Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A saliva de artrópodos hematófagos constitui um coquetel farmacológico que atua nos sistemas hemostático, inflamatório e imunológico de seus hospedeiros para auxiliar a aquisição do sangue. O inseto T. infestans, vetor da doença de Chagas, apresenta em sua saliva uma série de moléculas e atividades biológicas já descritas. Dentre elas está a trialisina, uma proteína formadora de poros em bicamadas lipídicas. A trialisina é capaz de lisar/permeabilizar diversos tipos celulares e se propõe que a atividade lítica ocorra pela inserção da porção N-terminal da molécula na membrana das células de tal forma a promover a formação de um poro. A identificação do gene que codifica a trialisina mostrou que além de ter uma seqüência sinal de secreção, a proteína conteria uma região ácida no seu N-terminal. Este domínio está ausente na proteína madura purificada da saliva e poderia inibir a ação da trialisina. O objetivo de nosso trabalho foi estudar o mecanismo de lise da trialisina e como se daria a ativação do precursor da trialisina (pró-trialisina) durante a secreção da glândula salivar até a ejeção da saliva. Para entender o mecanismo de ação da trialisina, já que a expressão heteróloga tanto da pró-trialisina quanto da trialisina apresentou várias dificuldades, utilizamos peptídeos sintéticos baseados na região N-terminal da trialisina madura. Os peptídeos mostraram diferentes especificidades para tripomastigotas de Trypanosoma cruzi, hemácias humanas e Escherichia coli, mas de modo geral, aqueles que continham a maior parte da primeira hélice anfipática predita na trialisina madura apresentaram maior atividade lítica. Todos os peptídeos adquiriam estrutura secundária (α-hélices) na presença de agentes miméticos de membranas. Determinamos as estruturas tridimensionais em solução por Ressonância Magnética Nuclear dos três peptídeos mais ativos e de um pouco ativo e pudemos observar a importância de segmentos distintos de alguns peptídeos nas especificidades dos alvos. 3 Utilizando um anti-soro gerado contra a porção C-terminal da trialisina recombinante (fragmento não-lítico), identificamos a pró-trialisina em extratos de glândulas salivares contendo APMSF, inibidor da ativação da trialisina. O precursor apresentou menor atividade lítica contra tripomastigotas. Embora fosse previsto que o precursor teria uma porção pró de 33 resíduos, a diferença entre as bandas em SDS-PAGE da pró-trialisina e trialisina foi de cerca de 10-15 aminoácidos. Um peptídeo de fluorescência apagada contendo 12 resíduos da porção pró e 27 do N-terminal da trialisina madura foi sintetizado e observamos que sua atividade lítica era aumentada quando a serino-protease salivar triapsina ou endoproteinase Arg-C eram adicionadas, ao mesmo tempo em que o peptídeo alterava sua estrutura, indicando que a porção acídica é responsável pela inibição da lise. Esses resultados permitiram caracterizar o papel do N-terminal da trialisina no processo de lise, identificar o precursor da trialisina na glândula salivar, verificar sua ativação durante a salivação e melhor elaborar um mecanismo pelo qual a atividade é controlada durante o armazenamento da proteína nas glândulas salivares. / Hematophagous arthropods contain in their saliva a pharmacological cocktail that acts on the hemostatic, inflammatory and immune systems of their hosts facilitating blood acquisition. The saliva of the insect T. infestans, vector of Chagas' disease, contains several described molecules and biological activities, among which lies trialysin, a protein that forms pores in lipid bilayers. Trialysin can lyse/permeabilize different cell types and it is proposed that lytic activity is achieved by insertion of the N-terminal portion of the molecule onto a cell membrane forming a pore. The identification of the gene that codes for trialysin has shown that besides a secretion signal sequence, the protein contains an acidic region upstream the mature sequence that is not present in the N-terminus of trialysin purified from saliva and could inhibit the activity of the molecule. Our goal was to study trialysin lytic mechanism and the activation of its precursor (pro-trialysin) from secretion inside the salivary glands to saliva ejection. To understand trialysin action mechanism, since heterologous expression of either protrialysin or trialysin was mostly unsuccessful, we used synthetic peptides based on the Nterminal region of mature trialysin that presented different specificities against T. cruzi trypomastigotes, human erythrocytes and E. coli, but those that encompassed most of the first predicted amphipathic helix in trialysin were more active. All peptides folded into α-helices in the presence of membrane mimetic agents. We solved the tridimensional solution structures by Nuclear Magnetic Resonance of the three most active peptides and a less lytic one and observed that distinct regions of some peptides determine target specificity. Using an anti-serum against the recombinant C-terminal portion of trialysin (non-lytic fragment), we identified pro-trialysin in salivary glands extracts containing APMSF, inhibitor of trialysin activation. The lytic activity of the precursor against trypomastigotes is reduced. 5 Although it was predicted that the precursor would contain a pro-region 33-amino acids long, the difference between the SDS-PAGE trialysin and pro-trialysin bands was around 10-15 residues. Using a fluorescence resonance emission transfer peptide encompassing 12 proregion amino acids and 27 mature N-terminal residues, after incubation with triapsin or endoproteinase Arg-C, an increase in lytic activity was observed. At the same time, the peptide changed its structure indicating this region can impair lysis inside salivary glands. These results allowed us to characterize the role of trialysin N-terminus in the lysis process, identify the trialysin precursor in the salivary gland, and determine the mechanism of activation and lysis control during storage and saliva release. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

COUTO, José Luciano Pimenta. Estudo de parâmetros salivares em portadores de picnodisostose. 2010. 96 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-12-14T12:01:20Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_jlpcouto.pdf: 2128077 bytes, checksum: 41ef6743abecdb86af2057605a3347ab (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-01T16:01:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_jlpcouto.pdf: 2128077 bytes, checksum: 41ef6743abecdb86af2057605a3347ab (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-01T16:01:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_jlpcouto.pdf: 2128077 bytes, checksum: 41ef6743abecdb86af2057605a3347ab (MD5) Previous issue date: 2010 / Picnodysostosis (PKND) is a skeletal displasia characterized by short stature, osteosclerosis, acrosteolisis, craniofacial deformities and bone fragility. Approximately 200 cases have been described among different ethnic groups, with an estimated incidence of 1.7: 1.000.000 live births. The use of saliva as a diagnostic tool has advanced exponentially within recent years. Unbalance in the amount and composition of saliva may generate oral diseases such as dental caries and periodontitis, and may also indicate important systemic alterations. This study has aimed to investigate the parameters of human whole saliva in patients with PKND. Our study sample consisted of 4 individuals with PKND (experimental group) and 4 healthy individuals without PKND (control group). Salivary flow rate, pH and protein profile were evaluated in this population. Non stimulated whole saliva was collected and centrifuged. The supernatant was separated and lyophilized and stored at -20°C for posterior total protein and bidimensional electroforetic analysis. Statistically significant differences were observed between groups (p<0,05) for the analyzed salivary parameters. When compared to the control group, individuals with PKND presented reduced salivary flow rate, lower pH values, reduced total protein concentration, and protein bands with differentiated expression. The results of this study suggest the existence of a differentiated pattern of salivary composition between groups. / A picnodisostose é uma displasia esquelética caracterizada por baixa estatura, osteoclerose, acrosteólise, deformidades crânio-faciais e fragilidade óssea. Aproximadamente 200 casos foram descritos em diferentes grupos étnicos, estimando-se uma incidência de 1,7: 1.000.0000 de nascidos. O uso da saliva como um método de diagnóstico avançou exponencialmente nos últimos anos. Desequilíbrios na quantidade e composição da saliva podem gerar afecções bucais tais como cáries e doença periodontal, além de ser indicativo de alteração sistêmica importante. Esse trabalho objetivou estudar parâmetros de saliva total humana em pacientes portadores de picnodisostose (PYCN). A amostra consistiu em 04 indivíduos com PYCN (grupo experimental) e 04 indivíduos não-sindrômicos (grupo controle), tendo sido avaliado fluxo salivar, pH e perfil protéico. Saliva total não estimulada foi coletada e centrifugada; o sobrenadante foi retido, liofilizado, armazenado a -20°C e analisado para contagem de proteínas totais e eletroforese bidimensional. Foi possível detectar diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (p<0,05) para os parâmetros salivares analisados. Quando comparados com o grupo controle, portadores de PYCN apresentaram redução no fluxo salivar; pH com valores aumentados; redução na concentração total de proteínas e bandas protéicas com expressão diferenciadas. Os resultados desse estudo sugerem haver padrões diferenciados na composição salivar entre os grupos avaliados.

O estudo de peptídeos grampeados, que estabilizam voltas de hélices-α com a ligação de uma cadeia química, desenvolveu-se na última década, uma vez que a adição de um elemento não peptídico (grampo) mostrou aumentar o conteúdo de hélice e a estabilidade conformacional destas moléculas. A consequente manutenção de um arcabouço estrutural definido possibilita, em princípio, simular regiões específicas da superfície de proteínas e, assim, modular terapeuticamente potenciais vias de sinalização associadas. Neste sentido, a capacidade de antecipar a eficácia de grampos sobre peptídeos específicos através de simulações computacionais pode contribuir na aceleração e na redução de custos no processo de planejamento racional de novos fármacos. O presente trabalho buscou avaliar a capacidade de simulações por dinâmica molecular em reproduzir o efeito conformacional de grampos olefínicos em um peptídeo derivado da RNAse A. Foram utilizados três diferentes campos de força: AMBER99SB-ILDN, CHARMM36 e GROMOS54a7, e os resultados foram comparados a dados de dicroismo circular obtidos experimentalmente, além de análises de RMSD, RMSF, estrutura secundária e conteúdo de hélice. Os parâmetros utilizados com o campo de força átomo unido GROMOS54a7 foram os que mais se aproximaram dos dados experimentais, embora não tendo sucesso na descrição de dois dos três grampos nos parâmetros simulados, mas tendo um desempenho melhor do que campos de força que descrevem todos os átomos do sistema. Tais resultados indicam que, com melhorias na parametrização, a dinâmica molecular pode ser utilizada para antecipar efeitos conformacionais de grampos olefínicos em peptídeos. / The study of stapled peptides, which stabilize turns of an alpha-helix through the addition of a linker, has developed in the last decade since it was shown that the addition of the staple enhanced helical content and conformational stability of peptides. The maintenance of a structural scaffold allows the simulation of specific regions of protein surfaces, and thus allows the therapeutical modulation of signaling pathways of interest. The ability to anticipate the efficacy of the addition of a staple in a peptide through computational simulations may contribute to enhance the speed and lower the costs associated with rational drug design. This work evaluated the capability of molecular dynamics simulations to reproduce the effect of all-hydrocarbon staples in an RNAse A-derived peptide. We used three different force fields: AMBER99SB-ILDN, CHARMM36 and GROMOS54a7, and the results were compared to experimentally obtained circular dichroism data. The parameters used with the GROMOS54a7 united-atom force field revealed themselves to be more closely related to experimental data, even though it does not reproduce the effect of the addition of a staple in two of three stapled peptides, but it also shows an enhanced performance when compared to all-atom force fields. These results indicate that, with further enhancement of parametrization, molecular dynamics simulations may be used to anticipate conformational effects of all-hydrocarbon staples in peptides.

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-01-21T19:53:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoAtividadeAntiangiogênica.pdf: 2183887 bytes, checksum: 20976b466a997681ece6568897f57866 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-01-22T15:17:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoAtividadeAntiangiogênica.pdf: 2183887 bytes, checksum: 20976b466a997681ece6568897f57866 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-22T15:17:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoAtividadeAntiangiogênica.pdf: 2183887 bytes, checksum: 20976b466a997681ece6568897f57866 (MD5) Previous issue date: 2014 / A angiogênese ou neovascularização é um processo que inclui a ativação, adesão, proliferação e transmigração de células a partir de vasos sanguíneos pré-existentes, formando novos vasos. Para que isso ocorra, as células endoteliais devem primeiramente escapar da sua localização estável, através da ruptura da membrana basal, mediada por serino proteases (SPs) e metaloproteases (MPs) e migrar em direção ao estímulo angiogênico. Neste sentido, o equilíbrio entre as proteases e seus inibidores endógenos é necessário para manter a homeostase celular e a angiogênese fisiológica. Os inibidores de proteases do tipo Bowman-Birk (BBI) são proteínas caracterizadas pela presença de dois domínios independentes, capazes de inibir proteases tripsina-símile e quimotripsina-símile. Dotado de capacidade antitumoral essa molécula pode atuar inibindo proteases envolvidas na angiogênese. A capacidade do BBI de prevenir a carcinogênese tem sido comprovada, tanto em preparações enriquecidas, o BBI concentrado (BBIC) quanto em preparações purificadas. Entretanto, essa atividade antitumoral pode estar relacionada à presença de outras substâncias em sua preparação. Mais recentemente a Lunasina tem sido apontada como o principal componente responsável por tal atividade. O mecanismo de ação proposto para a Lunasina está relacionado à capacidade de inibição da acetilação de histonas, regulando a desespiralização da cromatina e assim, inibindo a proliferação celular. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antiangiogênico de ambas as substâncias tendo em vista a possibilidade de inibição de enzimas proteolíticas pelo BBI e a atividade antiproliferativa da Lunasina. A avaliação do potencial antiangiogênico foi realizada através do Ensaio em Membrana Corioalantóica (CAM) de Gallus domesticus. Para identificar as atividades biológicas dessas proteínas da soja e explorar os possíveis mecanismos relacionados à atividade antiangiogenica, o domínio ativo da Lunasina (PL22) foi sintetizado e testado no ensaio de CAM in vivo. Testamos ainda o BBI purificado a partir de sementes de soja e a associação de PL22 e BBI. O peptídeo PL22 e o BBI apresentaram atividade na redução de vasos sanguíneos, a partir da dose de 7000 pmol. A porcentagem de redução do número de bifurcações em relação ao controle foi de 18% para o BBI na dose de 70 pmol e de 31% para o peptídeo PL22 na mesma dose. Entretanto não foi verificado efeito cooperativo ou sinérgico na associação do peptídeo PL22 com o BBI. Não foram observadas variações na expressão dos marcadores conexina-43 e VEGF pela técnica de Western blotting, sugerindo esses marcadores não estão relacionados ao mecanismo de ação do BBI e PL22. Os resultados da análise corroboram as avaliações feitas pela contagem direta dos vasos em microscópio digital do ponto de vista do efeito antiangiogênico. Além disso, foi observada uma atividade antinflamatória pra ambas as subtâncias. A apreciação dos perfis eletroforéticos bidimensionais de extratos das membranas corioalantóicas tratadas com BBI e PL22 demonstram uma expressão de proteínas diferencial em relação ao controle que permitirá a identificação de possíveis marcadores visando esclarecer o mecanismo e confirmar molecularmente os efeitos constatados. ______________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Angiogenesis or neovascularization is a process, which includes activation, adhesion and transmigration of cells from pre-existing blood vessels, forming new blood vessels. For the process occur, endothelial cells must first escape from their stable location, through disruption of the basement membrane, mediated by serine proteases (SPs) and metalloproteases (MPs) and migrate toward the angiogenic stimulus. Accordingly, the balance between proteases and their endogenous inhibitors is necessary to maintain cellular homeostasis and physiological angiogenesis. Protease inhibitors Bowman- Birk type (BBI) are proteins characterized by the presence of two independent domains capable of inhibiting trypsin-like and chymotrypsin-like proteases. Endowed with antitumor capacity this molecule may act by inhibiting proteases involved in angiogenesis. The ability of BBI to prevent carcinogenesis has proved both in enriched preparations, BBI concentrate (BBIC) and in purified preparations. However, the antitumor activity could be related to the presence of other substances in its preparation. More recently, lunasin was identified as the main component responsible for this activity. The proposed mechanism of action for lunasin was related with the ability to inhibit histone acetylation, regulating the chromatin unfolding and thus inhibiting cell proliferation. This study aimed to evaluate the antiangiogenic potential of both substances in view of the possibility of inhibition of proteolytic enzymes by BBI and antiproliferative activity of lunasin. The assessment of antiangiogenic potential was performed using Chorioallantoic Membrane Assay (CAM) of Gallus domesticus. To identify the biological activities of these proteins in soy and explore the possible use in anti- angiogenic therapy, the active area of lunasin (PL22) was synthesized and tested in the CAM assay in vivo. BBI also was tested and purified from soybean seeds and the association of PL22 and BBI. The PL22 peptide and BBI showed activity in reducing blood vessels from the dose of 7000 pmol . The percentage of reduction in the number of bifurcations compared to control was 18% for the BBI at a dose of 70 pmol and 31 % for the PL22 peptide at the same dose. However, no cooperative or synergistic effect was observed in association with the peptide PL22 and BBI. No changes in the expression of markers connexin-43 and VEGF by Western blotting was observed, suggesting these markers are not related to the mechanism of action of BBI and PL22. The results of the analysis support the evaluation performed by direct counting of vessels in digital microscope view of the antiangiogenic effect. In addition, an anti-inflammatory activity for both subtances was observed. The assessment of the two-dimensional electrophoretic profiles of extracts of chorioallantoic membranes treated with BBI and PL22 showed a differential expression of proteins compared to control. These experiments represent an approach to identify markers and mechanisms related to the observed effect.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Química e Biológica, 2018. / Submitted by Robson Amaral (robsonamaral@bce.unb.br) on 2018-05-11T15:04:54Z No. of bitstreams: 1 2018_AnaLauraAlfonsoPérez.pdf: 2516747 bytes, checksum: b579caf86dfe900c3615afb57174b809 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-06-07T13:22:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_AnaLauraAlfonsoPérez.pdf: 2516747 bytes, checksum: b579caf86dfe900c3615afb57174b809 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-07T13:22:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_AnaLauraAlfonsoPérez.pdf: 2516747 bytes, checksum: b579caf86dfe900c3615afb57174b809 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / O sistema de expressão baseado na utilização da levedura Komagataella phaffii tem sido utilizado com sucesso na produção de uma grande variedade de proteínas heterólogas. Esta levedura reúne características como fácil manipulação molecular, crescimento celular rápido, capacidade de realizar modificações pós-traducionais e secreção eficiente de proteínas, além de atingir altas densidades celulares com grande produção da proteína heteróloga. Uma das proteínas de grande interesse na indústria biofarmacêutica e cosmética é o fator de crescimento epidermal humano (hEGF). O objetivo desse estudo foi desenvolver um sistema para a produção de hEGF na levedura K. phaffii. Para isso foram utilizados os peptídeos sinais dos genes αF, SUC2 e PHO1. Três vetores foram construídos, cada um deles contendo um dos peptídeos sinal. Foram construídos os vetores de expressão sob o controle do promotor do PGK1 e utilizados para transformação de K. phaffii M12-K, uma linhagem mutante para o gene KEX1. Os clones recombinantes foram confirmados por PCR de colônia e foram crescidos em meio mínimo para avaliar a cinética de crescimento. Os clones positivos foram selecionados e utilizados na expressão em frasco empregando meio complexo. A presença do hEGF foi avaliada por SDS-PAGE e confirmada por Western blot na presença de um anticorpo específico. Com isso, um clone de cada sistema foi escolhido para a purificação do hEGF por cromatografia de exclusão molecular e RP-HPLC. A partir desses experimentos foi confirmada a presença do hEGF e o polipeptídeo foi parcialmente purificado. Finalmente, foi escolhido o clone 1αF para otimizar o processo de purificação, adicionando uma etapa em HILIC. O hEGF foi satisfatoriamente purificado. O tamanho correto e a sequência do N-terminal igual ao EGF presente em humanos foram confirmados por espectrometria de massas e sequenciamento automático. Os resultados obtidos mostram que o hEGF foi produzido com sucesso em K. phaffii com a sequência primária correta. / The expression system based on the utilization of the yeast Komagataella phaffii has been used successfully used in the production of a large variety of heterologous proteins. This yeast combines several important features such as easy molecular manipulation, rapid cell growth, ability to perform post-translational modifications and efficient secretion of proteins, in addition to large heterologous protein production at high cell densities. One of the proteins of great interest in the biopharmaceutical and cosmetic industry is the human epidermal growth factor (hEGF). The aim of this study was to develop a system for hEGF production in K. phaffii. For this, the 3 different signal peptides sequences from genes αF, SUC2 and PHO1 were tested. Three vectors were constructed, each containing one of the signal peptides. Expression vectors were constructed under the control of the PGK1 promoter and used for transformation of K. phaffii M12-K, a strain mutant for the KEX1 gene. Recombinant clones were confirmed by colony PCR and grown in minimal medium to evaluate growth kinetics. Positive clones were selected and used in flask expression using complex media. The presence of hEGF was assessed by SDS-PAGE and confirmed by western blot with a specific antibody. One clone from each system was chosen for the production and purification of hEGF by molecular-exchange chromatography and RP-HPLC. From these experiments the presence of hEGF was confirmed and the polypeptide was partially purified. Finally, clone 1αF was chosen to optimize the purification process by adding one step in HILIC. The hEGF was successfully purified. Correct size and N-terminal sequence equal to EGF present in humans were confirmed by mass spectrometry and Edman sequencing. Together, our results show that hEGF was successfully produced in K. phaffii with the proper primary structure. / El sistema de expresión basado en la utilización de la levadura Komagataella phaffii ha sido utilizado con éxito en la producción de una gran variedad de proteínas heterólogas. Esta levadura reúne características como fácil manipulación molecular, rápido crecimiento celular, capacidad de realizar modificaciones pos-traduccionales y eficiente secreción de proteínas, además de llegar hasta altas densidades celulares con elevada producción heteróloga. Una de las proteínas de gran interés en la industria biofarmacéutica y cosmétic es el factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF). El objetivo de este estudio foi desarrollar un sistema para la producción de hEGF en la levadura K. phaffii. Para eso fueron utilizadas los péptidos señales de los genes αF, SUC2 e PHO1. Fueron construidos tres vectores, cada uno de ellos conteniendo una de las sequencias señales. Los vectores fueron construidos sobre el control del promotor del gen PGK1 y fueron utilizados para la transformación de la cepa M12-K de K. phaffii, que es mutante para el gen KEX1. Los clones recombinantes fueron confirmados mediante PCR de colonias y fueron crecidos en medio mínimo para analizar la cinética de crecimiento. Los clones positivos fueron seleccionados y utilizados para expresión en frasco utilizando medio complejo. La presencia de hEGF fue analizada por SDS-PAGE e confirmada por western blot en presencia de un anticuerpo específico. A partir de ahí, una muestra de cada sistema fue escogida para la purificación de hEGF utilizando cromatografía de exclusión molecular y RP-HPLC. A partir de esos experimentos fue confirmada la presencia de hEGF y el polipeptídeo fue parcialmente purificado. Finalmente, fue escogido el clon 1αF para optimizar el proceso de purificación, adicionando una cromatografía en HILIC. El hEGF fue satisfactoriamente purificado. El tamaño correcto y la secuencia del N-terminal igual al EGF presente en humanos fueron confirmados por espectrometría de masas y sequenciamiento automático. Los resultados obtenidos muestran que fue producido hEGF en K. phaffii, con la sequencia primária correcta.

Uma série de pseudopeptideos incorporados de estruturas pentaciclicas e triciclicas foram sintetizadas e suas preferencias conformacionais em solução foram avaliadas através de espectroscopia de RMN (velocidade de troca de deutério, EON, titulação de solvente entre outros) e através de cálculos teóricos utilizando-se dinknica molecular, métodos semiempiricos de ab initio. Em solução de CDCl3, os compostos pentaciclicos mostraram preferencialmente as conformações em dobra-C8 e dobra-y. Em solução de DMSO-d6, o dipeptideo (±)-12 adota uma conformação em dobra-y para uma das cadeias peptidicas e uma conformação em dobra-y e uma estrutura não-clássica, dobra-C5, para a outra cadeia. Os compostos tricíclicos evidenciaram a formação de dobras-ß e folhetos-ß em solução de CDCl3 . Realizou-se a análise de van't Hoff para estes derivados, obtendo-se dados termodinâmicos os quais estão de acordo com os dados teóricos. As espécies ligadas por ligações de hidrogênio destes derivados mostraram-se entalpicamente favoráveis mas entropicamente desfavoráveis. Os estudos teóricos, sustentados através de dados experimentais, tornou possível identificar estas conformações e foram de grande importância na discussão dos resultados observados. Finalmente, sintezou-se uma serie de derivados destes sistemas para serem testados na inibição da protease do vírus HIV-1, realizando-se uma análise comparativa de modelos de complexacão com a enzima. / An assembly of nineteen depsipeptides attached to the conformationally restrict endotriciclo[ 6.2.1.02 '7]undeca-4,9-dieno-3,6-endo-endo-diol (2) and three stereochemically different pentaciclo[5.4.0.0 2'6 .03,10. 05'9]undecano-8,11-diol derivatives (3, 4 and 5) were synthesized. In order to investigate the conformational preferences in solution these depsipeptides were studied by NMR spectroscopy and by dynamic simulations, semiempirical and ab initio calculations. In the NMR experiments, the most probable secondary structures were evaluated from different parameters as the rates of proton-deuterium exchange, nuclear Overhauser effects, titration experiment, temperature coefficients, coupling constants and chemical shifts of NH protons analysis. In CDCl 3 solution, the pentacyclic scaffolds displayed different types of turn conformations characterized by a 8-membered hydrogen-bonded ring and by a y-like strand hydrogen-bonded ring for each peptide chain. In a strong solvating medium such as DMSO-d6 the depsipeptide (±) -12 derived from pentaciclo[5.4.0.0 2'6 .0 05 '9]undecano-endo-exo-8,11 system adopts a y-like strand hydrogen-bonded ring for one peptide chain and, for the other one, a bifurcated H-bond formed by a y-like strand and a non classical C5-structure. The tricycle constrained peptides have been shown to adopt ß-turn- and ß-sheet-like conformations. The van't Hoff analysis for all derivatives in CDCl 3 solution indicated that the formation of hydrogen-bonded species is enthalpically preferred but entropically disfavoured, in agreement with the theoretical studies. The theoretical calculations made it possible to identify the conformations and were of great importance in the discussion of the observed results. In addition, the conformationally constrained molecular frameworks of (2), (3), (4) and (5) were used to build a series of eight novel symmetric and pseudo-symmetric peptidomimetics to test as HIV-1 protease inhibitors, which are in the stage of biologic test. Finally, a complexation model of these compounds in the protease active site was proposed and compared with the current models in the literature.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-08-22T14:42:46Z No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-26T19:21:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T19:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MicaellaPereiradaFonseca.pdf: 4630281 bytes, checksum: 0e37678d479f619b59d863660a07a446 (MD5) Previous issue date: 2017-09-26 / Os neutrófilos são granulócitos polimorfonucleares que utilizam mecanismos intra e extracelulares para eliminar patógenos. A ativação de neutrófilos pela N-formil-Metionil-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), uma molécula quimiotáctica liberada de bactérias Gram-positivas, disparadores de explosão respiratória, modificações morfológicas, degranulação e liberação de NETs. No entanto, a desregulamentação de neutrófilos está envolvida com várias patologias, em parte, devido à exacerbação da descarga de espécies reativas de oxigênio e enzimas citolíticas Embora haja um número considerável de estudos sobre condições, as questões sobre como essas desregulações permanecem sem resposta; Para os caminhos exatos que são percorridos por esses caminhos intracelulares ainda estão preenchidos com lacunas. Atualmente, a comunidade científica vem usando uma ferramenta de análise conhecida como espectrometria de massa (MS) para desempenhar melhor o papel dos neutrófilos na resposta imune; a realização de estudos relacionados aos neutrófilos de proteômica comparativa são ferramentas essenciais para a compreensão dos mecanismos intracelulares que regem a resposta inflamatória. Usando ferramentas proteômicas de alta resolução, o presente trabalho identificou 8362 proteínas no total, na ativação de neutrófilos por fmp de 100 nmL / L. Em conclusão este trabalho representa a eficiência dos métodos de análise proteômica proporcionaram a identificação de 8362 proteínas, sendo 301 proteínas reguladas diante do estímulo com fMLP. Pois, proteínas importantes para a resposta inflamatória dos neutrófilos foram identificadas, mostrando que a análise comparativa dos mapas proteômicos utilizando diferentes métodos de aquisição e extração proteicas atuaram de forma complementar na robustez da identificação mais abrangente de proteínas de neutrófilos, tanto quiescentes quanto ativados com fMLP. Ademais, E que existe uma forte conexão entre a família das pequenas GTPases com a maioria dos processo desencadeados pela ativação de vias por fMLP, como por exemplo as evidências de alterações estruturais em MEV. Com as análises conjugadas será possível sugerir pontos de modulação da resposta inflamatória promovidas por agentes ativadores relacionados a receptores ligados a proteína G. A identificação de regulações por subunidades do proteassoma 26S tendo extensa participação nas vias reguladas, o que pode ser um indicativo para um mecanismo de regulação por esse complexo. Outrossim, a proteômica se mostra uma ferramenta essencial para a análise de vias, pois proporciona a identificação de proteínas que estão em pequenas quantidades como citocinas liberadas pela ativação. No mais, os mecanismos de morte celular programada com divergência entre vias de ativação e bloqueio da apoptose, podendo acarretar desregulação pois os dados tentem a sugerir um fino balanço entre as vias de vida e morte. O presente trabalho apresenta um conjunto de proteínas com diversas funções relacionadas aos processos da resposta inflamatória, que incluem a atividade oxidativa, motilidade, metabolismo energético e sinalização intra e intercelular. Este estudo adiciona dados relacionados à ativação de neutrófilos por fMLP, também revelando proteínas que não foram previamente identificadas em neutrófilos, ampliando as possibilidades de modulação da resposta inflamatória. Nosso estudo também comtempla o maior número de proteínas nos neutrófilos ativados por fMLP, ampliando assim as possibilidades de sugerir uma modulação da resposta inflamatória em neutrófilos. / Neutrophils are polymorphonuclear granulocytes that use intra- and extracellular mechanisms to eliminate pathogens. Activation of neutrophils by N-formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), a chemotactic molecule released from gram-positive bacteria, triggers respiratory burst, morphological modifications, degranulation and NETs´ release. However, neutrophils´ deregulation are involved with several pathologies, in part, due to the exacerbated discharge of reactive oxygen species and cytolytic enzymes; in other words, prolonged lifespan of activated neutrophils and their migration to non-injured tissues may result in severe clinical conditions. Although there are a considerable number of studies on conditions, questions about how such deregulations still remain unanswered; For the exact pathways that are traversed by these intracellular pathways are still filled with gaps. Currently, the scientific community has been using an analysis tool known as mass spectrometry (MS) to better play the role of neutrophils in the immune response; studies related to comparative proteomics neutrophils are essential tools for understanding the intracellular mechanisms governing the inflammatory response. In conclusion, this work represents the efficiency of the methods of proteomic analysis, which allowed the identification of 8362 proteins, 301 of which were regulated proteins before the stimulation with fMLP. Because proteins important for the inflammatory response of neutrophils were identified, showing that the comparative analysis of proteomic maps using different methods of protein acquisition and extraction acted in a complementary way in the robustness of the more comprehensive identification of neutrophil proteins, both quiescent and activated with fMLP . In addition, there is a strong connection between the family of small GTPases with most of the processes triggered by the activation of fMLP pathways, such as the evidence of structural alterations in SEM. With the conjugated analyzes it will be possible to suggest modulation points of the inflammatory response promoted by activating agents related to G protein-linked receptors. The identification of 26S proteasome subunit regimens having extensive participation in the regulated pathways, which may be indicative of a mechanism of regulation by this complex. In addition, the mechanisms of programmed cell death with divergence between activation pathways and apoptosis blockade, may lead to deregulation as the data try to suggest a fine balance between the life and death pathways. The present work presents a set of proteins with diverse functions related to the processes of the inflammatory response, which include oxidative activity, motility, energetic metabolism and intra and intercellular signaling. This study adds data related to the activation of neutrophils by fMLP, also revealing proteins that were not previously identified in neutrophils, increasing the possibilities of modulation of the inflammatory response. Our study also contemplates the largest number of proteins in the neutrophils activated by fMLP, thus increasing the possibilities of suggesting a modulation of the inflammatory response in neutrophils.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-24Bitstream added on 2014-06-13T19:49:45Z : No. of bitstreams: 1 barros_rs_me_araiq.pdf: 931248 bytes, checksum: cb6128639cbeba5c7ae65a24a783b21a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / CcdB é uma proteína de 11,7 kDa, com 101 resíduos de aminoácidos, produzida pelo plasmídeo F, como parte de um sistema de morte programada, de dois componentes, para a manutenção do número de cópias do plasmídeo. Neste sistema, CcdB age como uma toxina e o CcdA como um antídoto. Na ausência do CcdA, devido à perda do plasmídeo durante a replicação celular, CcdB pode matar bactéria pela inibição das enzimas DNA-girase e topoisomerase IV (topo IV). Girase e a topo IV são topoisomerases, ATP dependentes, responsáveis pelos processos de replicação e transcrição do DNA bacteriano, de modo que exercem papel fundamental na viabilidade dos microrganismos procariotos. Peptídeos derivados do CcdB têm demonstrado grande capacidade de inibição enzimática in vitro, porém a baixa permeabilidade da membrana celular bacteriana a estes derivados tem prejudicado a atividade in vivo. No intuito de criar um meio para facilitar a inserção de derivados sintéticos do CcdB em células bacterianas, uma série de peptídeos, constituídos de quatros seqüências carreadoras fundidas ao derivado peptídico CcdB1, foi sintetizada pela metodologia da fase sólida. Estes peptídeos foram testados quanto à inibição da girase e topo IV em solução. Dois peptídeos apresentaram inibição, com valores de IC100 abaixo de 100 μM, para ambas as enzimas. Estudos de dicroísmo circular associado aos ensaios de inibição evidenciaram forte dependência da atividade com a presença da hélice C-terminal. O derivado CPP1-CcdB1 apresentou atividade antimicrobiana contra Bacillus subtilis, a uma concentração de 50 μM, mostrando que a inserção de uma seqüência carreadora, pode facilitar o transporte de derivados do CcdB através da membrana celular. Além disso, a molécula de CcdB1 pode servir como um bom modelo para o desenvolvimento de novos CPPs. / CcdB is an 11.7 kDa protein with 101 amino acid residues, produced by the F plasmid as part of a two-component system of programmed cell death for maintaining plasmid copy number. In this system, CcdB acts as a toxin and CcdA as an antidote. In the absence of the CcdA, due to loss of plasmid during cell replication, CcdB can kill bacteria by inhibition of the DNA gyrase and topoisomerase IV (topo IV) enzymes. Gyrase and topo IV are ATP dependent topoisomerases, responsible for the transcription and replication processes in bacterial DNA, so that carries key role in the viability of prokaryotes microorganisms. Peptides derived from CcdB have shown great capacity for in vitro enzyme inhibition, but the low permeability of the bacterial cell membrane to these derivatives has damaged the activity in vivo. In order to create a form to facilitate the insertion of synthetic derivatives of CcdB in bacterial cells, a series of peptides, consisting of four carrier peptide sequences fused to the derived CcdB1, was synthesized by the solid phase methodology. These peptides were tested about inhibition of Gyrase and topo IV activities, in solution. Two peptides showed inhibition, with values of IC100 below 100 mM for both enzymes. Circular dicroism studies associated with inhibition tests showed strong dependence of activity with the presence of the C-terminal helix. The CPP1-CcdB1 derivative showed antimicrobial activity against Bacillus subtilis at a concentration of 50 mM, showing that the insertion of a carrier sequence can facilitate the transport of derivatives of CcdB through the cell membrane. In addition, the CcdB1 molecule is a good model to develop new CPPs.

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Alberto José Cavalheiro / Banca: Osvaldo de Freitas / Banca: Clovis Ryuichi Nakaie / Resumo: A maioria das bactérias possui dois tipos de topoisomerases IIA, DNA girase e topoisomerase IV (topo IV), que juntas ajudam a administrar a integridade e a topologia do DNA. A girase primariamente introduz superenovelamento negativo no DNA, e a topo IV, embora intimamente relacionada com a girase, preferencialmente desencadeia o DNA plasmidial e relaxa o superenovelamento positivo, funções essenciais para a replicação do DNA e transcrição. Isso faz da girase e da topo IV alvos importantes para diversas drogas antibacterianas. Estruturalmente, ambas operam como um heterotetrâmero composto por duas proteínas GyrA e duas proteínas GyrB, para a girase, e duas proteínas ParC e duas ParE, na topo IV. Inúmeros agentes antibacterianos atuam inibindo a girase e a topo IV, tais como as quinolonas, cumarinas e algumas toxinas naturais, incluindo o CcdB. A toxina bacteriana CcdB, é uma pequena proteína de 11,7 kDa, contendo 101 resíduos de aminoácidos que, juntamente com o CcdA, faz parte de um sistema de morte celular programada do plasmídeo F, um fator de conjugação muito estudado em Escherichia coli. CcdB atua como uma toxina e o CcdA como a antitoxina. Na ausência de CcdA, CcdB pode matar a bactéria através de um mecanismo, ainda pouco conhecido, que envolve a girase e/ou a topo IV, assim como a região C-terminal da toxina CcdB (Trp-99 a Ile-101). Neste trabalho está descrita a obtenção de uma série de seqüências peptídicas miméticas, racionalmente projetadas, baseadas na estrutura primária do CcdB natural, com o objetivo de melhor entender o mecanismo de inibição da atividade de ambas, DNA girase e topo IV, pelo CcdB, e também propor um novo grupo de moléculas com potencial atividade antibacteriana. / Abstract: Most bacteria posses two type IIA topisomerases, DNA gyrase and topoisomerase IV (topo IV), that together help manage DNA integrity and topology. Gyrase primarily introduces negative supercoils into DNA, and the topo IV, although closely related to gyrase, preferentially decatenates DNA and relaxes positive supercoils, essential functions for bacterial DNA replication and transcription. This makes of the gyrase and topo IV important targets for antibacterial drugs. Structurally both operate as a heterotetramer formed by two GyrA and two GyrB proteins for girase, and two ParC and two ParE proteins for topo IV. A large number of antibacterial agents act in the inhibition of the gyrase and topo IV, such as quinolones, coumarins, and some natural toxins including the protein CcdB. The bacterial toxin CcdB is a 11.7 kDa protein with 101 amino acids that with CcdA form a programmed cell death system of F plasmid, a conjugation factor widely studied in E. coli. CcdB acts like a toxin and CcdA as the antitoxin. In the CcdA absence, CcdB can kill the cell by an unclear mechanism that involves gyrase and/or topo IV, as well as the CcdB C-terminal region (Trp-99 to Ile-101). In this work it is described the obtaining of a several peptides mimics, rationally design, based on the primary structure of natural CcdB toxin, to a better understanding the inhibition mechanism of the activity of the gyrase and topo IV, by CcdB toxin, and also propose a new molecules group with potential antibacterial activity. The peptides mimics were synthesized by Solid Phase methodology (SPPS), purified and analyzed by liquid chromatography (HPLC) and identified by LC/ESI-MS and by amino acid analysis. The inhibition capacity of the peptide mimics was tested by electrophoresis agarose gels and by bacterial growth in liquid medium assays. / Doutor

Memorial apresentado ao Instituto de Química do campus de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" para concurso de Livre Docência / Inclui bibliografia e índice.