A proposta deste trabalho foi de aplicar a Terapia Fotodinâmica (TFD) para avaliar a inativação da bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), um patógeno que está associado à endocardite bacteriana, abscessos cerebrais e subcutâneos e principalmente à doença periodontal, que é caracterizada pela inflamação dos tecidos de suporte dos dentes, e consequentemente a perda de dentes. O surgimento de resistência bacteriana a diversas classes de antibióticos vem sendo um problema sério que surge como efeito do uso indiscriminado destes fármacos e até mesmo por fatores adaptativos dos microrganismos. Devido a este fator, várias investigações vêm surgindo com referências satisfatórias no que diz respeito ao emprego da TFD como medida terapêutica. O efeito da TFD foi verificado sobre a cultura da bactéria A. actinomycetemcomitans em meio planctônico e em biofilme. Foi utilizado como agentes fotossensibilizadores Rose bengal, Azul de metileno e Eritrosina, que em baixas concentrações não causam toxicidade para células de fibroblastos e células humanas. Como fonte de luz foi utilizado o fotopolimerizador de resina odontológica, que é de fácil acesso, baixo custo e apresenta uma faixa de emissão de luz de 300 a 800 nm. Rose Bengal até 1 µM não afetou as células de fibroblastos, mas essa mesma concentração sem usar a TFD reduziu a viabilidade de A. actinomycetemcomitans em 41,2%, porém as células de A. actinomycetemcomitans quando cultivadas em biofilme não foram afetadas quando se usou apenas o corante (0,5 e 1,0 µM) ou apenas a luz. Quando se aplicou a TFD Rose Bengal foi o segundo corante (entre os três estudados), que causou uma maior redução da viabilidade celular de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico 54,4% e o terceiro em reduzir a viabilidade quando cultivadas em biofilme com 45% de redução. Azul de Metileno nas concentrações de 0,5 e 1,0 µM reduziu a viabilidade de A. actinomycetemcomitans em meio planctônico 16 e 24% respectivamente, já sobre o biofilme essa concentração de corante não promoveu redução da viabilidade bacteriana. Com a TFD observou-se uma redução de 50% da viabilidade das células de A. actinomycetemcomitans em meio planctônico e 53,3% em biofilme. Dos três corantes utilizados Eritrosina foi o corante que per se apresentou menor redução da viabilidade 5 e 14%, indicando ter baixa toxicidade, no escuro, e não afetou as células do biofilme de A. actinomycetemcomitan. Porém com a TFD, esse corante promoveu uma maior redução da viabilidade das células bacterianas de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico e em biofilme 75% e 67,2% respectivamente. Desta forma, a Eritrosina foi o corante mais eficiente em diminuir a viabilidade de A. actinomycetemcomitans nas condições estudadas. Esses resultados indicam que a TFD reduz as células viáveis de A. actinomycetemcomitans cultivadas em meio planctônico e em biofilme, indicando que essa terapia poderá ser uma opção efetiva para o tratamento clinico da doença periodontal, com a vantagem de não apresentar efeitos colaterais como a terapia medicamentosa, nem desenvolver a resistência bacteriana que vem sendo um grande problema do tratamento com antibióticos. / The objective of this work was to apply the photodynamic therapy (TFD) to evaluate the inactivation of the Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) bacteria, a pathogen that is associated to bacterial endocarditis, subcutaneous and cerebral abscesses and mainly to periodontal disease, which is characterized by inflammation of teeth support tissue and as a consequence, teeth loss. The occurrence of bacterial resistance to many classes of antibiotics has been a serious problem that results from the indiscriminate use of these drugs and also by the adaptation factors of these microorganisms. Due to this, many investigations are being done with satisfactory references regarding the use of TFD as therapeutic step. The TFD effect on A. actinomycetemcomitans bacteria culture in planktonic medium and biofilm was verified. Rose Bengal, methylene Blue and Erythrosyn were used as photosensitizing agents which, in low concentrations are not toxic to fibroblast cells and human cells. The odontological resin photopolymerizer was used as a light source since it is easy accessible, low cost and has a light emission range between 300 and 800nm. Rose Bengal up to 1 µM did not affect the fibroblast cells, but this same concentration without the use of TFD has reduced viability of A. actinomycetemcomitans in 41.2%, but the cells when cultivated in biofilm were not affected when only dye (0.5 and 1.0 µM) or only light were used. When TFD was applied, Rose Bengal was the second dye (among the three studied) to cause the highest reduction of cell viability of A. actinomycetemcomitans cultivated in 54.4% planktonic medium and the third in reducing the viability when cultivated in biofilm, with 45% reduction. Methylene Blue in 0.5 and 1.0 µM concentrations has reduced the viability of A. actinomycetemcomitans in planktonic medium in 16% and 24%, respectively. In biofilm, this dye concentration has not fostered bacterial reduction. With TFD, a 50% reduction of A. actinomycetemcomitans cells in planktonic medium and a 53.3% in biofilm was observed. Among the three dyes used, Erythrosyn was the one that , per se, has shown the lowest viability reduction of all, 5% and 14%, indicating its low toxicity in the dark, and it did not affect the biofilm cells. Nevertheless, with TFD, this dye has fostered a higher viability reduction of A. actinomycetemcomitans bacterial cells cultured in planktonic medium and in biofilm of 75% and 67.2%, respectively. Therefore , Erythrosyn was the dye that, per se, has been the most efficient in reducing A. actinomycetemcomitans viability in the conditions studied. These results indicate that TFD reduces A. actinomycetemcomitans viable cells cultivated in planktonic medium and biofilm, indicating that this therapy could be an effective option for the treatment of periodontal disease, with the advantage that it does not show collateral effects like the drug therapy and without developing bacterial resistance, as this has been a major issue with antibiotics treatment.

O câncer de mama apresenta-se como um dos maiores problemas de saúde pública no mundo por ser, entre as mulheres, o primeiro em incidência e o segundo em número de óbitos. Este tipo de câncer apresenta alto grau de recorrência devido a falha no tratamento do tumor primário e o aparecimento de metástases da doença é a principal causa de mortalidade. As estratégias de tratamento nesse estágio não são específicas e comprometem a qualidade de vida das pacientes. A terapia fotodinâmica (PDT) aparece como uma alternativa terapêutica promissora. No entanto, a eficácia da PDT para o tratamento de tumores da mama, bem como os mecanismos que conduzem à morte celular permanecem obscuros. Para este propósito, neste estudo, nos propusemos a investigar mais profundamente os mecanismos moleculares envolvidos na morte celular induzida MB-PDT. Observou-se que a MB-PDT induz massiva morte celular em células tumorais preferencialmente. As células não-tumorigênicas foram significativamente mais resistentes à terapia em comparação com as células malignas. Análises morfológicas e bioquímicas das células em processo de morte apontou para mecanismos alternativos à apoptose clássica. A autofagia induzida por MB-PDT resultou em citoproteção ou citotoxicidade, dependendo do modelo de célula utilizado. No entanto, o comprometimento de uma destas vias não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. Ao analisar os mecanismos de necrose regulada, observamos que a necroptose desempenhou um papel importante na morte celular induzida por MB-PDT. Adicionalmente, nossos resultados mostraram uma localização preferencial do MB nos lisossomos, o que nos levou a analisar o comprometimento destas organelas. Nós demonstramos por meio da atividade de catepsinas no citosol das células tratadas com MB-PDT, evidências de que a permeabilização da membrana lisossomal é outro mecanismo de necrose regulada responsável pelos efeitos citotóxicos da MB-PDT. Além de resistência à morte celular, as células tumorais também desenvolvem mecanismos de evasão do sistema imune. Neste estudo, também demonstramos que a MB-PDT tem o potencial de aumentar o número de células de linfócitos T CD4+. Por fim, também mostramos a eficácia da terapia em induzir morte celular seletiva às células tumorais em um modelo que recapitula a morfologia do epitélio glandular. Em resumo, demonstramos que vários mecanismos de morte celular são ativados por MB-PDT, uma vez que o comprometimento de uma via de morte celular não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-PDT. No geral, os resultados obtidos nesta tese apontam a MB-PDT como uma terapia alternativa e eficaz para o tratamento do câncer de mama, exibindo uma ação de amplo espectro em células com diferentes mecanismos de resistência a vias de morte celular clássica, uma propriedade fundamental para uma terapia contra o câncer. Finalmente, as nossas observações destacam o potencial de MB-PDT como uma estratégia altamente eficaz para tratar o câncer de mama com segurança e possivelmente outros tipos de tumores. / Breast cancer is the main cause of mortality among women presenting high recurrence due to primary treatment failure. Photodynamic therapy (PDT) appears as a promising therapeutic alternative. However, the efficacy of PDT to treat breast tumors as well as the mechanisms that lead to tumorigenic cell death remain unclear. For this purpose, in this study, we set out to deeper investigate the molecular mechanisms involved in MB-PDT induced cell death. We observed that MB-PDT differentially induces massive cell death of tumor cells. Non-malignant cells were significantly more resistant to the therapy compared to malignant cells. Morphological and biochemical analysis of dying cells pointed to alternative mechanisms rather than classical apoptosis. MB-PDT-induced autophagy resulted in either cytoprotection or cytotoxicity depending on the cell model used. However, impairment of one of these pathways did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. When analyzing regulated necrosis mechanisms, we observed that necroptosis played an important role in MB-PDT-induced cell death. Additionaly, our results have shown preferential lysosomal MB localization. Furthermore, we have also presented evidences that the lysosome membrane permeabilization is another regulated necrosis mechanism responsible for MB-PDT cytotoxic effects. It is known that in addition to resistance to tumor cell killing therapies, malignant cells develop molecular mechanisms in order to evade the immune system. In this study, we have also been able to show that the MB-PDT has the potential to increase the number of T lymphocytes CD4+. Additionally, when using a physiological 3D culture model that recapitulates relevant features of normal and tumor breast tissue morphology, we found that MB-PDT differential action in killing tumor cell was even higher than what was detected in 2D cultures. In summary, we demonstrated that different cell death mechanisms are being activated upon MB-PDT induction, since impairment of only one cell death pathway did not prevent the fatal destination of MB-PDT treated cells. Overall, our observations point MB-PDT as an alternative and effective therapy for breast cancer treatment, displaying a broad-spectrum action on tumors with different resistance mechanisms to classic cell death pathways, a desired property for improving an anticancer therapy. Finally, our observations underscore the potential of MB-PDT as a highly efficient strategy to safely treat breast cancer and possibly other types of tumors.

O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto da terapia fotodinâmica (PDT) no tratamento de bolsas residuais de pacientes portadores de periodontite crônica em manutenção periodontal, através da avaliação de parâmetros imunológicos, durante 12 meses de acompanhamento. Foi conduzido um estudo prospectivo intervencional com 28 pacientes com periodontite crônica, que foram submetidos ao tratamento periodontal não-cirúrgico e apresentaram ao menos quatro sítios com bolsas residuais para serem submetidos à PDT. Os pacientes foram pareados em gênero, idade e média de profundidade clínica de sondagem (PCS) dos sítios experimentais, e assim sorteados em grupo teste (PDT) ou grupo controle. A intervenção foi feita no início do estudo, aos três, seis e nove meses e a coleta do fluido gengival foi realizada antes da intervenção, uma semana após, três e 12 meses depois. A avaliação imunólogica, realizada por meio do Luminex, quantificou os níveis de dez citocinas: interleucina (IL) IL-1(alfa), IL-1ß, IL-8, IL-1ra, fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), interferon- ? (IFN- Y), fator de necrose tumoral- (alfa) (TNF-(alfa)), IL-4 e IL-10. Em relação a essa análise, verificou-se que para o FGF, IL-4 e TNF-(alfa) não houve diferença estatística entre os grupos (p>0,05) em qualquer momento do estudo. Os mediadores IL-1(alfa), IL-1ß, IL-8 e VEGF apresentaram diferença significativa (p<0,05) entre os grupos, ao passo que os mediadores IL-1ra e IFN-Y demonstraram diferença estatística (p<0,01) ao longo do tempo em ambos os grupos e a IL-10 apresentou diferença estatística (p<0,01) aos 03 meses para o grupo PDT. Dentro dos parâmetros apresentados, a PDT se mostrou superior na modulação da inflamação. / The objective of this study was to evaluate the impact of photodynamic therapy (PDT) in the treatment of residual pockets of patients with chronic periodontitis in periodontal maintenance, by evaluating immunological parameters during 12 months of follow up. . An interventional prospective study in 28 patients with chronic periodontitis, who underwent non-surgical periodontal treatment and had at least four sites with residual pockets to undergo PDT was conducted. Patients were matched for gender, age and average probing pocket depth (PPD) of the experimental sites, and so drawn in group test (PDT) or control group. The intervention was done at baseline, at three, six, nine and gingival fluid collection was performed before intervention, a week after three and 12 months later. Immunological evaluation performed by the Luminex quantified levels ten cytokines: interleukin (IL) IL-1(alfa), IL-ß, IL-8, IL-1ra, fibroblast growth factor (FGF), vascular growth factor endothelial (VEGF), interferon-Y (IFN-Y), Tumor necrosis factor (alfa) (TNF-(alfa)), IL-4 and IL-10. In relation to this analysis, it was found that FGF, IL-4 and TNF-(alfa) was not different between groups (p> 0.05) at any time of the study. The mediators IL-(alfa), IL-1ß, IL-8 and VEGF showed a significant difference (p <0.05) between the groups, whereas IL-1ra mediators and IFN-Y showed a statistical difference (p <0.01) over time in both groups and IL-10 showed statistically significant difference (p <0.01) at 03 months for PDT group. Within the given parameters, the PDT was superior in the modulation of inflammation

A Terapia Fotodinâmica (do inglês, Photodynamic Therapy - PDT) é uma técnica indicada para o tratamento local de câncer que vem tendo grandes avanços ao longo dos anos. A PDT consiste na interação entre luz e uma substância fotossensibilizadora, resultando na transformação do oxigênio molecular em oxigênio singleto, altamente reativo e tóxico para a célula, levando à destruição do tecido. Nesse contexto, o uso do modelo de Membrana Corioalantóica (CAM) é uma opção para o estudo dos efeitos vasculares envolvidos nessa terapia, além de permitir o estudo na variação de diversos parâmetros associados com a PDT e seus efeitos. Nesse estudo foram investigados um composto derivado de porfirina e um derivado de clorina. Esses fotossensibilizadores foram administrados topicamente e por via intravenosa, sendo variados diversos parâmetros. No primeiro caso, o tempo de incubação foi variado entre 20 e 80 minutos e a concentração de área da droga foi variada entre 0,1 e 100 g/cm2. Quanto à dose de luz, o intervalo foi entre 4,8 e 60 J/cm2, empregando lasers de diodo em 635 nm para Photogem&reg e 660 nm para Photodithazine&reg. Depois de estabelecido 30 J/cm² para a aplicação tópica, foi usada a aplicação intravenosa com essa dose, a fim de comparar os resultados. Após iluminação, foram feitas imagens da membrana imediatamente após a iluminação até 300 minutos pós-terapia. Com ajuda de softwares de processamento de imagem, foi feita a transformação da imagem: os pixels referentes aos vasos sanguíneos foram transformados em preto e o restante (clara, gema e embrião) em branco. Esse processo levou à obtenção de um valor relacionado à área de vasos sanguíneos em função do tempo pós-terapia, quantificando e mostrando o comportamento do efeito vascular da PDT. A comparação entre os dois fotossensibilizadores mostrou que o uso da mesma concentração (1 g/cm²) pode levar à destruição da rede vascular tratada para a porfirina e à dilatação dos vasos periféricos com destruição dos vasos mais calibrosos, para a clorina. Entretanto, variando as concentrações de ambos, obtemos respostas contrárias. A análise dos resultados obtidos, observando a diferença de ação dos fotossensibilizadores, permitiu a obtenção de uma relação quantitativa do comportamento vascular além do estudo individualizado do efeito da terapia fotodinâmica para análise do dano tecidual induzido. / Photodynamic Therapy is a local treatment of cancer that has great advances over the years. To obtain an efficient process that leads to tissue destruction, a dynamic interaction of three factors is required: photosensitizing agent, light, and molecular oxygen. When there is the appropriate illumination of tissue with photosensitizer, this molecule is excited and produces singlet oxygen. This product is reactive and cytotoxic, and it results in cell death. In this context, the CAM model allows studies with variation in many parameters linked with PDT and its effects and it is an option to study of vascular effects. A compound of porphyrin (Photogem&reg) and a compound of chlorine (Photodithazine&reg) were investigated in this study. These fotosensitizers were topically administrated and the parameters were ranged between 20-80 minutes for incubation, and 0.1-100 g/cm2 for concentration. About light dose, the range was between 4.8-60 J/cm2, with diode laser at 635 nm (Photogem&reg) and 660 nm (Photodithazine&reg). After established that light dose of 30J/cm² as ideal for topical application, intravenous application was used with that dose in order to compare the results. After illumination, the membrane images were made from zero to 300 minutes. At image processing, the pixels corresponding to vessels were defined as black and the remaining structures as white pixels. Calculating the percentage area of the black pixels as a function of the treatment time, it is possible to quantify the vascular effect of this therapy. The comparison between two fotosensitizers (1 g/cm²) can lead to vascular network destruction to porphyrin and can lead to dilation of peripheral vessels with destruction to larger vessels, for chlorine. However, increasing the porphyrin concentration and decreasing the chlorine concentration, we have opposite responses. With varying PDT parameters, it was possible to obtain the best assay for PDT. The results obtained by observing the difference of action of photosensitizers, allows obtaining a quantitative relationship of vascular behavior in addition to individual study of the effect of photodynamic therapy for analysis of tissue damage induced.

A ação combinada da Terapia Fotodinâmica (TFD) e da Hipertermia (HPT), projetadas para trabalhar sinergicamente, pode levar a uma considerável regressão de tumores neoplásicos após mínimas doses de dissipação de calor e/ou fotossensitização luminosa. Nesse estudo foi proposto, inicialmente, a formação do complexo de inclusão entre o fármaco fotossensibilizante, ftalocianina de zinco (ZnPc) e a cucurbiturila (CB[7]), de modo a aumentar a solubilidade do fármaco e minimizar sua agregação. Além disso, foi proposto nanoencapsular o complexo em lipossomas, tornando-os bicompatíveis. O complexo de inclusão CB[7]:ZnPc foi preparado pelo método de co-evaporação complementado por liofilização e caracterizado por Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1H), Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC) e Difração de Raios-X (XDR). As formulações lipossomais foram preparadas pelo método de hidratação do filme lipídico e caracterizadas com relação ao tamanho das vesículas, potencial Zeta, índice de polidispersão e estabilidade. Nos estudos biológicos, utilizando a linhagem neoplásica B16-F10, foi feita uma comparação entre o complexo livre e encapsulado em lipossoma, a fim de estudar o lipossoma como um veículo de liberação de fármacos. Além desse estudo, foi avaliada a toxicidade do lipossoma contendo o complexo de inclusão e o fluido magnético (CB:ZnPc-MLp) na presença de luz e campo magnético. Esse resultado nos mostra que a aplicação da luz e do campo magnético em conjunto, consegue ser mais eficaz do que os mesmos aplicados separadamente, comprovando o efeito sinérgico. / The combined action of photodynamic therapy (PDT) and hyperthermia (HPT), designed to work synergistically, may lead to a significant regression of neoplasic tumors after minimum doses of heat dissipation and / or light photosensitization. In this study was provided initially, the formation of an inclusion complex between the drug photosensitizer, zinc phthalocyanine (ZnPc) and cucurbit[7]uril (CB [7]) in order to increase the solubility of the drug and minimize aggregation. Furthermore, it was also proposed nanoencapsular liposome complex, making them biocompatible. The inclusion complex CB [7]: ZnPc was prepared by co-evaporation method complemented by lyophilization and characterized by nuclear magnetic resonance (1H-NMR), Differential Scanning Calorimetry (DSC) and X-ray diffraction (XDR). Liposomal formulations were prepared by lipid film hydration and characterized with respect to vesicle size, zeta potential, polydispersity and stability. In the biological studies, using neoplasic cell line B16-F10, a comparison was made between the free complex and the complex encapsulated in liposome in order to study the liposome as a carrier for drug delivery. In this study, we evaluated the toxicity of the liposome containing the inclusion complex and the magnetic fluid (CB: ZnPc-MLP) in the presence of magnetic field and light. This result shows that the application of light and magnetic field in combination are able to be more effective than the same applied separately, demonstrating the synergistic effect.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica para tratamento de câncer que usa um fotossensibilizador (FS) que na presença de luz e oxigênio molecular gera espécies altamente reativas de oxigênio (EROs) que levam as células tumorais à morte por apoptose ou necrose. Os FSs do tipo clorina apresentam problemas de agregação reduzindo sua eficácia fotodinâmica. O objetivo deste estudo foi sintetizar, caracterizar e testar novas clorinas não agregáveis em meio fisiológico e determinar sua ação fotodinâmica em células tumorais (HEp-2 e HeLa) e não tumorais (Vero). As moléculas 10-a e 10-b foram obtidas com rendimentos de 68% e as moléculas 11-a e 11-b com 64% de rendimento. Foram caracterizadas por RMN 1H, 13C, UV-Vis e espectrometria de massas de alta resolução (HRMS). Os valores de rendimento quântico de oxigênio singleto (&Phi;0) das clorinas foram comparáveis a uma molécula comercial análoga usada em TFD, a verteporfina (Visudyne&reg;). As clorinas sintetizadas apresentaram valores de rendimento quântico de fluorescência (&Phi;f) maiores que o Visudyne&reg;, além de uma baixa fotodegradação. O coeficiente de absorção molar (&epsilon;) das clorinas 10a-b e 11a-b exibiram valores maiores em meio aquoso apresentando uma auto-agregação menor que o Visudyne&reg;. O coeficiente de partição (Log P) obtido para a verteporfina (1.61 ± 0.10) foi maior que das clorinas 10a-b e 11a-b (1,20 ± 0,04 e 1,40 ± 0,03) respectivamente, evidenciando uma maior lipofilicidade e dificuldade de solubilização em meio aquoso em relação às clorinas. Os valores de Concentração Inibitória Média (IC50) das clorinas 10-a e 10-b nas linhagens celulares HEp-2 e HeLa foram menores que os determinados para a verteporfina pelo método de MTT, estas clorinas foram três e duas vezes mais potentes do que Visudyne&reg; respectivamente. As análises por microscopia de fluorescência mostraram que as quatro clorinas sintetizadas levam à morte celular predominantemente por apoptose nas duas linhagens tumorais. A acumulação intracelular determinada por microscopia confocal mostrou que as clorinas 10a-b exibiram uma maior penetração em relação às clorinas 11a-b através da membrana citoplasmática nas células tumorais, assim como, nas não tumorais. Dessa forma, as clorinas sintetizadas mostraram-se mais fotoestáveis, mais fototóxicas e mais solúveis em meio fisiológico do que o Visudyne&reg;, vantagens consideráveis para o uso como fotossensibilizadores para TFD. / Photodynamic Therapy (PDT) is a technique for the treatment of cancer that uses a photosensitizer (PS) that in the presence of light and molecular oxygen generates highly reactive oxygen species (ROS) that lead tumor cells to death by apoptosis or necrosis. Chlorine-like PSs exhibit aggregation, reducing its photodynamic efficacy in PDT. Thus, the objective of this study was to synthesize, characterize and test new chlorins sterically-prevented for self-aggregation in physiological medium, as well as determining their photodynamic response in tumor cells (HEp-2 and HeLa) and non-tumor cells (Vero). The chlorins designated 10-a and 10-b (yield: 68%), 11-a and 11-b (yield: 64%) were characterized by 1H, 13C, UV-Vis, and high resolution mass spectrometry (HRMS). The singlet oxygen quantum yield (&Phi;0) values of the chlorins were comparable to an analogous commercial molecule used in PDT, verteporfin (Visudyne&reg;). The synthesized chlorins shown fluorescence quantum yield values (&oslash;f) higher than Visudyne&reg;, in addition to low photodegradation. The molar absorption coefficient (&epsilon;) of chlorins 10a-b and 11a-b exhibited higher values in aqueous medium showing less self-aggregation than Visudyne&reg;. The partition coefficient (Log P) obtained for verteporfin (1.61 ± 0.10) was higher than that of chlorins 10a-b and 11a-b (1.20 ± 0.04 and 1.40 ± 0.03), respectively, indicating a greater lipophilicity and difficulty of solubilization in aqueous medium comparing to chlorins. The half-maximal inhibitory concentration (IC50) values of 10-a and 10-b chlorins in HEp-2 and HeLa cell lines were lower than those determined for verteporfin by the MTT method. These chlorins were three and two times more potent than Visudyne&reg; respectively. Fluorescence microscopy analyzes displayed that the four synthesized chlorins lead to cell death predominantly by apoptosis in the two tumor cells. Intracellular accumulation determined by confocal microscopy showed that chlorinas 10a-b exhibited a greater penetration with respect to chlorins 11a-b through the cytoplasmic membrane in tumor cells, as well as in non-tumor cells. Thus, the chlorins synthesized in this study showed to be more phototoxic and more soluble in physiological medium than Visudyne&reg;, considerable advantages for the use as photosensitizers for PDT.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica baseada na interação entre uma substância fotossensibilizadora e luz, na presença do oxigênio, para causar morte celular. Sob iluminação de comprimento de onda específico, o fotossensibilizador é excitado e reage com oxigênio celular, dando origem a espécies reativas de oxigênio capazes de promover danos a biomoléculas da célula-alvo. O mesmo processo ocorre para micro-organismos, como bactérias, vírus e fungos. A Pitiose é uma doença causada por um micro-organismo semelhante a fungo denominado Pythium insidiosum. Por não ser um fungo verdadeiro, o agente não apresenta ergosterol em sua membrana plasmática e por isso, não responde à maioria das drogas antifúngicas disponíveis. Procedimentos cirúrgicos extensos, como amputação de membros, são indicados; porém as recidivas são frequentes. Neste trabalho, foi avaliado o efeito da TFD em modelo in vitro, em infecção experimental de pitiose e em pitiose equina. Além disso, foram realizados ensaios de cinética dos fotossensibilizadores utilizados, porfirina, clorinas e azuleno. As taxas de inibição de crescimento in vitro do P. insidiosum foram superiores a 95% para os ensaios com Photodithazine&reg. Photogem&reg apresentou inativação satisfatória e o azul de metileno se mostrou ineficiente para a inativação do patógeno. A cinética comprova os resultados obtidos in vitro, e revelou possível afinidade das clorinas com o oomiceto. Dez minutos após a incubação em solução de Photodithazine&reg e clorina e6 foi possível observar os compostos em estruturas intracelulares específicas. Para maiores tempos de incubação, a distribuição destes compostos se dá por toda a hifa e parede celular. O Photogem&reg mostrou distribuição heterogênea na cultura. Este fato explica o crescimento de algumas hifas após a TFD. O azul de metileno não penetrou na célula microbiana e por isso não foi eficiente na inativação do patógeno. Ao observar a estrutura morfológica da hifa do patógeno após a TFD com diferentes tempos de incubação, ficou evidente que a TFD é mais eficiente para maiores tempos de incubação. Apenas o azul de metileno não inativou o patógeno em nenhum dos parâmetros avaliados. Os estudos em pitiose experimental mostraram que o Photodithazine&reg concentra-se na lesão 4 horas após a administração por via endovenosa, o que não foi observado para o Photogem®. Altas fluências e intensidades luminosas foram necessárias para o tratamento das lesões. Foram avaliados 21 coelhos com aproximadamente 95% de cura. O tratamento de equinos naturalmente infectados mostrou resultados animadores. Foram avaliados quatro cavalos, realizando-se apenas duas sessões de TFD em cada animal e foi possível observar regiões de cicatrização tecidual e recuperação da função motora dos animais. Mais uma vez as clorinas mostraram maior eficiência quando comparadas aos outros fotossensibilizadores. Além disso, observou-se a relação entre os tempos de incubação e resposta tecidual que condizem aos observados no estudo farmacocinético. O protocolo para o tratamento da pitiose, provavelmente basear-se-á em tempos de incubação do composto maiores que 1 hora, altas fluências e intensidades luminosas e clorinas como agente fotossensibilizador. Neste trabalho, a TFD mostrou potencial terapêutico e pode vir a se tornar uma importante ferramenta no tratamento da pitiose. / Photodynamic Therapy (PDT) is a therapy based on the interaction of photosensitizer and light, in the presence of oxygen, to induce cellular death. Under the incidence of light, at an appropriated wavelength, these chemical compounds produce reactive oxygen species which affects the biomolecules of the target-cells. Pythiosis is a lifethreatening emerging disease caused by a fungus-like organism called Pythium insidiosum. Since it is not a true fungus, this microorganism does not present ergosterol in its plasmatic membrane, and so, does not respond satisfactorily to most antifungal drugs. Extensive surgical debridements are required, such as limb amputation, however, reccurence frequently occurs. In this study the PDT effect was investigated in an in vitro model, experimental in vivo infection and naturally occurred equine pythiosis. Besides, pharmacokinetic assays with chlorine, porphyrin and methylene blue were also carried out. It was observed inhibition rates greater than 95% for chlorine, while porphyrin showed satisfactory inhibition and methylene blue was inefficient to inactivate the pathogen. Pharmacokinetics assays corroborate with obtained in vitro results and demonstrated a possible affinity between chlorine and oomicetes. After ten minutes of incubation, for both chlorine and clorin e6 solutions, it was observed that these compounds were concentrated in intracellular specific structures. For longer incubation times the distribution of these compounds was observed along the hyphae and cellular wall. Porphyrin has shown heterogeneous distribution on cell culture. This fact may explain hyphal growth observed after PDT with this photossensitizer. Methylene blue was present only in the cell surface and so, did not inhibit the pathogen. By observing the morphological structure of the pathogen after PDT with different incubation times, it was evident that PDT is more efficient when employing longer incubation times. Only methylene blue did not inactivate the pathogen in none of the evaluated protocols. Concerning experimental infection, it was observed that chlorine concentrates in lesion 4 hours after intravenous administration, while the same was not observed for porphyrin. High light doses and irradiances were necessary for treating the lesions. It was evaluated 21 rabbits with complete response around 95%. The treatment of naturally infected equines showed promising results. Four horses were treated with two PDT sessions. Treated regions of healing and recovery of motor function of the animals were observed. Once again, chlorins showed improved results when compared to the other photosensitizers. Besides, it was observed the relation between incubation time and tissue response correlated to those observed in the kinetics study. The protocol for treating pythiosis, probably will be based on chlorine incubation time greater than 1 hour, high light dose and irradiance, that the results of the present study demonstrate that PDT is a potential treatment option for pythiosis.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) contra o melanoma cutâneo tem encontrado várias limitações devido à interferência de cromóforos endógenos (melanina) na irradiação deste tipo de cancêr de pele. Agentes fotossensibilizantes que absorverem em comprimentos de onda superiores a 650 nm evitam a competição com a melanina (absorção máxima 530 nm). Neste cenário, surge a ftalocianina de cloroalumínio com forte absorção entre 670-680 nm. Entretanto, esta molécula é lipofílica, o que impede sua aplicação na terapêutica. Para superar este problema, esforços têm sido direcionados para o desenvolvimento de sistemas de veiculação de fármacos hidrofóbicos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver, caracterizar e avaliar o efeito fotodinâmico de ClAlPc encapsulada em nanocápsulas e nanopartículas de organogel. As nanocápsulas contendo ClAlPc foram obtidas pelo método de nanoprecipitação por meio de um planejamento fatorial 23 e as nanopartículas de organogel contendo ClAlPc foram preparadas pela dispersão a quente do organogel em solução aquosa. Ambas as formulações coloidais foram caracterizadas com relação ao diâmetro médio, índice de polidispersão (IPd), potencial zeta, eficiência de encapsulação (E.E.) e estabilidade física. Os ensaios in vitro de toxicidade e fotocitotoxicidade de ClAlPc nanoencapsulada e/ou livre foram realizados sobre as linhagens melanocíticas WM1552C, WM278, WM1617 e B16-F10. O método de nanoprecipitação foi capaz de produzir nanocápsulas em tamanho nanométrico (233,0 nm ±2,00), com uma distribuição de tamanho homogênea e monodispersa (0,309 ±0,0038), bem como potencial zeta significantemente negativo de 29,6 mV (±3,91). A formulação de nanocápsulas apresentou uma boa E.E. de 63,7% para a ClAlPc. O conteúdo de ClAlPc presente nas formulações de nanocápsulas foi determinado pelos métodos analíticos espectrofotométrico e espectrofluorimétrico validados, os quais foram capazes de quantificar a ClAlPc com precisão e exatidão. O estudo de estabilidade física das formulações de nanocápsulas revelou o caráter estável desta formulação por um período de até 12 meses. As nanopartículas de organogel contendo ClAlPc apresentaram diâmetro médio de 282,7 nm (±2,99), IPd de 0,343 (±0,0280) e potencial de superfície de + 49,3 mV (±1,84). A formulação de nanopartículas de organogel apresentou uma E.E.de ClAlPc de 60%. O estudo de estabilidade física também revelou um comportamento estável das nanopartículas de organogel por um período de 6 meses. Os estudos de toxicidade na ausência de luz demonstraram o caráter biocompatível das nanocápsulas desenvolvidas e foi possível comprovar o excelente efeito fototóxico da ClAlPc nanoencapsulada sobre todas as linhagens melanocíticas com combinação de 0,30 µg.mL-1 de ClAlPc nanoencapsulada e doses de luz de 150 ou 500 mJ.cm-2, nestas condições a fração de morte celular foi superior a 90%. Portanto, estes resultados confirmam o potencial de nanocarreadores contendo ClAlPc como sistema de veiculação de compostos hidrofóbicos aplicados à TFD. / Photodynamic Therapy (PDT) against melanoma has found several limitations due to interference from endogenous chromophores (melanin) in the irradiation of this skin cancer. Photosensitizer agents which absorb at wavelengths above 650 nm may avoid melanin competition. In this context, the chloroaluminum phthalocyanine is a promissor photosensitizer with strong absorption between 670-680 nm. However, this molecule is lipophilic difficulting its application in therapy. In order to overcome such problem, efforts have focused on development of drug delivery systems containing hydrophobic photosensitizers. Therefore, the aim of this study was to develop, characterize, and evaluate the photodynamic effect of ClAlPc encapsulated into nanocapsules and organogel nanoparticles. The nanocapsules containing ClAlPc were obtained by nanoprecipitation method using a factorial design 23, and organogel nanoparticles containing ClAlPc were prepared hot dispersion of organogel in aqueous solution. Both colloidal formulations were characterized with respect to average diameter, polydispersity index (PdI), zeta potential, encapsulation efficiency (EE), and physical stability. The in vitro tests for toxicity and photocytotoxicity of nanoencapsulated and free ClAlPc were performed on melanocytic cell lines (WM1552C, WM278, WM1617, and B16-F10). The nanoprecipitation method was able to produce nanocapsules with nanometer-size (233.0 nm ± 2.00), PdI of 0.309 (± 0.0038) indicating homogeneous and monodisperse formulations, as well as significantly negative zeta potential of 29.6 mV (± 3.91). The formulation of nanocapsules showed a good EE of 63.7% for ClAlPc. The ClAlPc content present in nanocapsules was determined by validated analytical spectrophotometric and spectrofluorimetric methods, which were reliably able to determine ClAlPc in nanocapsules. The study of physical stability for nanocapsules showed the stable character of this formulation for a period of 12 months. The nanoparticles of organogel containing ClAlPc had an average diameter of 282.7 nm (± 2.99), IPD of 0.343 (± 0.0280), and surface potential of + 49.3 mV (± 1.84). The formulation of organogel nanoparticles showed a ClAlPc EE of 60%. The physical stability study also revealed a behavior stable organogel nanoparticles for a period of 6 months. Toxicity studies in darkness conditions have been confirmed biocompatibility of nanocapsules. Besides that, the excellent photodynamic effect of ClAlPc nanoencapsulated was reached on all melanocytic cell lines using an arrangement of 0.30 g.mL-1 of ClAlPc encapsulated, and light doses of 150 or 500 mJ.cm-2, under these conditions the cell death fraction was more than 90%. Therefore, these results confirm the potential of nanocarriers containing ClAlPc as delivery system for hydrophobic photosensitizers applied to PDT.

Dentre os diferentes tipos, o câncer de pele é o tipo de câncer com maior incidência no mundo. É crescente o interesse em explorar técnicas que auxiliem no diagnóstico de lesões malignas e pré-malignas, assim como no monitoramento da eficácia dos tratamentos existentes. As lesões tumorais apresentam temperatura diferente se comparadas a tecidos normais e, com o desenvolvimento de detectores térmicos cada vez mais sensíveis e com melhor qualidade de resolução, a termografia tem se apresentado como uma abordagem de interesse cada vez maior. Os objetivos deste estudo foram: (1) avaliar o uso do imageamento termográfico para o monitoramento e diferenciação de lesões clinicamente semelhantes e (2) analisar a eficiência da terapia fotodinâmica durante o tratamento. Um monitoramento piloto por termografia do crescimento de tumores de Ehrlich (hipotérmicos) injetados no dorso de camundongos Swiss mostrou capacidade para a detecção de tumores a partir de 4 mm de diâmetro. Na avaliação de lesões clínicas, foi investigada a discriminação de pares de lesões cutâneas potencialmente semelhantes clinicamente: CBC versus nevo intradérmico, carcinoma espinocelular (CEC) versus queratose actínica (QA) e queratose seborreica (QSP) versus melanoma. As lesões de CEC foram discriminadas com maior facilidade, apresentando aumento da temperatura na área da lesão em comparação com a região adjacente, enquanto as outras lesões clinicamente identificadas como QA, que podem evoluir para CEC, quase não se diferenciam termicamente do tecido saudável circundante. Uma rotina de processamento das imagens das lesões utilizando um classificador de rede neural mostrou capacidade de diferenciar as lesões dos tipos CBC versus nevo em 67,2% dos casos; em 80% para as lesões de CEC versus QA, e em 50% para as lesões QSP versus melanoma. O monitoramento da terapia fotodinâmica (TFD) foi realizado em lesões clínicas de CBC tratadas em duas sessões. Verificou-se que a região da lesão fica mais evidente termicamente ao longo do procedimento, e as definições das bordas da lesão tornam-se mais delimitadas após o término da iluminação. Com a obtenção das imagens térmicas de TFD criou-se um modelo simplificado para estimar a energia convertida nos processos de transferência de energia envolvidos na TFD. Mesmo com as aproximações realizadas, mostrou-se que a maior parte da energia depositada foi convertida em ação fotodinâmica (53,8%), seguida da parcela que foi dissipada pela perfusão do sangue (37,2%), mostrando que a maior parte da energia depositada no tecido durante o procedimento é incorporada ao efeito fotodinâmico. Esta é uma evidencia de que a ação fotodinâmica não apresenta componente térmica relevante, aspecto importante para o estudo de seus mecanismos. / Among the different cancer types, skin cancer is the most prevalent type of cancer in the world. In most cases, the survival rates are higher when the diagnosis occurs in the early stages of the disease. Thus, there is a growing interest in techniques that aid in the diagnosis of malignant and premalignant lesions, as well as in monitoring the efficacy of existing treatments. Concerning tumor diagnosis, tumor lesions present different temperature compared to normal tissues. Thermography has been presented as an approach of increasing interest due to the development of thermal detectors with better resolution quality and increased sensitivity. The objective of this study was therefore to evaluate the possibility of differentiating clinically similar lesions and monitoring the efficiency of photodynamic therapy during the treatment by using thermographic images and neural network classifiers. A monitoring of the growth of Ehrlich (hypothermic) tumors injected into the Swiss mouse back using thermography showed the technique is able to detect tumors from 4 mm in diameter. For the evaluation of clinical lesions, the discrimination of potentially clinically similar cutaneous lesions: BCC versus intradermal nevus, squamous cell carcinoma (SCC) versus actinic keratosis (AK) and seborrheic keratosis (PSK) versus melanoma were investigated. SCC lesions were more easily discriminated, showing an increase of temperature in the lesion area compared to the adjacent region, while the lesions that were clinically identified as AK (which can possible progress towards SCC lesions) can hardly be thermally differentiated differ thermally from the surrounding healthy tissue. This is a very relevant result, given the great difficulty in diagnosing SCC lesions by the standard dermatoscopy technique. An images processing routine using a neural network classifier showed the ability to differentiate lesions between BCC and nevus types in 67.2% of the cases; 80% for SCC versus AK lesions, and 50% for PSK lesions versus melanoma. The monitoring of photodynamic therapy (PDT) was performed in BCC lesions treated in two sessions. The lesion region becomes more thermally evident throughout the procedure, and the definitions of the lesion edges become more clearly delimited visually after the end of the illumination. By obtaining the thermal images of PDT a model was created to calculate the amount of light energy converted to heat, damage, and other energy transfer processes involved in the PDT. Despite the approximations made, it was shown that most of the deposited energy was converted into photodynamic action (53.8%), followed by the portion cleared from the irradiated tissue by the blood perfusion (37.2%), showing that most of the energy deposited in the tissue during the procedure is incorporated into the photodynamic effect. This is an evidence that the photodynamic action does not present a relevant thermal component, an important aspect for the study of its mechanisms.

O aparecimento de uma grande variedade de microrganismos patogênicos resistentes aos antimicrobianos tem resultado no aumento do índice de doenças e mortalidade provocadas por infecções que eram facilmente tratadas no passado. Muitas vezes essa resistência está relacionada à formação de biofilme pelos microrganismos, que produzem substâncias poliméricas extracelulares (EPS) dificultando a penetração de agentes antimicrobianos. A Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (aPDT, do inglês antimicrobial photodynamic therapy) é uma alternativa promissora para combater infecções microbianas, principalmente aquelas em que apresentam biofilmes. Basicamente esse mecanismo envolve a combinação sinérgica de um fotossensibilizador (FS), oxigênio molecular e luz visível de comprimento de onda adequado para produzir espécies reativas de oxigênio (EROs) que causam oxidação dos componentes da célula levando-a à morte. Devido à natureza multifacetada e não-específica das EROs produzidos na aPDT, os microrganismos têm menos chance de desenvolver mecanismos de resistência. Apesar destas vantagens, a aPDT tem enfrentando o problema da hidrofobicidade que FSs como hipericina (Hy) e ftalocianina de zinco (FcZn) apresentam. Esta hidrofobicidade promove a agregação do FS em meio biológico, reduzindo a sua atividade fotodinâmica. Diante disso, este estudo teve o objetivo avaliar a ação fotodinâmica da Hy, FcZn e seus derivados hidrossolúveis (hipericina-glucamina - HyG, ftalocianina de zinco tetracarboxilada - FcZnTc e ftalocianina de zinco tetracarboxi-N-metilglucamina - FcZnTcG), para inativar as bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli, tanto em cultura planctônica como em biofilme. Como a aPDT apresenta também a vantagem de seletividade, foi proposto que as condições para fotoinativação destas bactérias provocassem o mínimo de dano às células hospedeiras. Estudos físico-químicos dos novos FSs mostraram menor agregação dos FSs derivados em meio aquoso que seus compostos de origem, bem como um ligeiro aumento no coeficiente de atividade fotodinâmica. Além disso, a hidrofilicidade dos FSs aumentou a acumulação intracelular dos mesmos nas bactérias de estudo S. aureus e E. coli, tanto na forma de células planctônicas quanto em biofilme. Os ensaios de acumulação intracelular dos FSs determinaram os parâmetros de fotoinativação seletiva dos microrganismos, tanto em células planctônicas como em biofilme. Todos os FSs, com exceção de FcZn, foram capazes de promover a seletividade de S. aureus e E. coli na forma planctônica. Entretanto, devido a maior complexidade morfológica de E. coli, os parâmetros de fotoinativação utilizados para inibir esta bactéria foram cerca de duas vezes maiores que para inativar a mesma concentração celular de S. aureus. Dentre todos os FSs, a FcZnTcG apresentou as melhores condições de seletividade tanto para E. coli quanto para S. aureus, uma vez que inibiu aproximadamente 100% destes microrganismos e no máximo 15% de células epiteliais (Vero). A obtenção das condições de seletividade para os biofilmes bacterianos foi mais difícil, pois a acumulação dos FSs por S. aureus e E. coli foi menor, tornando-se assim necessário aumentar os parâmetros de fotoinativação, ou seja, concentração do FS, tempo de incubação e dose de luz, que consequentemente inibiram mais as células epiteliais. Apesar disso, HyG e FcZnTcG foram capazes de promover a seletividade do biofilme de S. aureus em todas as etapas de formação. Entretanto, a seletividade do biofilme de E. coli foi alcançada apenas nas etapas de adesão reversível e irreversível e somente por FcZnTcG. Isso pode ser justificado pela maior concentração de EPS sintetizado por E. coli que por S. aureus, dificultando a acumulação dos FSs nas últimas etapas do biofilme de E. coli (biofilme maduro e dispersão). Portanto, os resultados desse estudo permitem sugerir que a hidrofilicidade é uma característica importante para os FSs fotoinativarem seletivamente os microrganismos S. aureus e E. coli, mesmo na forma de biofilme. Além disso, foi observado que a ação de aPDT no EPS do biofilme bacteriano desempenha um papel fundamental para inibição tanto de S. aureus quanto de E. coli. / The appearance of a large variety of antimicrobial-resistant pathogenic microorganisms has led to increased rates of disease and mortality caused by infections that were easily treated in the past. It has become clear that the biofilm-grown cells increase the bacteria resistance to antibiotics. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is a promising alternative way to fight microbial infections, especially the biofilm ones. This technique, basically, involves the synergistic combination of a photosensitizer, molecular oxygen and visible light of an appropriate wavelength to produce highly reactive oxygen species that lead to the oxidation of several cell components and to cell inactivation. The main advantage of the technique is that, given the existence of multiple targets, there is no development of resistance. The hidrophobicity of photosensitizers (PSs) like hypericin (Hy) and zinc phthalocyanine (ZnPc), reduces their photodynamic activity once they form aggregates in biological media. For this reason, was evaluated the effectivenes of Hy, ZnPc and its water-soluble derivatives (glucamine-hypericin-HyG, zinc tetracarboxylated phthalocyanine-ZnTcPc and zinc tetracarboxy-N-metylglucamine phthalocyanine-ZnTcGPc) to photoinactivate S. aureus and E. coli with minimal damage to a model of host cells. Physicochemical studies showed that hidrophilic PSs suffer less aggregation in aqueous media, as well as present a slight increase in photodynamic activity compared to Hy and ZnPC. Furthermore, the hydrophilicity of PSs increased the PS intracellular accumulation in bacteria, either in planktonic culture or biofilms. The accumulation study allowed to determine the parameters of selective photoinactivation of microorganisms. Due the morphologic complexity of E. coli the photodynamic parameters (incubation time, PS concentration and light dose) were twice that used against S. aureus. As a consequence, some more epithelial cells were affected by the process. Despite that, only the ZnPc could not promote the selective inactivation for planktonic cells. By the other hand, HyG and FcZnTcG were able to seletively photoinactivate the biofilm of S. aureus in all its formation stages. However, the selective inactivation of E. coli biofilm was achieved only in the reversible and irreversible adhesion and just for FcZnTcG. This fact can be explained by the higher concentration of exopolysaccharide (1,9 \'mü\'g/mL) synthesized by E. coli compared with S. aureus, making difficult the accumulation of the PSs in the last stages of the E. coli biofilm formation (mature biofilm and dispersion). So, we can suggest that hidrophilicity is an important characteristic for the PSs, improving the selective photoinactivation of S. aureus and E. coli, even as biofilm. Moreover, the effectiveness of aPDT agains EPS plays a key role for inhibition of bacterial biofilms.