2-Cys Prx compõem um grupo de enzimas antioxidantes homodiméricas que atuam na decomposição de hidroperóxidos utilizando uma cisteína reativa (cisteína peroxidásica - CysP). A alta reatividade da CysP é alcançada com o envolvimento de dois aminoácidos vicinais à CysP: uma treonina e uma arginina, que constituem a tríade catalítica. Após a decomposição do hidroperóxido, a CysP forma um dissulfeto intermolecular com um segundo resíduo de cisteína (cisteína de resolução - CysR), o qual é reduzido pela tiorredoxina (Trx). Durante o ciclo redox, estas enzimas sofrem alterações estruturais, mas os mecanismos envolvidos neste processo eram pouco compreendidos. Neste trabalho foi obtida a estrutura cristalográfica de Tsa1 de Saccharomyces cerevisiae, uma 2-Cys Prx. Através de abordagens envolvendo bioquímica e biologia molecular, foi verificada a importância de aminoácidos envolvidos na reatividade e em transições da estrutura terciária e quaternária. Por fim, foram realizados esforços para a determinação da estrutura cristalográfica de mutantes obtidos neste trabalho. / 2-Cys Prx constitute a group of homodimeric antioxidant enzymes that act in the decomposition of hydroperoxides using a reactive cysteine (peroxidase cysteine - CysP). The high reactivity of the CysP is achieved by the participation of two vicinal amino acids: a threonine and an arginine, which constitute the catalytic triad. After the decomposition of hydroperoxide, the CysP forms an intermolecular disulfide with a second cysteine residue (resolving cysteine - CysR), which is reduced by the thioredoxin (Trx). During the redox cycle, these enzymes undergo to changes in the structure, but the molecular mechanisms involved in this process were poorly understood. In this study we have obtained the crystallographic structure of the 2-Cys Prx enzyme Tsa1 from Saccharomyces cerevisiae. By means of biochemical and molecular biology approaches, the importance of amino acids involved in reactivity and structural transitions were determined. Finally, efforts have been performed to the determination of the crystallographic structures of mutant proteins obtained in this study.

Endothelial cells (EC) exposed to oscillatory shear stress (OS) experience oxidative stress as a signature of atherosclerosis. Conversely, unidirectional laminar shear stress (LS) reduces reactive oxygen species (ROS) levels and inflammatory responses. Peroxiredoxins (PRX) are antioxidant enzymes that reduce hydrogen peroxide, but have yet to be investigated in response to shear stress. We hypothesized that LS, compared to OS, promotes increased expression of PRX, which in turn influences the balance of ROS in EC. In this study, we identified all six PRX family members in bovine aortic endothelial cells (BAEC). Furthermore, we revealed that PRX are regulated by shear stress in EC. When compared to OS and static culture (ST), exposure to chronic LS upregulated PRX1 levels intracellularly. LS also upregulated PRX5 relative to ST, but not OS. In addition, PRX exhibited broad subcellular localization in BAEC, but these patterns did not change in response to shear stress. To establish the functional importance of PRX1 in shear stress-dependent redox balance, we next examined the role of PRX1 in LS-mediated hydrogen peroxide regulation. Here, Amplex Red assay was used to measure ROS levels in BAEC. Depletion of PRX1 using siRNA resulted in significantly higher ROS levels following LS, OS, and ST, while PRX5 depletion did not. These findings indicated that chronic exposure to LS upregulates PRX1 expression to keep ROS levels low in EC. To identify the pathway by which atheroprotective LS stimulates PRX1 protein production, we also undertook gene expression studies. We discovered that LS upregulates Prdx1 gene in a time-dependent manner compared to OS or ST. However, this increase in expression was not due to stabilization of Prdx1 mRNA. In addition, Prdx1 promoter analysis revealed a Nrf2 transcription factor binding site 160bp upstream of the gene. Nrf2 overexpression promoted basal PRX1 protein production, while Nrf2 depletion reduced Prdx1 mRNA following exposure to LS. Collectively, our work illustrated that LS affects PRX1 by inducing the Prdx1 gene, in part via the transcription factor Nrf2. Moreover, this discovery of PRX1 as a mechanosensitive antioxidant may contribute important insights into endothelial cell biology and provide a novel therapeutic target for vascular diseases.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5577.pdf: 2976978 bytes, checksum: 5c1bd2e18805f80570f1c48b19a12574 (MD5) Previous issue date: 2013-08-19 / Financiadora de Estudos e Projetos / Reactive Oxygen Species (ROS) are generated by the incomplete reduction of oxygen during metabolic processes, exposure to external agents and as a secondary response to several diseases and when in excess, can cause injury to tissues and cells. During the evolution process, cells have developed several antioxidant mechanisms. One of such mechanisms encompasses the peroxiredoxins (PRDXs), which are highlighted for their abundance and high reactivity with their substrates. In humans, six different PRDXs have been described as located in different cellular compartments. In erythrocytes, PRDXs, particularly PRDX2, is the third most abundant protein, indicating its possible role in the cell development and their maintenance. However, there are few studies connecting these proteins to erythroid diseases, especially in hemolytic anemias, that have a high ROS production, such as beta thalassemia and sickle cell disease (SCD). This study evaluated the role of PRDXs in reticulocytes of patients with the diseases described above, compared to reticulocytes of health blood donors, using Real Time PCR and proteins will be analyzed by Western blot. Our results showed that the levels of transcript and PRDX1 protein were increased in BT patients and decreased in SCD. The PRDX2 transcript showed no differences in both diseases but in western blot analysis a decrease in PRDX2 protein was observed in SCD, indicating a possible pos transcription regulation process for this gene in SCD. The levels of PRDX5 transcript did not present difference in any of the diseases. A reduction in mRNA and protein levels for PRDX6 was observed in BT and SCD patients. Besides its action in the detoxification of ROS, PRDX6 acts also as a phospholipase A2 regulating the phospholipid turnover at the cell membrane. The decrease of this enzyme found in both patients could indicate that the cell membrane of the erythroid cells were not renovated leading to hemolysis observed in these patients. This is the first study correlating gene expression of peroxiredoxins in these hemolytic anemias The results could contribute in better understand the role of these protein and in a identification of new targets that could help in the management of diseases and improve the survival of these patients. / As espécies reativas de oxigênio (EROS) são geradas pela redução incompleta do oxigênio durante processos metabólicos, exposição a agentes externos e como resposta secundária a várias doenças, quando em excesso podem causar danos a tecidos e células. Durante o processo de evolução, as células desenvolveram vários mecanismos antioxidantes. Um desses mecanismos compreende as peroxirredoxinas (PRDXs), que se destacados pela sua abundância e grande reatividade com seus substratos. Em seres humanos já foram descritas seis diferentes PRDXs localizadasem diferentes compartimentos celulares. Nos eritrócitos, a PRDX2 é terceira proteína mais abundante, indicando um possível papel no desenvolvimento e manutenção destas células. No entanto, existem poucos estudos relacionando estas proteínas com doenças eritróides, especialmente anemias hemolíticas, que apresentam elevados níveis de EROS, como a beta talassemia (BT) e a anemia falciforme (AF). Este estudo avaliou o papel das PRDXs em reticulócitos de pacientes com as doenças descritas acima, comparando com reticulócitos de indivíduos sadios, utilizando PCR em tempo real e Western blot para análise proteica. Nossos resultados mostraram que o nível de transcritos e de proteínas PRDX1 foram aumentados em pacientes BT e diminuídos em pacientes com anemia falciforme. As análises de transcrição da PRDX2 não mostraram diferenças em ambas as doenças, contudo na análise de western blot foi observada diminuição desta proteína em pacientes com anemia falciforme, indicando um possível processo de regulação pós- transcricional deste gene nesta doença. Os níveis de transcrição da PRDX5 não apresentaram diferenças em nenhuma das doenças. A PRDX6 mostrou redução dos níveis de RNAm e proteicos em BT e AF. Além de sua atividade de detoxificação de EROS, a PRDX6 atua como fosfolipase A2 a renovação dos fosfolipídios de membrana. A diminuição desta enzima encontrada em ambos os pacientes poderia indicar que o reparo da membrana das células eritróides pode estar prejudicado conduzindo à hemólise observada nestes pacientes. Este é o primeiro estudo relacionando a expressão gênica de peroxirredoxinas nestas anemias hemolíticas Os resultados podem contribuir para compreender melhor o papel destas proteínas e na identificação de novos alvos que podem ajudar no tratamento destas doenças e melhorar a sobrevida destes pacientes.

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-09-20T18:14:03Z No. of bitstreams: 1 TeseCAB.pdf: 11456750 bytes, checksum: 7ab706a3e4cc604844c73a7452eece9a (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:48:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseCAB.pdf: 11456750 bytes, checksum: 7ab706a3e4cc604844c73a7452eece9a (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:49:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseCAB.pdf: 11456750 bytes, checksum: 7ab706a3e4cc604844c73a7452eece9a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-21T12:49:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCAB.pdf: 11456750 bytes, checksum: 7ab706a3e4cc604844c73a7452eece9a (MD5) Previous issue date: 2015-11-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Peroxiredoxins (Prx) are antioxidant proteins capable of decomposing a variety of hydroperoxide are very abundant in the cell and in eukaryotes are distributed in many cell compartments. The Prx are able to reduce their substrates using a highly reactive cysteine residue, named peroxidatic cysteine (CP-S-), which is maintained in the thiolate form as a consequence of the active site environment. In hydroperoxide decomposition process the CP is oxidized to cysteine sulfenic acid (CP-SOH). These vast majorities of these proteins are obligate dimers and has a second cysteine involved in the catalytic cycle, named resolution cysteine (CR), which forms a disulfide with CP and is often reduced by the enzyme thioredoxin (Trx). In addition to the reduction of Prx, the Trx are involved in several other biological processes such as cell growth, inhibition of apoptosis, transcriptional activation and DNA synthesis. When cell are exposed to oxidative stress, the CP can suffer overoxidation, forming species such as cysteine sulfinic acid (CP-SO2H) and cysteine sulfonic acid (CP-SO2H), which are not reduced by Trx. However, the CP overoxidation results in a change of the of Prx quaternary structure, resulting in the formation of high molecular weight structures (HMW) with molecular chaperone property and related to signal transduction triggered by hydroperoxides. Saccharomyces cerevisiae, have two isoforms of cytosolic Prx (Tsa1 and Tsa2), which shares high similarity (86% identity and 96% similarity), but differ in cellular abundance and expression levels. However, these enzymes are often considered redundant proteins. This study aimed the comparative analysis searching for functional and structural differences between Tsa1 and Tsa2. We evaluated Tsa1 and Tsa2 relationships with its oxidizing (hydroperoxide) and reducing substrates (Trx1 and Trx2). We also performed structural and kinetic analysis showed a significant relationship between maintaining the decameric structure the activity of enzymes which occurs by a series polar interactions but not equal to the active site amino acids. Highlighting the Thr44 of Tsa1 (Ser in Tsa2) which is involved in decamer structure stabilization by a CH-π interaction type with the Tyr77 and through the Oγ atom (from Thr) polar interactions with Phe45 and Leu41. Overoxidation susceptibility assays were performed using Tsa1 and Tsa2, and our results revealed that organic hydroperoxides were able to promote the CP overoxidation more efficiently when compared to H2O2. In turn, Tsa2 was very more resistant to CP overoxidation than Tsa1. This difference was also investigated concerning the catalytic triad Thr (Tsa1) to Ser (Tsa2). We generated mutants carrying reciprocal substitutions Tsa1T44S and Tsa2S44T and our results revealed that Tsa1T44S become more resistant to CP overoxidation and Tsa2S44T become more sensitive. The formation of high molecular weight structures (HMW) of Tsa1, Tsa2 and mutants were also investigated by size exclusion chromatography (SEC) and transmission electron microscopy (TEM). The Tsa1, Tsa2 and mutants HMW formation were analyzed by size exclusion chromatograph (SEC) and transmission electron microscopy (TEM). The results showed an increase of HMW formation after Trx system reaction using high concentrations of CHP. Were observed the stacking of the ring-shaped structures besides spherical species. Our results demonstrate that Tsa1 and Tsa2 proteins differ significantly in overoxidation susceptibility and HMW complex formation, indicating that these proteins have not redundant biological roles and small changes in active site promote high functional and structural changes in these enzymes. / Peroxirredoxinas (Prx) são proteínas antioxidantes capazes de decompor uma grande variedade de hidroperóxidos, são muito abundantes na célula e em eucariotos estão distribuídas nos diversos compartimentos celulares. As Prx são capazes de reduzir seus substratos utilizando um resíduo de cisteína altamente reativa, denominada de cisteína peroxidásica (CP-S-), que se apresenta na forma de tiolato. No processo de decomposição de hidroperóxidos é oxidada a cisteína ácido sulfênico (CP-SOH). A grande maioria destas proteínas se apresenta como dímeros obrigatórios e apesar de algumas Prx apresentarem somente uma cisteína, grande parcela possui uma segunda cisteína envolvida no ciclo catalítico que recebe o nome de cisteína de resolução (CR), a qual forma um dissulfeto com CP, que frequentemente é reduzido pela enzima tiorredoxina (Trx). Adicionalmente à redução das Prx, as Trx estão envolvidas em diversos outros processos biológicos como crescimento celular, inibição de apoptose, ativação de transcrição e síntese de DNA. Quando a célula é exposta a elevado estresse oxidativo, pode ocorrer a superoxidação de CP formando espécies superoxidadas como a cisteína ácido sulfínico (CP-SO2H) e sulfônico (CPSO3H) que não podem ser reduzidas por Trx. Entretanto, também resulta na alteração da estrutura quaternária das Prx, levando à formação de estruturas de alto peso molecular (HMW) que possuem propriedade de chaperona molecular e estão relacionadas a transdução de sinal desencadeada por hidroperóxidos. Em Saccharomyces cerevisiae, há duas isoformas citosólicas de Prx (Tsa1 e Tsa2), que possuem grande semelhança (86% de identidade e 96% de similaridade), mas apresentam diferenças na concentração celular e nível de expressão. Entretanto, muitas vezes são consideradas proteínas redundantes. Este trabalho teve como objetivos uma análise comparativa aprofundada buscando um maior entendimento das diferenças funcionais e estruturais de Tsa1 e Tsa2. Foram avaliados a relação de Tsa1 e Tsa2 com seus substratos oxidantes (hidroperóxidos) e substratos redutores (Trx1 e Trx2). Análises estruturais e cinéticas demonstraram uma importante relação entre a manutenção da estrutura decamérica a atividade das enzimas a qual ocorre por uma serie interações polares similares mas não iguais entre aminoácidos do sítio ativo. Com destaque para a Thr44 de Tsa1 (Ser em Tsa2) que possui importância na estabilização da estrutura decamérica através de uma interação do tipo C-H-π com Tyr77 e através do átomo de O que possui interações polares com Phe45 e Leu41. Também foram realizadas análises de susceptibilidade a superoxidação de Tsa1 e Tsa2, e demonstrou-se que peróxidos orgânicos são capazes de promover mais eficientemente a superoxidação quando comparados a H2O2, sendo que Tsa1 apresenta uma maior sensibilidade a superoxidação. Essa diferença foi também relacionada à substituição Thr/Ser e análises de susceptibilidade a superoxidação dos mutantes Tsa1T44S e Tsa2S44T demonstraram que a substituição reciproca tornou Tsa1T44S mais resistente a superoxidação e Tsa2S44T mais sensível. A formação de estruturas de alto peso molecular (HMW) de Tsa1, Tsa2 e mutantes foram investigadas através de cromatografia de exclusão molecular (SEC) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os resultados demonstraram um aumento da formação de HMW após reações de superoxidação utilizando o sistema Trx em altas concentrações de CHP e foi verificada a presença de empilhamentos de decâmeros, além de esferas, descritas na literatura. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram de forma clara que as proteínas Tsa1 e Tsa2 diferem de forma significativa tanto na suscetibilidade a superoxidação quanto na formação de complexos HMW distintos, indicando fortemente que estas proteínas possuem papeis biológicos não redundantes e que alterações sutis de aminoácidos no sitio ativo promovem grandes alterações funcionais e estruturais nas enzimas.

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Kléber Luiz de Araújo e Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula_FlaviaMariaMourade_D.pdf: 1277288 bytes, checksum: fbf2861e21e4c2c3095813e5df9456e2 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Durante a instalação do diabetes tipo 1 as células beta pancreáticas são alvos do ataque pelo sistema de defesa do organismo. A morte das células beta, em geral por apoptose, é provocada por contato direto com células ativadas do sistema imune e por mediadores inflamatórios tais como: citocinas pró-inflamatórias, quemocinas e radicais livres. As citocinas pró-inflamatórias, como IL1-beta, TNF-alpha e IFN-gamma, produzem grande quantidade de ROS e RNS no interior das células beta e estas, por sua vez, possuem uma baixa defesa anti-oxidante enzimática, principalmente ao que se refere às enzimas que degradam H2O2, como catalase e glutationa peroxidase. Tal combinação resulta no surgimento de estresse oxidativo e morte celular. Adicionalmente, outro sistema de peroxidases, as PRDXs, também atuam na proteção das células beta contra o estresse oxidativo. Neste sentido, o estudo sobre a modulação de PRDXs por agentes inflamatórios é de grande valia, à medida que se tenta descobrir novas vias intracelulares desencadeadas pelas citocinas e alternativas para suprir a vulnerabilidade das células beta pancreáticas ao estresse oxidativo. Para isso utilizamos linhagem de células beta produtoras de insulina RINm5F. Estas células foram expostas às citocinas pró-inflamatórias IL1-beta, TNF-alpha e IFN-gamma e à anti-inflamatória IL-4 e a expressão das PRDXs foi analizada. Nossos resultados demonstram que IFN-gamma e TNF-alpha reduzem a expressão da PRDX6. Quando separadas, essas citocinas alteram somente a expressão protéica, através da ativação de sistemas de proteólise, especialmente de calpaínas e ubiquitina-proteassomo, e via ativação da JNK/c-Jun. A pré-incubação das células RINm5F com a citocina antiinflamatória IL4, bloqueia os efeitos do TNF-alpha ou IFN-gamma sobre a expressão da PRDX6. Em conjunto, IFN-gamma e TNF-alpha reduzem tanto a expressão gênica quanto protéica da PRDX6. As alterações transcricionais ocorrem, provavelmente, por ação sinérgica de mais de uma via intracelular, neste caso, NFkB (ativado pelo TNF-alpha) e STAT1 (ativado pelo IFN-gamma), sendo necessária a participação dessas duas vias para a modulação gênica da PRDX6. A deleção dessa enzima aumenta a suceptibilidade das células RINm5F aos efeitos deletérios de IFN-gamma, TNF-alpha e H2O2, sugerindo função importante da PRDX6 na proteção das células beta ao estresse oxidativo / Abstract: Peroxiredoxins are a family of six antioxidant enzymes (PRDX1-6), and may be an alternative system for the pancreatic beta cells to cope with oxidative stress. This study investigated whether the main diabetogenic pro-inflammatory cytokines or the antiinflammatory cytokine IL-4 modulate PRDXs levels and putative intracellular pathways important for this process in the insulin-producing RINm5F cells. RINm5F cells expressed significant amounts of PRDX1, PRDX3 and PRDX6 enzymes. Only PRDX6 was modulated by cytokines, showing both mRNA and protein down-regulation following incubation of RINm5F cells with TNF-alpha and IFN-gamma but not with IL-1beta. Separately IFN-gamma or TNF-alpha decreased PRDX6 protein but not mRNA levels. The blockage of the JNK signalling and of the calpains and proteasome proteolysis systems restored PRDX6 protein levels. IL-4 alone did not modulate PRDXs levels. However, pre/co-incubation with IL-4 substantially prevented the decrease in PRDX6 induced by proinflammatory cytokines. Knockdown of PRDX6 increased susceptibility of RINm5F cells to the deleterious effects of pro-inflammatory cytokines and to oxidative stress. These results show that, from the PRDXs highly expressed in RINm5F cells, only PRDX6 is modulated by the diabetogenic cytokines IFN-gamma and TNF-alpha. This PRDX6 downregulation depends on the Calpain and proteasome systems and JNK signalling. PRDX6 is an important enzyme for protection against oxidative stress and the interaction between pro- and anti-inflammatory cytokines might be important to determine the antioxidant capacity of the cells / Doutorado / Fisiologia / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

A redução incompleta de oxigênio a água durante a respiração celular resulta na formação de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs), compostos oxidantes que podem, em determinadas situações, gerar quadros sérios de estresse oxidativo celular. células aeróbicas são equipadas com um complexo sistema de defesas anti-oxidantes para lidar com esta situação. Peroxirredoxinas constituem uma família de enzimas anti-oxidantes com a habilidade de remover hidroperóxidos à custa de um agente redutor que contenha tióis, protegendo biomoléculas de danos oxidativos. Ahp1 e Tsa1 são as duas peroxirredoxinas mais abundantes da levedura Saccharomyces cerevisiae, podendo cada uma constituir até 1% do total de proteínas solúveis celulares. Neste trabalho, foi realizada a caracterização de algumas propriedades bioquímicas de Ahp1, principalmente no que diz respeito às suas preferências por substratos e sensibilidade à inativação por hidroperóxidos, as quais foram comparadas com as de Tsa1. Diversos cristais de Ahp1 foram obtidos e difrataram com resolução máxima de 1.8A. Diversas estratégias para a resolução de sua estrutura tridimensional foram adotadas, sem sucesso. Por outro lado, a estrutura tridimensional preliminar de Tsa1 foi resolvida, buscando relacionar as características funcionais da proteína com a sua organização espacial. Em uma outra linha, relações entre a regulação do gene AHP1 em condições fisiológicas específicas com a de outros genes que codificam enzimas anti-oxidantes foram reveladas. Ahp1, em conjunto com as outras Prxs Tsa2 e Prx1 parece desempenhar um papel importante na defesa contra o estresse oxidativo em situações nas quais os peroxissomos estão ativos e não possuem catalase. / The incomplete reduction of oxygen to water during respiration results in the formation of Reactive Oxygen Species (ROS), oxidizing compounds, which can generate severe cellular oxidative stress. Aerobic cells are equipped with a complex defense system to cope with this condition. Peroxiredoxins make up a family of antioxidant enzymes with the ability to remove hydroperoxides at the expense of a thiol-containing reducing agent, thereby protecting biomolecules from oxidative damage. Ahp1 and Tsa1 are the two most abundant peroxiredoxins in the yeast Saccharomyces cerevisiae, each one making up to 1% of the cellular soluble proteins. In this work, we carried out a biochemical characterization of some of Ahp1\'s properties, particularly of its substrate preferences and sensitivity to inactivation by hydroperoxides, which have been compared to those of Tsa1. In one approach, Ahp1 crystals were obtained and diffracted at 1.8A resolution. Several methods were unsuccessfully employed in the attempt to solve Ahp1 structure. On the other hand, the three-dimensional structure of Tsa1 was solved, aiming to correlate its functional properties with its spatial organization. In another part of the work, relations between the regulation of AHP1 and other Prx genes were revealed. Ahp1, together with Tsa2 and Prx1, appears to carry out an important role in the cellular defense against oxidative stress, in conditions where peroxisomes are active and devoid of catalase.

2-Cys Prx compõem um grupo de enzimas antioxidantes homodiméricas que atuam na decomposição de hidroperóxidos utilizando uma cisteína reativa (cisteína peroxidásica - CysP). A alta reatividade da CysP é alcançada com o envolvimento de dois aminoácidos vicinais à CysP: uma treonina e uma arginina, que constituem a tríade catalítica. Após a decomposição do hidroperóxido, a CysP forma um dissulfeto intermolecular com um segundo resíduo de cisteína (cisteína de resolução - CysR), o qual é reduzido pela tiorredoxina (Trx). Durante o ciclo redox, estas enzimas sofrem alterações estruturais, mas os mecanismos envolvidos neste processo eram pouco compreendidos. Neste trabalho foi obtida a estrutura cristalográfica de Tsa1 de Saccharomyces cerevisiae, uma 2-Cys Prx. Através de abordagens envolvendo bioquímica e biologia molecular, foi verificada a importância de aminoácidos envolvidos na reatividade e em transições da estrutura terciária e quaternária. Por fim, foram realizados esforços para a determinação da estrutura cristalográfica de mutantes obtidos neste trabalho. / 2-Cys Prx constitute a group of homodimeric antioxidant enzymes that act in the decomposition of hydroperoxides using a reactive cysteine (peroxidase cysteine - CysP). The high reactivity of the CysP is achieved by the participation of two vicinal amino acids: a threonine and an arginine, which constitute the catalytic triad. After the decomposition of hydroperoxide, the CysP forms an intermolecular disulfide with a second cysteine residue (resolving cysteine - CysR), which is reduced by the thioredoxin (Trx). During the redox cycle, these enzymes undergo to changes in the structure, but the molecular mechanisms involved in this process were poorly understood. In this study we have obtained the crystallographic structure of the 2-Cys Prx enzyme Tsa1 from Saccharomyces cerevisiae. By means of biochemical and molecular biology approaches, the importance of amino acids involved in reactivity and structural transitions were determined. Finally, efforts have been performed to the determination of the crystallographic structures of mutant proteins obtained in this study.

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Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la seconde cause d'invalidité à long terme et de mortalité dans le monde entier qui résulte d'une perte de sang au cerveau. Il y a actuellement peu de médicaments pour traiter les accidents vasculaires cérébraux. Pourtant, il y a un intérêt pour trouver un traitement, ciblant spécifiquement la cascade post-inflammatoire. Il y a une attention particulière pour inhiber les protéines peroxyrédoxines humaines (hPrx) qui sont des initiateurs clés de l'inflammation. Les protéines hPrx sont des enzymes qui dégradent les peroxydes et aussi protègent les cellules du stress oxydatif. Cette thèse est centrée sur l'étude de ligands potentiels des hPrx, dérivés du catéchol, susceptibles de devenir des agents thérapeutiques potentiels pour traiter les AVC. Premièrement, différents ligands potentiels ont été criblés par RMN et modélisation moléculaire pour savoir s'ils pouvaient se lier à différents isoformes des peroxirédoxines. Ces études ont révélé que ces dérivés du catéchol pouvaient se lier à plusieurs hPrx. Deuxièmement, la capacité des dérivés du catéchol à inhiber l'activité des hPrx a été examinée au travers de tests enzymatiques in vitro. Il a été montré que tous les dérivés du catéchol étudiés étaient capables de les inhiber. En utilisant des simulations de dynamique moléculaire, nous avons pu expliquer le mécanisme d'action moléculaire d'inhibition. En général, cette recherche fournit un aperçu des ligands qui pourrait être développés pour devenir un médicament pour aider dans le processus de rétablissement de patients atteints d'attaque cérébrale / Strokes are the second leading cause of long-term disability and death worldwide that result from a sudden loss of blood to the brain. Currently, there are limited drugs to treat patients when having a stroke. However, there is now interest focused on treatment after a stroke, specifically the post-inflammation cascade. In particular, there is attention to inhibit human peroxiredoxin proteins, which are key initiators of inflammation. Human peroxiredoxins are enzymes that degrade peroxides and also, protect the cells against oxidative stress. This thesis focuses on studying ligands, catechol derivatives, to bind and inhibit human peroxiredoxin proteins to become potential therapeutic agents for strokes. First, the ligands were screened to identify if they could bind to various human peroxiredoxin isoforms with NMR and computational modeling techniques. This study revealed the catechol derivatives could indeed bind to several human peroxiredoxins. Second, the ability for the catechol derivatives to inhibit human peroxiredoxin peroxidase activity was examined through an in vitro enzymatic assay. All the catechol derivatives were determined to inhibit several human peroxiredoxins. In utilizing molecular dynamic simulations, it assisted in explaining the in vitro inhibition molecular mechanism of action. Overall, this research provides insight of molecules that could be further developed to become possibly a drug to aid in stroke patients recovery process

Submitted by Daniele Amaral (daniee_ni@hotmail.com) on 2016-10-06T19:17:32Z No. of bitstreams: 1 DissCPP.pdf: 3587784 bytes, checksum: 38e18e70b6c78d140d46b17a57600689 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-21T13:32:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissCPP.pdf: 3587784 bytes, checksum: 38e18e70b6c78d140d46b17a57600689 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-21T13:33:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissCPP.pdf: 3587784 bytes, checksum: 38e18e70b6c78d140d46b17a57600689 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-21T13:33:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCPP.pdf: 3587784 bytes, checksum: 38e18e70b6c78d140d46b17a57600689 (MD5) Previous issue date: 2015-10-14 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Reactive oxygen species (ROS) are products naturally generated by the cell metabolism and at low levels play an important physiological role in intracellular regulation, whereas in excess can cause damage to cells. To combat this damage, cells present a complex defense mechanism including different enzymes which act as antioxidants. Among these enzymes, and especially in cells such as erythrocytes, which are exposed to high levels of molecular oxygen, the Peroxiredoxins (Prxs), stand out for the abundance and great reactivity with its substrates. In this cell type, when occurs hemolytic diseases such as sickle cell anemia and beta thalassemia, increased production of ROS and consequently oxidative damage are observed, greatly aggravating the clinical picture of patients affected by these diseases. In these diseases, the PRDX2 appears to be a major line of antioxidant defense, as it is the third most present protein in the cytosol of the erythrocyte. Therefore, this study aimed to assess the role of PRDX2 in differentiated K562 cells for the expression of erythroid characteristics, through gene silencing using shRNA_PRDX2. It was possible to obtain a 70% of the PRDX2 expression inhibition, which caused a decrease in the proliferation, cell viability and interaction, showing the importance of PRDX2 in oxidative protection on this cell type. In order to evaluate the modulation of antioxidant system in these cells, we also analyzed the pattern of gene and protein expression of all other PRDXs beyond the gene expression of other antioxidant enzymes during the process of differentiation. We found that inhibition of PRDX2 expression adversely affects the expression of PRDX5 and causes increased expression of their biological reducing agents, which increase the recycling PRDX2, compensating for their lack the cell. These data are not get described in the literature and additional analysis is needed to better understand this interaction beyond the molecular mechanisms involved in the expression of related enzymes in protection against ROS. Understanding these mechanisms seems important to work with a better insight of the pathophysiology of hemolytic diseases by identifying possible targets to assist in the management and can mitigate the effects of the disease in these patients. / Espécies reativas de oxigênio (EROs) são produtos gerados naturalmente pelo metabolismo celular e em baixos níveis fisiológicos desempenham importante papel na regulação intracelular, enquanto que em excesso podem causar diversos danos às células. Para combater esses danos, as células apresentam um complexo mecanismo de defesa incluindo diferentes enzimas que atuam como antioxidantes. Dentre estas enzimas e, principalmente em células como os eritrócitos, que são expostas a altos teores de oxigênio molecular, as Peroxirredoxinas (Prxs), se destacam pela abundância e grande reatividade com os seus substratos. Neste tipo celular, quando ocorrem doenças hemolíticas como a anemia falciforme e a beta talassemia, uma maior produção de EROs e consequentemente de danos oxidativos são observados, agravando sobremaneira o quadro clínico dos pacientes acometidos por estas doenças. Nessas doenças, a PRDX2 aparenta ser uma importante linha de defesa antioxidante, já que é a terceira proteína mais presente no citosol do eritrócito. Diante disso, esse trabalho teve como objetivo a avaliação do papel de PRDX2 em células K562 diferenciadas para a expressão de características eritróides, através do silenciamento gênico de PRDX2 utilizando shRNA. Foi possível a obtenção de uma inibição de 70% da expressão de PRDX2, a qual causou diminuição na proliferação, viabilidade e interação celular, mostrando a importância da PRDX2 na proteção oxidativa nesse tipo celular. Com o objetivo de avaliar a modulação do sistema antioxidante nestas células, analisamos também, o padrão de expressão gênica e proteica de todas as outras PRDXs além da expressão gênica de outras enzimas antioxidantes durante o processo de diferenciação. Verificamos que a inibição da expressão de PRDX2 afeta negativamente a expressão de PRDX5 e causa o aumento da expressão de seus redutores biológicos, o que aumentaria a reciclagem de PRDX2 compensando sua falta na célula. Esse dado é inédito na literatura e análises adicionais são necessárias para melhor compreender essa interação além dos mecanismos moleculares envolvidos na expressão de enzimas relacionadas na proteção contra EROS. A compreensão destes mecanismos parece importante para colaborar com o melhor entendimento da fisiopatologia de doenças hemolíticas, identificando possíveis alvos que auxiliem no manejo e que possam amenizar os efeitos da doença desses pacientes.