Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-10T15:57:18Z No. of bitstreams: 1 2009_CristianoGuimaraesdoAmaralPinheiro.pdf: 6022850 bytes, checksum: de87af154e58c83712757d3e3e0faa67 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-30T21:16:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CristianoGuimaraesdoAmaralPinheiro.pdf: 6022850 bytes, checksum: de87af154e58c83712757d3e3e0faa67 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-30T21:16:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CristianoGuimaraesdoAmaralPinheiro.pdf: 6022850 bytes, checksum: de87af154e58c83712757d3e3e0faa67 (MD5) Previous issue date: 2009 / A inserção de peptídeos na membrana plasmática é um dos principais paradigmas do processo geral de interação entre a célula e o ambiente. O entendimento físico-químico desse processo, sobretudo nos aspectos estruturais e energéticos da matéria, no nível das interações atômicas, é de particular interesse para novas aplicações na medicina e farmacologia. Podemos destacar o desenho racional de peptídeos antibacterianos, que por meio de interações com a membrana causam lise celular e conseqüente morte desses microorganismos. Além disso, a compreensão do processo de inserção peptídica é de igual interesse para o desenvolvimento de novos produtos voltados para o tratamento clínico de doenças humanas, como o Mal de Alzheimer relacionado à inserção e agregação de placas peptídicas na membrana. Dada à relevância biológica da inserção peptídica, o estudo desse processo têm sido de interesse científico e tecnológico para diversos grupos de pesquisa no mundo, entretanto, a sua completa descrição microscópica permanece ainda não elucidada. Nesse contexto atual, como um esforço adicional, esse trabalho visa caracterizar as propriedades microscópicas dirigentes do fenômeno de inserção de peptídeos utilizando simulações computacionais de Dinâmica Molecular, conjugadas a métodos de cálculo de energia livre. Um tempo total de simulação de 1,2 microsegundos foi requerido para estudar a partição de dois peptídeos com natureza físico-química distintas, isto é, um hidrofóbico e o outro hidrofílico carregado. O estudo revela uma estabilidade energética global para o peptídeo hidrofílico estruturalmente associado à região interfacial água/membrana, e inclusão do hidrofóbico no centro da bicamada. Em ambos os casos, o passo limitante para o processo de inserção é a transposição peptídica através da região polar do lipídio. Via manipulações biotecnológicas, essa informação é de especial valor para a maior estabilização de moléculas no interior da membrana, aumento da velocidade de inserção ou estabilização de agregados na superfície celular. Finalmente, a metodologia aqui desenvolvida permitirá estudar uma série de outras moléculas que se particionem e efetivamente atravessem diferentes modelos de membranas, contribuindo para o entendimento geral sobre o transporte de peptídeos pela membrana. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Peptide insertion through the plasmatic membrane is a major paradigm for the cellular-environment communications. At the level of atomic interactions, the structural and energetic knowledge about this process is of particular interest for novel applications in the fields of medicine and pharmacology. We can highlight the rational design of antimicrobial peptides that induce the microorganism death by causing cellular lysis and further developments applied to human dysfunctions, such as the Alzheimer’s disease related to peptide insertion and aggregation on the membrane surface. Given the broad biological significance of peptide insertion through membranes, this process has been of scientific and technological interests for several worldwide research groups, its complete microscopic description remains however to be clarified. Here, as an additional effort, the present contribution aims to the characterization of major microscopic properties controlling the process of peptide insertion, using advanced methods of free-energy Molecular Dynamics simulations. A total simulation time of 1.2 microseconds was required to study the membrane partition of two peptides with distinct physical and chemical properties, e.g., one hydrophobic and the other hydrophilic (charged). The study reveals a global energy minimum for the hydrophilic peptide adsorbed on the water-membrane interface, and the burying of the hydrophobic one in the lipid-bilayer main core. For both peptides, the rate-limiting step for molecule partition is the displacement across the lipid headgroups. By means of biotechnological manipulations, these findings are worth to enhance the stability of molecules in the bilayer-tail region, to speed up the insertion process or even to stabilize peptide aggregate forms on the membrane surface. Finally, the methodology herein developed allows one to study another set of molecules that interacts or permeates different lipid bilayer models, contributing therefore to a general understanding concerning the transport of peptides across membranes.

Tese (doutorado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-03-16T17:53:45Z No. of bitstreams: 1 2007_SelmaAparecidaSouzakuckelhaus.pdf: 5606121 bytes, checksum: 44dd25773a2f4d3a74f1adb28d4c2865 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-03-18T23:22:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_SelmaAparecidaSouzakuckelhaus.pdf: 5606121 bytes, checksum: 44dd25773a2f4d3a74f1adb28d4c2865 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-18T23:22:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_SelmaAparecidaSouzakuckelhaus.pdf: 5606121 bytes, checksum: 44dd25773a2f4d3a74f1adb28d4c2865 (MD5) / As doenças infecciosas estão entre as principais causas de mortalidade em todo o mundo e seu controle depende da existência de agentes antimicrobianos eficazes. O maior entrave para a manutenção da eficácia é o desenvolvimento de resistência dos agentes infecciosos às drogas antimicrobianas. A geração de resistência aos antimicrobianos tornou-se nas últimas décadas uma das grandes preocupações da Organização Mundial de Saúde que, desde então, tem estimulado as pesquisas, básica e aplicada, na busca por novas drogas que possam ajudar na luta constante contra os mecanismos de resistência. Todos os seres vivos estão continuadamente expostos a uma grande quantidade de potenciais agentes patogênicos e a capacidade para evitar as doenças depende, em grande parte, dos seus mecanismos de defesa. Tanto animais quanto plantas desenvolveram, ao longo da evolução, mecanismos inatos de defesa, tais como a produção de diferentes substâncias bioativas, que são identificadas, sobretudo, nos anfíbios. Dentre essas substâncias destacam-se os peptídeos com ação antimicrobiana, que exercem, in vitro, potente atividade lítica contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, protozoários e fungos filamentosos e, comumente, exibem baixa toxicidade para células de mamíferos. Esses peptídeos são caracterizados por apresentarem seqüências de 12 a 50 resíduos de aminoácidos e intensa carga positiva e, apesar da grande diversidade molecular, têm em comum suas configurações anfipáticas e propriedade de interação com membranas celulares. Os estudos realizados com a secreção cutânea de duas pererecas do gênero Phyllomedusa permitiram a descoberta de uma nova família de peptídeos antimicrobianos denominada filosseptinas (PSs) e, estudos preliminares realizados com a filosseptina-1 (PS-1) mostraram seu potencial antimicrobiano. Logo, considerando a diversidade funcional desses peptídeos e sua eficácia ao longo do processo evolutivo o objetivo desse estudo foi avaliar a toxicidade da PS-1 sobre células de mamíferos, in vitro e in vivo e sua atividade antiparasitária sobre L. (L.) amazonensis e P. falciparum, visando aplicações biomédicas e biotecnológicas. Observaram-se, com as maiores concentrações de PS- 1, efeitos tóxicos sobre células de mamíferos e com as menores concentrações capacidade imunomodulatória, por aumentar a adesão de macrófagos, influenciar a fagocitose, a produção de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio por macrófagos de camundongo e, de fator de necrose tumoral por monócitos humanos. A PS-1 apresentou também grande atividade lítica sobre L. (L.) amazonensis e P. falciparum, sendo definidas como 1 ou 48μg/mL, respectivamente, as concentrações capazes de inibir o crescimento de, no mínimo 50% dos parasitos. Nossos resultados demonstraram que a PS-1 apresenta grande potencial para aplicações biomédicas, como modulador do sistema imunitário ou como agente antimicrobiano contra plasmódio e leishmânia. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Infectious diseases cause millions of deaths throughout the world and their control depends on the use of efficient antimicrobial agents. However, a major concern is the frequent development of resistance of the infectious agents to these products. The growing emergence of this phenomenon lead the World Health Organization to consider it as a major public health problem, and it has stimulated the development of novel products, mainly from nature, to fight the pathogens. It is well established that animals and plants produce many bioactive substances as defense mechanisms. This ability is particularly important among the amphibians. Some of these substances are represented by antimicrobial peptides, which are endowed with activity against bacteria and protozoa, and commonly exhibit low toxicity to mammalian cells. These antimicrobial peptides are characterized by the presence of 12 to 50 amino acids residues, high cationicity and, despite the great diversity of molecular structures, they are amphipathic and present the property to interact with cell membranes. Recently, our group identified a new family of antimicrobial peptides named phylloseptins, and the preliminary studies with phylloseptin-1 (PS-1) showed its potential as an antimicrobial agent. Considering the functional diversity of antimicrobial peptides and their efficacy throughout the evolutionary process, the objective of the present investigation was to evaluate the toxicity of PS-1 against mammalian cells, in vitro and in vivo, and its activity against two protozoa, L. (L.) amazonensis and P. falciparum, for future biomedical applications. Toxic effects of PS-1 were observed on mammalian cells exclusively with larger concentrations of the peptide, whereas with the smaller ones, immunomodulation was observed, affecting macrophage adherence, phagocytosis, production of hydrogen peroxide and nitric oxide by mouse peritoneal macrophages, and tumor necrosis factor by human monocytes. PS-1 showed strong activity against L. (L.) amazonensis and P. falciparum, and at concentrations of 1 or 48μg/mL, respectively, the peptide was able to inhibit 50% of these parasites, respectively. Our results showed that PS-1 presents an important potential for biomedical applications, both as an immunomodulatory product, and as an antimicrobial agent against plasmodium and leishmania species.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-06-30T17:10:00Z No. of bitstreams: 1 Andrea_Cruz_CarvalhoParcial_noPW.pdf: 1857896 bytes, checksum: cf340b7a56f876a3c4e447cb70f8df1f (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-07-06T12:59:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Andrea_Cruz_CarvalhoParcial_noPW.pdf: 1857896 bytes, checksum: cf340b7a56f876a3c4e447cb70f8df1f (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-06T12:59:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrea_Cruz_CarvalhoParcial_noPW.pdf: 1857896 bytes, checksum: cf340b7a56f876a3c4e447cb70f8df1f (MD5) / As secreções cutâneas dos anfíbios anuros são reconhecidamente uma rica fonte de substâncias bioativas. Um importante grupo dentre esses compostos são os peptídeos antimicrobianos (PAMs). Os PAMs são componentes do sistema imune inato, presentes na maioria dos seres vivos, que vêm despertando um interesse crescente, uma vez que apresentam atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de microrganismos, sendo usualmente atóxicos para células de mamíferos. O presente trabalho teve como objetivo o isolamento, a identificação e a caracterização empregando espectrometria de massa tipo MALDI-TOF de PAMs presentes nas secreções cutâneas dos anuros Proceratophrys goyana, Physalaemus fuscumaculatus e Physalaemus centralis, comumente encontrados na fauna do Cerrado. Também foi objeto do presente a caracterização biológica de duas versões sintéticas do peptídeo ceratoxin-like previamente isolado e quimicamente caracterizado da rã Hypsiboas albopunctatus. As secreções cutâneas das espécies P. goyana, P. fuscumaculatus e P. centralis foram obtidas por estimulação elétrica, liofilizadas e armazenadas a - 20°C. Cada secreção bruta foi submetida a fracionamento por RP-HPLC usando coluna C18 (Shim-pack CLC-ODS, 6.0 x 150 mm) em sistema HPLC com emprego de gradiente linear de TFA 0,1% (v/v) em acetonitrila. A detecção foi monitorada a 216 nm e a eluição realizada com fluxo de 1 mL/min. As frações cromatográficas eluídas foram coletadas manualmente e secadas a vácuo. Diferenças significativas nos perfis cromatográficos de cada espécie foram observadas. Todas as frações cromatográficas obtidas foram avaliadas quanto à capacidade em inibir a proliferação de bactérias patogênicas S. aureus (ATCC 25923) e P. aeruginosa (ATCC 27853), bem como quanto à capacidade de lisar eritrócitos humanos. As frações ativas foram analisadas por espectrometria de massa tipo MALDI-TOF a fim de se avaliar seu grau de pureza e determinar as massas moleculares dos componentes presentes. Peptídeos antimicrobianos foram identificados nas três secreções cutâneas em estudo. As duas versões sintéticas do peptídeo ceratoxin-like contendo Leu ou Ile na porção C-terminal foram avaliados quanto ao seu potencial inibitório sobre o crescimento de sete linhagens de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. As duas versões do peptídeo ceratoxin-like de H. albopunctatus apresentaram atividade antibacteriana significativa com MICs que variaram de 2 a 8 μM. Como vários PAMs de amplo espectro de ação também apresentam citotoxicidade para células cancerígenas, tais peptídeos foram testados contra a linhagem celular de câncer cervical (HeLa) e fibroblastos normais (NIH3T3). Os resultados obtidos indicaram que as duas versões testadas exibem atividade citotóxica contras as linhagens celulares avaliadas. Estudos de bioprospecção relacionados com a caracterização química e biológica dos compostos presentes na secreção cutânea de anuros são de extrema relevância, podendo auxiliar no esclarecimento de questões taxonômicas, no desenvolvimento de novas drogas terapêuticas, além do entendimento da biologia dos anuros. O presente trabalho é parte de um esforço para aumentar o nosso conhecimento acerca da diversidade de peptídeos antimicrobianos presentes nas secreções cutâneas de anuros da fauna do Cerrado brasileiro. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Skin secretion of anurans are recognized as a rich source of several bioactive substances. An important group of such compounds are the antimicrobial peptides (AMPs). AMPs are components of the innate immune system present in the most living beings that have been awaken to an increasing interest, because they exhibit antimicrobial activity against a large array of microorganisms, being usually non-toxic for mammal cells. The aim of this study was the isolation, identification and characterization using MALDI-TOF mass spectrometry of AMPs from the cutaneous secretions of the anurans Proceratophrys goyana, Physalaemus fuscumaculatus and Physalaemus centralis, commonly found in the Brazilian Cerrado. It was also described the biological characterization of two synthetic versions of the ceratoxinlike peptide previously isolated and chemically characterized from the frog Hypsiboas albopunctatus. The skin secretions were obtained by electrical stimulation, freeze-dried and stored at -20ºC. Each crude secretion was fractioned by RP-HPLC on a C18 column (Shim-pack CLC-ODS, 6.0 x 150 mm) using a HPLC system and employing a linear gradient of TFA 0,1% (v/v) in acetonitrile. The detection was monitored at 216 nm and the elution was performed at 1 mL/min. The eluted chromatographic fractions were manually collected and dried in vacuum. Meaningful differences in the chromatographic profiles of each species were observed. All eluted chromatographic fractions were tested for their cellular proliferation inhibition of pathogenic bacteria S. aureus (ATCC 25923) and P. aeruginosa (ATCC 27853), as also for their ability to promote lysis of human erythrocytes. The bioactive fractions were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry in order to evaluate their homogeneity and to determine the molecular masses of the major components present in each fraction. Antimicrobial peptides were identified in the three secretions under analysis. The two synthetic versions of the ceratoxin-like peptide with Leu or Ile in the C-terminal region were evaluated for their inhibitory activity on the cellular proliferation of seven different Gram-positive and Gram-negative bacteria. The two versions of the ceratoxin-like peptide of H. albopunctatus exhibited strong antibacterial effects with MICs ranging from 2 to 8 M. As several AMPs of large spectrum of action are also toxic to cancer cells, these two peptides were also tested against cervix cancer cell lineage (HeLa) and fibroblasts (NIH3T3). The results indicated that the two peptides were cytotoxic for both tested cells (cancer and normal cells). Bioprospective studies related to the chemical and biological characterization of the compounds present in the skin secretions of anurans are extremely relevant, as they can help clarifying taxonomy issues, on the development of therapeutic drugs, and also on the understanding of amphibian biology. This work is part of an effort to increase our knowledge about the diversity of antimicrobial peptides present in the skin secretions of the anurans from the Brazilian Cerrado fauna.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Ciências Médicas, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-12-19T12:11:47Z No. of bitstreams: 1 2013_OsorioLuisRangelAlmeida.pdf: 2794636 bytes, checksum: a926215a853491f81a853483001a74e0 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-01-07T21:18:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_OsorioLuisRangelAlmeida.pdf: 2794636 bytes, checksum: a926215a853491f81a853483001a74e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-07T21:18:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_OsorioLuisRangelAlmeida.pdf: 2794636 bytes, checksum: a926215a853491f81a853483001a74e0 (MD5) / Apesar do valor prognóstico do peptídeo natriurético cerebral (BNP) em pacientes com insuficiência cardíaca ser bem conhecido, existem poucas evidências sobre seu papel no contexto do infarto do miocárdio (IM). Conceitualmente, o estiramen- to atrial produzido pela sobrecarga ventricular no pós-infarto torna plausível a hipótese de que elevados níveis de BNP no pós-IM estejam associados a remodelamento ventricular negativo e menor sobrevida. Pacientes consecutivos com IM com elevação do segmento ST (n=152) do Brazilian Heart Study foram acompa- nhados prospectivamente por 332 (300-349) dias. Nas primeiras 24h do início dos osintomas (D1) e no 5 dia (D5) foram avaliados os níveis plasmáticos do BNP e foi ocalculado o Delta-BNP (D5–D1). No 3 mês após o IM os pacientes foram submetidos à ressonância nuclear magnética cardíaca (RNM-c). Nos modelos de regressão logística e de Cox ajustados para sexo, idade e dose de estatina e diagnóstico de diabetes mellitus, um Delta-BNP acima da mediana (80 pg/ml) foi associado, respectivamente, a maior incidência de morte súbita e re-infarto fatal e não-fatal (MACE) em 30 dias (OR 10,88, IC95% 1,10–108, p=0,038) e em 1 ano (HR 2,51, IC95% 1,03–6,11, p=0,043). Além disso, em curvas ROC para discriminação da incidência de MACE, o Delta-BNP se mostrou superior ao BNP no D1 (Área sob a curva 0,72 p=0.031 vs 0,43 p=0.5). Consistentemente, pacientes com Delta-BNP maior que mediana apresentaram 3.14 vezes (1,01–9,75; p=0.048) mais chances de evoluir com fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) oabaixo de 46,5% (mediana da FEVE no 3 mês) do que os pacientes com Delta-BNP menor que a mediana. Entretanto, o Delta-BNP não se associou significativamente com massa infartada ou com os volumes do VE ao final da sístole e diástole. Pacientes com maior variação do Delta-BNP entre a admissão e D5, após o infarto do miocárdico, se associaram a maior incidência de eventos cardiovas-culares em curto e longo prazo, o que pode potencialmente ser justificado pela pior FEVE apresentada nesse grupo de indivíduos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Although the prognostic value of BNP in patients with heart failure is well known, there is only little evidence about their role in the context of myocardial infarction (MI). Conceptually, the atrial stretch produced by ventricular overload in post-MI makes plausible the hypothesis that high levels of BNP in after MI may be associated with shorter survival and negative ventricular remodeling. Consecutive patients with ST elevation MI (n = 152) from Brazilian Heart Study were followed prospectively for 332 (300-349) days. In the first 24 hours after the onset of symptoms (D1) and at day 5 (D5) we evaluated plasma levels of BNP and calculated Delta-BNP (D1-D5). At the third month after MI patients underwent cardiac magnetic resonance imaging (cMRI). In logistic regression and Cox models adjusted for sex, age, dose of statin and diagnosis of diabetes mellitus, a Delta-BNP above the me- dian (80 pg/ml) was associated with higher incidence of sudden death and myo-cardial infarction (MACE) at 30 days (OR 10.88, 95% CI 1.10 to 108, p = 0.038) and at 1 year (HR 2.51, 95% CI 1.03 to 6.11, p = 0.043). In addition, in ROC curves for discrimination of the incidence of MACE, Delta-BNP showed superiority against BNP D1 (Area under the curve of 0.72 p=0.031 vs 0.43 p=0.5). Consistently, patients with Delta-BNP above the median were 3.14 times (95% CI 1.01 to 9.75, p=0.048) more likely of having left (left ventricular ejection fraction (LVEF) lower than median (46.5%)) than those with delta BNP below the median. However, Delta-BNP was not significantly associated with infarcted mass or end of diastolic and systolic LV volumes. Patients with greater elevation in BNP levels beween admission and D5 after MI show an increased risk of cardiovascular events in short and long term, which may potentially be explained by worse LVEF presented by this group of individuals.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Ciências Fisiológicas, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-01-17T12:16:55Z No. of bitstreams: 1 2013_PriscillaGalanteRibeiro.pdf: 1737160 bytes, checksum: 4a420525f22119a33e4c567b33ad185e (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2014-01-23T14:46:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_PriscillaGalanteRibeiro.pdf: 1737160 bytes, checksum: 4a420525f22119a33e4c567b33ad185e (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-23T14:46:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_PriscillaGalanteRibeiro.pdf: 1737160 bytes, checksum: 4a420525f22119a33e4c567b33ad185e (MD5) / Peçonhas de vespas são formadas por um conjunto de moléculas com diversas ações farmacológicas, como as aminas biogênicas, as acilpoliaminas e os peptídeos, sendo estes últimos os mais abundantes. Atualmente, compostos neuroativos isolados de peçonhas de animais tem despertado grande interesse devido a seu potencial no desenho de novas drogas para prevenir ou tratar doenças como dor crônica, epilepsia e Parkinson, assim como novas ferramentas farmacológicas. Neste contexto, o estudo da peçonha de vespas tem proporcionado à descoberta de novos compostos neuroativos, mas, ainda, até o momento, a grande maioria dos peptídeos não foi identificada e avaliada. A vespa social Parachartergus fraternus tem uma marcante peculiaridade: embora estas vespas vivam em comunidade, a ação da sua peçonha é capaz de paralisar a presa de modo irreversível e não letal o que difere de outras vespas sociais que a utiliza apenas para proteção contra predadores. Esta diferença indica a presença de compostos com ação em estruturas do sistema nervoso. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi a identificação e o isolamento de peptídeos antinociceptivos da peçonha de P. fraternus. A peçonha de P. fraternus foi analisada por duas estratégias: fracionamento por CLAE seguido de MALDI/TOF e a construção da biblioteca de cDNA e sequenciamento. Uma fração específica foi separada por CLAE e após ser sequenciada de novo, teve sua sequência parcialmente determinada, com diversas ambiguidades e especialmente, entre Leucina e Isoleucina. Em relação ao transcritoma, um clone da biblioteca de cDNA foi identificado que codifica o peptídeo, o que possibilitou a completa determinação da sequência peptídica. A análise do sequenciamento revelou a presença de um precursor do peptídeo maduro, composto por um propeptídeo de 61 aminoácidos e com um possível sinal de clivagem. A sequência do peptídeo maduro foi determinada como ILGTILGLLKGL-NH2. Após busca nos bancos de dados, este peptídeo mostrou homologia com a Protonectina, identificada anteriormente na vespa Protonectarina sylveirae. Para o peptídeo sintético, duas modificações foram desenhadas e o peptídeo IFGTILGFLKGL-NH2 foi produzido ®por síntese em fase sólida (Aminotech ). A atividade antinociceptiva dos dois peptídeos foi avaliada utilizando o modelo de placa quente em camundongos Swiss (n=4-6/grupo). Os peptídeos foram injetados por via i.c.v. nas concentrações de 16 e 8 nmol/animal diluídas em solução veículo quatro dias após a implantação da cânula guia. Como controle positivo foi utilizado morfina (16nmol/animal) e como controle negativo foi utilizado água deionizada como veículo. A atividade antinociceptiva do peptídeo natural foi efetiva na concentração de 8 nmol/animal em 90, 120 e 240 min (p<0,05), enquanto que na concentração de 16 nmol/animal mostrou um efeito menor, provavelmente devido à neurotoxicidade. Já o peptídeo sintético mostrou uma resposta dose-dependente, sendo que na concentração de 16 nmol/animal a atividade antinociceptiva não diferiu estatisticamente (p>0,05) da morfina em todos os tempos testados (240min). O peptídeo sintético não mostrou atividade hemolítica, assim como o descrito na literatura para o peptídeo natural. Ao contrário do peptídeo natural, animais injetados com o peptídeo sintético não apresentaram déficit motor, na maior dose testada no teste de antinocicepção. Esses resultados corroboram a hipótese de que a peçonha de vespas possui um grupo de moléculas que atuam no SNC de mamíferos. O peptídeo sintético mostrou potencial de contribuir com o desenvolvimento da neurociência na elucidação da transmissão sináptica e no desenho de novas drogas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Wasp venoms are formed by several molecules, such as biogenic amines, acylpoliamines and peptides which are the most abundant component. Neuroactive compounds are of great interest for their relevant potential to design new drugs, important to prevent and/or treat diseases such as chronic pain, epilepsy and Parkinson, as well as to develop other pharmacological tools. In this context, the study of wasp venoms has lead to the discovery of neuroactive molecules, however most peptides have yet to be identified or characterized. The social wasp Parachartergus fraternus has a remarkable peculiarity: although these wasps live in community, their venom act by irreversibly and non-lethally paralyzing their prey, which differs from other social wasps, which typically uses the venom only for protection against prey. This difference in the mode of action suggests the presence of compounds with activity in the nervous system. For this reason, the aim of this study was the identification and isolation of antinociceptive peptides in the venom of P. fraternus. The venom of P. fraternus was analyzed by two complementary strategies: HPLC fractionation followed by MALDI-TOF analysis and cDNA library construction and sequencing. A specific fraction was identified by mass spectrometry (MALDI-TOF), however sequencing of this fraction was unable to unambiguously determine between Leucine and Isoleucine. Using the transcriptomic approach, the sequence of the precursor encoding this peptide was identified. The precursor encodes a propeptide of 61 amino acids with a putative signal peptide. The sequence of the mature peptide was determined as ILGTILGLLKGL-NH2. Similarity search in public databases showed that this peptide is identical to Protonectin isolated from Protonectarina sylveirae. A synthetic peptide with two amino acid substitutions, IFGTILGFLKGL-NH2, was produced by solid phase synthesis (Aminotech). Antinociceptive activity of both peptides was evaluated by the hot plate model in Swiss mice (n=4-6/group). The peptides were infused via i.c.v. at doses of 16 and 8 nmol/animal (in vehicle solution) four days after the implantation of the guide cannula. Morphine (16nmol/animal) was used as positive control and vehicle solution was used as negative control (2µL/animal). The analgesic activity of the natural isolated peptide was shown to be effective at 8 nmol/animal (p<0.05) in the time points of 90, 120 and 240 min whereas the higher dose of 16 nmol/animal showed a decreased effect, probably due to neurotoxicity. The synthetic peptide had a dose- dependent response, where the highest dose (16 nmol/animal) showed antinociceptive activity that did not differ (p<0.05) from morphine in all time points tested (240min). The synthetic peptide did not show hemolytic activity, similar to the natural peptide as shown in previous studies. Contrary to the natural peptide, animals injected with the higher dose of the synthetic peptide (16nmol/animal) did not show motor deficit in the antinociceptive test. Together, these results support the hypothesis that wasp venoms have a group of molecules with activity in the CNS of mammals. The synthetic peptide tested here showed the potential to contribute to the development of neuroscience in the elucidation of synaptic transmission and also in the design of new drugs.

Uma série de pseudopeptideos incorporados de estruturas pentaciclicas e triciclicas foram sintetizadas e suas preferencias conformacionais em solução foram avaliadas através de espectroscopia de RMN (velocidade de troca de deutério, EON, titulação de solvente entre outros) e através de cálculos teóricos utilizando-se dinknica molecular, métodos semiempiricos de ab initio. Em solução de CDCl3, os compostos pentaciclicos mostraram preferencialmente as conformações em dobra-C8 e dobra-y. Em solução de DMSO-d6, o dipeptideo (±)-12 adota uma conformação em dobra-y para uma das cadeias peptidicas e uma conformação em dobra-y e uma estrutura não-clássica, dobra-C5, para a outra cadeia. Os compostos tricíclicos evidenciaram a formação de dobras-ß e folhetos-ß em solução de CDCl3 . Realizou-se a análise de van't Hoff para estes derivados, obtendo-se dados termodinâmicos os quais estão de acordo com os dados teóricos. As espécies ligadas por ligações de hidrogênio destes derivados mostraram-se entalpicamente favoráveis mas entropicamente desfavoráveis. Os estudos teóricos, sustentados através de dados experimentais, tornou possível identificar estas conformações e foram de grande importância na discussão dos resultados observados. Finalmente, sintezou-se uma serie de derivados destes sistemas para serem testados na inibição da protease do vírus HIV-1, realizando-se uma análise comparativa de modelos de complexacão com a enzima. / An assembly of nineteen depsipeptides attached to the conformationally restrict endotriciclo[ 6.2.1.02 '7]undeca-4,9-dieno-3,6-endo-endo-diol (2) and three stereochemically different pentaciclo[5.4.0.0 2'6 .03,10. 05'9]undecano-8,11-diol derivatives (3, 4 and 5) were synthesized. In order to investigate the conformational preferences in solution these depsipeptides were studied by NMR spectroscopy and by dynamic simulations, semiempirical and ab initio calculations. In the NMR experiments, the most probable secondary structures were evaluated from different parameters as the rates of proton-deuterium exchange, nuclear Overhauser effects, titration experiment, temperature coefficients, coupling constants and chemical shifts of NH protons analysis. In CDCl 3 solution, the pentacyclic scaffolds displayed different types of turn conformations characterized by a 8-membered hydrogen-bonded ring and by a y-like strand hydrogen-bonded ring for each peptide chain. In a strong solvating medium such as DMSO-d6 the depsipeptide (±) -12 derived from pentaciclo[5.4.0.0 2'6 .0 05 '9]undecano-endo-exo-8,11 system adopts a y-like strand hydrogen-bonded ring for one peptide chain and, for the other one, a bifurcated H-bond formed by a y-like strand and a non classical C5-structure. The tricycle constrained peptides have been shown to adopt ß-turn- and ß-sheet-like conformations. The van't Hoff analysis for all derivatives in CDCl 3 solution indicated that the formation of hydrogen-bonded species is enthalpically preferred but entropically disfavoured, in agreement with the theoretical studies. The theoretical calculations made it possible to identify the conformations and were of great importance in the discussion of the observed results. In addition, the conformationally constrained molecular frameworks of (2), (3), (4) and (5) were used to build a series of eight novel symmetric and pseudo-symmetric peptidomimetics to test as HIV-1 protease inhibitors, which are in the stage of biologic test. Finally, a complexation model of these compounds in the protease active site was proposed and compared with the current models in the literature.

Submitted by Andre Moraes Queiroz (andre.moraesqueiroz@ufpe.br) on 2015-04-14T15:24:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Regina Elisabety Oliveira Folha.pdf: 2918360 bytes, checksum: 1a7e68f1ca5dfdac7826122b071a2c7f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T15:24:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Regina Elisabety Oliveira Folha.pdf: 2918360 bytes, checksum: 1a7e68f1ca5dfdac7826122b071a2c7f (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CNPq; FACEPE; CAPES / O pinhão-manso é uma espécie vegetal com grande potencial para produção de biodiesel a partir de óleo extraído das sementes, composto principalmente por ácidos graxos sintetizados primariamente nos cloroplastos. A determinação do proteoma cloroplastidal de pinhão-manso, submetido a estresse por salinidade e déficit hídrico, revelou alterações provavelmente associadas a mecanismos de regulação gênica, metabólica e fisiológica para adaptação da planta. Este trabalho teve como objetivo a identificação de peptídeos expressos nos cloroplastos de pinhão-manso submetido ao estresse hídrico e salino, através do mapeamento eletroforético (1D e 2D) e espectrometria de massas. Na análise proteômica, as proteínas cloroplastidias foram extraídas, quantificadas e analisadas por eletroforese unidimensional e bidimensional. No tratamento salino, sete fragmentos do perfil eletroforético 1D controle, após duas ou 72 h sob aplicação do estresse foram excisados, digeridos com tripsina e identificados via espectrometria de massas. No tratamento com déficit hídrico, seis fragmentos do perfil eletroforético 1D controle ou sob estresse, assim como 14 spots diferencialmente expressos entre os perfis 2D, foram também analisados via espectrometria de massas. Foram identificadas presumivelmente mais de 35 proteínas, categorizadas em processo de geração de energia, metabolismo de carboidratos e em respostas de defesa a estresses abióticos. O padrão de comportamento dos peptídeos identificados sugere a existência de mecanismos de ajuste fisiológico para tolerância aos fatores de estresse estudados. Estas proteínas podem ser candidatas para investigações futuras de caracterização estrutural e funcional em estratégias de seleção e melhoramento genético para conferir maior tolerância à salinidade e ao déficit hídrico em pinhão-manso.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-31T22:13:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Nathalia Albuquerque Roberto.pdf: 2170710 bytes, checksum: d4675cfd7d221fc806601335f88f71e1 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-02T17:18:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Nathalia Albuquerque Roberto.pdf: 2170710 bytes, checksum: d4675cfd7d221fc806601335f88f71e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-02T17:18:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Nathalia Albuquerque Roberto.pdf: 2170710 bytes, checksum: d4675cfd7d221fc806601335f88f71e1 (MD5) Previous issue date: 2017-02-22 / CAPES / Os resíduos de processamento de peixe são uma importante fonte de recursos subutilizados que apresentam potencial para diversas aplicações biotecnológicas. A espécie Coryphaena hippurus, conhecida no Brasil como dourado, representa um importante recurso pesqueiro com uma ampla distribuição global. O colágeno, é uma proteína fibrosa encontrada em todo o reino animal, que possui uma variedade de aplicações industriais, principalmente nos setores farmacêutico, de cosméticos e alimentos. Devido aos baixos riscos de transmissão de doenças, alto rendimento nos processos de extração e ausência de toxicidade, organismos aquáticos têm se destacado como uma alternativa frente ao colágeno comercial (obtido a partir de animais terrestres). Assim, o presente trabalho teve por objetivo produzir peptídeos bioativos através da hidrólise do colágeno isolado da pele de dourado (C. hippurus), empregando colagenase extraída de suas vísceras intestinais. O rendimento da extração do colágeno ácido solúvel (ASC) e pepsino solúvel (PSC) foi de 43% e 3%, respectivamente. A SDS-PAGE do ASC e PSC apresentaram padrão de bandas semelhante ao encontrado na literatura para amostras de colágeno, com cadeias α 1 e α 2, bem como cadeia β. O espectro de absorção ultravioleta (UV) de ambos colágenos apresentou absorção máxima a 230 nm. A solubilidade de ASC e PSC foi maior na faixa de pH ácida, alcançando seu máximo em pH 1 e 2, respectivamente. A solubilidade do ASC foi superior em baixas concentrações de NaCl, apresentando diminuição da solubilidade em concentrações acima de 1%. Os espectros FTIR do ASC e PSC exibiram picos característicos de Amida I, II, III bem como amida A e B, semelhantes a colágenos do tipo I de outros peixes. Os resultados obtidos neste estudo indicam a possibilidade de obtenção de proteases e colágeno do tipo I a partir da pele do dourado para a produção de peptídeos bioativos. / Fish processing wastes are an important source of underutilized resources that have potential for various biotech applications. The species Coryphaena hippurus, represents an important fishery resource with a wide global distribution. Collagen is a fibrous protein found throughout the animal kingdom, which has a variety of industrial applications, mainly in the pharmaceutical, cosmetics and food industries. Due to the low risks of disease transmission, high yields in the extraction processes and absence of toxicity, aquatic organisms have stood out as an alternative against commercial collagen (obtained from terrestrial animals). Therefore, the present work aimed to produce bioactive peptides through the hydrolysis of collagen isolated from the skin of gold (C. hippurus), using collagenase extracted from its intestinal viscera. The extraction yield of ASC and PSC was 43% and 3%, respectively. The SDS-PAGE of the ASC and PSC presented bands pattern similar to that found in the literature for samples of collagen, with α 1 and α 2 chains, as well as β chain. The ultraviolet (UV) absorption spectrum of both collagens showed maximum absorption at 230 nm. The solubility of ASC and PSC was higher in the acid pH range, reaching its maximum at pH 1 and 2, respectively. The solubility of the ASC was higher at low NaCl concentrations, with a decrease in solubility at concentrations above 1%. FTIR spectra of ASC and PSC exhibited characteristic peaks of Amide I, II, III as well as amide A and B, similar to type I collagens of other fish. The results obtained in this study indicate the possibility of obtaining proteases and type I collagen from the skin of gilt for the production of bioactive peptides.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-08-07T18:59:40Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Felipe Roberto Borba Ferreira.pdf: 2146138 bytes, checksum: a5216409b3f582f8aa557abee059d6b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-15T20:38:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Felipe Roberto Borba Ferreira.pdf: 2146138 bytes, checksum: a5216409b3f582f8aa557abee059d6b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-15T20:38:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Felipe Roberto Borba Ferreira.pdf: 2146138 bytes, checksum: a5216409b3f582f8aa557abee059d6b7 (MD5) Previous issue date: 2015-04-28 / CAPES / A aranha brasileira Lasiodora (Mygalomorphae, Theraphosidae), conhecida popularmente como, é amplamente distribuída na região Nordeste do Brasil, na Zona da Mata. Os venenos de Theraphosídeos podem ser uma rica fonte de importantes ferramentas farmacológicas. O presente estudo realizou a venômica parcial, extração e atividade antimicrobiana do veneno da tarântula brasileira Lasiodora sp contra bactérias e fungos patogênicos importantes. Após o processo de extração, um veneno incolor foi obtido sem contaminação de fluidos gástricos. Este mostrou conter um concentração ~ 4,53 ± 0,38 ug / μL de proteína e um pH de 5,5. O Perfil eletroforético mostrou uma baixa massa molecular variando de 2 kDa a 10 kDa e uma variedade de faixas com massas moleculares de 30 kDa a 250 kDa. O perfil do veneno por RP-HPLC junto com SDS-PAGE não revelou uma diferença significativa entre venenos de macho e fêmea. Após separação cromatográfica, as frações do veneno, foram digeridas em gel e analisada por espectrometria de massa. Quatro peptídeos, U1-theraphotoxin-Lp1a (Lasiotoxin-1), U1-theraphotoxin-Lp1b (Lasiotoxin-2) e U3-theraphotoxin-Lsp1a (LTx5) e ω-theraphotoxin-Asp3a, foram identificados. Estes peptídeos mostraram uma elevada homologia com outros peptídeos encontrados em Lasiodora sp. e em outros Theraphosideos. Foram identificadas duas proteínas: PLA2 e hialuronidase. ω-theraphotoxin-Asp3a, PLA2 e hialuronidase estão sendo descritas pela primeira vez compondo o veneno de Lasiodora sp. O veneno inibiu o crescimento e matou todos os microrganismos testados, com inibição mínima (MIC), mínima bactericida (CBM) e mínima fungicida (MFC) em concentrações que variam de 3,9 a 500 ug / ml. O veneno de Lasiodora sp. pode ser classificado como um agente bactericida (MBC / MIC = 1) contra as bactérias Gram-positivos Bacillus subtilis e Micrococcus luteus e a bactéria Gram-negativas Aeromonas sp. Além disso, ele pode ser classificado como um agente fungicida contra Candida parapsilosis (MFC / MIC = 1) e Candida albicans (MFC / MIC = 2). O veneno agiu como um fármaco bacteriostático contra a espécie gram-positiva Staphylococcus aureus (MBC / MIC = 64), e bactérias Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa (MBC / MIC = 8) e Klebsiella pneumoniae (MBC / MIC = 16), bem como agente fungistático sobre as leveduras Candida tropicalis (MFC / MIC = 16,02) e Candida krusei (MFC / MIC = 8). Em conclusão, o veneno de Lasiodora sp. foi parcialmente caracterizado e é fonte de agentes antimicrobianos com relevância clínica e o estudo contribui para a caracterização do gênero. / The Brazilian spider Lasiodora (Mygalomorphae, Theraphosidae), whose trivial names are “caranguejeira” or tarantula, is widely distributed in Northeastern Brazil, in the rainforest. The theraphosid venoms may be a rich source of important pharmacological tools. In the present study we conducted the partial venomic, extraction and antimicrobial activity against medically important bacteria and fungi from the venom of the Brazilian tarantula Lasiodora sp. After extraction process, a colorless venom was obtained without contamination with gastric fluids. This venom showed a contained 4.53±0.38 μg/μL of protein and a pH of 5.5. Electrophoretic profile showed a low molecular mass ranging from 2 kDa to 10 kDa and a variety of bands with molecular masses from 30 kDa to 250 kDa. RP-HPLC venom profile together SDS-PAGE did not reveal a difference among male and female venom’s. After chromatographic separation fractions of venoms were in gel digestion and analyzed by mass spectrometry. Four peptides, U₁-theraphotoxin-Lp1a (Lasiotoxin-1), U₁-theraphotoxin-Lp1b (Lasiotoxin-2) and U₃-theraphotoxin-Lsp1a (LTx5), ω-theraphotoxin-Asp3a. were identified. These peptides showed a high identity with other peptides found in Lasiodora and other Theraphosides. Two proteins were identified: PLA₂ and hyaluronidase. ω-theraphotoxin-Asp3a, PLA₂ and hyaluronidase are describe for first time composing the venom of Lasiodora sp. The venom inhibited the growth and killed all tested microorganisms, with minimal inhibitory (MIC), minimal bactericide (MBC) and minimal fungicide (MFC) concentrations ranging from 3.9 to 500 μg/mL. The Lasiodora sp. venom can be classified as a bactericide agent (MBC/MIC = 1) against the Gram-positive bacteria Bacillus subtillis and Micrococcus luteus and the Gram-negative bacterium Aeromonas sp. Also, it can be classified as a fungicide agent on Candida parapsilosis (MFC/MIC = 1) and Candida albicans (MFC/MIC = 2). The venom acted as a bacteriostatic drug against the Gram-positive species Staphylococcus aureus (MBC/MIC = 64), the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa (MBC/MIC = 8) and Klebsiella pneumoniae (MBC/MIC = 16) as well as fungistatic agent on the yeasts Candida tropicalis (MFC/MIC = 16.02) and Candida krusei (MFC/MIC = 8). In conclusion, Lasiodora sp. venom was partial characterized and is source of antimicrobial agents with clinical relevance and the study contributes for the characterization of the genus.

Made available in DSpace on 2018-08-23T21:50:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12424_Dissertação_Divan Henrique Barcelos.pdf: 1490408 bytes, checksum: bfc34fc78982de3e46382c567f84009d (MD5) Previous issue date: 2018-03-21 / As leishmanioses são um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo, com 12 milhões de pessoas infectadas. Os tratamentos disponíveis embora eficientes, apresentam problemas como toxicidade, alto custo ou resistência pelo parasito. As bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos produzidos no ribossomo por diversas bactérias. Sua ação de inibição in vitro já foi testada contra fungos, bactérias e protozoários, sendo por isso consideradas como uma substância de grande potencial biotecnológico. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade anti-leishmania das bacteriocinas A53; C55 e Nisina e da (substância inibitória do tipo bacteriocina) BLIS P16, contra as espécies de Leishmania infantum e Leishmania amazonensis. Os resultados de IC50 para L. amazonensis foram de: A53-24,78 &#956;g/mL; C55-75,49 &#956;g/mL e Nisina-3191 &#956;g/mL. Já para o tratamento contra promastigotas de L. infantum foi observado IC50 de: A53-12,57 &#956;g/mL; C55-44,31 &#956;g/mL. Nisina-317,2 &#956;g/mL e P16- 2,9 &#956;g/mL. O tratamento contra amastigotas de L. infantum se mostrou mais eficiente que contra as formas promastigotas, apresentando um IC50 de 2,17 &#956;g/mL para A53 e de 1,76 &#956;g/mL para P16. Também foi avaliado a ação citotóxica de A53 e P16 sobre macrófagos da linhagem J774A.1, apresentando respectivamente IC50 de 9,75 &#956;g/mL e de 6,6 &#956;g/mL. Para se avaliar a interação entre a A53 e a P16 com a membrana externa de promastigotas de L. infantum foi realizada microscopia eletrônica de varredura, a qual demostrou que as substâncias testadas possuem a capacidade de alterar a morfologia externa do parasita. Foram realizados experimentos para se avaliar a capacidade do tratamento com P16 sobe a indução do estresse oxidativo em promastigotas de L. infantum. Foi verificado a capacidade de estimular apoptose nas formas promastigotas, bem como um estimulo a superprodução de espécies reativas de oxigênio (ROS) e uma interferência na progressão do ciclo celular. Os dados do presente trabalho demonstram que as bacteriocinas são promissoras para testes que visem o desenvolvimento de novas drogas contra as leishamanioses.