Orientador: Luiz Carlos Dias / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-25T17:39:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Meira_PauloRobertoRodrigues_M.pdf: 3747189 bytes, checksum: f1cc1b554e40eb02c896115ad69b4fc9 (MD5) Previous issue date: 1999 / Mestrado

Orientador: Reinaldo Marchetto / Co-orientador: Sybele Saska Specian / Banca: Wilton Rogério Lustri / Banca: Ana Maria Minarelli Gaspar / Resumo: A celulose bacteriana (CB) apresenta ampla diversidade de aplicações. Neste trabalho o enfoque foi desenvolver um curativo temporário ou suporte para regeneração tecidual de pele, a partir da funcionalização de CB com peptídeo RGD, caracterizá-lo quanto às propriedades físico-químicas e avaliar in vitro a capacidade de estimular a adesão e a proliferação de fibroblastos, a citotoxicidade e a resposta imune. A finalidade do material desenvolvido consiste em promover a reparação tecidual de pele, visto que diversos fatores sistêmicos tais como diabetes, tabagismo e carência nutricional, podem dificultar o processo de cura. O uso de biomateriais como suporte de medicamentos ou curativos temporários, auxiliando ou acelerando o processo de reparação e cura, é uma necessidade nestes casos. A sequência peptídica RGD (Arginina-Glicina-Ácido Aspártico), encontrada em diversas proteínas da matriz extracelular (MEC), é frequentemente utilizada para promover a adesão celular, mediada por integrinas, em biomateriais. O peptídeo sintetizado foi escolhido por meio de estudo computacional. Foram sintetizados dois tipos de membranas, a CB-RGDAds, na qual o peptídeo RGD encontra-se adsorvido, e a CBRGDImz, na qual o peptídeo encontra-se ligado covalentemente à membrana, e, portanto, imobilizado. Estes materiais, juntamente com a membrana de CB pura, foram caracterizados a partir de análises de ângulo de contato, difratometria de raios-X (DRX), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de absorção na região de infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR), termogravimetria (TG) e calorimetria diferencial exploratória (DSC). Posteriormente, as amostras foram submetidas a ensaios in vitro de viabilidade celular e morfologia celular utilizando a linhagem de fibroblastos L929; adicionalmente análises de determinação de citocinas TNF-α, IFN-γ e produção de óxido... / Abstract: Bacterial cellulose (BC) exhibits a broad diversity of applications. The aim of this study was to develop a scaffold or temporary dressing for skin tissue repair, whereof the BC would be functionalized with an RGD peptide. The synthesized materials were physicochemically characterized and submitted to in vitro analyses to assess their capacity of stimulating fibroblasts adhesion, proliferation and immune response. The developed materials would be applied in skin tissue repair that may be hampered by a series of sistemic factors, such as diabetes, smoking and nutritional deficiency. In theses cases, the usage of biomaterials as a drug delivery system or wound dressing, aiding or accelerating the repair and healing processes, becomes a necessity. The RGD peptide sequence (Arginine-Glycine-Aspartic Acid) is found in many extracellular matrix (ECM) proteins, and it is frequently used to promote cell adhesion, mediated by integrins, in biomaterials. The synthesized peptide sequence was chosen by means of computational analysis. Two types of membrane were synthesized, the BC-RGDAds in which the RGD peptide was adsorbed, and the BC-RGDImz in which the peptide was covalently bonded to the membrane, therefore, immobilized. These materials, together with the pure BC membrane, were characterized by contact angle analysis, x-ray diffractometry (XRD), scanning electron microscopy (SEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), thermogravimetric analysis (TGA) and differential scanning calorimetry (DSC). Subsequently, the samples were submitted to in vitro assays of cellular viability and cellular morphology, using the fibroblast lineage L929; moreover, to evaluate the immune and inflammatory response, the nitric oxide production assay as well as TNF-α and IFN-γ cytokines determination assays were performed using Balb/c mice cells. The results indicate that the BC-RGDAds and the BC-RGDImz membranes... / Mestre

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Henrique da Silva / Banca: Luiz Carlos Bertucci Barbosa / Resumo: O sistema ParE-ParD é um sistema Toxina-Antitoxina (TA) do tipo II (composto por duas proteínas) encontrado no plasmídeo RK2 de uma gama de bactérias. A antitoxina ParD (9kDa) é capaz de neutralizar a citotoxicidade da toxina ParE, pela formação de um complexo estável, e também é eficaz na auto-repressão do operon parDE. A toxina (12kDa) apresenta atividade citotóxica no processo de replicação do DNA por interferir diretamente na ação da DNA girase. Estudos prévios sugeriram que a região C-terminal da antitoxina é responsável pelo processo de interação com ParE. Embora esta toxina possa ser encontrada em um grande número de microrganismos, ainda apresenta mecanismos de citotoxicidade e funções celulares a serem elucidadas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a tentativa de expressão das duas proteínas ParE e ParD, bem como o design e a síntese de peptídeos análogos da antitoxina, para a realização de estudos de interação molecular, a fim de encontrar uma estrutura mínima de ParD capaz de inativar a função toxica de ParE. Com base nas informações estruturais, obtidas por modelagem e dinâmica molecular, quatro sequências peptídicas análogas de ParD foram projetadas e sintetizadas pela metodologia da fase sólida. As sequências foram analisadas e purificadas por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizadas por espectrometria de massas. Os estudos de interação foram realizados através de ensaios de cromatografia de afinidade e supressão de fluorescência. ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The ParE-ParD system is a toxin-antitoxin (TA) type II module (composed of two proteins) of the plasmid RK2 of a range of bacteria. The ParD antitoxin (9 kDa) is able to neutralize the cytotoxicity of the ParE toxin by forming a stable complex and is effective in the auto repression of the parDE operon. The toxin (12 kDa) exhibits cytotoxic activity by blocking DNA replication, acting directly in the DNA gyrase action. Previous studies have been suggest that the C-terminal region of the antitoxin is responsible for the interaction process with ParE. Although this toxin can be find in a large number of microorganisms, still have cytotoxicity mechanisms and cellular functions to be elucidate. In this context, this work aimed at the expression of ParE and ParD proteins, as well as the design and synthesis of antitoxin analog peptides, to perform molecular interaction studies in order to find a minimum ParD structure able to inactivate the toxic function of ParE. Based on the structural information obtained by modeling and molecular dynamics, four analogous peptide sequences of ParD were designed and synthesized by the solid phase methodology. The peptide sequences were analyzed and purified by high performance liquid chromatography and characterized by mass spectrometry. Interaction studies were performed by affinity chromatography and fluorescence suppression assays. The intrinsic fluorescence of ParEAC2 was suppressed by ParD analogs (ParDTB1, ParDTB3, ParDTB5 and ParDTB6) add... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:39Z : No. of bitstreams: 1 000825911_20160226.pdf: 355265 bytes, checksum: 547f484aecd3612ad60abee5af1a27e3 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-26T14:03:55Z: 000825911_20160226.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-26T14:04:49Z : No. of bitstreams: 1 000825911.pdf: 1735726 bytes, checksum: ac1e06d8b87ef7b2876cb9e6bf68776f (MD5) / A celulose bacteriana (CB) apresenta ampla diversidade de aplicações. Neste trabalho o enfoque foi desenvolver um curativo temporário ou suporte para regeneração tecidual de pele, a partir da funcionalização de CB com peptídeo RGD, caracterizá-lo quanto às propriedades físico-químicas e avaliar in vitro a capacidade de estimular a adesão e a proliferação de fibroblastos, a citotoxicidade e a resposta imune. A finalidade do material desenvolvido consiste em promover a reparação tecidual de pele, visto que diversos fatores sistêmicos tais como diabetes, tabagismo e carência nutricional, podem dificultar o processo de cura. O uso de biomateriais como suporte de medicamentos ou curativos temporários, auxiliando ou acelerando o processo de reparação e cura, é uma necessidade nestes casos. A sequência peptídica RGD (Arginina-Glicina-Ácido Aspártico), encontrada em diversas proteínas da matriz extracelular (MEC), é frequentemente utilizada para promover a adesão celular, mediada por integrinas, em biomateriais. O peptídeo sintetizado foi escolhido por meio de estudo computacional. Foram sintetizados dois tipos de membranas, a CB-RGDAds, na qual o peptídeo RGD encontra-se adsorvido, e a CBRGDImz, na qual o peptídeo encontra-se ligado covalentemente à membrana, e, portanto, imobilizado. Estes materiais, juntamente com a membrana de CB pura, foram caracterizados a partir de análises de ângulo de contato, difratometria de raios-X (DRX), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de absorção na região de infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR), termogravimetria (TG) e calorimetria diferencial exploratória (DSC). Posteriormente, as amostras foram submetidas a ensaios in vitro de viabilidade celular e morfologia celular utilizando a linhagem de fibroblastos L929; adicionalmente análises de determinação de citocinas TNF-α, IFN-γ e produção de óxido... / Bacterial cellulose (BC) exhibits a broad diversity of applications. The aim of this study was to develop a scaffold or temporary dressing for skin tissue repair, whereof the BC would be functionalized with an RGD peptide. The synthesized materials were physicochemically characterized and submitted to in vitro analyses to assess their capacity of stimulating fibroblasts adhesion, proliferation and immune response. The developed materials would be applied in skin tissue repair that may be hampered by a series of sistemic factors, such as diabetes, smoking and nutritional deficiency. In theses cases, the usage of biomaterials as a drug delivery system or wound dressing, aiding or accelerating the repair and healing processes, becomes a necessity. The RGD peptide sequence (Arginine-Glycine-Aspartic Acid) is found in many extracellular matrix (ECM) proteins, and it is frequently used to promote cell adhesion, mediated by integrins, in biomaterials. The synthesized peptide sequence was chosen by means of computational analysis. Two types of membrane were synthesized, the BC-RGDAds in which the RGD peptide was adsorbed, and the BC-RGDImz in which the peptide was covalently bonded to the membrane, therefore, immobilized. These materials, together with the pure BC membrane, were characterized by contact angle analysis, x-ray diffractometry (XRD), scanning electron microscopy (SEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), thermogravimetric analysis (TGA) and differential scanning calorimetry (DSC). Subsequently, the samples were submitted to in vitro assays of cellular viability and cellular morphology, using the fibroblast lineage L929; moreover, to evaluate the immune and inflammatory response, the nitric oxide production assay as well as TNF-α and IFN-γ cytokines determination assays were performed using Balb/c mice cells. The results indicate that the BC-RGDAds and the BC-RGDImz membranes...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-18Bitstream added on 2014-06-13T19:08:54Z : No. of bitstreams: 1 cespedes_gf_me_araiq.pdf: 806873 bytes, checksum: d4f792502dbe67b9a6199790a01daa7e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Cepas bacterianas resistentes aos antibióticos convencionais representam um problema de saúde global com forte impacto social e econômico. Desta maneira, há uma urgente necessidade de desenvolver antibióticos com novos mecanismos de ação. O grupo da Profª Drª Mariana S. Castro isolou e determinou a seqüência do peptídeo GWLDVAKKIGKAAFNVAKNFI-NH2, secretado na pele da rã Hypsiboas albopunctatus e qual mostrou atividade antimicrobiana. O objetivo do presente trabalho foi avaliar 3 análogos para obter informações a respeito da relação estrutura-atividade biológica. Os peptídeos foram sintetizados por SPFS utilizando a estratégia química Fmoc. As propriedades conformacionais dos peptídeos foram investigadas por CD em água, em TFE (agente indutor de estrutura secundária) e em micelas zwitteriônicas (LPC). As atividades antimicrobianas foram analisadas pela medida da concentração inibitória mínima em bactérias (uma Gram-positiva e duas Gram- negativa) e em fungos. O aminoácido triptofano foi usado como sonda para analisar a profundidade da inserção em miméticos de membrana. Os resultados mostraram que a SPFS foi útil, obtendo um material com alto índice de pureza. Os estudos de CD demonstraram que os peptídeos em água apresentam uma estrutura ao acaso, adquirindo um alto teor de a-hélice na presença de TFE e LPC. As interações peptídeo/miméticos de membranas indicaram que todos interagiram fortemente com as micelas, mas não com vesículas, com exceção do peptídeo “wild type”, que mostrou forte interação com ambos os modelos. Os resultados biológicos demonstraram que todos os peptídeos tem atividade (antibacteriana e antifúngica), porém, o “wild type” mostrou valores mais baixos de CIM. Além disso, nossos resultados sugerem que os peptídeos Hy- D-V 16, Hy-D-V 5,16 e Hy-K9 podem vir a ser potenciais modelos para o desenvolvimento de novas... / Antibiotic resistant bacterial strains represent a global health problem with a strong social and economic impact. Thus, there is an urgent need for the development of antibiotics with novel mechanisms of action. Castro´s group isolated and determined the sequence of the peptide GWLDVAKKIGKAAFNVAKNFI-NH2 of skin secretion from the frog Hypsiboas albopunctatus which showed antimicrobial activity. The aim of the present work was evaluated 3 analogues to supply information about the relationship structurebiological activity. The peptides were synthesized by SPPS using the Fmoc chemical approach. The conformational properties of the peptides were investigated by CD techniques in water, TFE (secondary structure-inducing agent) and in zwitterionic micelles (LPC). The antimicrobial activity was assayed by measuring growth inhibition of bacteria (one Gram-positive and two Gram-negative) and fungus. The tryptophan amino acid was used as probe to analyze the deeply of insertion in membrane mimetic. The result showed that the SPFS proved to be useful, and material with high purity was obtained. The CD studies demonstrated that peptides in water have random coil structure, acquiring high amount of a-helix in the presence of TFE and LPC. The interactions peptide/mimetic of membranes indicated that all strongly interacted with micelles, but not with vesicles, with the exception of “wild type” peptide, that showed strong interaction with the both models. The biological results demonstrated that all peptides have activity (antibacterial and antifungal), nevertheless, the “wild type” showed lower MIC values. In addition, our findings suggest that peptides Hy-D-V 16, Hy-D-V 5,16 and Hy-K9 as potential templates for the development of new drugs, therefore these analogous have the higher relationshipantimicrobial/hemolytic activity. These findings highlight the importance of single a-amino acid... (Complete abstract click electronic access below)

A dengue é uma arbovirose que tem se destacado nos últimos anos como um grave problema de saúde pública no Brasil. O Dengue virus (DENV) pertence à família Flaviviridae, gênero Flavivirus e seu genoma é composto de uma fita RNA, com polaridade positiva. Atualmente são conhecidos cinco sorotipos de DENV, os quais são geneticamente e antigenicamente distintos. O desenvolvimento de uma vacina que confira imunidade simultânea, eficiente e duradoura, contra os cinco sorotipos do DENV é considerado prioritário diante a magnitude do problema. Desta forma, neste estudo foi avaliado o potencial vacinal de três peptídeos (PEP01, PEP02 e PEP03) tetravalentes, sintéticos e conservados derivados da proteína do envelope do DENV. Um ensaio de ELISA indireto revelou a reatividade de amostras de soros humanos IgM/IgG positivos para dengue contra os peptídeos sintéticos. Ensaios de imunização em modelo murino mostraram que estes peptídeos foram capazes de induzir a produção de anticorpos específicos. Entretanto, os ensaios de neutralização mostraram ausência ou um baixo título de anticorpos neutralizantes. As células do baço derivadas de camundongos imunizados com os peptídeos mostraram uma alta produção de IL-10 e uma redução da produção do TNF-α e IFN-γ após a infecção com todos os sorotipos DENV quando comparado ao controle positivo. Em adição, células provenientes de camundongos imunizados com os peptídeos PEP02 e PEP03 apresentaram in vitro uma redução significativa da viabilidade celular após a infecção com os quatro sorotipos de DENV. A fim de se buscar um candidato vacinal para a dengue, foi expressa em sistema procarioto uma proteína recombinante (PEPDENV) que contém as sequências de PEP01, PEP02 e PEP03 fusionadas a uma sequência específica capaz de induzir de anticorpos neutralizantes. A imunização com a proteína PEPDENV revelou a imunogenicidade desta proteína ao induzir alta produção de anticorpos IgG1 em modelo murino, porém os soros não apresentaram atividade de neutralização da partícula viral. Ensaios imunoenzimáticos utilizando os peptídeos como substratos mostraram que os soros dos animais imunizados com PEPDENV tem capacidade de reconhecer os peptídeos, apresentando especialmente uma alta reatividade com o PEP03. Esses resultados sugerem que a ausência de atividade neutralizante dos anticorpos ocorreu pelo fato de que a resposta imune à proteína PEPDENV está mais direcionada para PEP03 do que para outras regiões da molécula, confirmando a imunogenicidade deste peptídeo. No entanto, mais estudos que visam modificar a sequência peptídica serão necessários para induzirem a produção de uma resposta imune eficaz contra todos os quatro sorotipos de DENV e também para melhorar a imunogenicidade deste canditatos vacinais. / Dengue is an arbovirus that has distinguished itself in recent years as a serious public health problem in Brazil. The Dengue virus (DENV) belongs to the family Flaviviridae, genus Flavivirus and its genome is composed of a single stranded RNA with positive polarity. Currently, there are five serotypes of DENV, which are genetically and antigenically distinct. The development of a vaccine that confers simultaneous, efficient and lasting immunity against the five serotypes of DENV is a priority given the magnitude of the problem. In this study, we evaluated the vaccine potential of three synthetic, conserved and tetravalent peptides (PEP01, PEP02 and PEP03) derived from the envelope protein. An indirect ELISA assay showed the reactivity of Dengue IgM/IgG human positive serum samples against the synthetic peptides. Immunization assays in mice have shown that these peptides were able to induce the production of specific antibodies. However, the neutralization assays showed absence or lower titers of neutralizing antibodies. The spleen cells derived from mice immunized with the peptides showed a high IL-10 expression and reduced expression of TNF-α and IFN-γ after infection for all DENV serotypes when compared with the positive control. In addition, cells from mice immunized with the PEP02 and PEP03 peptides present, in vitro, a significant reduction of cell viability after infection with the four DENV serotypes. To continue the evaluation of this vaccine candidate for dengue, it was expressed in prokaryote system a recombinant protein (PEPDENV) containing sequences of the PEP01, PEP02 and PEP03 fused to a specific sequence able to induce neutralizing antibodies. Immunization with PEPDENV protein showed the immunogenicity of this protein in inducing high production of IgG1 antibodies in mice, however the sera of immunized animals showed no neutralizing activity of the viral particle. Immunoenzymatics assay using the peptides as the substrates showed that the sera of immunized animals with PEPDENV were able to recognize the peptides, with a high reactivity to PEP03. These results suggest that the lack of neutralizing activity of the antibodies may be due to an immune response more directed to the PEP03 than to the other regions of the molecule, confirming the immunogenicity of this peptide. However, further studies aimed at modifying the peptide sequence will be required to induce the production of an effective immune response against all four serotypes of DENV and also to enhance the immunogenicity of these vaccine candidates. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

O peptídeo liberador da gastrina (GRP) está estabelecido como um fator de crescimento celular no câncer. Os fatores de crescimento desempenham um papel importante na proliferação das células neoplásicas e progressão do câncer, estando envolvidos na invasão local, angiogênese, metástases à distância e apoptose. A super-expressão de receptores para fatores de crescimento em células malignas é geralmente um marcador de agressividade e está associada a um prognóstico reservado. Na busca por novas estratégias no tratamento do câncer, muitos esforços têm sido feitos para se identificar quais são esses receptores e desenvolver terapias dirigidas contra eles, explorando a especificidade molecular. O GRPR já foi identificado em diversas neoplasias humanas, mas até o presente momento não há nenhum dado na literatura quanto a sua expressão no carcinoma hepatocelular (HCC). Considerando que esta neoplasia é uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo, objetivamos avaliar, nesse estudo, o perfil de expressão de GRPR em lesões neoplásicas malignas do fígado. Através da técnica de imunoistoquímica, lesões hepatocelulares malignas de 61 pacientes foram selecionadas do arquivo de patologia do HCPA, entre o período de janeiro de 2004 a março de 2009 e avaliados quanto à expressão de GRPR. O receptor foi detectado em 77% das amostras tumorais, na maioria das vezes exibindo padrão de coloração difuso; moderado ou forte (57.4%). Os GRPRs foram, também, intensamente expressos em lesões hepatocelulares cirróticas adjacentes às malignas (48.4%), entretanto, no tecido hepático normal (não-neoplásico e não-cirrótico) os GRPRs foram fracos e moderadamente expressos (36 a 59% respectivamente). A expressão do GRPR mostrou-se significativamente associada com o estagio do tumor (p= 0.047), mas não houve relação com os parâmetros clínico-patológicos (idade, gênero, presença de infecção viral, de cirrose, tamanho do tumor e nível de AFP). Entretanto, a estratificação dos pacientes, baseada na expressão do GRPR, revelou que os pacientes, que tiveram uma alta expressão do GRPR, tenderam a apresentar a sobrevida global e a sobrevida livre de doença menor (p= 0.174). Esse estudo demonstrou, pela primeira vez, a expressão aberrante de GRPRs no HCC em seres humanos. / Gastrin-releasing peptide (GRP) is already established as a growth factor in cancer. Growth factors are involved in cell proliferation and cancer progression, enhancing local invasion, angiogenesis, distant metastasis and apoptosis. Furthermore, the overexpression of growth factor receptors on the cell surface of malignant cells might be associated with a more aggressive behavior and a poor prognosis. Searching for new strategies for cancer treatment, much effort has been done to identify these receptors and to develop targeted therapies exploring their molecular specificity. The GRPR has been identified in many human malignancies, but to date, no information regarding its expression in hepatocellular cancer (HCC) was found in the literature. Considering that HCC is a very important cause of morbidity and mortality worldwide, we aimed to evaluate the GRPR expression profile in neoplasic hepatocelular lesions. Sections of paraffin-embedded hepatocelluar carcinomas and cirrhotic surrounding tissues from 61 patients with primary HCC were studied, as well as 22 samples from non-cirrhotic and non-neoplastic hepatic tissue. GRPR immune-expression was demonstrated in the parenchymal tumor cells in 77% of tumor tissue samples (47/61) and was moderately to strongly expressed in 57.4% of these cases. In the surrounding cirrhotic liver, GRP immunostaining was also observed, showing a high expression in 15/31 of cases (48.4%). In the normal hepatic tissue, GRPR was also expressed, mostly with a weak to moderate expression (36.4 and 59.1, respectively). GRPR expression was significantly associated with tumor stage (P=0.047), but no correlation was observed with other clinicopathologic parameters (age, gender, virus, liver cirrhosis, tumor size, and AFP level). Moreover, stratification of patients based on tumor GRPR expression revealed that the patients who had a high expression of GRPR tended to have a shorter overall survival (OS) time and a significantly shorter disease-free survival (DFS) time.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-15Bitstream added on 2014-06-13T19:01:10Z : No. of bitstreams: 1 barbosa_lcb_dr_araiq.pdf: 1542454 bytes, checksum: 327a840d830dd6df24f9ee9a47d53cff (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O sistema ParE-ParD é um sistema toxina-antitoxina bacteriano, sendo ParE a toxina e ParD a antitoxina. ParD é capaz de neutralizar a ação de ParE formando um complexo com o mesmo, o qual é eficaz na autorregulação do operon parDE. Estudos têm mostrado que a atividade tóxica de ParE ocorre inibindo a atividade da DNA girase, mas nenhum efeito desta proteína sobre a atividade da topoisomerase IV foi observado até hoje. Baseando-se na estrutura primária da toxina ParE de Escherichia coli, bem como nos escassos dados em relação a esta toxina, a meta deste trabalho foi a obtenção de peptídeos sintéticos baseados nesta proteína a fim de avaliar as sequências de aminoácidos responsáveis pela interação com as diferentes topoisomerases bacterianas, além de tentar isolar uma sequência polipeptídica com potencial atividade inibitória sobre essas enzimas. Utilizando modelagem molecular por homologia, um modelo tridimensional para toxina ParE de E. coli foi obtido e validado. Com base nos dados estruturais inferidos a partir do modelo da estrutura tridimensional de ParE, 12 peptídeos foram racionalmente desenhados e sintetizados pela metodologia da fase sólida. Ensaios de inibição in vitro da atividade de superenovelamento de DNA pela girase e de relaxamento de DNA pela topoisomerase IV foram realizados e indicaram que os peptídeos ParE3 (ParE 80-100), ParE8 (ParE 61-105), ParE10 (ParE 61-87) e ParE12 (ParE 61-79) atuam como bons inibidores de ambas enzimas. Ensaios de fluorescência intrínseca e anisotropia de fluorescência, empregando peptídeos sintéticos derivados de ParE, evidenciaram que o processo de inibição da atividade da DNA girase pela toxina ParE deve ocorrer por interação com a proteína GyrA da enzima. Foi iniciado neste trabalho os primeiros testes usando lipossomas como veículos... / The operon parDE encode a toxin-antitoxin system formed by ParE toxin and its antitoxin ParD. ParD is able to neutralize ParE action and is effective in autoregulation of the operon. Studies have shown that the toxic activity of the ParE occurs by inhibiting the activity of DNA gyrase, but no effect of this protein on the activity of topoisomerase IV has been observed yet. Based on the primary structure of the Escherichia coli ParE toxin, as well as the scarce data of this toxin, the aim of this work was to obtain synthetic peptides based on this protein in order to assess the amino acid sequences responsible for interaction with the bacterial topoisomerases, besides trying to isolate a polypeptide sequence with potential inhibitory activity against these enzymes. Using molecular homology modeling, a three-dimensional model for E. coli ParE toxin was obtained and validated. Based on structural data inferred from ParE threedimensional model, 12 peptides were rationally designed and synthesized by solid-phase method. Tests of inhibition of the supercoiling reaction of the DNA gyrase and inhibition of DNA relaxation by topoisomerase IV were performed and indicated that the peptides ParE3 (ParE 80-100), ParE8 (ParE 61-105), ParE10 (ParE 61 -87) and ParE12 (ParE 61-79) act as good inhibitors of both enzymes. Intrinsic fluorescence and fluorescence anisotropy assays, using synthetic peptides derived from ParE showed that inhibition process of activity of the DNA gyrase by ParE toxin must occur by interaction with the GyrA protein. In this work was started the first tests using liposomes as carrier vehicles for bioactive peptides derived from ParE. The peptides were efficiently encapsulated in soybean phosphatidyl choline liposomes. It was observed, although reduced, inhibition of bacterial growth when peptides encapsulated in liposomes were... (Complete abstract click electronic access below)

Memorial apresentado ao Instituto de Química do campus de Araraquara da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", para a obtenção do título de Livre Docente junto ao Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química. / Resumo: Não disponivel. / Abstract: Not available.

Ureases são enzimas níquel-dependentes que catalisam a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Além disso, apresentam diversas propriedades independentes da catálise, sendo consideradas proteínas moonlighting. São amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas em bactérias, arqueas, plantas e fungos, podendo se organizar em unidades funcionais compostas por uma, duas ou três subunidades. Sua ativação, que envolve a passagem da enzima de sua forma apo-urease a sua forma holourease, requer pelo menos três proteínas acessórias. Parte de suas propriedades não-catalíticas é associada à liberação de peptídeos internos da proteína nativa. Nesse contexto, a presente tese se dedicou ao estudo de diferentes aspectos da biologia estrutural de ureases. Ao elaborar uma narrativa filogenética, envolvendo varredura de bancos de dados em larga escala e diferentes algoritmos de reconstrução de árvores, foi possível propor uma rota evolutiva indicando a transição de três subunidades para uma única unidade funcional, sem passar por intermediários de duas cadeias. Quanto ao seu processo de ativação, por meio de múltiplos cálculos de atracamento baseados em dados experimentais prévios (especialmente SAXS), foram propostas estruturas para suas diferentes etapas, em resolução atomística. Finalmente, o comportamento dinâmico de diferentes peptídeos derivados de urease foram analisados computacionalmente por meio de simulações de longa duração (500 ns) e associados a outros dados obtidos in vitro, permitindo justificar efeitos diferenciais obtidos na aplicação destes peptídeos. De maneira geral, o trabalho empregou técnicas computacionais à análise de ureases, fornecendo bases para futuros estudos de suas propriedades, sejam catalíticas ou não, incluindo sua aplicação biotecnológica. / Ureases are nickel-dependent enzymes that catalyze the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. They have many catalysis-independent properties, being considered moonlighting proteins. Ureases are found in bacteria, archaea, plants, and fungi, and may be organized in functional units composed by one, two, or three subunits. Their activation, involving the transition from apo to holourease, requires at least three accessory proteins. Some of their non-catalytic properties are related to the release of internal peptides from the native protein. In this context, this thesis was developed upon the study of different aspects of urease structural biology. By phylogenetical reconstruction, employing large-scale databank scans and different tree-building algorithms, we were able to propose an evolutionary route by which the transition from three to one functional subunits was possible, with no need for a two-chained intermediate. Regarding the activation mechanism, we have proposed structural models for the oligomeric intermediates of the process by multiple docking calculations, at atomistic resolution, based on previous experimental data (especially SAXS). Additionally, the dynamical behavior of different ureasederived peptides was analyzed by computational simulations at large time scales (500 ns) and correlated to in vitro results, allowing us to explain the variable effects observed after their application on test systems. In short, in this work we have employed computational techniques to the analysis of urease, providing working grounds for further studies of this enzyme and its properties (catalytical or not), including its biotechnological applicability.