Made available in DSpace on 2015-06-17T19:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-11. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:48:23Z : No. of bitstreams: 1 000832029.pdf: 1345027 bytes, checksum: 6207079d0ab94cde1a6d3a7db40846f6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Paracoccidiodomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, de alta prevalência no Brasil, que tem como agente etiológico os fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides, P. brasiliensis e P. lutzii. No processo de infecção as adesinas, substâncias sintetizadas por estes fungos que se ligam a matriz extracelular, são importantes fatores de virulência para o estabelecimento da infecção. A proteína de 30kDa, pertencente a família de proteínas 14-3-3, se destaca no processo adesivo deste fungo. As proteínas 14-3-3 são uma família de proteínas presentes em todas as células eucariotas e possuem múltiplas funções. Em P. brasiliensis, a proteína 14-3-3Pb, liga-se a laminina, principal componente da matriz extracelular das células hospedeiras, e durante a infecção sua expressão é aumentada. Com o intuito de compreender melhor a função desta proteína o objetivo deste estudo foi realizar a análise funcional da 14-3-3Pb através da obtenção de um homólogo funcional em S. cerevisiae e análise do anticorpo monoclonal anti-14-3-3Pb. S. cerevisiae foi escolhida como modelo de estudo por ser uma levedura amplamente utilizada na pesquisa genética, ao contrário de P. brasiliensis, e por possuir duas isoformas de 14-3-3, Bmh1p e Bmh2p, com alta identidade com 14-3-3Pb Para obtenção do homólogo funcional, foi realizada a transformação do vetor pYES-14-3-3Pb em S. cerevisiae. A partir da obtenção dos transformantes a avaliação da complementação foi realizada e foi observado uma complementação parcial das proteínas Bmh1p e Bmh2p por 14-3-3Pb. Ainda foram realizados teste de sensibilidade aos antifúngicos e a derivados semissintéticos do ácido gálico, onde foi possível observar um aumento da sensibilidade das linhagens com nocaute para os genes BMH1 e BMH2, S. cerevisiae Δbmh1 e Δbmh2, quando comparado à linhagem selvagem. A análise do anticorpo monoclonal foi realizada através de ensaio... / Paracoccidioidomycosis (PCM) a systemic mycosis endemic in Latin America, with high prevalence in Brazil, has as etiological agent dimorphic fungi Paracoccidioides spp., P. brasiliensis e P. lutzii. During the infection process the adhesins, substances synthetized by fungi that interacts with host's extracellular matrix (ECM), are important virulence factors for the establishment of infection. A 30kDa protein that belongs to 14-3-3 proteins family stands out in the adhesion process of this fungus. The 14-3-3 proteins are present in all eukaryotic cells and play multiple functions. In P. brasiliensis, the 14-3-3Pb protein binds to lamin, the major component of ECM from host cells, and during the infection the expression is increased. In order to have a better understanding of 14-3-3Pb functions the aim of this study is to perform a functional analysis of this protein through achieving a functional homologous in S. cerevisiae and to analyze the monoclonal antibody anti-14-3-3Pb during infection. S. cerevisiae was chosen as model because it's widely use in genetic research, unlike P. brasiliensis, and has two isoforms of 14-3-3 proteins, Bmh1p and Bmh2p, with high identity with 14-3-3Pb. The functional homologous were obtained by yeast transformation of pYES-14-3-3Pb vector. Complementation assay was performed with obtained transformants, and it was observed that 14-3-3Pb partially complements Bmh1p and Bmh2p, with higher complementation of Bmh2p. Also susceptibility assays were performed with antifungal drugs and semi-synthetic compounds derived from gallic acid where it was observed that S. cerevisiae wild type was less sensitive to antifungals than the knockout strains, S. cerevisiae Δbmh1 and Δbmh2. Monoclonal antibody anti14-3-3Pb was evaluated alone and in association with substances with antifungal activities through inhibition adhesion assay, where it was observed that the anti-14-3-3Pb alone is able to inhibit P. brasiliensis ...

Orientadores: Sônia Maria Alves Bueno, Síndélia Freitas Azzoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-24T06:02:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Radke_VanessaSoraiaCortezdeOliveira_M.pdf: 2121610 bytes, checksum: edb8e8ef74060659b8f0672335ee64c1 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Emergindo como alvo de estudos para fins terapêuticos, acompanhado de novas tecnologias a fim de explorar todo seu potencial e especificidade, o DNA plasmidial (pDNA) tem demonstrando um importante papel na nova geração de vacinas e terapia gênica como um vetor não viral. No entanto, há grandes desafios para atender altas demandas de preparações de vetores plasmidiais (pDNA), seguindo rigorosos padrões das agências reguladoras internacionais. As dificuldades sobretudo, são encontradas no downstream processing, com alto custo e operações não apropriadas para uso em larga escala e nos longos e caros kits comerciais, este último utilizado para ensaios pré-clínicos. Almejando, explorar as características do DNA plasmidial e tornar cada vez mais factível sua produção e purificação, esta pesquisa teve como foco o desenvolvimento de um protocolo para obtenção de pDNA para aplicação em ensaios in vitro com possível escalonamento para larga escala. Para tanto, buscou-se adsorventes seletivos para a etapa de pré-purificação de pDNA diretamente do lisado celular. O trabalho foi baseado em géis de agarose (S) com ligantes de natureza hidrofóbica e tiofílica, visando testar o comportamento do pDNA em cromatografia negativa e cromatografia tiofílica aromática. Os ligantes eleitos para investigação foram os aminoácidos de natureza hidrofóbica, fenilalanina (Phe) e D-triptofano (T), ambos imobilizados covalentemente em Sepharose 6B®, e um tiofílico, a mercaptopiridina. O tampão de adsorção, e os sais adicionados, foram escolhidos com o objetivo de favorecer um ambiente hidrofóbico, de tal forma que a interação das biomoléculas presentes no lisado celular com os ligantes fosse favorecida. Os sais utilizados para tal foram citrato de sódio 1,5 mol/L, fosfato de potássio 2,0 mol/L e sulfato de amônio 1,5 mol/L. Os resultados obtidos com os sistemas fenilalanina-agarose e D-triptofano-agarose demonstraram seu potencial na retenção de moléculas de RNA e na remoção de grande parte de endotoxinas e proteínas. O sistema adsortivo mercaptopiridina-agarose, permitiu uma urificação bastante satisfatória, com remoção total de endotoxinas e relevante recuperação de pDNA. / Abstract: Coming up as a target for therapeutic studies, together with new technologies in order to explore its potential use and specificity, plasmid DNA (pDNA) has demonstrated an important role in new generation of vaccines and gene therapy as a non-viral vector. However, there are huge challenges to meet high demands of plasmid vectors (pDNA) preparation, following strict standards of international regulatory agencies. Its difficulties are found in downstream processing, with high cost operations which are not suitable for large-scale use and in the long expensive commercial kits, the last one used for preclinical trials. Aiming then, to explore DNA plasmid characteristics and making its production and purification even more feasible, this research focused on a development of a protocol to obtain pDNA for assays in vitro applications with a possible staggering to large scale. Therefore selective adsorvents were sought for pre-step purification of pDNA directly from cell lysate. The work was based on agarose gels (S) with ligands of hydrophobic and thiophilic nature aiming to test pDNA actions in negative chromatography and thiophilic aromatic chromatography. The ligands chosen for investigation were the amino acids of hydrophobic nature, phenylalanine (Phe) and D-tryptophan (T), both covalently immobilized on Sepharose 6B ®, and a thiophilic one, mercaptopyridine. The adsorption caps and as well as its concentration, experienced in this work were chosen in order to support a hydrophobic environment, so that the interaction of the biomolecules in the lysate cell would be easier with the ligands. The salts used for this interaction were sodium citrate 1.5 mol/L, potassium phosphate 2.0 mol/L and ammonium sulfate 1.5 mol/L. The results achieved with the systems phenylalanine- agarose and D-tryptophan-agarose have demonstrated its potential in the retention of the RNA molecules and the removal of most part of endotoxin, and proteins. The mercaptopyridine-agarose adsorptive system enabled a satisfactory purification, with a total removal of endotoxins and pDNA relevant recovery. / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-19Bitstream added on 2014-06-13T19:43:15Z : No. of bitstreams: 1 tansini_a_dr_arafcf.pdf: 666076 bytes, checksum: 4a336ba4a2f0d99a602646cc539929be (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A infecção por Y. pseudotuberculosis é uma causa de doenças intestinais e extraintestinais. A resolução da infecção está relacionada à ativação de células Th1, entretanto, pouco se conhece sobre a influência de outras subpopulações de linfócitos T, como Th17 e Treg, na regulação dessa infecção. Células dendríticas são capazes de orientar a resposta imune adaptativa através da produção de citocinas e apresentação de antígenos às células T, tornando essas células essenciais na ativação e diferenciação de linfócitos T. Desse modo, o presente trabalho avaliou o papel de distintas subpopulações de linfócitos T e a influência de células dendríticas no desenvolvimento da resposta imune contra a infecção por Y. pseudotuberculosis. Para tanto, foram avaliadas as subpopulações de linfócitos T CD4+, CD8+ e Foxp3+, presentes durante a infecção por Y. pseudotuberculosis e amostras bacterianas mutantes para fatores de virulência Yops, bem como a expressão de citocinas intracelulares (IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α e TGF-β) por estas células. O papel de linfócitos Treg e Th17 no controle da bactéria foi analisado por meio de ensaio de depleção de células CD25+ e neutralização de IL-17. Além disso, a influência de células dendríticas na modulação da resposta imune contra Y. pseudotuberculosis foi estudada através da determinação da produção de citocinas (IL-6, IL-12, IL-10, IL-23, TNF-α e TGF-β) e co-cultivo com linfócitos T obtidos de animais imunizados com antígenos de Y. pseudotuberculosis. Os resultados mostraram redução na produção de citocinas pró-inflamatórias por células dendríticas infectadas com a amostra bacteriana portadora do plasmídeo de virulência, em ambas as linhagens de camundongos estudadas... / Y. pseudotuberculosis infection is a cause of intestinal and extraintestinal diseases. Infection resolution is related to the activation of Th1 cells, however, little is known about the influence of other T cells subsets, like Th17 and Treg, in the control of this infection. Dendritic cells are capable of directing the adaptive immune response by producing cytokines and presenting antigens to T cells, making them essential to T lymphocytes activation and differentiation. Thus, this study evaluated the role of different T lymphocytes subsets and the influence of dendritic cells on the development of the immune response against Y. pseudotuberculosis infection. Here, we evaluated the T cells subsets CD4+, CD8+ and Foxp3+, present during Y. pseudotuberculosis infection and mutant samples bacterial virulence factors, and also the intracellular expression of cytokines (IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α and TGF-β) by these cells. The role of Th17 and Treg cells in controlling the bacteria was analyzed by tests of depleted CD25+ cells and IL-17 neutralization. Furthermore, the influence of dendritic cells in modulating the immune response against Y. pseudotuberculosis was studied by determining the cytokine production (IL-6, IL-12, IL-10, IL-23, TNF-α and TGF-β) and co-culture with lymphocytes from animals immunized with Y. pseudotuberculosis antigens. The results showed a reduction in proinflammatory cytokines production by dendritic cells infected with bacteria carrying the bacterial virulence plasmid, in both mice strains studied... (Complete abstract click electronic access below)

Orientadores: Everson Alves Miranda, Adriano Rodrigues Azzoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T15:34:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonturi_Nemailla_M.pdf: 2076232 bytes, checksum: e3f4e56f400891ab77fe029e0c1f0899 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O número de estudos em terapia gênica com vetores plasmídiais (pDNA) têm aumentado nestes últimos anos. Como resultado, a demanda para preparações de pDNA em conformidade com as recomendações das agências reguladoras (EMEA, FDA) também aumentou. O DNA plasmidial é frequentemente obtido através da fermentação de Escherichia coli transformada e purificada por uma série de operações unitárias, incluindo a cromatografia. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um processo cromatográfico para a recuperação e purificação do pDNA superenovelado (sc pDNA) a partir do lisado neutralizado. Os ligantes fenil (hidrofóbico) e mercaptopirimidina (tiofílico) foram imobilizados em matrizes de agarose e celulose. A seletividade destes ligantes para com o sc pDNA foi determinada através de estudos de adsorção utilizando citrato de sódio 1,5 mol/L e fosfato de potássio 2,0 mol/L como tampões de adsorção. A cromatografia com o adsorvente fenil-agarose e o citrato de sódio 1,5 mol/L permitiu recuperar 58% do pDNA sem contaminação por gDNA, proteínas e endotoxinas, sendo uma alternativa potencial para a recuperação primária do sc pDNA. O resultado mais promissor foi obtido com a cromatografia com o adsorvente mercaptopirimidina-agarose e fosfato de potássio 2,0 mol/L como tampão de adsorção. Este sistema tampão de adsorção/adsorvente permitiu a obtenção de pDNA com 100% de pureza e dentro das recomendações das agências reguladoras no tocante à contaminação por RNA e endotoxinas. Assim, este trabalho lançou as bases para o desenvolvimento de dois métodos cromatográficos para a recuperação primária ou purificação de pDNA diretamente do lisado neutralizado, ambos potencialmente aplicáveis em larga escala / Abstract: The number of studies in gene therapy with plasmid vectors (pDNA) has witnessed an increase in the recent years. As result the demand for preparations of pDNA in compliance with recommendations of the regulatory agencies (EMEA, FDA) has also increased. Plasmid DNA is oftenly obtained through fermentation of transformed Escherichia coli and purified by a series of unit operations, including chromatography. This work aimed the development of a chromatographic process for the recovery and purification of supercolied pDNA (sc pDNA) directly from neutralized cell lysate. Phenyl (hydrophobic) and mercaptopyrimidine (thiophilic) molecules immobilized in agarose and cellulose matrices were the ligands used to capture the pDNA. Their selectivity towards sc pDNA was evaluated through adsorption studies using sodium citrate 1.5 mol/L and potassium phosphate 2.0 mol/L as the adsorption buffers. The chromatography with the adsorbent phenyl-agarose and sodium citrate 1.5 mol/L was able to recover 58% of sc pDNA without gDNA, proteins and endotoxins contamination, being an potential alternative for the primary recovery of sc pDNA. The most promising result was obtained with the chromatography with mercaptopyrimidine-agarose and potassium phosphate 2.0 mol/L adsorpition buffer. With the latter buffer/adsorbent system it was possible to obtain in a single step pDNA with 100% purity and within the recommendations of regulatory agencies with regard to contamination by RNA and endotoxins. Thus, this work laid the basis for the development of two chromatographic process for the recovery or purification of pDNA directly from the neutralized lysate, both potentially applicable in larger scale / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientadores: Adriano Rodrigues Azzoni, Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T06:15:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toledo_MarceloAugustoSzymanskide_D.pdf: 15660446 bytes, checksum: 8e64c5b4455cf458c2eb0d9b8e030e70 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Apesar de seguros e simples de produzir, o uso de vetores não virais como o DNA plasmidial (DNAp) em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA tem sido limitado pela baixa eficiência quando comparados aos vetores virais. Essa limitação provém principalmente da reduzida capacidade de superar as barreiras físicas, enzimáticas e difusionais encontradas durante o tráfego intracelular para o interior do núcleo das células alvo. Dentro deste contexto, o presente trabalho demonstra a utilização de cadeias leves modificadas de Dineína (Lc8 e Rp3) como vetores não-virais de entrega gênica. A escolha de cadeias leves de Dineína justifica-se pela possibilidade de utilizar o transporte retrógrado celular mediado por complexos motores de Dineína para facilitar o tráfego de material genético exógeno através do citoplasma em direção à periferia nuclear. Através da adição de pequenos domínios peptídicos, ricos em aminoácidos polares positivos (arginina e lisina), ao N-terminal de cadeias leves de Dineína foi possível conferir a estas proteínas a habilidade de interagir com material genético condensando-o em partículas. Ensaios de transfecção demonstraram que tais partículas apresentam elevada eficiência de entrega do material genético exógeno ao núcleo de células HeLa, eficiência esta superior àquela apresentada pelo peptídeo protamina, amplamente estudado como vetor não-viral de entrega gênica. A formação de complexos ternários utilizando-se DNA plasmidial, cadeias leves de Dineína modificadas e lipídios catiônicos apresentou eficiência de entrega superior àquelas apresentadas na ausência do lipídio. Adicionalmente, complexos de entrega formados apenas com DNA plasmidial e cadeias leves de Dineína modificadas apresentaram baixo efeito citotóxico em células HeLa, característica esta de grande relevância uma vez que a toxicidade dos vetores de entrega gênica atua como importante fator limitante em sua aplicação clínica. O mecanismo envolvido no processo de entrega gênica mediado por cadeias leves de Dineína modificadas também foi estudado, podendo ser observado que (1) a entrada dos complexos de entrega na célula é altamente dependente do processo de endocitose, (2) a eficiência de entrega observada depende da rede de microtúbulos e (3) parte significativa dos complexos de entrega é degradada na via de endossoma/lisossomo celular. Os vetores não-virais de entrega gênica descritos no presente estudo associam elevada eficiência de transfecção, baixa toxicidade celular e relativo baixo custo de produção, uma vez que as cadeias leves de Dineína recombinantes são produzidas em sistema heterólogo utilizando-se Escherichia coli. Ressalta-se ainda a possibilidade de adição de novos domínios peptídicos às cadeias leves de Dineína modificadas, agregando novas funções/capacidades que poderiam resultar em maior eficiência de entrega gênica através da otimização dos processos de internalização celular ou escape endossomal. A abordagem de se utilizar a via de transporte retrógrado celular para o desenvolvimento de vetores não-virais para entrega gênica é pouco explorada pela comunidade científica e o presente estudo apresenta-se entre os poucos da área, esperando assim contribuir para o desenvolvimento de vetores não-virais mais eficientes e seguros / Abstract: The use of non viral vectors such as plasmidial DNA (pDNA) in gene therapy and DNA vaccination protocols has been limited due to its low transfection efficiency when compared to viral vectors. This limitation occurs mainly due to the physical, enzymatic and diffusion barriers faced during the transport of the genetic material to the nucleus of target eukaryotic cells. Regarding this subject, the present work demonstrates the feasibility of using modified Dynein light chains (Lc8 and Rp3) as non viral vectors for gene delivery. The use of Dynein light chains relies on the possibility to exploit the Dynein based cellular retrograde transport in order to improve the exogenous genetic material transport across the citosol towards the nuclear periphery. By adding small peptide domains, based in positively charged aminoacids (arginine and lysine) to the N-terminal of Dynein light chains, the resulting recombinant proteins were able to interact and condense genetic material into delivery particles. Transfection assays demonstrated that these particles are highly efficient to delivery plasmidial DNA to nucleus of HeLa cells when compared to the transfection efficiency presented by protamine, a well characterized non viral vector peptide. Ternary complexes formed by modified Dynein light chains, pDNA and a cationic lipid showed even higher transfection efficiency. Additionally, the light chain based non viral delivery vectors presented low citotoxic effect to HeLa cells, a valuable feature as toxicity is regarded as one of the main concerns on delivery vectors development. The mechanism by which the modified Dynein light chain based vectors mediates gene delivery was also investigated and we could observe that (1) the internalization process deeply relies on endocytosis, (2) it depends on the microtubule network and (3) a significant fraction of the delivery complexes are trapped and degraded in the endocytic pathway. The non viral vectors developed in the present study combine high transfection efficiency, low toxicity and relative low production cost, as all modified proteins were produced in Escherichia coli prokaryotic host. Its noteworthy that additional peptide domains can be further associated to the delivery vectors described providing it with new abilities such as higher internalization or endosomal escape capacity. The approach to use the cellular retrograde transport in order to develop non viral vectors is poorly exploited by the scientific community and the present study stands among few in the field hopefully contributing to the development of more efficient and safer non viral vectors for gene delivery / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Marco Antonio Garcia de Carvalho, Marco Aurelio Takita / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T15:21:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Palma_EloaCarolinaNavaCardoso_M.pdf: 2004126 bytes, checksum: 618ad5da7f91e98f63bfdc0a41812387 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O surgimento dos sequenciadores automáticos de DNA por volta dos anos 1990 fez com que a quantidade de sequências e informações a serem analisadas aumentasse exponencialmente. Sendo assim, os recursos computacionais são cada vez mais exigidos em diversas tarefas de armazenamento desses dados. Para atender essas e outras necessidades, surgiu a Bioinformática, que engloba diversas áreas como Ciência da Computação, Matemática, Estatística, e a Biologia Molecular. Neste trabalho, desenvolvemos um software denominado Biodonut, que consiste em manipular plasmídeos utilizando visualização 2D e 3D. Biodonut é um produto de software de plataforma web, open source para que os pesquisadores possam manipular plasmídeos in silico, visualizando em formato 2D e 3D e possibilitando uma análise diferenciada das áreas julgadas importantes. A base de dados utilizada no software é o GenBank, por ser mundialmente conhecida e respeitada. Uma comparação com dois importantes softwares da área foi efetuada e é apresentada neste trabalho. Os resultados apontam que usar Biodonut é vantajoso em relação os outros dois softwares / Abstract: The advent of automated DNA sequencers around 1990s led to the amount of information sequences to be analyzed and increased exponentially. Thus, computing resources are increasingly demanded in various tasks such data storage. To meet these and other needs arose Bioinformatics, encompassing diverse areas as Computer Science, Mathematics, Statistics, and Molecular Biology. In this work, we developed a software called Biodonut, which involves manipulating plasmids using 2D and 3D visualization. Biodonut is a product of web software platform, open source so that researchers can manipulate plasmids in silico, visualizing 2D and 3D format, enabling a differentiated analysis of the areas deemed important. The database software is used in GenBank, to be globally known and respected. A comparison with two important software of the area was conducted and is presented in this paper. The results show that using Biodonut is advantageous over the other two softwares / Mestrado / Tecnologia e Inovação / Mestra em Tecnologia

Orientador: Maria Luiza Moretti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:52:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kuboyama_RogerioHakio_D.pdf: 1899697 bytes, checksum: 863826cd141f1e5f89eb90d272c0c330 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Os objetivos do presente estudo, conduzido retrospectivamente, utilizando cepas isoladas de espécimens clínicos obtidos de pacientes internados em dois hospitais brasileiros entre fevereiro de 2001 e junho de 2004 foram descrever: a presença de cepas de Klebsiella pneumoniae produtoras de beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs), o melhor método e o substrato preferido para os testes de triagem e de confirmação da produção de ESBLs, a relação epidemiológica das cepas obtidas e analisar os fatores de risco para infecção por cepa produtora de ESBLs. A fim de investigar a relação genética das cepas, foram utilizadas as análises do DNA plasmidial e do DNA cromossômico por eletroforese em campo pulsátil (PFGE). Um total de 89 cepas de K. pneumoniae foram coletadas de diversos sítios anatômicos. Os espécimens clínicos mais comuns dos quais foram isoladas cepas produtoras foram urina (12,4%) e sangue (10,1%). Utilizando os critérios estabelecidos pelo CLSI (testes de triagem), 35 (39,3%) cepas de K. pneumoniae foram consideradas possivelmente produtoras de ESBLs, enquanto que o teste de aproximação de discos (DDAT) revelou distorções características nas zonas de inibição produzidas pela molécula do clavulanato em 96, 62,5, 50, 18,8 e 12,5% das cepas ao redor dos discos contendo aztreonam, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona e cefpodoxima, respectivamente. Das 89 cepas, 32 (36%) foram consideradas produtoras de ESBLs baseadas no teste confirmatório pelo método Oxoid de discos-combinados. O disco contendo cefotaxima foi capaz de confirmar 100 % dos produtores de ESBLs enquanto que o disco contendo ceftazidima deixou de confirmar 2 cepas produtoras. Dez e 32 diferentes perfis plasmidiais foram observados dentre as cepas de K. pneumoniae produtoras e não produtoras, respectivamente. A PFGE demonstrou melhor poder discriminatório fornecendo 15 e 55 perfis de DNA cromossômico dentre as cepas ESBLs-positivas e ESBLs-negativas, respectivamente. Da análise univariada, as variáveis significativamente associadas com infecção por cepas de K. pneumoniae produtoras de ESBLs foram: uso de cefalosporinas de quarta geração, de lincosamida, de carbapenêmicos, de glicopeptídeos, cirurgia recente, traqueostomia, idade, dias em uso de lincosamida, dias em uso de glicopeptídeos, número total de antibióticos e duração da terapia antimicrobiana. Ao realizar a análise multivariada, utilizando um modelo de regressão logística que incluía as variáveis estatisticamente significantes da análise univariada (P < 0,05), número total de antibióticos permaneceu como única variável independente para infecção por cepa de K. pneumoniae produtora de ESBLs (OR, 1,60; IC95%, 1,194-2,145.; P = 0,0017). Os dados obtidos revelam: uma taxa relativamente alta da produção de ESBLs em cepas de K. pneumoniae obtidas de pacientes das instituições estudadas; a insuficiência da análise plasmidial na elucidação da relação genética dentre as cepas produtoras de ESBLs; aztreonam como melhor substrato indicador da produção presuntiva de ESBLs e cefotaxima como o melhor substrato no teste confirmatório pelo método Oxoid de discoscombinados / Abstract: The objectives of this study conducted restrospectively using strains isolated from clinical specimens obtained from patients hospitalized in two Brazilian hospitals between February 2001 to June 2004 were to describe the presence of extended-spectrum b-lactamase (ESBL)-producing Klebsiella pneumoniae strains, the best method and the preferred substrate for screening and confirming ESBL production and the epidemiological relatedness of ESBL-producing strains and analyse the risk factors for infection due to ESBL-producing K. pneumoniae. To investigate the genetic relatedness of the strains, plasmid analysis and chromosomal DNA analysis by pulsed-field gel electrophoresis were used. A total of 89 K. pneumoniae were collected from diverse body sites. The most commom specimens yielding ESBL-producing strains were urine (12.4%) and blood (10.1%). Using CLSI criteria (ESBL screening breakpoints), 35 K. pneumoniae (39.3%) had presumptive ESBL phenotype, while using the double-disk approximation test (DDAT) characteristic clavulanate-induced distortions of inhibition zones were found in 96, 62.5, 50, 18.8 and 12.5% of the strains around the disks containing aztreonam, cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone and cefpodoxime, respectively. Of 89 isolates, 32 (36%) produced ESBL based on the confirmatory Oxoid combination disk method. The disk containing cefotaxime was able to confirm 100% of the ESBL producers while the disk containing ceftazidime was not able to confirm 2 ESBL-positive strains. Ten and 32 different plasmid profiles were observed among the ESBL-producing K. pneumoniae and non ESBL producers, respectively. Pulsed-field gel electrophoresis showed the best discriminatory power giving 15 and 55 different chromosomal DNA profiles among the ESBL-positive and ESBL-negative K. pneumoniae, respectively. From univariate analysis, variables significantly associated with infection by an ESBL-producing strain of K. pneumoniae included the following: use of 4st-generation cephalosporins, lincosamide, carbapenems, glycopeptides, recent surgery, tracheostomy, age, days in using of lincosamide, days in using of glycopeptides, total number of antibiotics and duration of the antimicrobial therapy. The only variable that remained independent risk factor for acquiring infection due to ESBL-producing K. pneumoniae after multivariable analysis using a logistic regression model, which included the variables associated with acquiring infection by ESBL-producing K. pneumoniae by univariate analysis (P < 0.05), was total number of antibiotics (OR, 1.60; 95%CI, 1.194-2.145; P = 0.0017). In summary, these data indicate that ESBL-producing K. pneumoniae occur at a relatively high incidence at our institutions and the plasmid analysis is not sufficient to identify relationships between ESBL-producing strains of K. pneumoniae. The ESBL screening breakpoints and DDAT with aztreonam appear to be good indicators in presumptive detection of ESBL-producing strains and the cefotaxime used in the Oxoid combination disk method constituted the best substrate in the confirmatory test / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica