After an intense development of optical tweezers as a biophysical tool during the last decades, quantitative experiments in living cells have not found in this technique its best ally, due, in part, to the lack of a reliable method to measure forces in complex environments. The attempts to overcome this problem either require complicated in situ calibrations, which make their use impossible in the study of dynamic processes, or they are inaccurate. Using a different approach, Steven Smith at Carlos Bustamante’s lab at the University of Berkeley developed a method based on the direct measurement of the momentum change of the trapping beam. However, its diffusion has been modest mainly because it requires a counter-propagating optical trapping system, which is difficult to implement and combine with other techniques. Although it has not been used for this purpose yet, it seems a more suitable method for in vivo experiments since the measurement depends only on some properties of the sensor apparatus but not on the experiment itself. On the other hand, the use of holographic optical tweezers in molecular biology experiments involving force and position measurements is still far from established. The existence of different effects associated to the use of spatial light modulators to create the optical traps has restricted their use. In this thesis, I present the work that I carried out in the Optical Trapping Lab – Grup de Biofotònica at the University of Barcelona related to these two subjects. During these years, I have focused on the implementation of the force detection method based on the conservation of the light momentum in single-beam optical traps, and on the analysis of several aspects of holographic tweezers oriented to their use in quantitative experiments.

Dans cette thèse, les propriétés rhéologiques du sang sont étudiées suivant deux approches differentes. Les propriétés de l'écoulement du plasma sont analysées selon trois modes différents : sous cisaillement, en extension et en constriction. Jusqu'à présent, le plasma était considéré comme un fluide newtonien, et le comportement complexe du sang était simplement attribué à la présence des globules rouges. Les expériences menées ont montré un comportement visco-élastique du plasma, que doit désomais être pris en compte dans les études futures. La deuxième axe traite des globules rouges. Leur assemblage en agrégats rectilignes est à l'origine du comportement rhéofluidifiant, mais les causes de la formation des agrégats restent encore vagues. L'énergie d'interaction entre deux cellules et la distribution des tailles des clusters dans des canaux microfluidiques ont été mesurées en présence de dextran et de fibrinogène. Comme les agrégats sont normalement cassés à des taux de cisaillement élevés, on a cru qu'ils ne jouaient pas de rôle dans l'écoulement du sang. Mais le fait que le nombre de clusters augmente à des concentrations physiologiques de fibrinogène, même pour des taux de cisaillement correspondant à ceux du système microvasculaire, il est clair que l'agrégation ne peut pas être négligée dans la description de l'écoulement du sang en le réseau capillaire.

Les structures G-quadruplexes (G4) sont considérées comme des obstacles qui s’opposent à la progression du réplisome. Les séquences capables de former des G4 dans le génome humain se trouvent dans les régions d’ADN double brin au niveau des oncogènes et des proto-oncongènes et sur l’extrémité simple brin des télomères. La plupart des études biochimiques et biophysiques ont caractérisé les propriétés thermodynamiques des G4 en utilisant par exemple la température de fusion Tm pour déduire la thermodynamique de la formation/résolution du G4. Cependant, les expériences en solution donnent seulement une information indirecte concernant la dynamique du G4. Dans ce travail de thèse en molécule unique utilisant la technique des pinces magnétiques, nous avons pu caractériser la cinétique de la formation et résolution des G4s ainsi que la stabilité d’une structure G4 insérée dans une région d’ADN double brin : une situation qui ressemble aux G4 dans les promoteurs de gènes, où la séquence complémentaire est en compétition avec la formation de la structure de G4. Nous avons trouvé que le G4 télomérique a une très courte durée de vie (~20 s) et donc ce G4 se résout sans qu’une hélicase soit nécessaire. Au contraire, ce n’est pas le cas pour le G4 du c-MYC qui est très stable (~2h). Nous avons observé en temps réel la collision entre les hélicases et les polymérases et le G4 du c-MYC. Nous avons trouvé que l’hélicase Pif1 ouvre l’ADN puis résout le G4 après avoir effectué une pause et reprend l’ouverture de l’ADN, alors que l’hélicase RecQ et l’hélicase réplicative du bactériophage T4 ne peuvent pas le résoudre, mais peuvent le sauter. Nous avons aussi trouvé que la RPA ne peut pas résoudre le G4 du c-MYC. D’autre part, nous avons observé que la polyémrase du virus T4, la gp43, ainsi que la polymérase de T7, et la polymérase ε de la levure peuvent répliquer le G4 du c-MYC qui de façon étonnante ne constitue pas une barrière infranchissable. / G-quadruplex (G4) structures are considered as the major impediments for the replisome progression. The putative G4 forming sequences in the human genome are mostly located in the double-stranded DNA regions of oncogenes and proto-oncogenes and on the single-stranded overhangs of telomeres. Most of the biochemical and biophysical studies have characterized the G4 thermodynamics properties using melting temperature Tm as a proxy to infer thermodynamics of G4 folding/unfolding energetic. However, these thermodynamics properties give only indirect information about G4 dynamics. In this work, using single molecule magnetic tweezers technique, we first characterize the kinetics of folding and unfolding and thus the stability of a single G4 inserted in a dsDNA: a situation that mimics the G4s in promoters, where the complementary sequence competes with the G-rich structure. We find that the lifetime of telomeric G4 is short (~20 s) and thus that this G4 unfolds without the need of a helicase. This is not the case for the very stable c-MYC G4 (~2 hr). We observe in real time how helicases or polymerases behave as they collide with the c-MYC G4 on their track. We find that the Pif1 helicase unwinds dsDNA, resolves this G4 after pausing and resume unwinding, while RecQ helicase and the bacteriophage T4 replicative helicase do not resolve the G4 but may jump it. We also find that RPA does not unfold the c-MYC G4. Besides, we find that T4 bacteriophage gp43 polymerase, T7 polymerase and Yeast Pol ε can replicate the G4 which surprisingly does not appear as a major roadblock for them.

Nous présentons une série d’expériences sur des particules micrométriques de polystyrène de formes ellipsoïdales. Les rapports d’aspects (k) des particules sont variables, de 0.2 à 8 environ. Ces ellipsoïdes sont manipulés dans l’eau par faisceau laser modérément focalisé. On observe la lévitation et l’équilibre dynamique de chaque particule, dans le volume et au contact d’une interface, solide-liquide ou liquide-liquide. Dans une première partie, nous montrons que des particules de k modéré sont piégées radialement. Par contre, les ellipsoïdes allongés (k>3) ou aplatis (k<0.3) ne peuvent pas être immobilisés. Ces particules « dansent » autour du faisceau, dans un mouvement permanent associant translation et rotation. Les mouvements sont périodiques, ou irréguliers (chaotiques) selon les caractéristiques de la particule et du faisceau. Un modèle en 2d est proposé qui permet de comprendre l’origine des oscillations. La seconde partie est une application de la lévitation optique pour une étude de la transition mouillage total-mouillage partiel des particules à l’interface eau-air. Nous montrons que la dynamique de la transition ne dépend pratiquement pas de la forme de particule, et qu’elle est déterminée par le mécanisme d’accrochage-décrochage de la ligne de contact. / We report experiments on ellipsoidal micrometre-sized polystyrene particles. The particle aspect ratio (k) varies between about 0.2 and 8. These particles are manipulated in water by means of a moderately focused laser beam. We observe the levitation and the dynamical state of each particle in the laser beam, in bulk water or in contact to an interface (water-glass, water-air, water-oil). In the first part, we show that moderate-k particles are radially trapped with their long axis lying parallel to the beam. Conversely, elongated (k>3) or flattened (k<0.3) ellipsoids never come to rest, and permanently “dance” around the beam, through coupled translation-rotation motions. The dynamics are periodic or irregular (akin to chaos) depending on the particle type and beam characteristics. We propose a 2d model that indeed predicts the bifurcation between static and oscillating states. In the second part, we apply optical levitation to study the transition from total to partial wetting of the particles at the water-air interface. We show that the dynamics of the transition is about independent of particle shape, and mainly governed by the pinning-depinning mechanism of the contact line.

La membrane plasmique constitue la première entité séparant la cellule de son environnement. A ce rôle de barrière s'ajoute celui de réguler la. Par conséquent, la membrane plasmique est une zone privilégiée pour le passage d'information. Cependant, son étude reste difficile, ne serait-ce que par l'extraordinaire complexité d'organisation de cet assemblage supramoléculaire.Mon projet de thèse vise à développer de nouvelles approches expérimentales pour explorer plus spécifiquement l'organisation et le rôle de la membrane plasmique d'une cellule dans les mécanismes de transduction de l'information. Deux axes ont été privilégiés : le premier, concerne la description de la dynamique d'organisation de la membrane ; le deuxième concerne l'inter-connectivité et la transmission du signal d'une cellule avec d'autres partenaires.Ce manuscrit se compose de plusieurs parties. Le premier chapitre introduira succinctement les questions biologiques. Dans le second chapitre, je présenterai des méthodes utilisées pour l'étude de la membrane. J'y présenterai aussi une série d'observation que j'ai réalisée sur la diffusion de l'EGFR. Le troisième chapitre sera consacré à la technique de corrélation croisée de fluorescence depuis le montage jusqu'à l'étude du modèle EGFR. Dans la quatrième partie, nous verrons comment les collaborations à l'interface biophysique ont permis des développements innovants sur un système de pinces optiques holographiques. J'y présenterai les applications de ce système à différent modèles d'intérêt biologique. Enfin, je conclurai ce document par une brève discussion autour des résultats obtenus aussi bien d'un point de vue méthodologique que biologique. / The plasma membrane separates the cell from its environment. But it is more than a barrier any cell has to communicate with the outside world. Therefore the plasma membrane plays a prime role in transferring and exchanging information. However, the biological study of the plasma membrane remains difficult due to the extraordinary complexity of it organization.My thesis is a part of an effort to develop new experimental approaches to explore more specifically the organization and the role of the plasma membrane in the signal transduction mechanisms. Two major aspects were followed: the first one concerns the description of the dynamics of membrane organization and of molecular interactions, the second concerns the inter-connectivity and signal transduction between a cell and other biological partners.This manuscript is composed of several parts. The first chapter briefly introduces the biological questions that I tried to answer. In the second chapter, I present the methods commonly used to study the membrane with a dynamic perspective. Additionally, I include a series of observations that I made on the EGF receptor diffusion. The third chapter is devoted to the fluorescence cross-correlation technique to study the assembly of the EGFR. In the fourth part, I demonstrate how scientific collaborations at the interface between biology and physics have led to the development of innovative solutions on a holographic optical tweezers system. I present applications of this system in different biological models. Finally, I conclude this thesis with a brief discussion about my technological and biological results.

Lorsque l’on place des atomes suffisamment proches les uns des autres, l’interaction dipôle-dipôle résonante entre les atomes modifie leurs propriétés. Les atomes se comportent alors de manière collective. Ces effets collectifs se produisent lorsque les distances interparticulaires sont de l’ordre de l/(2Pi), où l est la longueur d’onde de la transition atomique. La densité atomique est alors de l’ordre de 10^14 at/cm^3. Afin de créer des échantillons d’atomes froids présentant des densités aussi élevées, nous avons mis en place plusieurs méthodes de chargement de nos pinces optiques de taille micrométrique. L’une d’elles utilise un processus d’évaporation forcée qui amène les atomes proches de la dégénérescence quantique. En utilisant des nuages denses contenant quelques centaines d’atomes à des densités spatiales élevées, et en étudiant les modifications de la diffusion de la lumière qui en résultent, nous avons pu mettre en évidence des effets collectifs entre les atomes. Nous avons par ailleurs mesuré le retard de Wigner associé à la diffusion élastique de la lumière par un atome unique de rubidium. Nous avons mesuré un retard proche de la valeur théorique, c’est-à-dire deux fois la durée de vie de la transition atomique (52 ns). / When several atoms are placed close to each other, the resonant dipole-dipole interactionbetween atoms modifies the atomic properties and atoms behave collectively. These collective effects occur for interatomic distances on the order of l/(2Pi) where l is the wavelength of the atomic transition. The atomic density is then on the order of 10^14 at/cm^3. To create such cold atomic samples, we load optical tweezers with a microscopic size according to several loading schemes. One of them uses forced evaporative cooling and brings the atoms close to quantum degeneracy. We have used dense clouds containing a few hundred atoms with a high spatial density to demonstrate collective effects between the atoms. In particular, we have studied how these effects modify the scattering of light by the cloud. Besides, we have also measured for the first time the time-delay associated to the elastic scattering of light by a single rubidium atom, the so-called Wigner delay. We have shown that this delay is close to the theoretical prediction of twice the lifetime of the atomic transition (52 ns).

Depuis les premiers travaux d’Ashkin sur les pinces optiques classiques, beaucoup d’efforts ont été fait pour piéger des nano particules. Néanmoins, elles peuvent difficilement piéger des particules inférieures à 200 nm à cause des limites imposées par la diffraction. Cette limite peut être dépassée grâce aux forces optiques de gradient provenant du champ évanescent généré et amplifié par des nano cavités photoniques. Cependant, cette approche est confrontée à deux verrous importants pour les applications : La surface de piégeage est très faible ce qui rend peu probable la capture d’une nanoparticule animée d’un mouvement brownien et pour les pinces « ultimes » de type nanoantenne où le mode est confiné dans des régions nanométriques, leur excitation en espace libre n’est pas très efficace. L’objectif de ce travail vise à lever ces deux verrous. Pour augmenter la surface de piégeage, nous présenterons d’abord une approche utilisant le mode de Bloch d’une cavité étendue à double période dans un cristal photonique fabriqué sur SOI. Nous montrerons que cette approche permet le piégeage de particules de 200, 100 et 75 nm sur une surface étendue de 5x5 µm² en utilisant un faisceau laser d’excitation en espace libre. Dans un deuxième temps, nous nous intéresserons à l’excitation optique en espace libre de structures nanométriques. Nous présenterons une structure hybride nano antenne – cristal photonique, où le cristal photonique joue le rôle de réservoir à photons pour la nano antenne. Cela permet ainsi un effet « entonnoir à photon» où la lumière issu d’un faisceau large (5µm) est concentrée dans la nanoantenne. Nous démontrerons la pertinence de cette approche par le piégeage particules de 100 nm. / Since the first work on optical tweezers by Ashkin, a lot of efforts have been made to trap nanoparticles. However, optical tweezers are diffraction limited and can hardly trap particles below 200 nm. This limit can be overstepped using the optical gradient forces of an evanescent field generated and amplified by a photonic nano cavity. Nonetheless, this approach faces two major issues for applications: the trapping section is very small, making the capture of a Brownian motion animated particle very unlikely, and for the “ultimate” nano antennas with nanometric optical modes, their excitation from free space is not effective. The goal of this work is to overcome these two difficulties. To increase the trapping surface, we will first present a device using slow Bloch modes within a double period extended cavity designed in a photonic crystal made out of SOI. We will show that this approach allow for the trapping of 200, 100 and 75 nm particles on an extended surface of 5x5 µm² using a free space laser beam excitation. Secondly, we will investigate the free space excitation of nanometric structures. A photonic crystal – nano antenna mixed structure will be presented, where the photonic crystal is used as a photon pool for the nano antenna. This lead to a funnel effect where the light coming from a large free space laser beam (5µm wide) is focused into the nano antenna. The trapping of 100 nm particles will demonstrate the relevance of this approach.

L'objectif de cette thèse est de caractériser l'influence de facteurs protéiques sur la dynamique du cytosquelette cellulaire au moyen d'outils de micromanipulation contrôlés. Nous avons déterminé la réponse microrhéologique du réseau d'actine pour des cellules uniques. Nous avons appliqué grâce à un système de pinces optiques des forces statiques et oscillantes à des microbilles de verres attachées de manière spécifique au réseau d'actine de divers types cellulaires. Dans le cas statique nous avons mesuré des modules élastiques dans la gamme 29

Le globule rouge a une grande faculté à se déformer, notamment lorsqu?il traverse des capillaires dont le diamètre peut être inférieur au sien. Cette résistance au cisaillement est attribuée à sa membrane particulière. Celle-ci est constituée d?une bicouche lipidique sur laquelle est fixé un réseau bidimensionnelle de protéines : le squelette. Ce squelette est principalement constitué de longs filaments de spectrine (~200 nm) reliés entre eux et à la bicouche lipidique par des complexes de jonction. Dans la première partie de ce travail, nous avons mesuré le module de cisaillement µ de la membrane (bicouche lipidique + squelette) à l?aide de deux pinces optiques. Deux billes de silice attachées à la membrane sont utilisées pour lui appliquer des forces connues. Le module de cisaillement est déduit de la déformation mesurée en fonction de la contrainte appliquée. Nous avons trouvé µ = 2.5 +/- 0.4 µN/m, valeur du même ordre de grandeur, mais inférieure, à celles obtenues par d?autres techniques. Dans une seconde partie, nous mesurons les modules d?extension KC et de cisaillement µC du squelette seul. Un globule rouge avec trois billes un piégé, et une solution de détergent est injectée afin de dissoudre la bicouche lipidique. Le squelette reste attaché aux billes et il est ensuite déformé en déplaçant les billes les unes par rapport aux autres. Les modules élastiques sont déduits de la mesure des contraintes et des déformations. Nous trouvons KC = 4.8 +/- 2.7 µN/m et µC = 2.4 +/- 0.7 µN/m dans une solution d?osmolarité égale à 25 mOsm/kg. De ces mesures, nous pouvons déduire la longueur de persistance de la spectrine, ici 5 nm. Ces valeurs sont en bon accord avec des prédictions théoriques et numériques réalisées sur des réseaux bidimensionnels de ressorts. L?influence de la force ionique et du vieillissement du squelette après l?extraction sont étudiés dans la dernière partie.

Ce travail expérimental porte sur l'étude du comportement colloïdale aux interfaces de nématiques. Dans un premier temps, nous détaillons la séquence de phase observée par des billes de silice à ancrage homéotrope fort piégées à l'interface air-nématique. En fonction de leur densité ainsi que l'épaisseur du film, les colloïdes forment différentes structures spontanément. A l'aide des pinces optiques, nous mesurons le potentiel de paire et nous discutons les rôles respectifs des forces capillaires et élastiques. Dans un second temps, nous étudions le comportement des colloïdes sur des interfaces nématiques plus complexes. En contrôlant la géométrie des interfaces et la densité des particules piégées, à l'aide de la technique de microfluidique, nous étudions le comportement colloïdale à la surface des coques nématiques fines. La compétition entre les conditions d'ancrage aux interfaces, l'élasticité du CL, les défauts et les densités des fluides est à l'origine de la formation de nouvelles configurations topologiques. Dans cette partie nous discutons le rôle des colloïdes dans la formation de ces structures.