Orientadores: Dagmar Ruth Stach-Machado, Gisele Abigail Montan Torres / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T19:49:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorenzi_MarcelSalmeron_M.pdf: 4641112 bytes, checksum: 98293f35d81cf7287376bbbf8a203993 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: No Brasil a batata é considerada uma das principais hortaliças produzidas, tanto em área plantada quanto em consumo. A produção anual é em torno de 2 milhões de toneladas, ocupando uma área superior a 130 mil hectares, gerando cerca de 500 mil empregos. Nos últimos anos, a bataticultura brasileira vem sofrendo perdas significativas devido ao aumento da incidência de viroses, principalmente provocadas pelo vírus Y da batata (Potato virus Y - PVY). Mundialmente, são conhecidas pelo menos três linhagens distintas do vírus Y: PVYO, PVYC e PVYN, cujos sintomas variam de acordo com o ambiente e a planta hospedeira. A linhagem PVYN apresenta uma variante denominada PVYNTN, que provoca sintomas de mosaico foliar mais intenso e a indução de formação de anéis necróticos nos tubérculos. A presença de focos de infecção de PVY em índices acima de 4% (limite de tolerância regulamentada pelo Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento) é suficiente para condenar o uso de determinadas lavouras para a produção de batata-semente, além de representar grandes danos em cultivos comerciais de batata para consumo. Já o PVX pode representar um grande problema quando em associação com o PVY. É um vírus cosmopolita, sendo transmitido mecanicamente e caracterizado por mosaico leve nas folhas, mais visíveis na metade inferior da planta. Atualmente, a análise de fitossanidade e a indexação viral da batata-semente destinada à multiplicação comercial no Brasil são efetuadas através da combinação da utilização de plantas indicadoras, que demanda tempo, e por testes sorológicos como ELISA, os quais representam custos adicionais à cadeia produtiva, uma vez que o Brasil é dependente da importação dos antisoros de detecção. Deste modo, considerando a relevância do estabelecimento de testes de diagnóstico nacionais que permitam a identificação específica dos vírus Y e X, em virtude da grande incidência de infecções do PVY e da grande necessidade de proteção contra o aumento da introdução do PVX, com oagravante de grandes prejuízos na co-infecção, os objetivos específicos deste projeto foram produzir soros policlonais específicos para o PVX e PVY, estabelecer ELISA indireto e desenvolver diagnóstico molecular dos vírus através de primers específicos e do IC-RTPCR. Esse trabalho conseguiu isolar e purificar os vírus X e Y através da indexação biológica e protocolos de extração. Com isso, foi possível produzir e caracterizar os anticorpos policlonais para o PVY e o PVX, com grande especificidade e poder de detecção. Após essas etapas, foi realizado a construção de primers específicos, e o desenvolvimento de técnicas moleculares de detecção baseadas na extração de material genético de folhas infectadas e PCR com os respectivos primers, obtendo-se os respectivos fragmentos esperados, concluindo com sucesso o estabelecimento do teste. Por fim, tentouse estabelecer o IC-RT-PCR, todavia o tamanho reduzido das partículas virais inviabilizou a realização do teste, mas a execução da detecção por ELISA e molecular separadamente foi estabelecido com sucesso, permitindo agregar novas tecnologias nacionais e contribuindo com a redução dos custos para a execução dos testes de fitossanidade, importantes e imprescindíveis para o controle das viroses predominantes na bataticultura nacional. / Abstract: The potato culture (Solanum tuberosum L.) represents the fourth major vegetal production in the world, reaching productivity indexes which overcome that of cerals in 5 times. Potato crop may be affected by several disease. Actually, some references point out near 40 in a total of 70 disorders are caused by viral agents. Among the most important viruses of potato, virus X and Y usually cause major concern, due to their harmfull effects in productivity and comercialization of potato. Nowadays, the viral infecctions have found their way into Brazil's potato production reagions in a very fast maner. The state of São Paulo is the most afeccted. Althought potato crop is among the stocks 10 major crops in the country, its production relies on virus-free imported potato-seeds to mantain its production. This is not only responsable by a considerable part of the production costs, but also represents a dangerous entrance door for a number of exotic pathogens inexistent in our territory. Thus, a fitosanity control of imported seed-potato lots, which enter Brazil via Santos harbor in the State of São Paulo, has fundamental importance. The usage of imunodiagnosis like ELISA, althought being efficient and widely applied, results in an additional cost due to the dependency of Brazil on the importation of policlonal antisera and monoclonal antibodys necessaries for the proper detection of the most important virus afeccting the national potato plantations. It has becoming a must for the seed-potato production a program in Brazil to have our independence of the diagnoses antiserum reagents for ELISA to at least the most important seed-potato viruses. The independence on importation of these biotecnological products and the modernization of imunodiagnosis by applying molecular techniques with specifics primers and like IC-RT-PCR (ImmoCapture - Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction), which makes possible to detect the major potato's virus in a fast, efficient and cheap way in order to screen the sanity of the material produced in the country, leading to a increase in production and stating the quality of it. This work isolated and purified the virus X and Y by biological indexing and extraction protocols. Therefore, it was possible to produce and to characterize the polyclonals antiserum to PVX and to PVY, with great specificity and power of detection. After these steps, it was made specifics primers and the development of molecular detection techniques based on extraction of genetic material from infected leaves and PCR with the primers. The expected fragments was obtained, concluding with successful the establishment of the test. Finally, there was the attempt to establish the IC-RT-PCR, however the small size of viral particles prevented the test, but the implementation of detection by ELISA and molecular separately was successful, add new national technologies allowing and contributing to the reduction of costs for implementing of the fitosanitty tests, importants and essentials for the control of viruses prevailing in the national potato culture. / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

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Ogusku.pdf: 3811428 bytes, checksum: f32cda31f56f3f4d15311ce015f3600a (MD5) Previous issue date: 2012-06-28 / Item withdrawn by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-14T13:23:59Z Item was in collections: Doutorado em Biotecnologia (ID: 76) No. of bitstreams: 3 Tese - Maurício M. Ogusku.pdf: 3811428 bytes, checksum: f32cda31f56f3f4d15311ce015f3600a (MD5) Tese - Maurício M. Ogusku.pdf.txt: 191579 bytes, checksum: ee0f8a6107947c9c2298bc9b541a1c9c (MD5) Tese - Maurício M. Ogusku.pdf.jpg: 4160 bytes, checksum: 65c7cd943f5481f875e561b9fda3e11e (MD5) / Item reinstated by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-14T13:28:41Z Item was in collections: Doutorado em Biotecnologia (ID: 76) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / In clinical practice is widely accepted that an episode of active tuberculosis (TB) is caused by a single clone of Mycobacterium tuberculosis. However, several studies have shown that there is heterogeneity of clones and this can be much larger than expected. In this context, the aim of this study was to investigate pulmonary TB by M. tuberculosis polyclonal infection in newly diagnosed patients, from a sputum sample and before starting treatment. A total of 62 of sputum samples were select. By screening in 7H10 medium, simultaneous presence of M. tuberculosis clones phenotypically sensitive and resistant to INH and/or RIF in the same isolate was observed in 30.6% (n=19). Genotyping by DRE-PCR and DNA sequencing of katG, inhA and rpoB genes were carried out in 74 clones INH and RIF sensitive, 65 clones INH-resistant, a clone RIF-resistant and 3 clones INH/RIF-resistant. The presence of resistant and sensitive clones to INH and/or RIF as well as the occurrence of different genotypes indicating heterogeneity in the same isolated from M. tuberculosis. The frequency of polyclonal infection was superior to published studies that show percentages ranging from 0.4% to 19.0%. These results indicate that the presence of polyclonal infection is not a rare phenomenon in patients with pulmonary TB in this population. The partial sequencing of the katG gene revealed that only 4.4% of INH-resistant clones were present described mutations in this gene. For inhA gene mutations were not detected for INH-resistant clones. Clones resistant to RIF present mutations in the rpoB gene. In clones INH-resistant, 83.8% not show mutations in katG and inhA genes, while 11.7% had mutations in katG gene not yet described. The absence of mutations commonly associated with drug resistance in katG and inhA genes, besides detection of new mutations in M. tuberculosis INH-resistant clones, suggests the need to sequencing larger fragments of these genes to propose strategies for fast detection of M. tuberculosis resistance. The results of this survey show that polyclonal infection is present in approximately one third of patients newly TB diagnosed, either by genotypic or phenotypic characteristics of M. tuberculosis clones, although both are not strictly related. / Na prática clínica é amplamente admitido que um episódio de tuberculose (TB) ativa seja causado por um único clone de Mycobacterium tuberculosis. Contudo, vários estudos têm revelado que há uma heterogeneidade de clones e isso pode ser bem maior que o esperado. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi investigar a TB pulmonar por infecção policlonal de M. tuberculosis em pacientes recém-diagnosticados, a partir de uma amostra de escarro e antes do início do tratamento. Foram selecionadas 62 amostras de escarros, sendo 31 paucibacilares e 31 multibacilares. A triagem de clones em meio de 7H10 proporcionou o isolamento de clones sensíveis e resistentes à Isoniazida (INH) e/ou Rifampicina (RIF) coexistentes em 19 (30,6%) isolados de M. tuberculosis. A genotipagem por DRE-PCR e o sequenciamento parcial de DNA para os genes katG, inhA e rpoB foram realizados em 74 clones sensíveis à INH e RIF, 65 clones resistentes à INH, 1 clone resistente à RIF e 3 clones resistentes à INH e RIF. A presença de clones sensíveis e resistentes a INH e/ou RIF, assim como a ocorrência de diferentes genótipos indicam a heterogeneidade de clones em um mesmo isolado de M. tuberculosis. A frequência de infecção policlonal observada foi superior aos estudos descritos na literatura, visto que os mesmos apresentaram percentuais de 0,4% a 19,0%. Estes resultados permitem afirmar que a presença de infecção policlonal não é um fenômeno raro em pacientes com TB pulmonar na população estudada. O sequenciamento parcial dos genes katG revelou que apenas 4,4% dos clones resistentes à INH apresentaram as mutações comumente descritas neste gene. Para o gene inhA não foram detectadas mutações para os clones resistentes à INH. Os clones resistentes para RIF apresentaram mutações no gene rpoB. Dos clones resistentes à INH, 83,8% não apresentaram mutações nos genes katG e inhA, enquanto 11,7% apresentaram mutações ainda não descritas no gene katG. A ausência das mutações comumente associadas à resistência medicamentosa nos genes katG e inhA e a detecção de novas mutações em clones de M. tuberculosis resistentes à INH, explicitam a necessidade de sequenciar fragmentos maiores desses genes ou ampliar a busca de mutações em outros genes, a fim de que sejam propostas estratégias mais rápidas para a detecção de resistência em M. tuberculosis. Os resultados da presente pesquisa evidenciam que a infecção policlonal está presente em aproximadamente 1/3 dos pacientes de TB recém-diagnosticados, seja pelas características fenotípica ou genotípica dos clones de M. tuberculosis, embora estas não estejam estritamente relacionadas.

O Tomato chlorosis virus (ToCV) é uma espécie do gênero Crinivirus que causa danos, principalmente na cultura do tomateiro (Solanum lycopersicum). Foi primeiramente isolado e descrito em 1998, nos Estados Unidos, e em seguida foi reportado em doze países. No Brasil, foi constatado primeiramente no Estado de São Paulo, na região de Sumaré, em 2008, e posteriormente nos Estados da Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais e Rio de Janeiro. Há evidência da sua presença também nos Estados do Paraná e Santa Catarina. O ToCV pode infectar outras solanáceas além do tomateiro e, recentemente, foi observado infectando plantas de batata (Solanum tuberosum) no Brasil. Esse crinivirus é transmitido no Brasil principalmente pelo aleirodídeo (mosca branca) Bemisia tabaci MEAM1. Considerando o patossistema batateira/ToCV, não há estudos sobre a ocorrência, sintomatologia em diferentes variedades e danos provocados por esse crinivirus. Também não há antissoro policlonal para o isolado brasileiro do ToCV para uso na diagnose da doença em solanáceas. Esse trabalho teve por objetivos: purificar o ToCV e produzir antissoro policlonal; avaliar a reação de genótipos de batateira à infecção com o ToCV; avaliar o dano provocado por esse vírus em duas variedades de batateira. A purificação do vírus a partir de folhas de tomateiro e a produção de antissoro policlonal em coelho foram satisfatórias. No entanto, o antissoro não foi eficiente em ELISA, mas sim em dot-blot e somente na diluição de 1:20. Foi avaliada a reação de 21 genótipos de batateira à infecção com o ToCV, por meio da inoculação com B. tabaci MEAM1, com chance de escolha do vetor. Nenhum genótipo exibiu resistência à infecção; enquanto a variedade Camila foi assintomática e não apresentou alteração na fotossíntese. Plantas de batateira das variedades Ágata e Asterix sadias foram inoculadas com o ToCV, por meio da B. tabaci MEAM1 e ao final foram avaliadas a massa fresca da parte aérea, peso e número dos tubérculos colhidos. Em dois experimentos independentes, as reduções médias no peso fresco da parte aérea foram de 60,1% para Ágata e 46% para Asterix. Porém, as reduções nas produções dessas variedades, no primeiro experimento foram de 99,5% e 98,1%, respectivamente; enquanto no segundo os valores foram de 82,3% e 56,2%, respectivamente. / Tomato chlorosis virus (ToCV) is a species of the genus Crinivirus, which is causing considerable losses mainly on tomato crop (Solanum lycopersicum). It was first isolated and described on 1998 in the United States and subsequently reported in twelve countries. In Brazil, it was first reported in São Paulo State, in Sumaré region in 2008, and after that on the states of Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais and Rio de Janeiro. There is evidence of the presence of ToCV on the states of Paraná and Santa Catarina. ToCV can also infect other solanaceae and more recently, it was reported infecting potato plants (Solanum tuberosum) in Brazil. This crinivirus is transmitted by Bemisia tabaci MEAM1. Considering the patosystem potato/ToCV, there are no studies on the occurrence, symptomatology in different varieties, and damages caused by this crinivirus. In addition, there is no polyclonal antiserum for the Brazilian isolate of ToCV for use in diagnosis. The objectives of the present work were: to purify the virus and produce a polyclonal antiserum; to evaluate the reaction of potato genotypes to ToCV infection; to evaluate the yield loss caused by this crinivirus on two potato cultivars. The virus purification from tomato leaves and the production of polyclonal antiserum in rabbit were satisfactorily accomplished. However, the antiserum was not efficient on ELISA test, but in dot-blot, only when diluted 1:20. The reaction of 21 potato genotypes to infection with ToCV was evaluated by inoculation with B. tabaci MEAM1, with chance of choice for the vector. All genotypes were infected with ToCV and Camila was the only one asymptomatic. Plants of cultivars Ágata and Asterix were inoculated with ToCV, by means of viruliferous vector, and at the end were evaluated for the fresh mass of the aerial part, weight and number of harvested tubers. In two independent experiments, average reductions in aerial fresh weight were 60.1% for Ágata and 46% for Asterix. However, reductions in yield of these varieties in the first experiment were 99.5% and 98.1%, respectively; while in the second the values were 82.3% and 56.2%, respectively.

O ovo é o alimento naturalmente mais completo, uma vez que possui todos os nutrientes necessários, como vitaminas, aminoácidos e minerais essenciais para manter uma vida. Porém, em contra partida, possui várias proteínas promotoras de alergias em considerável parcela da população mundial. Para determinar as proteínas dos alimentos alergênicos, um dos testes mais utilizados é o imunoensaios tais como ELISA (ensaio imunoenzimático - enzyme linked immunosorbent assay), onde o anticorpo reconhece o antígeno e essa conexão é mostrada por um sistema enzimático, em outras palavras, a densidade óptica. O objetivo deste estudo foi determinar a eficiência do anticorpo policlonal, produzido em laboratório, para identificar a presença do antígeno ovomucóide em ovos tratados por irradiação gama para a sua desativação. Para avaliar os tratamentos, o anticorpo policlonal foi produzido em quatro (04) coelhos da raça Nova Zelândia, do sexo feminino, com 45 dias de vida, imunizadas com ovomucóide bioconjugado. Foi utilizado o adjuvante de Freund completo na primeira imunização e a solução tampão PBS, foram realizadas, posteriormente, quatro imunizações a cada quinze dias, mais um reforço 48 horas antes da retirada do plasma sanguíneo. O soro sangüíneo foi titulado por PTA-ELISA (Plate trapped antigen). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal do Instituto de Ciência Animal e Pastagens (IZ) e precedida de acordo com as normas europeias para o bem-estar e ética animal. Foram utilizados ovos comerciais in natura, fornecidos pelo Departamento de Genética da Universidade de Agricultura \"Luiz de Queiroz\" - ESALQ / USP. As amostras foram submetidas à radiação gama proveniente de uma fonte de Co60, do tipo Multipropósito no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN), sob uma taxa de dose de 19,4 e 31.8Gy/hora, nas doses: 0 (controle); 10kGy; 20KGy e 30KGy, em todas as taxas. Pelo teste de ELISA, foi encontrado o alérgeno ovomucóide das amostras ovo e, pelo resultado apresentados, constatou-se que o tratamento da radiação não mostrou alterações significativas, quando avaliado por anticorpos policlonais. Assim, podemos concluir que o anticorpo produzido é capaz de identificar a proteína alergênica ovomucóide e, a irradiação gama em tais taxas não apresenta mudanças na estrutura da proteína, por esta forma de avaliação. Porém, apresentou algumas alterações na cor e viscosidade visual das amostras de ovos / The egg is the most complete natural food; it has all the necessary nutrients such as vitamins, aminoacids and essential minerals to maintain a life. However, although, has several proteins that promote allergies in considerable part of the world population. To determine allergenic food proteins, one of the most used tests is the immunoassays such as ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), where the antibody recognizes the antigen and this connection is showed by an enzymatic system, in other words, optical density. The aim of this study was to determine the polyclonal antibody efficiency, produced in laboratory, to identify the presence the ovomucoid antigen in treated eggs by gamma irradiation for its inactivation. To evaluate the treatments, polyclonal antibody was produced in four New Zealand female rabbits, at 45 days old, immunized with bioconjugated ovomucoid. Was used Freund Complete Adjuvant at first immunization and PBS Buffer at four subsequently immunizations every fifteen days, plus a booster 48 hours before the blood retreated. The blood serum was tittered by PTAELISA (Plate trapped antigen). All procedures were approved by Institute of Animal Science and Pastures (IZ)´s Committee of Ethical and Animal Experimentation and preceded according to European Norms for ethical and animal welfare. It was used, in nature, commercial laying eggs, from the Genetic Department of Agricultural University Luiz de Queiroz ESALQ/USP. So the samples were submitted to the gamma radiation coming from a source of Co60, type Multipurpose at the Energetically Researches and Nuclear Institute (IPEN), under a dose rate of 19.4 and 31.8Gy/hour, in the doses: 0 (control); 10KGy; 20KGy and 30KGy, in all rates. By the ELISAs test we can find the egg allergen ovomucoid and the radiation treatment do not showed considerable changes. So we can concluded that the antibody produced is capable of identify the ovomucoid allergenic protein and the gamma irradiation in such rates does not shows changes in that protein, therefore showed some changes in the color and visual viscosity of the egg samples

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-12-08Bitstream added on 2014-06-13T20:00:43Z : No. of bitstreams: 1 cangiani_ee_dr_arafcf.pdf: 879107 bytes, checksum: bd2b88a537298b5f3ad944c986ece870 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Yersinia enterocolitica é um enteropatógeno que pode levar ao desenvolvimento de artrite reativa. Um dos mecanismos imunomoduladores usados pelos patógenos artritogênicos é a ativação policlonal de linfócitos. O objetivo deste estudo foi verificar se ocorre ativação policlonal de linfócitos B e comparar o padrão isotípico de imunoglobulinas produzidas durante a infecção com Y. enterocolitica O:8 em linhagens de camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C57BL/6), bem como analisar o padrão de secreção de citocinas pró-inflamatórias e regulatórias pelas populações de células T CD4+ e CD8+. / Yersinia enterocolitica is an enteropathogen that can lead to the development of reactive arthritis. One of the immunomodulating mechanisms used by arthritogenic pathogens is the polyclonal activation of lymphocytes. The objective of this study was to verify if the polyclonal activation of B-lymphocytes occur and to compare the different immunoglobulin (Ig) isotypes produced during the infection with Y. enterocolitica O:8 in susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice strains. We also analyzed the production of pro-inflammatory and regulatory cytokines in T CD4+ and T CD8+ lymphocytes populations.

O ovo é o alimento naturalmente mais completo, uma vez que possui todos os nutrientes necessários, como vitaminas, aminoácidos e minerais essenciais para manter uma vida. Porém, em contra partida, possui várias proteínas promotoras de alergias em considerável parcela da população mundial. Para determinar as proteínas dos alimentos alergênicos, um dos testes mais utilizados é o imunoensaios tais como ELISA (ensaio imunoenzimático - enzyme linked immunosorbent assay), onde o anticorpo reconhece o antígeno e essa conexão é mostrada por um sistema enzimático, em outras palavras, a densidade óptica. O objetivo deste estudo foi determinar a eficiência do anticorpo policlonal, produzido em laboratório, para identificar a presença do antígeno ovomucóide em ovos tratados por irradiação gama para a sua desativação. Para avaliar os tratamentos, o anticorpo policlonal foi produzido em quatro (04) coelhos da raça Nova Zelândia, do sexo feminino, com 45 dias de vida, imunizadas com ovomucóide bioconjugado. Foi utilizado o adjuvante de Freund completo na primeira imunização e a solução tampão PBS, foram realizadas, posteriormente, quatro imunizações a cada quinze dias, mais um reforço 48 horas antes da retirada do plasma sanguíneo. O soro sangüíneo foi titulado por PTA-ELISA (Plate trapped antigen). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal do Instituto de Ciência Animal e Pastagens (IZ) e precedida de acordo com as normas europeias para o bem-estar e ética animal. Foram utilizados ovos comerciais in natura, fornecidos pelo Departamento de Genética da Universidade de Agricultura \"Luiz de Queiroz\" - ESALQ / USP. As amostras foram submetidas à radiação gama proveniente de uma fonte de Co60, do tipo Multipropósito no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN), sob uma taxa de dose de 19,4 e 31.8Gy/hora, nas doses: 0 (controle); 10kGy; 20KGy e 30KGy, em todas as taxas. Pelo teste de ELISA, foi encontrado o alérgeno ovomucóide das amostras ovo e, pelo resultado apresentados, constatou-se que o tratamento da radiação não mostrou alterações significativas, quando avaliado por anticorpos policlonais. Assim, podemos concluir que o anticorpo produzido é capaz de identificar a proteína alergênica ovomucóide e, a irradiação gama em tais taxas não apresenta mudanças na estrutura da proteína, por esta forma de avaliação. Porém, apresentou algumas alterações na cor e viscosidade visual das amostras de ovos / The egg is the most complete natural food; it has all the necessary nutrients such as vitamins, aminoacids and essential minerals to maintain a life. However, although, has several proteins that promote allergies in considerable part of the world population. To determine allergenic food proteins, one of the most used tests is the immunoassays such as ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), where the antibody recognizes the antigen and this connection is showed by an enzymatic system, in other words, optical density. The aim of this study was to determine the polyclonal antibody efficiency, produced in laboratory, to identify the presence the ovomucoid antigen in treated eggs by gamma irradiation for its inactivation. To evaluate the treatments, polyclonal antibody was produced in four New Zealand female rabbits, at 45 days old, immunized with bioconjugated ovomucoid. Was used Freund Complete Adjuvant at first immunization and PBS Buffer at four subsequently immunizations every fifteen days, plus a booster 48 hours before the blood retreated. The blood serum was tittered by PTAELISA (Plate trapped antigen). All procedures were approved by Institute of Animal Science and Pastures (IZ)´s Committee of Ethical and Animal Experimentation and preceded according to European Norms for ethical and animal welfare. It was used, in nature, commercial laying eggs, from the Genetic Department of Agricultural University Luiz de Queiroz ESALQ/USP. So the samples were submitted to the gamma radiation coming from a source of Co60, type Multipurpose at the Energetically Researches and Nuclear Institute (IPEN), under a dose rate of 19.4 and 31.8Gy/hour, in the doses: 0 (control); 10KGy; 20KGy and 30KGy, in all rates. By the ELISAs test we can find the egg allergen ovomucoid and the radiation treatment do not showed considerable changes. So we can concluded that the antibody produced is capable of identify the ovomucoid allergenic protein and the gamma irradiation in such rates does not shows changes in that protein, therefore showed some changes in the color and visual viscosity of the egg samples

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-13T14:40:14Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Leidiane A. S. Galvão.pdf: 2769437 bytes, checksum: cd70444b94b36102f02a5102e38a68c8 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-13T14:41:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Leidiane A. S. Galvão.pdf: 2769437 bytes, checksum: cd70444b94b36102f02a5102e38a68c8 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-12-13T14:41:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Leidiane A. S. Galvão.pdf: 2769437 bytes, checksum: cd70444b94b36102f02a5102e38a68c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-13T14:41:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Leidiane A. S. Galvão.pdf: 2769437 bytes, checksum: cd70444b94b36102f02a5102e38a68c8 (MD5) Previous issue date: 2014-08-26 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Due to rising rates of morbidity and mortality caused by human rotavirus, detection methods have been used routinely in clinical and epidemiological studies. The diagnosis of rotavirus infections is based on the detection of particles, antigens or viral RNA from the fecal material. This study aimed to develop the VP4 and VP6 protein detection tools for immunodiagnostic of Rotavirus group A. Rabbit and mice anti-VP4 and anti-VP6 IgGs were obtained from immunizations made with VP4 and VP6 recombinant proteins of Rotavirus A, both built in this study, and tested by flow cytometry and Western blot against the recombinant antigen and the native antigen. The region of the VP4 protein, selected for the generation of mice and rabbit anti-VP4 IgGs, was efficient to recognize native antigen in denatured form, as observed in western blot assays. The cytometry analysis demonstrated that generated anti-VP4 antibodies were not specific enough to be used in techniques where the VP4 protein is in its native form. Selected regions for production of VP6 protein have been efficient for the generation of anti-VP6 antibodies, able to recognize the native protein in its denatured and non-denatured form. Future studies will aim to increase the specificity of the antibodies obtained to allow their use in a greater number of immunoassays. / Devido as crescentes taxas de morbidade e mortalidade causada por Rotavírus humanos, métodos de detecção têm sido empregados rotineiramente em estudos clínicos epidemiológicos. O diagnóstico das infecções por Rotavírus baseia-se na detecção das partículas, antígenos ou RNA virais a partir de material fecal. O objetivo deste estudo foi desenvolver ferramentas de detecção das proteínas VP4 e VP6 para imunodiagnósticos de Rotavírus do tipo A. IgG de coelho e camundongos anti-VP4 e anti-VP6 foram obtidos a partir de imunizações feitas com as proteínas recombinantes VP4 e VP6 de Rotavírus A (ambas construídas neste estudo) e testados através de citometria de fluxo e western blot contra o antígeno recombinante e o antígeno nativo. A região da proteína VP4 selecionada para a geração de IgG de camundongo e coelho anti-VP4 foi eficiente para o reconhecimento do antígeno nativo em sua forma desnaturada, como foi possível observar nos ensaios de western blot. As análises de citometria demonstraram que os mesmos anti-VP4 gerados não foram específicos o suficiente para serem utilizados em técnicas onde a proteína VP4 está em sua forma nativa. As regiões selecionadas para a produção da proteína VP6 foram eficientes para a geração de anticorpos anti-VP6 capazes de reconhecer a proteína nativa em sua forma desnaturada e não desnaturada. Futuros trabalhos terão como objetivo o aumento da especificidade dos anticorpos obtidos de modo a permitir sua aplicação em um maior número de imunoensaios.

O Tomato chlorosis virus (ToCV) é uma espécie do gênero Crinivirus que causa danos, principalmente na cultura do tomateiro (Solanum lycopersicum). Foi primeiramente isolado e descrito em 1998, nos Estados Unidos, e em seguida foi reportado em doze países. No Brasil, foi constatado primeiramente no Estado de São Paulo, na região de Sumaré, em 2008, e posteriormente nos Estados da Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais e Rio de Janeiro. Há evidência da sua presença também nos Estados do Paraná e Santa Catarina. O ToCV pode infectar outras solanáceas além do tomateiro e, recentemente, foi observado infectando plantas de batata (Solanum tuberosum) no Brasil. Esse crinivirus é transmitido no Brasil principalmente pelo aleirodídeo (mosca branca) Bemisia tabaci MEAM1. Considerando o patossistema batateira/ToCV, não há estudos sobre a ocorrência, sintomatologia em diferentes variedades e danos provocados por esse crinivirus. Também não há antissoro policlonal para o isolado brasileiro do ToCV para uso na diagnose da doença em solanáceas. Esse trabalho teve por objetivos: purificar o ToCV e produzir antissoro policlonal; avaliar a reação de genótipos de batateira à infecção com o ToCV; avaliar o dano provocado por esse vírus em duas variedades de batateira. A purificação do vírus a partir de folhas de tomateiro e a produção de antissoro policlonal em coelho foram satisfatórias. No entanto, o antissoro não foi eficiente em ELISA, mas sim em dot-blot e somente na diluição de 1:20. Foi avaliada a reação de 21 genótipos de batateira à infecção com o ToCV, por meio da inoculação com B. tabaci MEAM1, com chance de escolha do vetor. Nenhum genótipo exibiu resistência à infecção; enquanto a variedade Camila foi assintomática e não apresentou alteração na fotossíntese. Plantas de batateira das variedades Ágata e Asterix sadias foram inoculadas com o ToCV, por meio da B. tabaci MEAM1 e ao final foram avaliadas a massa fresca da parte aérea, peso e número dos tubérculos colhidos. Em dois experimentos independentes, as reduções médias no peso fresco da parte aérea foram de 60,1% para Ágata e 46% para Asterix. Porém, as reduções nas produções dessas variedades, no primeiro experimento foram de 99,5% e 98,1%, respectivamente; enquanto no segundo os valores foram de 82,3% e 56,2%, respectivamente. / Tomato chlorosis virus (ToCV) is a species of the genus Crinivirus, which is causing considerable losses mainly on tomato crop (Solanum lycopersicum). It was first isolated and described on 1998 in the United States and subsequently reported in twelve countries. In Brazil, it was first reported in São Paulo State, in Sumaré region in 2008, and after that on the states of Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais and Rio de Janeiro. There is evidence of the presence of ToCV on the states of Paraná and Santa Catarina. ToCV can also infect other solanaceae and more recently, it was reported infecting potato plants (Solanum tuberosum) in Brazil. This crinivirus is transmitted by Bemisia tabaci MEAM1. Considering the patosystem potato/ToCV, there are no studies on the occurrence, symptomatology in different varieties, and damages caused by this crinivirus. In addition, there is no polyclonal antiserum for the Brazilian isolate of ToCV for use in diagnosis. The objectives of the present work were: to purify the virus and produce a polyclonal antiserum; to evaluate the reaction of potato genotypes to ToCV infection; to evaluate the yield loss caused by this crinivirus on two potato cultivars. The virus purification from tomato leaves and the production of polyclonal antiserum in rabbit were satisfactorily accomplished. However, the antiserum was not efficient on ELISA test, but in dot-blot, only when diluted 1:20. The reaction of 21 potato genotypes to infection with ToCV was evaluated by inoculation with B. tabaci MEAM1, with chance of choice for the vector. All genotypes were infected with ToCV and Camila was the only one asymptomatic. Plants of cultivars Ágata and Asterix were inoculated with ToCV, by means of viruliferous vector, and at the end were evaluated for the fresh mass of the aerial part, weight and number of harvested tubers. In two independent experiments, average reductions in aerial fresh weight were 60.1% for Ágata and 46% for Asterix. However, reductions in yield of these varieties in the first experiment were 99.5% and 98.1%, respectively; while in the second the values were 82.3% and 56.2%, respectively.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_gizele_lima_de_sa.pdf: 488608 bytes, checksum: fe16f7b595024fb9112b8c23f5da90ca (MD5) Previous issue date: 2012-02-14 / Neosporosis is considered a disease of worldwide distribution. It is caused by the apicomplexa protozoan Neospora caninum, responsible for neuromuscular disorders in dogs and abortions in bovines, which makes it an important pathogen in cattle breeding. The diagnosis of this disease can be accomplished by identifying the parasites by histological sections or by detection of specific antibodies. However, serological methods can be hampered by cross-reactivity with other apicomplexa parasites, such as Toxoplasma gondii. Parasite-specific antigens used for detection of antibodies or in the production of antiserum for the detection of tachyzoites can improve the specificity and sensitivity of diagnostic tests and studies of the biology of the parasite. Among specific antigens of Neospora genus, NcSRS2 (Nc-p43) which is an immunodominant surface protein stands out. It is present in tachyzoites as well as bradyzoites. In this study, Nc-p43 protein was produced in its recombinant form (rNcp43), by inserting the gene NcSRS2 in the cloning vector pET100/DTOPO, which was used to transform Escherichia coli BL21 Star. rNc-p43 protein was evaluated for reactivity with immune sera from naturally infected bovine, ovine and canine species, and used to immunize BALB/c mice for the production of a polyclonal antibody (pAb). rNc-p43 (pAb/rNc-p43) antibody was conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) and the reactivity with the native protein on the surface of the parasite was evaluated by immunofluorescence. rNc-p43 protein was recognized by anti N. caninum present in immune sera by ELISA and dot blot and it was able to generate antibodies against the p43 antigen. The pAb/rNc-p43 reacted with the rNc-p43 protein in indirect ELISA and Western blotting, detecting N. caninum tachyzoites in direct and indirect immunofluorescence, with a fluorescence pattern only in the apical complex of the parasite, maintaining affinity even after conjugation with FITC. pAb/rNc-p43 showed no cross-reactivity with T. gondii. The results of this study suggest that the rNc-p43 obtained and the pAb produced can be useful in developing diagnostic tests based on the detection of specific antibodies and the antigen present on the surface of the parasite. / A neosporose é considerada uma doença de distribuição mundial, causada pelo protozoário apicomplexa Neospora caninum, causador de desordens neuromusculares em cães e abortos em bovinos, o que o torna um patógeno de relevância na bovinocultura. O diagnóstico desta enfermidade pode ser realizado através da identificação do parasito em cortes histológicos ou pela detecção de anticorpos específicos. No entanto, os métodos sorológicos aplicados podem ser dificultados por reações cruzadas com outros parasitos apicomplexas, como Toxoplasma gondii. Antígenos específicos do parasito utilizados para detecção de anticorpos ou na produção de insumos biológicos para a detecção de taquizoítos podem melhorar a especificidade e a sensibilidade dos testes de diagnóstico e de estudos da biologia do parasito. Entre os antígenos específicos de Neospora, destaca-se a proteína de superfície imunodominante NcSRS2 (Nc-p43), presente tanto em taquizoítos quanto em bradizoítos. Neste estudo, a proteína Nc-p43 foi produzida em sua forma recombinante (rNc-p43), através da inserção do gene NcSRS2 no vetor de clonagem pET100/DTOPO, o qual foi utilizado para transformar a bactéria Escherichia coli BL21 Star. A proteína rNc-p43 foi avaliada quanto a reatividade com soros imunes de animais naturalmente infectados das espécies bovina, ovina e canina; e utilizada para imunizar camundongos da linhagem BALB/c para a produção de um anticorpo policlonal (pAb). O anticorpo anti rNc-p43 (pAb/rNc-p43) foi conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e avaliado quanto a reação com a proteína nativa na superfície do parasito por imunofluorescência. A proteína rNc-p43 foi reconhecida por anticorpos anti N. caninum presente nos soros imunes, através de ELISA e Dot blot e foi capaz de gerar anticorpos contra o antígeno rNc-p43. O pAb/rNc-p43 reagiu com a proteína rNc-p43 em ELISA indireto e Western blotting, detectou taquizoítos de N. caninum em imunofluorescência indireta e direta, apresentando um padrão de fluorescência somente no complexo apical do parasito, mantendo sua afinidade mesmo após sua conjugação com FITC. O pAb/rNc-p43 não apresentou reação cruzada com T. gondii. Os resultados deste estudo sugerem que a rNc-p43 obtida e o pAb gerado podem ser úteis no desenvolvimento de testes de diagnóstico baseados na detecção de anticorpos específicos e do antígeno presente na superfície do parasito.

Alguns fatores de virulência em bactérias de microbiota normal, tais como sideróforos moléculas captadoras de ferro e determinadas fímbrias, possibilitam que esses microorganismos causem infecção quando a colonização ocorre fora de seu habitat normal. Dentre as diferentes espécies bacterianas da microbiota normal com potencial para causar doenças, como as infecções do trato urinário (ITUs), destaca-se Escherichia coli. Certas cepas dessa espécie bacteriana apresentam um plasmídeo (pColV) que contém um gene que codifica IutA, o receptor para a aerobactina férrica, que é um sideróforo frequentemente associado às ITUs. Recentemente, nosso grupo estabeleceu que IutA apresenta a capacidade de induzir proliferação de linfócitos B. Neste trabalho, objetivamos identificar as moléculas e os mecanismos que modulam a proliferação de linfócitos B induzida por IutA recombinante (rIutA) de E. coli. Para avaliar se a proliferação era dependente de outras células, foram realizados ensaios de proliferação de células B marcadas com CFSE utilizando o sobrenadante de macrófagos ou células dendríticas estimulados com rIutA, por 24 horas, ou coculturas em placas de transwell. As análises desses ensaios revelaram que a proliferação das células B induzida por rIutA é dependente de moléculas liberadas por células acessórias, ou seja, ocorre de forma indireta. Os resultados dos ensaios utilizando células deficientes da molécula adaptadora MyD88 mostraram dependência da sinalização por essa molécula nos linfócitos B, mas não nas células acessórias, para que ocorresse a proliferação. Posteriormente, os ensaios in vitro utilizando células de animais deficientes para TLR4, TLR2 e IL-33R mostraram que a sinalização por esses receptores é dispensável. Contrariamente, a utilização do antagonista do receptor de IL-1 reduziu significativamente a proliferação de células B tratadas com esse antagonista. Além disso, identificamos que rIutA leva à expressão de IL-1 em macrófagos e células dendríticas estimuladas com essa proteína. Assim, nossos resultados sugerem que rIutA de E. coli induz a proliferação policlonal de linfócitos B de maneira independente de células T, por um mecanismo mediado por células acessórias, como macrófagos e células dendríticas. Embora não identifiquemos o receptor macrofágico ou das células dendríticas a qual rIutA se liga, sugerimos que a ação de rIutA sobre essas células induz a produção de IL-1 que age sobre seu receptor em células B, induzindo-as a proliferação. Esses resultados abrem perspectivas de estudo de IutA como molécula estimuladora do tecido linfóide associado a mucosa, assim como evasina de E. coli patogênicas. / Indigenous bacteria may contain some virulence factors, such as siderophores iron chelator molecules and fimbriae, that allow these microorganisms to become pathogens in sites others than their normal habitat. Among the different indigenous bacterial species in the gut, Escherichia coli is one with potential to cause infections, mainly urinary tract infection (UTI). Certain strains of E. coli have a plasmid (pColV), which encode ferric aerobactin outer membrane receptor, IutA, often associated with UTI. Our group has recently described IutA as an inducer of B cell proliferation. Here, we identify the molecules and mechanisms that modulate the proliferation of B lymphocytes induced by recombinant IutA (rIutA) from E. coli. To determine whether the B cell proliferation induced by rIutA is dependent on other cell, we carried out assays with CFSE-labeled B cells cocultured separately with macrophages or dendritic cells stimulated with rIutA using transwell membranes or incubated with conditioned medium from these cells. The analysis of the results showed that rIutA indirectly induced the proliferation of B cells in a manner dependent on molecules released by accessory cells. When we analyzed the ability of rIutA in inducing proliferation of cells from mice deficient in adapter molecule MyD88, we found that this signaling molecule is crucial for signaling induced by rIutA in B cells, but not in accessory cells. A similar analysis with cells from mice deficient in Toll like receptor (TLR) 4, TLR2 or inteukin (IL-) 33 receptor revealed that these receptors were not required for rIutA signaling of any tested cells. Conversely, the pretreatment of the B cells with IL-1 receptor antagonist significantly decreased the proliferation of these cells in response to conditioned medium from cultures of IutAstimulated macrophages. Moreover, we determined that rIutA induced the expression of IL-1 in macrophages and dendritic cells stimulated with IutA. Altogether, our results suggest that IutA from E. coli induces polyclonal B-cell proliferation independently of T cells in a mechanism mediated by accessory cells such as macrophages and dendritic cells. Although the IutA-binding receptors from macrophages and dendritic cells have not been identified, we suggested that rIutA induces these cells to produce IL-1, which in turns acts on its receptor on B cells, triggering proliferation. These results open perspectives for studying IutA as a molecule that stimulates the mucosa-associated lymphoid tissue and as an immune-evasion molecule from pathogenic E. coli.