L'objectif est l'étude de la corrosion et de l'usure des pinces à couper les ligatures au cours des cycles de stérilisation en respectant les normes concernant l'inactivation du prion. Le matériel consiste en 3 lots de 25 pinces à couper les ligatures à mors rapportés provenant de 3 fournisseurs différents (Dentaurum®, ETM® et RMO®), du fil de ligature de diamètre .010 pouces, soit 0,25mm, en acier inoxydable, et enfin 5 produits de prédésinfection (Ampholysine Plus®, Elusept®, Dy Septi®, Prédolyse®, Dentasept Ultra®). Après caractérisation des pinces (étude de la composition, de la dureté, et de la structure) puis des produits de prédésinfection (étude de la composition et du pH) la susceptibilité à la corrosion de chaque partie de ces pinces a été analysée, avec réalisation de couplages galvaniques de ces différents éléments. Le comportement électrochimique des pinces dans leur globalité a été étudié par immersion dans les différents produits de prédésinfection, ainsi que l'usure et l'apparition de traces de corrosion, ceci au fur et à mesure des cycles de stérilisation. L'observation des pinces a mis en évidence de faibles modifications aussi bien en termes de corrosion que d'usure. Quelque soit la marque des pinces, ou le produit de prédésinfection, la résistance au cours des cycles de stérilisation est satisfaisante. / The aim of this work was to assess the effect of sterilization on ligature-cutting pliers, and more specifically the corrosion and wear of the plier's cutting edges, while respecting prion inactivation norms. Material included one set of 25 ligature-cutting pliers supplied by three major orthodontic distributors (Dentaurum®, ETM® and RMO®), .010 inch stainless steel orthodontic ligature wire and five disinfecting agents (Ampholysine Plus®, Elusept®, Dy Septi®, Prédolyse®, Dentasept Ultra®). Pliers (chemical composition, Vickers hardness, crystalline network) and disinfecting agents (chemical composition, pH) were initially characterized. Corrosion susceptibility of each single part of the different pliers was then analyzed, and galvanic coupling performed. Electrochemical behaviors of the whole pliers were studied by immersion in the various disinfecting agents. The pliers corrosion and wear were also observed with increasing number of sterilization cycles. Resistance to corrosion during sterilization cycles was found to be satisfactory, all pliers and disinfecting agents included.

Ce travail de thèse s'inscrit dans les efforts actuellement réalisés, pour améliorer l'efficacité des pinces optiques conventionnelles qui permettent de manipuler sans contact des objets de quelques dizaines de nanomètres à quelques dizaines de micromètres avec une extrême précision et trouvent de nombreuses applications en biophysique et sciences de colloïdes.L'objectif de cette thèse a été d'explorer une nouvelle approche pour la réalisation de Nanopinces Optiques. Elle s'appuie sur l'utilisation de cavités à cristaux photoniques à modes de Bloch lents. Ces cavités peuvent être efficacement et facilement excitées par un faisceau Gaussien à incidence normale. Contrairement aux pinces optiques conventionnelles, des objectifs à faibles ouvertures numériques peuvent être utilisés. Les performances attendues en termes de piégeage vont bien au-delà de limitations imposées par la limite de diffraction pour les pinces conventionnelles. Ce travail démontre expérimentalement l'efficacité de l'approche. Cette thèse comporte deux parties principales. Dans un premier temps, il a fallu monter un banc expérimental pour mener nos études. Nous avons construit un banc optique, interfacé les instruments, et développé des applications logicielles pour analyser les données. Deux éléments importants ont présidé à sa construction : - Le développement d'un système optique permettant d'exciter les nanostructures photoniques - la conception d'un système d'imagerie pour suivre les nanoparticules. La seconde partie de ce travail a porté sur la mise en évidence du piégeage optique à l'aide de nanostructure à base de cristaux photonique. Nous avons d'abord montré que même des cavités possédant des coefficients de qualités modérés (quelques centaines) permettait d'obtenir des pièges optiques dont l'efficacité est d'un ordre de grandeur supérieur à celui de pinces conventionnels. Fort de ce résultat, nous avons exploré un nouveau type de cavité à cristaux photoniques s'appuyant sur une approche originale : des structures bi-périodiques. Nous avons montré qu'à l'aide de cette approche des facteurs de qualités de l'ordre de plusieurs milliers étaient facilement atteignable. A l'aide de ces nouvelles structures, nous sommes arrivés aux résultats le plus important de ce travail : le piégeage de nanoparticules de 250nm de rayon avec une puissance optique incidente de l'ordre du milliwatt. Une analyse fine du mouvement de la nanoparticule, nous a permis de trouver la signature du mode de Bloch lent.

Dans ce travail, nous proposons un nouvel appareillage, destiné à aider à la détermination du mécanisme de certaines protéines. Cet outil, qui combine un appareil de pinces magnétiques, et un microscope de fluorescence en ondes évanescentes, a été conçu pour permettre à la fois la manipulation mécanique et l'observation de l'activité d'ADN translocases à l'échelle de la molécule unique. Nous présentons d'abord ici la conception, la réalisation et l'expérimentation de ce montage. Nous montrons que, d'une part, il se compare favorablement à ses composants séparés (pinces magnétiques et microscope de fluorescence), et que d'autre part leur réunion dans un appareil unique permet d'obtenir des résultats d'un type nouveau. Nous avons orienté l'étude des ADN translocases avec cet appareil sur l'exemple de deux protéines : le moteur FtsK de Escherichia coli et l'ARN Polymérase de T7. Nous détaillons dans cette étude les questions importantes encore en suspens concernant le mécanisme et présentons les expériences que nous avons envisagées pour y répondre. Nous relatons ensuite également la difficulté que nous avons rencontrée à obtenir des substrats protéiques adaptés aux expériences que nous avons envisagées, et les solutions que nous avons mises en oeuvre pour y remédier. Enn, nous analysons les résultats obtenus dans des expériences en volume ou en pinces magnétiques seules, qui ont permis de mettre en valeur de nouveaux comportements et de préparer la réalisation de nouvelles expériences sur notre montage combiné.

Les techniques de micromanipulation de molécules d’ADN uniques offrent des perspectives nouvelles pour lire et exploiter l’information contenue dans les génomes. Cela inclut le séquençage, la cartographie, le dénombrement de molécules et l'identification de modifications chimiques de l'ADN. Dans ce contexte, l'Équipe ABCDLab de l'ENS a développé une méthode utilisant l’ouverture et la fermeture mécanique répétée d’une molécule d’ADN en épingle à cheveux par pince magnétique. Cet outil permet de déterminer la position d'hybridation de petits oligonucléotides ainsi que celle d'anticorps révélant la position de marques épigénétiques. Un avantage de cette approche est de pouvoir travailler sur la même molécule pour d’une part identifier les marques épigénétiques et d'autre part réaliser une cartographie de sa position dans le génome. Mon travail de thèse consiste à développer un ensemble de méthodes bio-informatique visant à réaliser cette étape de cartographie. Le signal expérimental consiste en lecture des positions d’hybridation d’un, ou de plusieurs petits oligonucléotides sur la molécule étudiée. Cette mesure permet de construire une signature spécifique de la molécule que l’on peut rechercher dans le génome d’origine. Dans ce travail de thèse, j'ai réalisé des expériences avec sur pinces magnétiques pour acquérir des signatures moléculaires sur des molécules sélectionnées en aveugle dans E. coli. J'ai développé un logiciel capable de faire la recherche de ces signatures dans un génome et ensuite effectué l’ensemble du traitement des données pour tester le logiciel. Après plusieurs étapes d’optimisation, j’ai pu retrouver la position génomique des molécules étudiées, établissant ainsi une preuve de concept de cette stratégie de cartographie. Le travail a concerné l'ensemble de la chaîne de mesure : (1) le choix des sondes utilisées pour constituer la signature d’une molécule observée en optimisant un ensemble de critères liés aux conditions expérimentales et à la combinatoire des motifs de séquence. (2) la mise au point d’algorithmes de cartographie adaptés aux caractéristiques expérimentales des mesures. Enfin, j'ai testé ces algorithmes, à la fois sur des données simulées in silico et in vitro sur de l'ADN d'origine bactérienne. Je discuterais en quoi les performances des solutions de cartographie développées ici sont influencées par, d’une part les limites du montage expérimental actuel, et d’autre part les limites des approches bioinformatiques. Je présenterais les voies d’amélioration possibles de ces dernières. Mes travaux établissent qu'identifier des molécules d’ADN uniques par pinces magnétiques est possible dans le contexte d’application épigénétique et en génomique. / Single molecule micromanipulations technic offer new perspectives to read and unravel genome information. This includes sequencing, mapping, molecule counting and identification of DNA modifications. In this respect, ABCDLab team has developed a cutting edge method using repeated mechanical opening and closing of a DNA molecule with a hairpin shape using magnetic tweezers. This tool allows measuring along the DNA molecule the hybridization positions of oligonucleotides a few bases long and also to locate specific antibodies transiently bound to epigenetic markers. With this approach we can identify with the single molecule level epigenetics markers and localized them on the genome. My PhD work consisted of developing a set of bioinformatics methods to perform DNA mapping using magnetics tweezer signal consisting of hybridization positions along the studied molecule. This measurement may be viewed as a fingerprint of the molecule which can be searched on the reference genome. During my thesis, I have realized an experimental test using magnetic tweezers to acquire a set fingerprint data on a set of blinded selected molecules in the E. coli genome. I have developed a software performing a rapid search of these fingerprints inside the genome. Then I have performed the whole data treatment to check the software on the selected molecules. After several rounds of optimization, I have recovered the genetic position of the studied molecules, establishing a proof of concept of this cartography strategy. The work has addressed the whole measuring chain; (1) by choosing the oligonucleotides best adapted to obtain the molecular signature by optimizing the set of experimental constrains and combinatorial motifs of the sequence. (2) by tuning the cartography algorithm to adapt to the experimental measurement constrains. Finally, I have tested these algorithms, both on simulated data in silico and on experimental fingerprint in vitro. I shall discuss how the performances of these cartography solutions that have been developed here are impacted by the experimental limitations of the present technique, and by the bioinformatics limits. I shall present possible improvements to these methods. My studies constitute a proof of concept for genomic and epigenetic applications.

Chez les eucaryotes, l'ADN s'associe à des octamères d'histones pour former une structure nucléoprotéique dense appelée chromatine. Sous cette forme compacte, la chromatine agit comme une barrière topologique empêchant des facteurs de transcription par exemple, d'interagir avec l'ADN. Il va donc être essentiel de moduler la structure de la chromatine pour réguler l'accès à l'ADN et donc l'expression des gènes. L'une des stratégies adoptées, implique l'intervention de complexes multi-protéiques, appelés facteurs de remodelage de la chromatine, qui utilisent l'énergie issue de l'hydrolyse de l'ATP pour perturber le positionnement des octamères d'histones par rapport à l'ADN. Les mécanismes sous-jacents, éventuellement variés, sont encore méconnus.<br />Nous utilisons ici un dispositif de pinces magnétiques pour sonder l'action de différents facteurs de remodelage (RSC, yISW1a et CHD1) sur une molécule d'ADN nue. Nous montrons que ces complexes ont des comportements différents vis-à-vis de ce substrat : en l'absence d'ATP, yISW1a et CHD1 s'accrochent à l'ADN de manière coopérative et réduisent son extension bout-à-bout. En présence d'ATP, RSC est capable de former de larges boucles d'ADN, sous-enroulées, dont la taille dépend de la force et de la concentration en ATP. Nous souhaitons maintenant sonder l'action de ces facteurs sur un substrat nucléosomal. Dans ce but, nous avons mis au point un protocole efficace pour préparer un substrat mono-nucléosomal, manipulable en pinces magnétiques, et nous avons défini une procédure pour s'assurer de la présence du nucléosome. Ce substrat de choix va nous servir de base pour l'étude de l'action des facteurs de remodelage de la chromatine.

Dans cette thèse, nous avons étudié les aspects mécanique et thermodynamique de la recombinaison homologue, un processus crucial de réparation de l'ADN. Des travaux préliminaires d'observation de molécules d'ADN étirées lors de la recombinaison homologue ont mis à jour la complexité de ce processus et la difficulté de l'observer en fluorescence. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique appelée "pinces magnétiques sensibles au couple" nous permettant de maintenir une molécule unique d'ADN avec une force et un couple connus tout en mesurant son état de torsion avec une résolution de quelques degrés. Nous avons ainsi montré de manière directe que la polymérisation de la recombinase hRad51 a lieu par ajout de monomères chacun déroulant l'ADN de 65° en moyenne. Nous avons également été capables de mesurer le couple d'arrêt de la polymérisation. Une modélisation mécano-chimique nous a finalement permis d'évaluer le potentiel chimique de la polymérisation, en bon accord avec les données biochimiques existantes.

Dans ce manuscrit nous abordons les propriétés mécaniques de fibres de chromatine à l'échelle de la molécule unique. La chromatine est la structure nucléoprotéique qui contient le génome des cellules eucaryotes. À ce titre, cette fibre est soumise à de nombreuses contraintes mécaniques, telle la torsion, lors des processus de transcription, de réplication ou bien encore de réparation. Une revue des connaissances concernant la chromatine est présentée dans un premier chapitre. En particulier, nous introduisons l'influence d'une histone, appelée histone de liaison. Cette protéine permet à la fibre d'accéder à un niveau de compaction supérieur. Ensuite nous donnons les outils théoriques et expérimentaux d'étude du substrat chromatinien. Nous détaillons les propriétés topologiques de la chromatine. Le dispositif d'étude que nous avons utilisé, les pinces magnétiques, est décrit. Il permet d'exercer sur une fibre unique des contraintes mécaniques de tension et de torsion controlées. Enfin nous présentons les résultats obtenus sur des fibres de chromatine reconstituées en présence ou non de l'histone de liaison. À l'aide des pinces magnétiques, nous avons pu mettre en évidence le fait que l'histone de liaison ne modifie pas l'élasticité torsionnelle remarquable de la chromatine, même si la fibre est dans un état plus condensé. Sous forte déformation torsionnelle positive, le nucléosome subit une transition chirale qui permet de relâcher la contrainte topologique appliquée à la fibre. Nous avons pu montrer que ce changement conformationnel peut tout à fait se dérouler au sein des fibres contenant l'histone de liaison. Les implications biologiques de ces phénomènes sont examinées. La capacité propre à la chromatine à supporter la contrainte de torsion pourrait avoir un rôle dans le maintien de l'organisation chromatinienne lors du cycle cellulaire.

Nous présentons une série d'expériences sur des particules micrométriques de polystyrène de formes ellipsoïdales. Les rapports d'aspects (k) des particules sont variables, de 0.2 à 8 environ. Ces ellipsoïdes sont manipulés dans l'eau par faisceau laser modérément focalisé. On observe la lévitation et l'équilibre dynamique de chaque particule, dans le volume et au contact d'une interface, solide-liquide ou liquide-liquide. Dans une première partie, nous montrons que des particules de k modéré sont piégées radialement. Par contre, les ellipsoïdes allongés (k>3) ou aplatis (k<0.3) ne peuvent pas être immobilisés. Ces particules " dansent " autour du faisceau, dans un mouvement permanent associant translation et rotation. Les mouvements sont périodiques, ou irréguliers (chaotiques) selon les caractéristiques de la particule et du faisceau. Un modèle en 2d est proposé qui permet de comprendre l'origine des oscillations. La seconde partie est une application de la lévitation optique pour une étude de la transition mouillage total-mouillage partiel des particules à l'interface eau-air. Nous montrons que la dynamique de la transition ne dépend pratiquement pas de la forme de particule, et qu'elle est déterminée par le mécanisme d'accrochage-décrochage de la ligne de contact.

Les propriétés mécaniques des cellules adhérentes ont une importance capitale pour l'ensemble de leurs fonctions : division, migration, différenciation, etc. De plus, on sait désormais qu'elles sont très sensibles aux caractéristiques mécaniques de leur substrat, auquel elles sont ancrées par l'intermédiaire des intégrines. Ces récepteurs transmembranaires lient indirectement le cytosquelette d'actine intracellulaire aux protéines de la matrice extracellulaire.<br />Nous avons conçu un dispositif de pinces optiques contrôlées par une boucle de rétroaction, qui permet d'appliquer aux cellules une force locale constante, via des microbilles liées aux intégrines.<br />Nous pouvons ainsi mesurer la fonction de fluage de chaque cellule et en tirer une estimation de sa rigidité. Des observations simultanées en épifluorescence permettent par ailleurs d'évaluer les effets de l'application de la force sur la répartition d'actine locale.<br />Nous avons constaté que les cellules se rigidifient sous l'application prolongée d'une force, tout en gardant le même comportement rhéologique : une fonction de fluage en loi de puissance du temps, J(t) = At^(alpha), où A décroît aux temps longs. Cette rigidification est couplée à un recrutement d'actine au niveau des contacts et au sein du réseau cytsoquelettique (jusqu'à plusieurs µm du point d'application de la force). De plus, les dynamiques de ces deux phénomènes semblent fortement corrélées. Ce travail présente une évaluation de la dynamique de renforcement cellulaire sous contrainte, et ouvre des perspectives prometteuses vers l'élucidation des phénomènes intervenant dans la mécanotransduction.

Les microtechnologies sont de plus en plus présentes dans notre quotidien. Leur production est aujourd'hui restreinte à des procédés de masse par photolithographie. Leur fabrication est mal contrôlée et les défauts sont fréquents. Or l'étude individuelle de chaque microcomposant est particulièrement difficile et coûteuse. La microrobotique propose des solutions automatiques ou téléopérées afin de résoudre ce type de verrous technologiques. Pour des raisons économiques et de flexibilité, de nombreux utilisateurs se tournent vers un contrôle impliquant un opérateur. Plusieurs travaux ont proposé un retour des interactions lors de la tâche au moyen d'une interface utilisateur évoluée, dite haptique, afin d'augmenter l'immersion dans le micromonde et donc la dextérité de l'opérateur. Dans le cas de la micromanipulation, les facteurs d'échelle et les fortes dynamiques provoquent de nombreuses instabilités dans le couplage bilatéral recherché. Il a donc été nécessaire d'utiliser des contrôleurs évolués au détriment des sensations. Pour obtenir des sensations réelles et utiles, nous proposons de revisiter la problématique sous un autre angle. Plutôt que d'utiliser un micromanipulateur existant, nous avons conçu un système dédié au retour d'effort. Nous posons les prémices d'un nouveau concept de micromanipulation haptique flexible, fiable et utile grâce à des choix et des optimisations de méthodes et de technologies : une méthode dédiée de préhension sans contact : les pinces optiques, une maximisation de l'espace de travail de ses actionneurs et capteurs, l'amélioration des performances en terme de dynamique et de bande passante, le développement de nouveau capteur de force robuste à l'environnement, basé sur la vision. Ce travail multidisciplinaire s'appuie sur la réalisation de trois installations expérimentales et sur des collaborations entre des équipes de micromanipulation, d'haptique et de vision.