As brássicas compreendem diversas espécies de grande relevância comercial dentre as demais espécies olerícolas cultivadas no Brasil. A região localizada próxima à cidade de São Paulo (SP) tem se destacado no cultivo de brássicas, especialmente do repolho, da couve-flor e do brócolis. Em campos de cultivo destas espécies, tem sido observadas plantas exibindo redução de tamanho, inflorescências mal formadas, avermelhamento de folhas e necrose dos vasos condutores. Investigações tem mostrado que estas anormalidades estão associadas aos fitoplasmas e a doença tem sido denominada enfezamento. Ainda, estudos anteriores têm sugerido a ocorrência de algumas espécies de cigarrinhas potencialmente vetoras destes fitoplasmas. Considerando estas informações, o presente trabalho teve por objetivo identificar espécies transmissoras de fitoplasmas para plantas de brócolis, buscando aumentar os conhecimentos sobre os vetores de fitoplasmas envolvidos com o enfezamento desta cultura. Para isto, foram coletados insetos no interior e áreas marginais de campos cultivados. Estes insetos foram separados em grupos, identificados taxonomicamente e confinados em plantas sadias de brócolis. A avaliação da transmissão foi feita com base na detecção de fitoplasmas nos tecidos dos insetos e das plantas, usando-se a técnica de PCR duplo, com primers específicos para identificação de fitoplasmas do grupo 16SrIII. A sobrevivência dos insetos nas plantas de brócolis foi pouco duradoura, não excedendo 48 horas. A transmissão experimental foi constatada em 30% das plantas inoculadas. Dentre as 8 potenciais espécies de vetores que foram testadas, as espécies Atanus nitidus, Balclutha hebe, Agalliana sticticollis e Agallia albidula transmitiram fitoplasma para plantas de brócolis. Os resultados deste estudo confirmaram aqueles obtidos nas investigações anteriores, as quais sugeriam a ocorrência de potenciais espécies vetoras de fitoplasmas dentre aquelas presentes nos campos de cultivo. No entanto, o conhecimento de detalhes sobre a transmissão necessita de estudos com populações sadias e infectivas das espécies vetoras, sob condições controladas. Apesar desta necessidade, uma etapa importante foi cumprida no presente trabalho, o qual se constitui numa contribuição relevante tanto para o conhecimento de aspectos epidemiológicos relacionados à disseminação do agente causal do enfezamento do brócolis como para a área de conhecimento relacionada à transmissão de patógenos por insetos vetores, nas condições brasileiras. / Cole crops include several species of commercial importance among the vegetable crops cultivated in Brazil. The region located near the city of São Paulo (SP) has excelled in the cultivation of brassica, especially cabbage, cauliflower and broccoli. In cultivated fields with these species have been observed plants showing reduction of size, malformed inflorescences, reddening of leaves and necrosis of region of vessels. Previous investigations have shown that these abnormalities are associated with phytoplasmas and the disease has been called stunt. In addition, previous studies have suggested the occurrence of some species of leafhoppers potentially vectors of phytoplasmas. Considering this information, the present study aimed to identify species that transmit phytoplasmas to plants of broccoli, seeking to increase knowledge about vectors of phytoplasmas involved with this culture. Thus, insects were collected within and in marginal areas of cultivated fields. These insects were separated into groups, taxonomically identified and confined in healthy plants of broccoli. The evaluation of transmission was based on detection of phytoplasmas in the tissues of plants and insects using the technique of nested PCR with specific primers for identification of phytoplasmas group 16SrIII. The survival of insects on plants of broccoli was short-lived, not exceeding 48 hours. The experimental transmission was observed in 30% of inoculated plants. Among the 8 potential vector species that were tested, the species Atanus nitidus, Balclutha hebe, Agalliana sticticollis and Agallia albidula transmitted phytoplasma to plants of broccoli. The results of the present study confirmed those obtained in previous research, which suggested the occurrence of potential vector species of phytoplasmas among those present in crop fields. However, details about these species as vectors require the creation of healthy populations of these species and infective for broadcast demonstration in controlled conditions. Despite this need, an important step has been accomplished in this work, which constitutes a significant contribution both to the knowledge of epidemiological aspects related to the spread of causal agent of broccoli stunt and the area of knowledge related to the transmission of pathogens by insects vectors, the Brazilian conditions.

Recentemente, um fitoplasma do grupo 16SrIX foi associado a plantas de citros com sintomas de huanglongbing (HLB) no Estado de São Paulo. No entanto, em razão da ampla diversidade de fitoplasmas que tem se observado em várias culturas no Brasil, seria possível que além do fitoplasma do grupo16SrIX, outros fitoplasmas também pudessem estar associados a plantas de citros no Estado de São Paulo. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi investigar se outros fitoplasmas, além daquele do grupo 16SrIX, estão associados a plantas de citros no Estado de São Paulo. Amostras foliares de plantas de citros, plantas daninhas e cicadelídeos foram coletados entre os meses de Junho a Outubro de 2010, em pomares localizados em quatro municípios: Araraquara, Bebedouro, Piracicaba e Taquarituba. Análises de nested PCR evidenciaram a presença de fitoplasmas associados a plantas de citros (sintoma: clorose foliar); a plantas daninhas: Bidens pilosa (sintomas: filodia e virescência), Leonorus sibiricus (sintoma: deformação foliar), Solanum americanus (sintoma: superbrotamento foliar), Erigeron bonariensis (sintomas: avermelhamento e superbrotamento foliar) e Euphorbia heterophylla (sintoma: deformação foliar); e a cicadelídeos da espécie Agallia albidula (Uhler, 1895) (subfamília Agalliinae). A confirmação da presença e caracterização molecular dos fitoplasmas foi realizada através de análises de RFLP e seqüenciamento da região 16S rDNA. Uma ampla diversidade de fitoplasmas foi identificada. Fitoplasmas dos grupos 16SrIII e 16SrIX foram associados a plantas de citros em Piracicaba, enquanto um fitoplasma do grupo 16SrVII foi associado a plantas de citros em Bebedouro. Fitoplasmas do grupo 16SrIII foram associados a plantas daninhas das espécies B. pilosa, L. sibiricus e S. americanus em Piracicaba e fitoplasmas do grupo 16SrVII foram associados a plantas de E. bonariensis e E. heterophylla em Piracicaba e Taquarituba, respectivamente. Um fitoplasma do grupo 16SrIII foi associado a A. albidula em Taquarituba, sugerindo ser este um potencial inseto vetor de fitoplasmas em pomares de citros. Com base na análise da região 16S rDNA, muitos dos fitoplasmas encontrados apresentaram-se distintos dos fitoplasmas já relatados. Em virtude disto, estes fitoplasmas foram propostos como representantes de novos subgrupos pertencentes aos grupos 16SrIII, 16SrVII e 16SrIX. Os resultados obtidos neste estudo não nos permite a associação dos fitoplasmas encontrados com o HLB ou qualquer outra doença já descrita, sendo, portanto, necessários mais estudos visando confirmar o papel destes fitoplasmas como patógenos de citros e plantas daninhas. / Recently a phytoplasma of the 16SrIX group was associated with citrus trees exhibiting symptoms of huanglongbing (HLB) in Sao Paulo state. However, due to the wide diversity of phytoplasmas that have been observed in several crops in Brazil, it is possible that in addition to the phytoplasma of group 16SrIX other phytoplasmas could also be associated with citrus trees. Therefore, the objective of this study was to investigate if others phytoplasmas besides that of the 16SrIX group are associated with citrus plants in the São Paulo state. Leaf samples from citrus trees, weeds and cicadellids were collected between June and October of 2010 from citrus orchards of four municipalities of the Sao Paulo state: Araraquara, Bebedouro, Piracicaba and Taquarituba. Nested PCR analysis revealed the presence of phytoplasmas associated with citrus trees (symptom: leaf chlorosis), weeds: Bidens pilosa (symptoms: phyllody and virescence), Leonorus sibiricus (symptom: leaf distortion), Solanum americanus (symptom: witches broom), Erigeron bonariensis (symptoms: redning and witches broom) e Euphorbia heterophylla (symptom: leaf distortion); and cicadellids of specie Agallia albidula (Uhler, 1895) (subfamily Agalliinae). The confirmation of the phytoplasma presence and molecular characterization was carried out by RFLP analysis and sequencing of the 16S rDNA region. A wide diversity of phytoplasmas was verified. Phytoplasmas of the 16SrIII and 16SrIX groups were associated with citrus trees in Piracicaba, while a phytoplasma of the 16SrVII group was associated with citrus trees in Bebedouro. Phytoplasmas of the 16SrIII group were associated with weeds belonging to the species B. pilosa, S. americanus and L. sibiricus in Piracicaba and a phytoplasma of the 16SrVII group was identified associated with plants of E. bonariensis and E. heterophylla in Piracicaba and Taquarituba, respectively. A phytoplasma of the 16SrIII group was associated with A. albidula in Taquarituba, suggesting that this cicadelid is a potential vector of phytoplasmas in citrus orchards. Based on the analysis of the 16S rDNA region, many of the found phytoplasmas are distinct from those already reported. Due to this distinction, these phytoplasmas were proposed as representatives of new subgroups of the groups 16SrIII, 16SrVII and 16SrIX. The results of this study dont allow us associate the found phytoplasmas with HLB or any other described disease. Thus, more studies are needed to identify the role of theses phytoplasmas as pathogens of citrus trees and weeds.

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A mandioca (Manihot esculenta) é uma das principais culturas exploradas no mundo, sendo o Brasil o segundo maior produtor. Cultivada em todas as regiões brasileiras, a mandioca é importante na indústria e na alimentação humana e animal. Em plantios instalados em campo experimental e comercial, nas cidades de Piracicaba/SP e Bragança Paulista/SP, respectivamente, foram observadas plantas exibindo sintomas de enfezamento generalizado, superbrotamento de ramos, deformação, clorose das folhas e redução do tamanho das folhas. Com base na sintomatologia, suspeitou-se da ocorrência de fitoplasmas nas plantas doentes. Assim, o objetivo do presente trabalho foi detectar e identificar possíveis fitoplasmas, bem como demonstrar que estes procariotos são os agentes da doença. Para isto, amostras de plantas sintomáticas e assintomáticas foram coletadas e o DNA total foi extraído e usado em duplo PCR, conduzido com os pares de primers P1/Tint e R16F2n/16R2, visando à detecção de fitoplasmas. A amplificação de fragmentos genômicos de 1,2 Kb a partir do 16S rDNA confirmou a presença de fitoplasmas em 76% das amostras de Piracicaba e em 95% das amostras coletadas em Bragança Paulista. A identificação molecular com o uso de primers específicos demonstrou que todos os fitoplasmas encontrados pertenciam ao grupo 16SrIII. As análises de RFLP, usando-se digestão enzimática dos produtos de duplo PCR com as enzimas de restrição AluI, KpnI, HpaI, HpaII, HhaI, HinfI, MseI e RsaI e as análises filogenéticas, baseadas na sequência nucleotídica do 16S rDNA, revelou que o fitoplasma detectado em todas as amostras positivas eram afiliados ao grupo 16SrIII, subgrupo B. A prova de patogenicidade foi demonstrada pela transmissão experimental do fitoplasma presente em plantas de mandioca para plantas de vinca, por meio de Cuscuta subinclusa. Este é o primeiro relato de que um fitoplasma do grupo 16SrIII-B é o agente causal do superbrotamento em mandioca no Estado de São Paulo. / Cassava (Manihot esculenta) is one of the main cultures explored in the world and Brazil is the second largest producer. Cultivated in all Brazilian regions, cassava is important in the industry, food and both human and animal feed. In plantings installed on trial and commercial fields located in Piracicaba/SP, Bragança Paulista/SP, respectively, plants have been exhibited symptoms of general stunt, witches broom , and size reduction of leaves with deformation and chlorosis. Based on the symptoms, it has suspected the occurrence of phytoplasmas in diseased plants. Thus, this study has carried on detecting and identifying the presence of phytoplasmas and demonstrates that those prokaryotes are the disease agents. Samples from symptomatic and asymptomatic plants have been collected and total DNA extracted and used in nested PCR, conducted with primer pairs P1/Tint and R16F2n/16R2 in order to detect phytoplasmas. Amplification of genomic fragments of 1.2 Kb from the 16S rDNA has confirmed the presence of phytoplasmas in 76% of samples from Piracicaba and 95% of samples collected in Bragança Paulista. The molecular identification using specific primers has revealed that all the phytoplasmas found in diseased plants belonged to group 16SrIII. The RFLP analysis, using enzymatic digestion of PCR products with restriction enzymes AluI, KpnI, HpaI, HpaII, HhaI, HinfI, MseI and RsaI and phylogenetic analysis, based on the nucleotide sequence of 16S rDNA has revealed the detected phytoplasma in all positive samples have affiliated to the group 16SrIII, subgroup B. Pathogenicity proof has demonstrated by experimental transmission of the phytoplasma present in cassava plants to periwinkle, through the Cuscuta subinclusa. This is the first report that a phytoplasma group 16SrIII-B is the causal agent of cassava witches broom, in Sao Paulo State.

A mandioca (Manihot esculenta) é uma das principais culturas exploradas no mundo, sendo o Brasil o segundo maior produtor. Cultivada em todas as regiões brasileiras, a mandioca é importante na indústria e na alimentação humana e animal. Em plantios instalados em campo experimental e comercial, nas cidades de Piracicaba/SP e Bragança Paulista/SP, respectivamente, foram observadas plantas exibindo sintomas de enfezamento generalizado, superbrotamento de ramos, deformação, clorose das folhas e redução do tamanho das folhas. Com base na sintomatologia, suspeitou-se da ocorrência de fitoplasmas nas plantas doentes. Assim, o objetivo do presente trabalho foi detectar e identificar possíveis fitoplasmas, bem como demonstrar que estes procariotos são os agentes da doença. Para isto, amostras de plantas sintomáticas e assintomáticas foram coletadas e o DNA total foi extraído e usado em duplo PCR, conduzido com os pares de primers P1/Tint e R16F2n/16R2, visando à detecção de fitoplasmas. A amplificação de fragmentos genômicos de 1,2 Kb a partir do 16S rDNA confirmou a presença de fitoplasmas em 76% das amostras de Piracicaba e em 95% das amostras coletadas em Bragança Paulista. A identificação molecular com o uso de primers específicos demonstrou que todos os fitoplasmas encontrados pertenciam ao grupo 16SrIII. As análises de RFLP, usando-se digestão enzimática dos produtos de duplo PCR com as enzimas de restrição AluI, KpnI, HpaI, HpaII, HhaI, HinfI, MseI e RsaI e as análises filogenéticas, baseadas na sequência nucleotídica do 16S rDNA, revelou que o fitoplasma detectado em todas as amostras positivas eram afiliados ao grupo 16SrIII, subgrupo B. A prova de patogenicidade foi demonstrada pela transmissão experimental do fitoplasma presente em plantas de mandioca para plantas de vinca, por meio de Cuscuta subinclusa. Este é o primeiro relato de que um fitoplasma do grupo 16SrIII-B é o agente causal do superbrotamento em mandioca no Estado de São Paulo. / Cassava (Manihot esculenta) is one of the main cultures explored in the world and Brazil is the second largest producer. Cultivated in all Brazilian regions, cassava is important in the industry, food and both human and animal feed. In plantings installed on trial and commercial fields located in Piracicaba/SP, Bragança Paulista/SP, respectively, plants have been exhibited symptoms of general stunt, witches broom , and size reduction of leaves with deformation and chlorosis. Based on the symptoms, it has suspected the occurrence of phytoplasmas in diseased plants. Thus, this study has carried on detecting and identifying the presence of phytoplasmas and demonstrates that those prokaryotes are the disease agents. Samples from symptomatic and asymptomatic plants have been collected and total DNA extracted and used in nested PCR, conducted with primer pairs P1/Tint and R16F2n/16R2 in order to detect phytoplasmas. Amplification of genomic fragments of 1.2 Kb from the 16S rDNA has confirmed the presence of phytoplasmas in 76% of samples from Piracicaba and 95% of samples collected in Bragança Paulista. The molecular identification using specific primers has revealed that all the phytoplasmas found in diseased plants belonged to group 16SrIII. The RFLP analysis, using enzymatic digestion of PCR products with restriction enzymes AluI, KpnI, HpaI, HpaII, HhaI, HinfI, MseI and RsaI and phylogenetic analysis, based on the nucleotide sequence of 16S rDNA has revealed the detected phytoplasma in all positive samples have affiliated to the group 16SrIII, subgroup B. Pathogenicity proof has demonstrated by experimental transmission of the phytoplasma present in cassava plants to periwinkle, through the Cuscuta subinclusa. This is the first report that a phytoplasma group 16SrIII-B is the causal agent of cassava witches broom, in Sao Paulo State.

Os amarelos estão associados a fitoplasmas, procariotos pertencentes à classe Mollicutes que não possuem parede celular e habitam o floema de plantas. Os danos causados pelas doenças de etiologia fitoplasmática são relevantes e podem ocorrer em diversas espécies economicamente importantes. Em videira, pesquisas realizadas em várias partes do mundo têm relatado a presença das doenças do tipo "amarelo", porém, no Brasil, estas doenças ainda não foram relatadas para esta cultura. Em vinhedos comerciais localizados nos Estados de São Paulo e Paraná têm sido observadas plantas com sintomas semelhantes àqueles provocados por fitoplasmas em outros países. Estes sintomas têm sido caracterizados por amarelecimento e ou avermelhamento foliar, necrose do limbo e rachaduras nas nervuras principais. Com o objetivo de detectar e identificar molecularmente fitoplasmas associados a estes tipos de sintomas, folhas e ramos foram amostrados a partir de plantas sintomática e assintomáticas. A detecção foi conduzida com PCR duplo usando-se os iniciadores R16 mF1/mR2 ou P1/P7 na primeira reação e R16 F2n/R2 na segunda reação. A identificação foi realizada através de PCR duplo com iniciadores específicos e análises de RFLP com as enzimas de restrição AluI, RsaI, KpnI, MseI, HhaI, HpaII, HinfI e MboI. Em 23 plantas amostradas, fitoplasmas foram detectados em 10 delas, através da amplificação do 16S rDNA, visualizado em gel de agarose na forma de bandas de 1,2Kb. A identificação por PCR demonstrou que os fitoplasmas associados ao amarelo da videira pertenciam aos grupos 16SrI e 16SrIII. As análises dos perfis eletroforéticos obtidos com o uso da técnica de RFLP revelaram a presença de fitoplasmas afiliados ao subgrupo 16SrI-B. A constatação de fitoplasmas pertencentes a estes dois grupos nas plantas amostradas demonstraram a ocorrência da doença conhecida como amarelo da videira nos Estados de São Paulo e Paraná. As pesquisas desenvolvidas neste trabalho vêm contribuir para aumentar os conhecimentos sobre o papel e a diversidade dos fitoplasmas no agroecossistema brasileiro. / Yellows diseases are associated with phytoplasmas, wall-less prokaryotes, inhabitant of phloem vessels. Damage caused by these diseases are relevant for some important cultivated botanical species. Grapevine yellows diseases have been observed in several areas of the world, but in Brazil the presence of these diseases had not been reported yet. In vineyards located in São Paulo and Paraná States, plants exhibiting symptoms similar those observed in grapevines from other countries have been observed. The symptoms were characterized by yellowing or redding of leaf blade and ribs, leaf blade necrosis and main ribs fissures. In order to detect and identify phytoplasmas associated with those kind of symptoms, leaves and stems were sampled from symptomatic and asymptomatic plants. The phytoplasma detection was conducted with nested PCR using the primer pairs R16mF1/mR2 or P1/P7 for first reaction and 16 F2n/R2 for second reaction. The identification was carried out by nested PCR with group-specifc primer pairs and RFLP analyses with enzymes AluI, RsaI, KpnI, MseI, HhaI, HpaII, HinfI and MboI. From a total of 23 samples analysed, phytoplasmas were detected in 10 of them, through amplification of the 16S rDNA, visualized through a 1.2Kb band in agarose gel. The identification by PCR demonstrated that phytoplasmas associated with grapevine yellow belong to 16SrI and 16SrIII groups. Analyses of electrophoretic profiles revealed the presence of phytoplasmas affiliated to 16SrI-B subgroup. The presence of phytoplasmas belonging to these two groups in the sampled plants demonstrated the occurrence of yellow disease in grapevine in São Paulo and Paraná States. The investigation conducted in the present work contributed to the knowledgement of the role and the diversity of phytoplasmas in Brasilian ecosystem.

A couve-flor está entre as folhosas mais produzidas na região do Cinturão Verde de São Paulo. A planta apresenta alto valor nutricional para os consumidores e relevante importância econômica e social para os agricultores. Em campos comerciais, têm sido observadas plantas exibindo sintomas de enfezamento e deformação da inflorescência, além da necrose dos vasos condutores. A doença foi denominada de enfezamento e a sua incidência e severidade têm se tornado mais intensas nos últimos anos, afetando a produção e levando ao abandono do cultivo. O quadro sintomatológico levantou a suspeita de que a doença pudesse estar sendo causada por fitoplasmas. Desta forma, este trabalho teve como objetivos detectar e identificar os fitoplasmas associados às plantas doentes de couve-flor, demonstrar a sua patogenicidade, buscar possíveis insetos vetores do agente patogênico e analisar a distribuição espacial da doença no campo. Amostras de plantas coletadas na região do Cinturão Verde ou enviadas de outras localidades tiveram o DNA total extraído e submetido a reações de PCR. A amplificação de fragmentos genômicos de 1,2 kb evidenciaram a presença de fitoplasmas nos tecidos de 66% das plantas sintomáticas. A detecção de fitoplasmas em plantas assintomáticas revelou a ocorrência de infecção latente e que plantas sem sintomas aparentes podem ser portadoras do patógeno. O emprego de PCR com primers específicos, análises convencionais e virtuais de RFLP e análise filogenética permitiram a identificação de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrIII-J, 16SrXIII e 16SrXV-A, com predominância para a ocorrência do grupo 16SrIII. Secções histológicas feitas à mão da região vascular de plantas de couve-flor doentes observadas em microscópio de luz revelaram que a região do floema apresentava-se escurecido e com início de degeneração celular. Fitoplasmas do grupo 16SrXIII foram encontrados em cigarrinhas da espécie Balclutha hebe coletadas em campo cultivado com couve-flor. Estes insetos foram utilizados em experimentos de transmissão e foram capazes de inocular fitoplasmas em plantas sadias de couve-flor e vinca. A transmissão também ocorreu a partir de plantas doentes de couve-flor para plantas sadias de vinca, através do emprego da planta parasita cuscuta. Análise epidemiológica da doença foi feita em dez campos de cultivo de couve-flor, localizados no município de Sorocaba-SP. Análises do índice de dispersão, lei de Taylor modificada e áreas isopatas evidenciaram que plantas de couveflor com sintomas de enfezamento encontraram-se agregadas no campo, e que os focos da doença tinham início nos bordos da cultura. O presente trabalho demonstrou que o enfezamento da couve-flor está associado aos fitoplasmas, os quais podem estar sendo transmitidos por cigarrinhas, sendo que, em termos epidemiológicos, a doença tem padrão agregado de distribuição no campo. / Cauliflower is among the most produced vegetable in the region of the Green Belt of Sao Paulo State. It has high nutritional value and relevant social and economic importance for farmers. In commercial fields, it has been observed plants exhibiting symptoms of stunting, deformation of the inflorescence and conductive vessel necrosis. The disease was named cauliflower stunt and its incidence and severity have become more intense in the past years, the production is being affected and the field is abandoned by the growers. The symptomatology raised the suspect that the disease could be caused by phytoplasmas. Thus, this study aimed to detect and identify phytoplasmas associated to diseased cauliflowers, demonstrate its pathogenicity, look for possible insect vectors of the pathogen and analyse the spatial distributions of disease in the field. Plant samples collected in the region of the green belt or sent from other locations had the total DNA extracted and subjected to PCR reactions. Amplification of genomic fragments of 1.2 kb revealed the presence of phytoplasmas in 66% of the symptomatic plants. The detection of phytoplasmas in asymptomatic plants revealed the occurrence of latent infection and that plants without visible symptoms may be infected. The use of specific primers, conventional and virtual RFLP analysis and phylogenetic analysis allowed the identification of phytoplasmas affiliated to 16SrIII-J, 16SrXIII and 16SrXV-A groups, and predominantly the occurrence of 16SrIII group. Histological sections made by hand of the vascular region of symptomatic cauliflower were observed under light microscope and revealed that the phloem was darkened and with beginning of cellular degeneration. The 16SrXIII phytoplasma was found in Balclutha hebe from cauliflower field. These insects were used in experiments and were able to transmit phytoplasmas to healthy cauliflower and periwinkle. The transmission also occurred from diseased cauliflower to healthy periwinkle through the parasitic plant dodder. Epidemiological analysis of the disease was made in ten plots of cauliflower, located in Sorocaba, SP. Dispersion index, modified Taylors law and isopath areas analysis showed that cauliflower plants with symptoms of stunting were aggregated in field and initial foci were at the edge of the plot. This study demonstrated that cauliflower stunt is associated with phytoplasmas, that may be being transmitted by insects (Homoptera) and, in epidemiological terms, the diseased plants show aggregated pattern of distribution in the field.

O Huanglongbing (HLB) é uma das mais temidas doenças da citricultura mundial, associada a bactérias do gênero Candidatus Liberibacter, que foram detectadas no Brasil em 2004. Em 2008, detectou-se outra bactéria associada a sintomas de HLB no Estado de São Paulo, que foi caracterizada como sendo um fitoplasma do grupo 16 SrIX. Fitoplasmas são molicutes fitopatógenos restritos ao floema de plantas, disseminados por insetos vetores. O presente trabalho buscou identificar cigarrinhas potencialmente vetoras do fitoplasma associado ao HLB e plantas hospedeiras desses insetos, bem como desenvolver uma técnica de quantificação de DNA desse patógeno em insetos e plantas. Amostragens de cigarrinhas foram realizadas quinzenalmente por 12 meses em dois pomares de laranja com histórico de ocorrência do fitoplasma 16SrIX na região norte do Estado de São Paulo, usando-se armadilhas adesivas amarelas em duas alturas (0,3 e 1,5 m) da copa de árvores cítricas, e rede de varredura na vegetação espontânea. Dados faunísticos identificaram uma espécie de Agalliinae (Agallia albidula Uhler) e três de Deltocephalinae, [Balclutha hebe (Kirkaldy), Planicephalus flavicosta (Stål) e Scaphytopius (Convelinus) marginelineatus (Stål)], como os cicadelídeos (Hemiptera: Cicadellidae) mais abundantes e frequentes nas áreas estudadas. Essas espécies predominaram na amostragem com rede de varredura e na menor altura de coleta com armadilhas adesivas, indicando comportamento de alimentação em vegetação rasteira. Com observações visuais, verificou-se associação das espécies com certas plantas invasoras, e influência da composição florística da vegetação rasteira sobre a abundância das cigarrinhas. S. marginelineatus e P. flavicosta ocorreram com maior frequência em Sida rhombifolia L. e Althernantera tenella Colla, respectivamente, enquanto que A. albidula foi predominante em Conyza bonariensis (L.) Cronq., e B. hebe ocorreu exclusivamente em gramíneas, principalmente Panicum maximum Jacq.. Plantas invasoras amostradas nas áreas foram testadas para a presença do fitoplasma 16SrIX, porém sem resultados positivos. No entanto, amostras de campo da cigarrinha S. marginelineatus foram positivas por PCR e sequenciamento para o referido fitoplasma. Indivíduos de S. marginelineatus criados em laboratório e mantidos por um período de acesso à aquisição de 72 h em citros infectado com o fitoplasma 16SrIX, foram capazes de transmití-lo para citros, após 21 dias de latência, porém com baixa eficiência (0,5%). Por meio de PCR quantitativo desenvolvido para esse fitoplasma, verificou-se baixo título do patógeno tanto em S. marginelineatus, quanto em plantas cítricas infectadas, o que pode explicar, pelo menos em parte, a baixa eficiência de transmissão pelo inseto tendo citros como fonte. Isto sugere a existência de outros hospedeiros mais adequados como fontes de inóculo para aquisição do fitoplasma por S. marginelineatus ou outro vetor ainda desconhecido. / Huanglongbing (HLB) is a severe citrus disease associated to phloemlimited bacteria in the genus Candidatus Liberibacter, which were detected in Brazil in 2004. In 2008, another bacterium was found in association with HLB symptom in the São Paulo State, and characterized as a phytoplasma belonging to 16SrIX group. Phytoplasmas are vector-borne phytopathogenic mollicutes that inhabit plant sieve elements. The goals of this study were to identify potential leafhopper vectors of the HLB-associated phytoplasma and their host plants, as well as to establish a real-time PCR procedure for pathogen quantification in vectors and plants. Leafhoppers were sampled fortnightly for 12 months by yellow sticky cards placed at two heights (0.3 and 1.5 m) on the citrus tree canopy and by sweep net in the ground vegetation of two sweet orange groves with history of infection by the 16SrIX phytoplasma, in the northern region of São Paulo State. Faunistic analyses indicated 1 Agalliinae (Agallia albidula Uhler) and 3 Deltocephalinae [Balclutha hebe (Kirkaldy), Planicephalus flavicosta (Stål) e Scaphytopius (Convelinus) marginelineatus (Stål)] species that were the most abundant and frequent leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae) in the experimental areas. These species predominated in sweep net and in sticky traps catches at 0.3 m above soil, showing that they inhabit the ground vegetation. Visual observations indicated a strong association of leafhopper species with some weeds and the influence of weed species composition on leafhopper abundance in the ground vegetation. S. marginelineatus and P. flavicosta were more frequent on Sida rhombifolia L. and Althernantera tenella Colla, respectively, while A. albidula was observed more often on Conyza bonariensis (L.) Cronq., and B. hebe occurred solely on grasses, more abundantly on Panicum maximum Jacq. Fourteen weed species sampled in the area were PCR tested for infection by the 16SrIX phytoplasma, but none was found infected. Nevertheless, 3 out of 30 field-collected samples (10 adults per sample) of S. marginelineatus tested positive for this phytoplasma by PCR and sequencing. Healthy lab-reared adults of S. marginelineatus were able to transmit inefficiently (0,5%) the 16SrIX phytoplasma to healthy citrus after a 72-h acquisition access period on infected citrus plants followed by a 21-day latent period on S. rhombifolia plants. By using the qPCR method developed for this phytoplasma, a very low pathogen titer was found both in S. marginelineatus and in infected citrus plants, which may explain, at least partially, the low transmission efficiency by this vector using citrus as a source plant. It also suggests that existence of alternative hosts that might be more adequate as inoculum sources for phytoplasma acquisition and spread by S. marginelineatus or another vector yet to be discovered.

O Huanglongbing (HLB) é uma das mais temidas doenças da citricultura mundial, associada a bactérias do gênero Candidatus Liberibacter, que foram detectadas no Brasil em 2004. Em 2008, detectou-se outra bactéria associada a sintomas de HLB no Estado de São Paulo, que foi caracterizada como sendo um fitoplasma do grupo 16 SrIX. Fitoplasmas são molicutes fitopatógenos restritos ao floema de plantas, disseminados por insetos vetores. O presente trabalho buscou identificar cigarrinhas potencialmente vetoras do fitoplasma associado ao HLB e plantas hospedeiras desses insetos, bem como desenvolver uma técnica de quantificação de DNA desse patógeno em insetos e plantas. Amostragens de cigarrinhas foram realizadas quinzenalmente por 12 meses em dois pomares de laranja com histórico de ocorrência do fitoplasma 16SrIX na região norte do Estado de São Paulo, usando-se armadilhas adesivas amarelas em duas alturas (0,3 e 1,5 m) da copa de árvores cítricas, e rede de varredura na vegetação espontânea. Dados faunísticos identificaram uma espécie de Agalliinae (Agallia albidula Uhler) e três de Deltocephalinae, [Balclutha hebe (Kirkaldy), Planicephalus flavicosta (Stål) e Scaphytopius (Convelinus) marginelineatus (Stål)], como os cicadelídeos (Hemiptera: Cicadellidae) mais abundantes e frequentes nas áreas estudadas. Essas espécies predominaram na amostragem com rede de varredura e na menor altura de coleta com armadilhas adesivas, indicando comportamento de alimentação em vegetação rasteira. Com observações visuais, verificou-se associação das espécies com certas plantas invasoras, e influência da composição florística da vegetação rasteira sobre a abundância das cigarrinhas. S. marginelineatus e P. flavicosta ocorreram com maior frequência em Sida rhombifolia L. e Althernantera tenella Colla, respectivamente, enquanto que A. albidula foi predominante em Conyza bonariensis (L.) Cronq., e B. hebe ocorreu exclusivamente em gramíneas, principalmente Panicum maximum Jacq.. Plantas invasoras amostradas nas áreas foram testadas para a presença do fitoplasma 16SrIX, porém sem resultados positivos. No entanto, amostras de campo da cigarrinha S. marginelineatus foram positivas por PCR e sequenciamento para o referido fitoplasma. Indivíduos de S. marginelineatus criados em laboratório e mantidos por um período de acesso à aquisição de 72 h em citros infectado com o fitoplasma 16SrIX, foram capazes de transmití-lo para citros, após 21 dias de latência, porém com baixa eficiência (0,5%). Por meio de PCR quantitativo desenvolvido para esse fitoplasma, verificou-se baixo título do patógeno tanto em S. marginelineatus, quanto em plantas cítricas infectadas, o que pode explicar, pelo menos em parte, a baixa eficiência de transmissão pelo inseto tendo citros como fonte. Isto sugere a existência de outros hospedeiros mais adequados como fontes de inóculo para aquisição do fitoplasma por S. marginelineatus ou outro vetor ainda desconhecido. / Huanglongbing (HLB) is a severe citrus disease associated to phloemlimited bacteria in the genus Candidatus Liberibacter, which were detected in Brazil in 2004. In 2008, another bacterium was found in association with HLB symptom in the São Paulo State, and characterized as a phytoplasma belonging to 16SrIX group. Phytoplasmas are vector-borne phytopathogenic mollicutes that inhabit plant sieve elements. The goals of this study were to identify potential leafhopper vectors of the HLB-associated phytoplasma and their host plants, as well as to establish a real-time PCR procedure for pathogen quantification in vectors and plants. Leafhoppers were sampled fortnightly for 12 months by yellow sticky cards placed at two heights (0.3 and 1.5 m) on the citrus tree canopy and by sweep net in the ground vegetation of two sweet orange groves with history of infection by the 16SrIX phytoplasma, in the northern region of São Paulo State. Faunistic analyses indicated 1 Agalliinae (Agallia albidula Uhler) and 3 Deltocephalinae [Balclutha hebe (Kirkaldy), Planicephalus flavicosta (Stål) e Scaphytopius (Convelinus) marginelineatus (Stål)] species that were the most abundant and frequent leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae) in the experimental areas. These species predominated in sweep net and in sticky traps catches at 0.3 m above soil, showing that they inhabit the ground vegetation. Visual observations indicated a strong association of leafhopper species with some weeds and the influence of weed species composition on leafhopper abundance in the ground vegetation. S. marginelineatus and P. flavicosta were more frequent on Sida rhombifolia L. and Althernantera tenella Colla, respectively, while A. albidula was observed more often on Conyza bonariensis (L.) Cronq., and B. hebe occurred solely on grasses, more abundantly on Panicum maximum Jacq. Fourteen weed species sampled in the area were PCR tested for infection by the 16SrIX phytoplasma, but none was found infected. Nevertheless, 3 out of 30 field-collected samples (10 adults per sample) of S. marginelineatus tested positive for this phytoplasma by PCR and sequencing. Healthy lab-reared adults of S. marginelineatus were able to transmit inefficiently (0,5%) the 16SrIX phytoplasma to healthy citrus after a 72-h acquisition access period on infected citrus plants followed by a 21-day latent period on S. rhombifolia plants. By using the qPCR method developed for this phytoplasma, a very low pathogen titer was found both in S. marginelineatus and in infected citrus plants, which may explain, at least partially, the low transmission efficiency by this vector using citrus as a source plant. It also suggests that existence of alternative hosts that might be more adequate as inoculum sources for phytoplasma acquisition and spread by S. marginelineatus or another vector yet to be discovered.

A couve-flor está entre as folhosas mais produzidas na região do Cinturão Verde de São Paulo. A planta apresenta alto valor nutricional para os consumidores e relevante importância econômica e social para os agricultores. Em campos comerciais, têm sido observadas plantas exibindo sintomas de enfezamento e deformação da inflorescência, além da necrose dos vasos condutores. A doença foi denominada de enfezamento e a sua incidência e severidade têm se tornado mais intensas nos últimos anos, afetando a produção e levando ao abandono do cultivo. O quadro sintomatológico levantou a suspeita de que a doença pudesse estar sendo causada por fitoplasmas. Desta forma, este trabalho teve como objetivos detectar e identificar os fitoplasmas associados às plantas doentes de couve-flor, demonstrar a sua patogenicidade, buscar possíveis insetos vetores do agente patogênico e analisar a distribuição espacial da doença no campo. Amostras de plantas coletadas na região do Cinturão Verde ou enviadas de outras localidades tiveram o DNA total extraído e submetido a reações de PCR. A amplificação de fragmentos genômicos de 1,2 kb evidenciaram a presença de fitoplasmas nos tecidos de 66% das plantas sintomáticas. A detecção de fitoplasmas em plantas assintomáticas revelou a ocorrência de infecção latente e que plantas sem sintomas aparentes podem ser portadoras do patógeno. O emprego de PCR com primers específicos, análises convencionais e virtuais de RFLP e análise filogenética permitiram a identificação de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrIII-J, 16SrXIII e 16SrXV-A, com predominância para a ocorrência do grupo 16SrIII. Secções histológicas feitas à mão da região vascular de plantas de couve-flor doentes observadas em microscópio de luz revelaram que a região do floema apresentava-se escurecido e com início de degeneração celular. Fitoplasmas do grupo 16SrXIII foram encontrados em cigarrinhas da espécie Balclutha hebe coletadas em campo cultivado com couve-flor. Estes insetos foram utilizados em experimentos de transmissão e foram capazes de inocular fitoplasmas em plantas sadias de couve-flor e vinca. A transmissão também ocorreu a partir de plantas doentes de couve-flor para plantas sadias de vinca, através do emprego da planta parasita cuscuta. Análise epidemiológica da doença foi feita em dez campos de cultivo de couve-flor, localizados no município de Sorocaba-SP. Análises do índice de dispersão, lei de Taylor modificada e áreas isopatas evidenciaram que plantas de couveflor com sintomas de enfezamento encontraram-se agregadas no campo, e que os focos da doença tinham início nos bordos da cultura. O presente trabalho demonstrou que o enfezamento da couve-flor está associado aos fitoplasmas, os quais podem estar sendo transmitidos por cigarrinhas, sendo que, em termos epidemiológicos, a doença tem padrão agregado de distribuição no campo. / Cauliflower is among the most produced vegetable in the region of the Green Belt of Sao Paulo State. It has high nutritional value and relevant social and economic importance for farmers. In commercial fields, it has been observed plants exhibiting symptoms of stunting, deformation of the inflorescence and conductive vessel necrosis. The disease was named cauliflower stunt and its incidence and severity have become more intense in the past years, the production is being affected and the field is abandoned by the growers. The symptomatology raised the suspect that the disease could be caused by phytoplasmas. Thus, this study aimed to detect and identify phytoplasmas associated to diseased cauliflowers, demonstrate its pathogenicity, look for possible insect vectors of the pathogen and analyse the spatial distributions of disease in the field. Plant samples collected in the region of the green belt or sent from other locations had the total DNA extracted and subjected to PCR reactions. Amplification of genomic fragments of 1.2 kb revealed the presence of phytoplasmas in 66% of the symptomatic plants. The detection of phytoplasmas in asymptomatic plants revealed the occurrence of latent infection and that plants without visible symptoms may be infected. The use of specific primers, conventional and virtual RFLP analysis and phylogenetic analysis allowed the identification of phytoplasmas affiliated to 16SrIII-J, 16SrXIII and 16SrXV-A groups, and predominantly the occurrence of 16SrIII group. Histological sections made by hand of the vascular region of symptomatic cauliflower were observed under light microscope and revealed that the phloem was darkened and with beginning of cellular degeneration. The 16SrXIII phytoplasma was found in Balclutha hebe from cauliflower field. These insects were used in experiments and were able to transmit phytoplasmas to healthy cauliflower and periwinkle. The transmission also occurred from diseased cauliflower to healthy periwinkle through the parasitic plant dodder. Epidemiological analysis of the disease was made in ten plots of cauliflower, located in Sorocaba, SP. Dispersion index, modified Taylors law and isopath areas analysis showed that cauliflower plants with symptoms of stunting were aggregated in field and initial foci were at the edge of the plot. This study demonstrated that cauliflower stunt is associated with phytoplasmas, that may be being transmitted by insects (Homoptera) and, in epidemiological terms, the diseased plants show aggregated pattern of distribution in the field.