O estudo de peptídeos grampeados, que estabilizam voltas de hélices-α com a ligação de uma cadeia química, desenvolveu-se na última década, uma vez que a adição de um elemento não peptídico (grampo) mostrou aumentar o conteúdo de hélice e a estabilidade conformacional destas moléculas. A consequente manutenção de um arcabouço estrutural definido possibilita, em princípio, simular regiões específicas da superfície de proteínas e, assim, modular terapeuticamente potenciais vias de sinalização associadas. Neste sentido, a capacidade de antecipar a eficácia de grampos sobre peptídeos específicos através de simulações computacionais pode contribuir na aceleração e na redução de custos no processo de planejamento racional de novos fármacos. O presente trabalho buscou avaliar a capacidade de simulações por dinâmica molecular em reproduzir o efeito conformacional de grampos olefínicos em um peptídeo derivado da RNAse A. Foram utilizados três diferentes campos de força: AMBER99SB-ILDN, CHARMM36 e GROMOS54a7, e os resultados foram comparados a dados de dicroismo circular obtidos experimentalmente, além de análises de RMSD, RMSF, estrutura secundária e conteúdo de hélice. Os parâmetros utilizados com o campo de força átomo unido GROMOS54a7 foram os que mais se aproximaram dos dados experimentais, embora não tendo sucesso na descrição de dois dos três grampos nos parâmetros simulados, mas tendo um desempenho melhor do que campos de força que descrevem todos os átomos do sistema. Tais resultados indicam que, com melhorias na parametrização, a dinâmica molecular pode ser utilizada para antecipar efeitos conformacionais de grampos olefínicos em peptídeos. / The study of stapled peptides, which stabilize turns of an alpha-helix through the addition of a linker, has developed in the last decade since it was shown that the addition of the staple enhanced helical content and conformational stability of peptides. The maintenance of a structural scaffold allows the simulation of specific regions of protein surfaces, and thus allows the therapeutical modulation of signaling pathways of interest. The ability to anticipate the efficacy of the addition of a staple in a peptide through computational simulations may contribute to enhance the speed and lower the costs associated with rational drug design. This work evaluated the capability of molecular dynamics simulations to reproduce the effect of all-hydrocarbon staples in an RNAse A-derived peptide. We used three different force fields: AMBER99SB-ILDN, CHARMM36 and GROMOS54a7, and the results were compared to experimentally obtained circular dichroism data. The parameters used with the GROMOS54a7 united-atom force field revealed themselves to be more closely related to experimental data, even though it does not reproduce the effect of the addition of a staple in two of three stapled peptides, but it also shows an enhanced performance when compared to all-atom force fields. These results indicate that, with further enhancement of parametrization, molecular dynamics simulations may be used to anticipate conformational effects of all-hydrocarbon staples in peptides.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-29T19:41:10Z No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-30T17:37:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-30T17:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MarianaDornellesCherobim.pdf: 2253045 bytes, checksum: 30449b1622cd0a37b98957acf907b947 (MD5) / Peptídeos antimicrobianos (PAM) são componentes do sistema imune inato da maioria dos seres vivos. Estas moléculas vêm despertando um crescente interesse como alternativas aos antibióticos clássicos, uma vez que podem apresentar atividade antimicrobiana potente contra um amplo espectro de microrganismos, inclusive contra microrganismos resistentes aos antimicrobianos disponíveis. Por mais dinâmica que sejam as indústrias farmacêuticas na busca por novos fármacos, é praticamente impossivel o mercado farmacêutico acompanhar o espantoso fenômeno da multirresistência apresentada por muitos microrganismos. Neste contexto, os PAMs surgem como uma alternativa farmacológica, pois podem ser usados isoladamente ou combinados entre si ou com outros antibióticos clássicos. Neste estudo foi avaliada a atividade antimicrobiana de dois peptídeos sintéticos e análogos denominados Pa-MAP 1.5 e Pa-MAP 1.9, derivados de um peptídeo do peixe Pleuronectes americanus. Os dois análogos tiveram sua homogeneidade e grau de pureza analisados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e posteriormente foram submetidos a ensaios antimicrobianos, isoladamente e em combinação, contra a bactéria Gram-negativa Klebsiella pneumoniae e avaliados também, com relação à sua atividade citotóxica Os resultados in vitro evidenciaram uma forte atividade sinérgica com CIM de 4/4g.ml-1, dos peptídeos, sendo que esta concentração não se mostrou citotóxica. Resultados dos testes In vivo, mostraram que a combinação de peptídeos foi eficiente, sendo observado um decréscimo notável de UFCs de K. pneumoniae no sangue bem como nos pulmões, de camundongos Black C57/bl6. Os animais foram tratados com os peptídeos combinados, inoculados por via intravenosa, utilizando concentrações de 36 mg.Kg-1, 18mg.Kg-1 e 9mg.Kg-1 para o peptídeo Pa-MAP 1.5; e para o peptídeo Pa-MAP 1.9 as doses utilizadas foram de 4mg.Kg-1, 2mg.Kg-1 e 1mg.Kg-1. Com o objetivo de entender como ocorre o acoplamento e a interação destes peptídeos, foram propostos modelos tridimensionais in silico através de modelagem molecular. Resultados das modelagens in silico sugerem uma estrutura em α-hélice anfipática, para ambos os peptídeos. Quando se realizou o acoplamento molecular dos peptídeos com uma membrana aniônica, os peptídeos conjugados 11 apresentaram uma alta taxa de afinidade, corroborando assim com os resultados experimentais in vitro e in vivo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Antimicrobial peptides (AMPs) are innate immune system components, which are present in several living organisms. This molecules interesting is growing as an alternative for traditional antibiotics due to their potent antimicrobial activities against a broad range of microorganisms including those resistant to classical antibiotics. In spite of pharmaceutical companies dynamism for new drugs discovery, have been virtually impossible to pharmaceutical market to keep up the amazing multidrug resistance phenomen shown by many microorganisms. By this way, antimicrobial peptides stand out as promising pharmacological alternatives, since they can be used alone or in combination to classic antibiotic. In this view, the present study characterized the activity of two synthetic analogues, named Pa-MAP 1.5 and Pa-MAP 1.9 from Pleuronectes americanus fish. Both analogs had the homogeinity and purity degree checked by MALDI-ToF mass spectrometry. Moreover, peptides were assayed according their antibacterial activity, alone and in combination against Gram-negative Klebsiella pneumonia as well as their hemolytic activity. Data in vitro assay demonstrate a strong synergistic activity between peptides, with MIC of 4/4g.ml-1. Nevertheless at this concentration they did not showed cytolytic effects. The in vivo results showed that peptides combination were capable to pronounced decrease K. pneumoniae’s UFCs in blood count, as well in black C57/bl6 mouse’s lung. The animals were treated with the combined peptides via intravenously using concentrations of 36 mg.Kg-1, 18 mg.Kg-1 and 9 mg.Kg-1 for Pa-MAP 1.5; and 4mg.Kg-1, 2mg.Kg-1 e 1mg.Kg-1 for Pa-MAP 1.9. In order to understand these peptides interact in silico three-dimensional models were constructed by molecular modeling. Results of in silico modeling suggest amphipathic α-helical structures for both peptides. When molecular peptide docking was performed with anionic membranes, conjugated peptides showed high affinity rates, thus corroborating with in vitro and in vivo data presented.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Laboratório de Biofísica, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-02-13T19:20:31Z No. of bitstreams: 1 2014_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 4612555 bytes, checksum: 6dee7baa09b2069ce2fb0ef9d358bcec (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-03-12T20:41:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 4612555 bytes, checksum: 6dee7baa09b2069ce2fb0ef9d358bcec (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T20:41:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 4612555 bytes, checksum: 6dee7baa09b2069ce2fb0ef9d358bcec (MD5) / A bradicinina (Bk) é um nonapeptídeo vasodilatador que apresenta regiões com aminoácidos susceptíveis à ação de proteases. Quando metabolizada, a Bk não promove vasodilatação, devido à meia-vida reduzida. O objetivo deste trabalho é analisar a atividade da Bk e de dois análogos na presença de um inibidor de proteases denominado black-eyed pea trypsin/chymotrypsin (BTCI). Sistemas contendo BTCI e Bk e seus análogos foram caracterizados estruturalmente na forma de complexos moleculares, por métodos espectroscópicos. As atividades dessas moléculas nas formas livre e de complexos, bem como o efeito na contratilidade em músculo liso de cobaia, foram avaliadas em ensaios colorimétricos in vitro e ex vivo. Além disso, o efeito do BTCI na potencialização da ação hipotensora da Bk e dos seus análogos foi investigado por meio de ensaios in vivo em ratos normotensos. As dimensões moleculares do BTCI na presença dos peptídeos, monitoradas por espalhamento de luz dinâmico, indicou formação de complexos entre estas moléculas. Esse processo foi associado a alterações conformacionais na estrutura do BTCI, monitoradas por espectroscopia de dicroísmo circular distante do UV. Adicionalmente, ensaios enzimáticos mostraram que o BTCI mantém sua atividade inibitória contra proteases na presença dos peptídeos e impede a degradação de Bk e seus análogos por estas proteases. Os ensaios em íleo de cobaia demonstraram que Bk e seus análogos apresentam atividade na contração do músculo liso, que é mantida quando adicionadoso BTCI e as proteases. Quando o BTCI foi testado in vivo em ratos Wistar, associado à Bk e aos análogos, diminuição da resistência vascular e, consequentemente, da hipotensão, foram observadas, além da vasodilatação renal e aórtica, principalmente quando complexado com a Bk e a Bk2. O presente estudo mostrou a inibição de proteases pelo BTCI na presença de Bk e seus análogos e indica este inibidor como uma ferramenta promissora para o aumento dos efeitos da Bk que visem o controle da hipertensão. Além disso, foi mostrado que os análogos de Bk podem ser utilizados como estratégia para o desenvolvimento de um sistema hipotensor de ação prolongada. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bradykinin (Bk) is a vasodilator nonapeptide presenting amino acid residues susceptible to proteases cleavage. Bk does not promote vasodilation when metabolized due its reduced half-life in this condition. The aim of this study was to analyze the activity of Bk and two analogs in the presence of the protease inhibitor named black-eyed pea trypsin proteases/chymotrypsin, BTCI. The BTCI, Bk and its analogues were characterized by spectroscopic methods in free and complexes forms. Ex vivo assays using guinea pig ileum were carried out to monitor the activity of the molecules in solution. Furthermore, the potentiation of the hypotensive action of Bk and its analogues, in the presence of BTCI, was investigated in normotensive rats. The hydrodynamic diameters of BTCI in the presence of peptides,monitored by dynamic light scattering, indicated the formation of complexes between these molecules. It was associated with conformational changes of BTCI,indicated by far- UV circular dichroismspectroscopy. Additionally, enzymatic assays showed that BTCI retains its inhibitory activity against proteases in the presence of these peptides, inhibiting their proteolytic degradation. Tests on guinea pig ileum demonstrated that BK and its analogues exhibit activity on the smooth muscle in the absence and presence of BTCI. When BTCI was tested in vivo on Wistar rats, in the presence of Bk and its analogues, induced a decrease in vascular resistance and, consequently, hypotension, as well as renal and aortic vasodilation, mainly when in complex with Bk and Bk2. This study indicates BTCI as a promising tool for increasing the effects of Bk aiming hypertension control. Furthermore, it shows that BK analogues are good strategies for the development of a system for prolonged hypotensive action.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T10:47:04Z No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T10:47:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-27T10:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Tityus pachyurus é uma das espécies causadoras de escorpionismo grave na Colômbia e pouco se conhece sobre as toxinas que constituem sua peçonha. O presente projeto teve como objetivo principal identificar novas toxinas moduladoras de canais para Na+ na peçonha de T. pachyurus. Pela construção da biblioteca de cDNA da glândula peçonhenta de um escorpião T. pachyurus se identificarem 5 novas toxinas putativas da família dos peptídeos com atividade em canais para Na+ e por similaridade na estrutura primária dos peptídeos maduros, 3 foram classificados como alfa-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 e Tpa6 - e dois como beta- NaScTxs - Tpa7 e Tpa8 -, sendo que a toxina Tpa8 é o primeiro registro de uma beta toxina anti-inseto excitatória na peçonha de escorpiões do Novo Mundo. Essas NaScTxs foram usadas na construção de uma árvore filogenética incluindo NaScTxs do escorpião T. obscurus e de outras identificadas em escorpiões do gênero Tityus e depositadas nos bancos de dados públicos de proteínas. A análise filogenética coincide com a distribuição geográfica dos escorpiões do gênero Tityus divididos nas espécies que ocorrem ao norte do rio Amazonas e naquelas que habitam ao sul do rio Amazonas. A peçonha bruta de T. pachyurus, submetida a fracionamento por RPHPLC usando uma coluna C18, resultou em 55 frações cromatográficas. As três frações mais abundantes foram submetidas a recromatografias e os peptídeos puros obtidos foram seqüenciados por espectrometria de massa (MS). Três seqüências parciais que correspondem a três novas NaScTxs foram obtidas: Tpa9 com 7061,87 Da, Tpa10 com 6994,36 Da e Tpa11 com 7167,23 Da. Essas novas toxinas (500 nM) foram testadas em canais de sódio expressos em células HEK. Tpa9 reduziu em 20% as correntes de Na" em hNavU, como as (3NaScTx.Tpa10 apresentou efeito em hNav1.1, hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6 como as aNaScTx e a Tpa11 em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. A Tpa2, uma (3NaScTx previamente identificada na mesma espécie de escorpião, modificou as correntes de sódio em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. Essas quatro toxinas foram administradas em camundongos via i.p., indicando que Tpa2 e Tpa10 causam escorpionismo classe II (x2= 8,0; p-valor = 0,005) e degeneração vacuolar e infiltrado inflamatório no fígado (x2= 4,4; p-valor = 0,035). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Although Tityus pachyurus is the scorpion species which is responsible for the most dangerous cases of scorpionism in Colombia, little is known about its venom toxins. This project aimed to identify new toxins having Na+ channels as molecular targets in the venom of T. pachyurus. By means of the library construction of the cDNA venomous gland of a scorpion T. pachyurus, five new putative toxins from NaScTx peptide family were identified and by the primary structure of the mature peptides, three of them were classified as alpha-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 and Tpa6 - and two as beta-NaScTxs - the Tpa7 and Tpa8. The last one is the first anti-insect excitatory beta-class toxin describedfor a New World scorpion. These five toxins, together with others NaScTxs described for Tityus species were used to construct a phylogenetic tree. Phylogenetic analysis indicated a marked geographic separation between toxins presented in scorpions occurring in the North of the Amazon River and those presented in the scorpions inhabiting the South of the Amazon River. The crude venom of T. pachyurus after being fractionated by RP-HPLC, using a C18 column, resulted in 55 chromatografic fractions. The three most abundant fractions were submitted to further fractioning and the purified peptides were sequenced by mass spectrometry (MS). Three NaScTxs partial sequences were described: Tpa9 with 7061.87 Da, Tpa10 with 6994.36 Da and Tpa11 with 7167, 23 Da. These new toxins (500 nM) were tested on Na+-channels expressed in HEK cells. Tpa9 reduced on 20% the Na+ currents in hNavl.1, similarly as the (3NaScTxs; Tpa10 acted on hNav1.1, hNavl .2, hNav1.3 and hNav1.6 as aNaScTxs, and Tpa11 had effect on hNavl .2, hNavl .3, and hNavl .6. The Tpa2, a (3-toxin previously identified, modified the currents in hNavl.2, hNavl.3 and hNavl .6. These four toxins were injected into mice showing that Tpa2 and Tpa10 caused class II scorpionism (x2 = 8.0, p = 0.005) and vacuolar degeneration and inflammatory infiltration in the liver (x2 = 4.4, p-value = 0.035).

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-06-26T22:29:36Z No. of bitstreams: 1 2011_MarianaTorquatoQuezadodeMagalhaes.pdf: 6229263 bytes, checksum: c403806342d7a4f80df912ac72ff753c (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T14:26:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MarianaTorquatoQuezadodeMagalhaes.pdf: 6229263 bytes, checksum: c403806342d7a4f80df912ac72ff753c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-27T14:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MarianaTorquatoQuezadodeMagalhaes.pdf: 6229263 bytes, checksum: c403806342d7a4f80df912ac72ff753c (MD5) / As toxinas de origem vegetal, animal e microbiana há muito despertam o interesse do homem. Assim, a busca por moléculas bioativas que permitam uma ampla biblioteca informativa surge como alternativa na busca de soluções de problemas agrícolas e farmacológicos. A pele dos anfíbios é uma rica fonte destas moléculas, as quais são produzidas pelas glândulas serosas holócrinas do tegumento, as quais estão localizadas nos grânulos do lúmem, e são liberadas sob a presença de estímulos apropriados. Suas funções são variadas, atuando tanto na regulação das funções fisiológicas da pele, como na defesa contra predadores e microrganismos. As moléculas mais estudas são os peptídeos antimicrobianos (PAM), os quais atuam diretamente na defesa química contra patógenos. Neste trabalho, foi estudada uma nova classe de PAM presentes na secreção cutânea do anuro Hypsiboas punctatus, as fenilseptinas (Phes). Estas são peptídeos antimicrobianos de 18 resíduos de aminoácido (FFFDTLKNLAGKVIGALT-NH2), com massa molecular M+H+=1954.2, as quais ocorrem naturalmente na forma de uma mistura racêmica (L-/D-Phes), e apresentam propriedades sensoriais. A enantiomerização do resíduo de aminoácido Phe2 e a amidação C-terminal foram estudadas e confirmadas por uma combinação de técnicas incluindo RP-UFLC, espectrometria de massa combinada com mobilidade iônica, experimentos de MS/MS de alta resolução, sequenciamento de cDNA, síntese de peptídeos em fase sólida e sequenciamento N-terminal por degradação de Edman. Os estudos detalhados das 20 estruturas de menor energia obtidas por experimentos de 1H RMN demonstram que os peptídeos assumem uma conformação de α-hélice dos resíduos 5-18 (RMSD 0.22 ± 0.09), e existe em D-Phes uma de mudança de 90° na orientação da porção N-terminal 1-3. Os peptídeos foram ativos contra bactérias gram-positivas e gram-negativas em ensaios de determinação da atividade antimicrobiana in vitro (e.x. S. aureus -65,5 e 32,7 μM, L-Phes e D-Phes, respectivamente). E, as mesmas moléculas foram testadas em camundongos às propriedades gustativas, em um sistema de animais KO para um canal iônico essencial para a transdução do sabor amargo e doce (Trpm5). Os camundongos WT rejeitaram os peptídeos (p < 0,05), enquanto que os camundongos KO foram indiferentes aos mesmos (p > 0,3). Provavelmente, as divergências estruturais são mais relacionadas com as diferenças observadas em relação às atividades antimicrobianas diferenciadas entre as duas moléculas, do que com as propriedades sensoriais. Fenilseptinas representam o primeiro relato de moléculas antimicrobianas, com propriedades sensoriais e enorme plasticidade estrutural. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Toxins from plant, animal and microorganism long light the interest of man. Thus, the search for bioactive molecules that allow a large databank appears as an alternative looking for solutions to agricultural problems and pharmacological. Amphibian skin secretions is a rich source of these molecules, which are produced by serous holocrine glands, which are located in the lumen of the granules and are released in the presence of appropriate stimuli. Their functions are diverse, acting both in the regulation of physiological functions of the skin, as in defense against predators and microorganisms. The molecules most studied are the naturally occurring antimicrobial peptides (AMP), which act directly on the chemical defense against pathogens. Here we report a new class of AMP present in the skin secretions of anuran Hypsiboas punctatus, the fenilseptina (Phes). These are antimicrobial peptides of 18 amino acid residues (FFFDTLKNLAGKVIGALT-NH2), with a molecular mass of M+H+ = 1954.2, that was purified as two naturally occurring D- and L-Phe analogs, with sensorial properties. The amino acid epimerazition and C-terminal amidation for both molecules (in short, D-Phes and L-Phes) were confirmed by a combination of techniques including reverse-phase UPLC, ion mobility mass spectrometry, high resolution MS/MS experiments, Edman degradation, cDNA sequencing and solid-phase peptide synthesis. RMSD analysis of the twenty best 1H NMR structures of each peptide revealed that the peptides assume an α-helical conformation of residues 5-18 (RMSD 0:22 ± 0.09), and there is D-Phes has a major 90° difference between the two backbones at the first four N-terminal residues and substantial orientation changes of the respective side chains. The peptides were active against gram-positive and gram-negative in vitro assays (S. aureus -65.5 and 32.7 mM, L-and D-Phes Phes, respectively). And the same molecules were tested in mice to evaluate the properties in a system of KO animals to a ion channel essential for transduction of bitter and sweet (Trpm5). The mice rejected the WT peptide (p < 0.05), while the KO mice were indifferent to them (p > 0.3). These structural divergences are most likely linked to the quantified differences in antimicrobial potencies determined for both molecules, but produced no detectable change in the gustatory aversive behavior. Perhaps the Phenylseptins are early examples of the amazing plasticity of small biomolecules yet to be understood.

Dissertação(mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal / Submitted by Sabrina Silva de Macedo (sabrinamacedo@bce.unb.br) on 2012-07-11T15:06:44Z No. of bitstreams: 1 2012_CesarAugustoPriasMarquez.pdf: 1029411 bytes, checksum: d57e4c8da8e6cbfd2e1beb6554f2c535 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-30T12:03:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_CesarAugustoPriasMarquez.pdf: 1029411 bytes, checksum: d57e4c8da8e6cbfd2e1beb6554f2c535 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-30T12:03:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_CesarAugustoPriasMarquez.pdf: 1029411 bytes, checksum: d57e4c8da8e6cbfd2e1beb6554f2c535 (MD5) / No presente trabalho foi caracterizado biológica e estruturalmente umpeptídeo análogo da ocelatina-P1 isolado a partir da secreção da pele da rã-pimentaLeptodacfylus labyrinthicus. A secreção cutânea, obtida por estimulação elétrica, foifracionada por RP-HPLC em coluna C3 e as frações obtidas testadas contra cepasreferenciais das bactérias Escherichia coii e Staphylococcus aureus. Um novopeptídeo antimicrobianoi nomeado G160CP1, foi purificado por RP-HPLC em colunaC18, analisado por MALDI-TOF MS e submetido à degradação de Edman paradeterminação de sua estrutura primária. Posteriormente, o peptídeo G160CP1 foisintetizado quimicamente (com o emprego da química Fmoc) e analisado pordicroísmo circular para avaliação dos seus componentes de estrutura secundária,bem como empregado em ensaios biológicos para avaliação de suas propriedadescitolíticas. A atividade antibacteriana deste peptídeo foi avaliada com a determinaçãoda CIM contra bactérias Gram-positivas {Staphylococcus aureus, Staphylococcusepidermidis e Enterococcus faecalis) e Gram-negativas (Escherichia coli, Klebsiellapneumoniae, Enterobacter cloacae e Pseudomonas aeruginosa). Também foramavaliados seus efeitos citotóxicos sobre eritrócitos, leucócitos e plaquetas humanos.O peptídeo G160CP1 apresenta uma massa molecular de 2,51 kDa, amidação naporção C-terminal e propensão para formar estruturas em a-hélice em ambienteshidrofóbicos. Tal peptídeo mostrou-se ativo contra os bacilos Gram-negativos E. colie K. pneumoniae e contra a bactéria Gram-positiva S. epidermidis, não tendodemonstrado toxicidade relevante contra células sangüíneas. Essas característicastornam o peptídeo G160CP1 um bom candidato para o tratamento de doençascausadas por bactérias Gram-negativas. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This study allowed the biological and structural characterization of a peptideanalog of ocellatin-P1 isolated from the skin secretion of the pepper-frogLeptodactyius labyhnthicus. The skin secretion, obtained by electrical stimulation,was fractioned by RP-HPLC using a Cs column and the eluted fractions were testedagainst Escherichia coli and Staphylococcus aureus bacterial strains. One newantimicrobial peptide, named G160CP1, was purified by RP-HPLC using a C18column, analyzed by MALDI-TOF MS and sequenced by Edman degradation.Subsequently, the peptide was chemically synthesized (using Fmoc chemistry) andanalyzed by circular dichroism for assessment of its secondary structurecomponents, as well as employed in biological assays to evaluate its cytolyticproperties. Antibacterial activity of this peptide was assessed by determination of itsMICs against Gram-positive (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidisand Enterococcus faecalis) and Gram-negative {Escherichia coli, Klebsiellapneumoniae., Enterobacter and Pseudomonas aeruginosa) bacteria. Cytotoxic effectson human erythrocytes, leucocytes and platelets were also assessed. The G160CP1peptide has a molecular mass of 2.51 kDa, amidated C-terminus and a propensity toform a-helix structures at hydrophobic environments. This peptide was active againstGram-negative bacilli E. coli and K. pneumoniae and against the Gram-positivebacteria S. epidermidis, while not relevant toxicity was found in blood cells. Suchfeatures make G160CP1 a good candidate for treatment of diseases caused byGram-negative bacteria.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Laboratório de Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-07-11T20:25:23Z No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-30T12:10:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-30T12:10:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Quase todos os vetores de expressão de Pichia pastoris utilizam a sequência da região pré-pró do fator-α de Saccharomyces cerevisiae como sinal de secreção, o qual pode ser processado incorretamente em condições de hiperexpressão. Utilizar um sinal de secreção nativo de P. pastoris pode contornar este problema, mantendo a estrutura correta da proteína heteróloga. Utilizando o software Signal P. 3.0, os peptídeos sinais de 13 proteínas nativas do secretoma e a região “pré-pró” do fator α putativo de P. pastoris foram identificados e em seguida suas sequências foram amplificadas via PCR. Essas sequências foram clonadas no vetor pPIC9, integradas e expressas nessa levedura, junto com o gene repórter α-amilase de Bacillus subtillis. O fator α de S. cerevisiae presente nesse vetor foi removido, permitindo que apenas as sequências testadas neste trabalho influenciassem a secreção da enzima heteróloga. Após análise dos halos de hidrólise em placa e ensaios enzimáticos utilizando sobrenadante de cultura, observou-se que pelo menos quatro sinais de secreção testados possuíam níveis de secreção semelhantes ao fator α de S. cerevisiae. O sequenciamento do N-terminal da α-amilase será feito por espectrometria de massa, após purificação da enzima em coluna de níquel, e permitirá a análise da eficiência de processamento dos peptídeos sinais testados. Este último teste permitirá a escolha de um novo sinal de secreção nativo de P. pastoris, introduzindo novas opções para expressão heteróloga nesta levedura, além das disponíveis comercialmente pela empresa Invitrogen (EUA). _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Almost all Pichia pastoris expression vectors uses Saccharomyces cerevisiae α-factor secretion signal, which can be improperly processed in conditions of hiperexpression. Using a native P. pastoris secretion signal should overcome this problem, maintaining the right structure of the heterologous protein. Using Signal P. 3.0 software, 13 secretion signals of native secretome proteins and the putative α factor of P. pastoris were identified and then their sequences were amplified via PCR. These sequences were cloned in pPIC9 vector, integrated and expressed in this yeast, along with a Bacillus subtillis α-amylase gene as a reporter. The S. cerevisiae α factor present in this vector was removed, allowing that only the sequences tested in this work had influence on the secretion of the heterologous enzyme. After analyses of hydrolysis halos on plates and enzymatic assays using culture supernatants, it was observed that at least four secretion signals tested had similar secretion levels of the S. cerevisiae α factor. Sequencing of the N-terminus of α-amylase will be carried out by mass spectrometry, after purification of the enzyme in a nickel based column, and will allow analysis of processing efficiency of the signal peptides tested. The latter test will enable the selection of a new native P. pastoris secretion signal, introducing new options for heterologous expression in this yeast, aside the ones commercially available by Invitrogen Company (USA).

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Sabrina Silva de Macedo (sabrinamacedo@bce.unb.br) on 2012-07-18T12:33:45Z No. of bitstreams: 1 2012_AngelinaMariaMoreschiBasso.pdf: 3146930 bytes, checksum: f2b004fd79a242867e007125e99964ac (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-08-23T13:35:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AngelinaMariaMoreschiBasso.pdf: 3146930 bytes, checksum: f2b004fd79a242867e007125e99964ac (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-23T13:35:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AngelinaMariaMoreschiBasso.pdf: 3146930 bytes, checksum: f2b004fd79a242867e007125e99964ac (MD5) / De acordo com a Organização Mundial da Saúde – OMS, um terço da população mundial não tem acesso a medicamentos (NWOBIKE, 2006). No Brasil, o Sistema Único de Saúde – SUS disponibiliza a aquisição gratuita destas drogas para a população. Estes fármacos são classificados em três categorias: componentes básicos, componentes estratégicos e componentes especializados da assistência farmacêutica. Dentre estas categorias, esta última se destaca devido aos medicamentos serem de alto custo, importados e utilizados em tratamentos prolongados. O Ministério da Saúde criou em 1993, o Programa de Medicamentos Especializados, anteriormente denominado excepcionais. Este programa fornece fármacos de alto custo e acesso restrito. No primeiro ano, o programa ofereceu 31 apresentações em 15 diferentes itens. Atualmente, a lista de medicamentos oferece 150 itens sob 310 apresentações distintas. O aumento da disponibilidade destes fármacos e a importação dos mesmos acarretaram em uma sobrecarga de gastos ao Ministério da Saúde. Durante o ano de 2011, foram gastos R$ 3 bilhões com estes fármacos. Os componentes especializados incluem fármacos para o tratamento de diversas doenças, tais como hepatites virais, doença de Alzheimer, esclerose múltipla e diabetes. Desde 2008, o fármaco glucagon está incluído na lista deste componente, utilizado principalmente em casos de hipoglicemia em diabéticos. Porém, este fármaco pode ser utilizado para diversas finalidades, como em diagnósticos e emergências hospitalares. Para reduzir o alto custo com estes medicamentos, o Governo Federal criou, em 2004, a Lei de Inovação Tecnológica. De acordo com o decreto número 6.041 de Fevereiro de 2007, foram instituídas a Política Nacional de Biotecnologia e a criação do Comitê Nacional de Biotecnologia, com o desenvolvimento da biotecnologia na área da saúde humana, cujo foco na indústria farmacêutica brasileira foi priorizado. A produção de glucagon pela bioindústria brasileira está inserida neste contexto. Desta forma o objetivo deste trabalho é desenvolver um processo de produção, expressão, purificação e avaliação da atividade biológica de um peptídeo glucagon recombinante. O peptídeo foi expresso em sistema heterólogo usando Escherichia coli, utilizando um vetor de expressão com a tecnologia de fusão do tag GST ao glucagon. A estratégia escolhida visou obter o peptídeo na fração solúvel, o que correspondeu a 50% da expressão total de proteínas na bactéria, na presença de 0,25 mM de IPTG, a 30°C. A purificação ocorreu através de cromatografia de afinidade e o glucagon fusionado foi obtido com 90% de pureza, que posteriormente foi clivado para liberação da fusão utilizando a enzima enteroquinase. A sequência dos primeiros 16 resíduos de aminoácidos, a partir da porção N-terminal, foi obtida por meio de espectrometria de massa e a avaliação da atividade biológica confirmou a atividade do peptídeo. Neste ensaio ratos Wistar hipoglicêmicos foram utilizados para monitorar a glicemia após aplicação de glucagon recombinante, onde o mesmo apresentou desempenho semelhante ao controle positivo (p < 0,00001). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / According to the World Health Organization - WHO, one third of the world population does not have access to therapeutic drugs. In Brazil, the Brazilian National Health System - SUS is the Policy Strategy for Pharmaceutical Assistance, which aiming to make available drugs for the treatment of specific diseases. The pharmaceutical drugs are classified into three categories: basic compounds, strategic compounds and specialized compounds. Among those categories, the last one is special because they present high-cost-drugs, imported and prolonged treatment. In 1993, the Ministry of Health created a program for distributing these drugs to the population for free. In the first year, the program offered 31 presentations in the 15 different drugs. The program includes, nowadays, 150 drugs in 310 presentations. The increased disponibility of these drugs and the import resulted in overhead costs to the Ministry of Health. During the year of 2011, the Brazilian Government spent R$ 3 billion on the acquisition of such therapeutic drugs. Some of the drugs are included in the list of specialized medicines, in order to treating various diseases, such viral hepatitis, Alzheimer’s disease, multiple sclerosis and diabetes mellitus. The glucagon peptide was added to the list in 2008 aiming to be used in on the control of recurring blood glucose falls in diabetics patients. It can also be used for other purposes, such in diagnostic procedures and emergency rooms. To reduce the high cost on the acquisition of drugs, the Government created the law of technological innovation in 2004. According to the decree 6.041 of February, 2007, in which was instituted the National Biotechnology Policy and created de National Committee of Biotechnology, the development of the Human Health Biotechnology Area, with focus on Biopharmaceutical was priorized. The glucagon production by brazilian industry is inserted in this context. The purpose of this work is the development of a methodology for the production, expression, purification, and evaluation of biological activity of recombinant glucagon. The peptide was expressed in a heterologous system using Escherichia coli. The vector used has a fusion system and GST tag was previously selected to obtain most of the peptide in the soluble fraction, thereby resulting in lower production costs. The expression level obtained was 50% of the total expression of the bacterium, using 0.25 mM IPTG. The purification of the fused peptide was performed on affinity chromatography, showing 90% purity. The partial sequence of the peptide was confirmed by mass spectrometry and the peptide was separated from the fusion using the enzyme enterokinase. In order o confirm the activity of glucagon, a biological assay was done using hypoglycemic Wistar rats, whose blood glucose was monitored after application of recombinant glucagon. The test confirmed the activity of the peptide (p < 0,00001).

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2006. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-16T13:45:06Z No. of bitstreams: 1 2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-16T13:45:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-16T13:45:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Em algumas regioes do mundo, inclusive no Brasil, o numero de acidentes com escorpioes e bastante significativo. Devido a necessidade, entao, de se produzir antidotos ou anti-soros eficazes para combater os prejuizos causados a saude humana em decorrencia desses acidentes, estudos envolvendo a caracterizacao quimica e farmacologica da peconha desses animais foram intensificados. A peconha dos escorpioes e composta por varios tipos de moleculas, principalmente polipeptideos geralmente toxicos para um grande numero de organismos como mamiferos, insetos e crustaceos. Muito se tem estudado sobre as diferentes propriedades fisiologicas e farmacologicas dessas moleculas e atualmente ja sao conhecidas a atuacao em canais ionicos, atividade antimicrobiana, antimalaria, fosfolipasica e inseticida. Esse trabalho tem como objetivo principal o isolamento e a caracterizacao de peptideos biologicamente ativos presentes na peconha do escorpiao Tityus fasciolatus, especie endemica do cerrado. Os animais foram coletados na regiao do Distrito Federal e a peconha foi obtida por meio de estimulacao eletrica moderada proximo a glandula produtora de peconha do especime e, em seguida, liofilizada. A purificacao dos peptideos foi realizada em duas etapas: filtracao em gel (Superdex 75 HR 10/30) em tampao formiato de amonia e RP-HPLC (Vydac C18 218TP54) com a eluicao mediada pela aplicacao de um gradiente linear de acetonitrila. Os peptideos de interesse foram reduzidos e alquilados com 4-vinilpiridina e suas massas moleculares foram obtidas por meio de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS). A estrutura primaria dos peptideos isolados foi obtida por meio da degradacao de Edman e tambem foram realizados ensaios biologicos a fim de se determinar a atividade de tais peptideos. Tres peptideos que apresentaram bom grau de pureza e abundancia tiveram suas estruturas primarias determinadas. O peptideo Tf14 possui massa molecular igual a 14 kDa e temos indicios de se tratar de um homodimero ligado por pontes dissulfeto; Tf3.5 e um provavel bloqueador de canais de potassio, uma vez que possui alta similaridade estrutural com peptideos dessa natureza e, finalmente, Tf2.7, um peptideo linear com 25 residuos de aminoacidos e massa molecular igual a 2,75 kDa. Ensaios biologicos revelaram tratar-se de um peptideo com atividade semelhante a bradicinina, alem de ser capaz de bloquear o fluxo de ions em canais de potassio voltagem-dependentes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In some regions of the world, including Brazil, the number of injuries caused by scorpions is rather relevant. In order to minimize the deleterious effects in human health caused by those injuries by means of counter poison or anti-serum, efforts were expanded to further investigate the biochemical and pharmacological properties of the poison of these animals. The scorpion venom are constituted by several and different kinds of molecules, mainly polypeptides, generally toxic for a large number of organisms like mammals, insects and crustaceans. Much is known about the physiological and pharmacological properties of these polypeptides, including their mode of action on ions channels, anti-malary, anti-microbial, phospholipasic and insecticidal activities. The main objective of this work is the purification and characterization of biologically active peptides present in the venom of the scorpion Tityus fasciolatus, an endemic species from cerrado region. The animals were collected in Distrito Federal, and the venom was obtained by gentle electric stimulation next to the producing glandule of the specimen. The peptides were purified in two steps: gel filtration (Superdex 75 HR 10/30) using ammonium formiate buffer, followed by RP-HPLC cromatography (Vydac C18 218TP54). The elution was performed by means of an acetonitrile gradient. The obtained peptides were reduced and alkylated using 4-vinylpyridine and their molecular masses were determined using mass spectrometry analysis (MALDI-TOF MS). The primary structures of these peptides were determined by Edman degradation and several assays were done in order to determine the biological activity of these peptides. Three highly pure and abundant peptides had their primary structures determined: Tf14, with a molecular mass of 14 kDa seems to be an homodimer holded by disulphide bridges; Tf3.5 should act blocking potassium channels since it shares high structural similarities to other scorpion peptides of this nature; and Tf2.7, a linear peptide of 25 amino acids residues with a molecular mass of 2.75 kDa. This peptide exhibits a bradykinin-like activity and is also able of blocking ion fluxes in voltage-dependent potassium channels.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-05T17:31:42Z No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-03-06T00:48:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-06T00:48:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5) Previous issue date: 2009 / A peçonha de aranhas constitui-se como um conjunto diverso de moléculas bioativas, usado para subjugar a presa e eventualmente para defesa. Essas moléculas atuam de formas variadas em muitos sistemas biológicos e despertam interesse pelo seu potencial para a prospecção de produtos naturais. Pouco se sabe sobre as peçonhas de aranhas caranguejeiras do Brasil. Este estudo apresenta a caracterização de componentes da peçonha de Lasiodora sp. bem como sua atividade biológica. Foram detectados 191 componentes na peçonha de Lasiodora sp. com predominância de componentes com massa molecular menor que 1000 Da e entre 4000 e 8500 Da. A atividade cardiotóxica foi atribuída aos componentes de baixo peso molecular da peçonha. Quatro peptídeos tiveram sua estrutura primária parcialmente elucidada. A análise de similaridade desses peptídeos isolados e caracterizados sugeriu a atividade em canais iônicos, que não foi detectada nos ensaios eletrofisiológicos. A peçonha bruta de Lasiodora sp. inibiu de maneira significativa o crescimento das bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus. A atividade antibacteriana foi identificada em oito frações cromatográficas e em um grupo de frações com baixa massa molecular (JL1), sendo que não foi possível a determinação de MIC. Este estudo contribui para a compreensão da diversidade e complexidade da peçonha da aranha Lasiodora sp., bem como preenche lacunas até então não esclarecidas para essa espécie. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The spider venom is a diverse set of bioactive molecules, used to subdue the prey and possibly for defense. These molecules act in various forms in many biological systems and arouse interest in its potential for the exploration of natural products. Little is known about the Tarantula venoms from Brazil. This study presents the characterization of components from the venom of Lasiodora sp. and its biological activity. We identified 191 molecular mass components in the Lasiodora sp. venom, with prevalence of components smaller than 1000 Da and between 4000 and 8500 Da. The cardiotoxic activity was attributed to low molecular weight components. Four peptides had their primary structure partially elucidated. The analysis of similarity of these isolated and characterized peptides suggest activity on ion channels, which was not detected in the electrophysiological testing. The Lasiodora sp. crude venom significantly inhibited the bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus growth. The antibacterial activity was identified in eight chromatographic fractions, and in a group of low molecular weight fractions (JL1), which was not possible to determine MIC. This study contributes to understanding the diversity and complexity of the venom of the spider Lasiodora sp. and then fills gaps unclear for this species.