in the agricultural industry. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-18T14:02:34Z No. of bitstreams: 2 TESE Jéssica do Nascimento.pdf: 8406202 bytes, checksum: 3044ddac08c83d542d9985dca68d8798 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-18T14:02:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Jéssica do Nascimento.pdf: 8406202 bytes, checksum: 3044ddac08c83d542d9985dca68d8798 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-04-25 / Rede Nanobiotecnologia-CAPES / Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) e os peptídeos anticongelantes (PACs) constituem uma nova classe de agentes antimicrobianos que desempenham sua função através da desestabilização das membranas, levando à morte do microrganismo. Este fato tem direcionado vários estudos para a compreensão dos mecanismos de ação destes peptídeos. Por outro lado, um dos principais problemas na utilização dos PAMs como princípio ativo é devido a eles serem compostos lábeis, podendo ser facilmente degradados. O desenvolvimento de um sistema de liberação controlada (SLC), como por exemplo, lipossomas capazes de carrear esses PAMs, seria uma alternativa promissora para o uso desses peptídeos como agentes antimicrobianos. Desta forma, nesta tese utilizamos diferentes técnicas espectroscópicas (voltametria cíclica, impedância, ressonância de plásmons de superfície, espalhamento de luz e fluorescência) para elucidar os mecanismos de ação dos PAMs MagaininaI, LL-37, Clavanina A e Clavanina X e do PAC Pa-MAP usando modelos de membranas e estudamos um SLC revestido com o copolímero em bloco Synperonic. Todos os PAMs estudados apresentaram grande capacidade para desestabilizar membranas, demonstrando o potencial desses peptídeos como agentes antimicrobianos. O Pa-MAP apresentou a habilidade em desestabilizar as membranas lipídicas no primeiro minuto de exposição, atuando através do modelo carpete, sendo este mecanismo descrito pela primeira vez para este PAC. Foi mostrado, também pela primeira vez, um possível SLC para PAMs utilizando vesículas lipídicas revestidas com o copolímero Synperonic. A importância do copolímero tribloco para estabilizar lipossomas foi demonstrada, uma vez que os lipossomas sem o revestimento foram instáveis, devido à formação de poros pelo peptídeo, o que não foi observado para os lipossomas revestidos. Os resultados obtidos fornecem contribuições importantes para a compreensão da interação peptídeomembrana através de parâmetros eletroquímicos, dielétricos, ópticos e morfológicos, além de poder contribuir para o desenvolvimento de novos sistemas de liberação de drogas para peptídeos antimicrobianos baseados em lipossomas.

Os peptídeos bioactivas são fundamentais no sistema imune inato (SII), devido a que eles proveem informação importante sobre o SII. O objetivo deste estudo é caracterizar os componentes e reações do SII em quilópodes. Para isto, analisamos o transcriptoma dos hemócitos de Scolopendra subspinipes subspinipes; assim como também, extraímos, purificamos e caracterizamos os peptídeos antimicrobianos presentes na exúvia, o extrato total e a hemolinfa de S. s. subspinipes e S. viridicornis. Várias frações com atividade antimicrobiana foram isoladas da hemolinfa. Dois novos peptídeos antimicrobianos foram caracterizados e sintetizados: a Pinipesina, de S. s. subspinipes e a Lacraina, de S. viridicornis. A análise preliminar do transcriptoma apresentou que os contigs relacionados ao SII foram transcritos com mais frequência moléculas com atividade regulatória (33,7%) e de reconhecimento (11,6%), e as relacionadas a cascata de coagulação (21,4%). Uma análise mais completa do transcriptoma e das moléculas bioactivas é apresentado. / Bioactive peptides are vital in the innate immune system (IIS), because they provide substantial information about the IIS. This study aims to characterize the components and reactions that constitute the ISS in Chilopoda. For this, we analyzed the hemocytes transcriptome from Scolopendra subspinipes subspinipes; as also extracted, purified and characterized the bioactive peptides presents in the exuviae, the body extract and the hemolymph from S. s. subspinipes and S. viridicornis. Several fractions with antimicrobial activity from the hemolymph were isolated. Two new antimicrobial peptides were characterized and synthetized as well: The Pinipesin, from S. s. subspinipes, and the Lacrain, from S. viridicornis. The preliminary analysis from the transcriptome show that the contigs related to the IIS were transcribed more frequently molecules with regulatory (33,7 %) and recognition (11,6%) activities, and those involved in the coagulation cascade (21,4%). A more complete analysis of the transcriptome and the bioactive molecules is presented.

Filmes de Langmuir são usados como modelos simplificados de membranas celulares, cujas propriedades podem ser correlacionadas com efeitos fisiológicos de moléculas de interesse biológico, como os peptídeos antimicrobianos (PAMs). Nesta dissertação investigamos a interação do peptídeo Aureína 1.2, na forma de monômero (AU), dímero ((AU)2K) e com variações na porção N-terminal (KAU e DAU), com filmes de Langmuir obtidos do extrato lipídico da bactéria Escherichia coli. Todos os peptídeos injetados em concentrações de 20 a 200nM se incorporaram ao filme de Langmuir, causando expansão nas isotermas de pressão superficial, que foi significativamente maior para o dímero. O módulo de compressibilidade do filme de E. coli à pressão superficial correspondente à de uma membrana real praticamente dobrou, de cerca de 40mN/m para 80nM/m para o dímero, ao passo que para os outros peptídeos a alteração não foi significativa. Dos espectros de reflexão e absorção no infravermelho com modulação de polarização (PM-IRRAS), observou-se que todos os peptídeos interagiram tanto com as caudas quanto com as cabeças polares das moléculas do extrato de E. coli no filme de Langmuir. Diferentemente dos resultados de pressão e compressibilidade, não há tendência de um peptídeo ter interação mais relevante do que os outros. O maior efeito do dímero na expansão e compressibilidade do filme de Langmuir não se refletiu numa maior atividade bactericida contra E. coli, pois sabe-se da literatura que a atividade é maior para a Aureína 1.2 (AU). Provavelmente porque essa atividade deve depender da camada externa de lipopolissacarídeos de uma bactéria Gram-negativa. / Langmuir films are used as simplified cell membrane models whose properties can be correlated with physiological effects of molecules of biological interest, such as antimicrobial peptides (AMPs). In this dissertation we report on the interaction of Aurein 1.2 peptide as monomer (AU), dimer ((AU)2K) and modified peptide in the N-terminal portion (KAU and SAD), with Langmuir films obtained from a lipid extract of Escherichia coli. All peptides injected at concentrations from 20 to 200nM were incorporated into the Langmuir film, causing the surface pressure isotherm to expand, particularly for the dimer. The compressibility modulus of the E. coli Langmuir film at the surface pressure corresponding to an actual membrane nearly doubled, from about 40mN/m to 80nM/m for the dimer, whereas for the other peptides the change was not significant. From the polarization-modulated infrared reflection - absorption spectra (PM-IRRAS), we observed that all peptides interacted with both tails and polar heads of the molecules of E. coli extract in the Langmuir film. Unlike the results of pressure and compressibility, there was no tendency of a peptide having more relevant interaction than the others. The larger effect of the dimer in the expansion and compressibility of the Langmuir film was not reflected in a higher bactericidal activity against E. coli, since it is known from literature that the activity is higher for Aurein 1.2 (AU). Probably because this activity should depend on the outer layer of lipopolysaccharides of Gram-negative bacteria.