La polyarthrite rhumatoïde (PR) est le rhumatisme inflammatoire chronique le plus fréquent. La PR est une maladie génétique où il existe plusieurs allèles de susceptibilité HLA-DRB1. Les auto-anticorps anti-protéines citrullinées sont les plus spécifiques de la PR. Ils sont détectés par les tests anti-peptides cycliques citrullinés (anti-CCP). 1/L’objectif de notre premier travail était de montrer l’influence des allèles susceptibilité HLA-DR sur la présence d’anti-CCP dans notre population marseillaise de PR. Nous avons montré que les allèles de susceptibilité HLA-DR ne sont pas nécessaires à la présence des anticorps anti-CCP. Nous avons mis en évidence une association entre l’allèle HLA-DRB1*04:04 et la présence des anti-CCP.2/Environ un tiers des patients présentant une PR n’ont pas d’anticorps anti-CCP. Nous avons donc recherché des nouveaux auto-anticorps pour le diagnostic de la maladie.Les auto-anticorps dirigés contre le domaine catalytique de la protéine B-Raf (v raf murine sarcoma viral oncogen homologue B1) ont été identifiés par la technique des puces à protéines chez les patients PR. B-Raf est une sérine-thréonine kinase qui est impliquée dans la voie des MAP-kinases. Nous avons montré que les auto-anticorps anti-B-Raf activent B-Raf. Nous avons montré que le peptide p25 de B-Raf est spécifiquement reconnu par les auto-anticorps des PR. Les auto-anticorps anti-p25 identifient 21% des patients PR sans anticorps anti-CCP.3/En utilisant des puces à protéines, nous avons identifié 24 nouveaux auto-antigènes associés aux PR débutantes. Quatre de ces auto-antigènes ont été validés par ELISA : GABA(A) receptor associated protein like, zinc finger protein 706, tropomyosin 2 et WIBG (within BGCN homolog (Drosophila)). Les auto-anticorps anti-WIBG identifient exclusivement les PR.Ces nouveaux auto-antigènes pourront être utilisés dans le diagnostic des PR débutantes et des PR sans anticorps anti-CCP. / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease with a prevalence of 0.5% wordwilde. HLA-DR genes are the strongest genetic prevalence in RA. The sera of RA patients contain many auto-antibodies. The most characteristic are directed at citrullinated proteins (ACPA). ACPA can be detected by commercially available enzyme-linked immune-absorbent assays using synthetic cyclic citrullinated peptides (CCP).1/In the first work we tested whether the presence of RA associated HLA-DRB1 alleles individually influences anti-CCP production in a population of RA from Marseille. We showed RA associated HLA-DR alleles are not mandatory for the production of anti-CCP. HLA-DRB1*04:04 was the most strongly associated with the presence of anti-CCP in RA sera. 2/ Anti-CCP antibodies are detected in 65% of RA patients. We wanted to detect new auto-antibodies for the diagnosis of RA.By screening protein arrays we found that B-Raf (v raf murine sarcoma viral oncogen homologue B1) is a major non-citrullinated auto-antigen recognized by 35% of RA patients’sera. B-Raf encodes a serine threonine-kinase involved in the MAPK signaling pathway. We showed that anti-B-Raf auto-antibodies activate the in vitro phosphorylation of MEK1 mediated by B-Raf.We found that one peptide of B-Raf, p25, is specifically recognized by auto-antibodies from RA patients. Of interest, anti-p25 auto-antibodies are detected in 21% of anti-CCP negative RA patients.3/We identified 24 new auto-antigens associated with RA patients with disease duration less than one year using 8000 human protein arrays. We identified four auto-antigens recognized almost uniquely by sera of early RA patients: GABA(A) receptor associated protein like, zinc finger protein 706, tropomyosin 2 and WIBG (within BGCN homolog (Drosophila)). These reactivities were confirmed by ELISA on purified proteins. Auto-antibodies to anti-WIBG identify exclusively RA patients’sera. These new auto-antigens could be used for the diagnosis of anti-CCP negative RA patients and in early RA.

La notion d’instauration rapide d’un traitement efficace et agressif dans la polyarthrite débutante a renforcé la nécessité de disposer de mesures d’utilité validées afin d’optimiser l’évaluation médico-économique de ces traitements. Actuellement, il n’y a pas de consensus sur le choix du questionnaire multi-attributs à utiliser pour le calcul des utilités. L’objectif de cette thèse est donc d’étudier les niveaux, les performances et les déterminants des 2 outils indirects de mesure d’utilité (EQ-5D et SF-6D) dans la polyarthrite débutante, au travers des données de la cohorte ESPOIR, cohorte multicentrique française de polyarthrites débutantes. En conclusion, l’EQ-5D et le SF-6D ne sont pas interchangeables dans la polyarthrite débutante : ils ont des échelles, des distributions, une reproductibilité et une sensibilité au changement différentes. Ils ne donnent pas les mêmes résultats surtout quand les patients ont un mauvais état de santé et plus particulièrement une incapacité fonctionnelle importante. La distribution bimodale de l’EQ-5D, sa moins bonne reproductibilité, le fait qu’il soit moins sensible à l’amélioration, sa plus grande variabilité dans l’estimation du gain d’utilité et donc des QALYs, les problèmes soulevés par la signification d’un état « pire que la mort » (qui n’est pas celle du patient), favoriseraient plutôt l’utilisation du SF-6D dans les essais sur les nouvelles biothérapies dans la polyarthrite débutante / The explosion of drug development for rheumatoid arthritis and the revolution of early aggressive therapy for the disease have fuelled the search for better approaches to establish cost-effectiveness in early arthritis (EA), but consensus is lacking on the choice of utility instrument. We aimed to compare the EQ-5D and SF-6D, 2 indirect utility measures widely used to calculate quality-adjusted life-years (QALYs), in terms of their utility values, their performance and their determinants in a large prospective cohort of patients with EA. In conclusion, the EQ-5D and SF-6D are not interchangeable: their scales, distributions, reliability and responsiveness are different. There is systematic disagreement between the EQ-5D and SF-6D in EA especially in patients with worse clinical outcomes and more specifically with high functional disability. Several elements suggest that the SF-6D may be more appropriate for clinical trials of biologics in patients with EA: the bimodal distribution of the EQ-5D, its lower reliability and responsiveness for EA improvement than the SF-6D, its high variability in the estimation of the utility gains and thus QALYs gains and the problems raised by the meaning of a state labeled " worse than the death " (which is not the one from the patient)

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est le rhumatisme inflammatoire chronique le plus fréquent. Cette maladie est caractérisée par une auto-immunité et une synovite hypertrophique, responsables d'une destruction des articulations périphériques. Les macrophages contribuent aux phénomènes inflammatoires de la PR. Ces cellules peuvent présenter différents états d'activation ou " polarisation ", réversibles, dépendant de leur environnement, notamment cytokinique. Les biothérapies (bDMARDs) ont représenté une avancée majeure dans la prise en charge des manifestations inflammatoires des formes sévères de PR. Toutefois, peu d'études ont évalué si ce bénéfice était lié à une action spécifique sur le macrophage. L'objectif de ce travail de transversal était : (i) d'évaluer in vitro l'effet des principales biothérapies de la PR (anti-TNF : etanercept, adalimumab, certolizumab ; anti-IL- 6R : tocilizumab ; CTLA4-Ig : abatacept) sur la différenciation et l'activation de macrophages dérivés de monocytes issus de patients atteints de PR et de sujets sains, (ii) d'identifier des marqueurs de polarisation du macrophage, corrélés à l'activité de la maladie (DAS28). Parmi les bDMARDs évalués, seuls les anti-TNF ont montré une action sur la polarisation des macrophages. En contexte de différenciation avec M-CSF, les bDMARDs anti-TNF ont induit un biais vers une polarisation non inflammatoire dite alternative. En contexte d'activation inflammatoire, les bDMARDs anti-TNF ont induit une préservation sélective des marqueurs de polarisation liés à l'IL-10 (CD16, CD163, MerTK) et une inhibition des marqueurs inflammatoires (CD40, CD80). Nous avons montré que ce changement phénotypique s'accompagnait : (i) d'un changement fonctionnel concordant avec une polarisation induite par l'IL-10, (ii) d'une inhibition de la production des cytokines de l'inflammation (TNF, IL-6, IL-12), (iii) et d'une majoration de la phagocytose. Nous avons montré que ce mécanisme était dû à une production précoce d'IL-10 et dépendant de STAT3. De plus, nous avons pu montrer que le certolizumab, un anti-TNF, induisait une réponse anti-inflammatoire, impliquant le facteur de transcription NRF2 (nuclear factor erythroid-2-related factor 2), un régulateur central dans la réponse au stress oxydatif. Enfin, nous avons observé que l'expression de CD16, à la surface des macrophages non activés, était corrélée négativement à l'activité de la PR. Ces travaux concourent à montrer l'intérêt du ciblage du macrophage dans la PR et nous ont d'identifier de potentielles cibles théranostiques dans le traitement de la PR par anti-TNF. / Rheumatoid arthritis (RA) is the most frequent chronic inflammatory rheumatism. This disease is characterized by an auto-immunity and a hyperplasic synovitis, both responsible for peripheral joints destruction. Macrophages contribute to inflammatory aspects of RA. This cell type can present various states of activation or "polarization", reversible and dependent on its environment, notably cytokines. Biologics (bDMARDs) represented a revolution in severe RA treatment. However, data regarding their specific action on macrophage are scarce. The aim of our translational work was: (i) to assess the in vitro effect of RA bDMARDs (anti-TNF: etanercept, adalimumab, certolizumab; anti-IL-6R: tocilizumab; CTLA4-Ig: abatacept) on the phenotype of monocytes-derived-macrophages from RA patients and healthy volunteers, during differentiation and activation phases, (ii) to identify polarization markers correlated with disease activity (DAS28). Among bDMARDs, only anti-TNF modulated macrophage polarization. During differentiation, anti-TNF bDMARDs induced a bias toward the so-called alternative non-inflammatory polarization. In inflammatory context, anti-TNF bDMARDs induced a selective preservation of markers associated with IL-10 (CD16, CD163, MerTK) and an inhibition of inflammatory markers (CD40, CD80). We showed that these changes in phenotype were associated with changes in functions consistent with: (i) a polarization induced by IL10, (ii) a decrease in inflammatory cytokines production (TNF, IL-6, IL-12), (iii) and an increase in phagocytosis. We showed that this mechanism was dependant on early IL-10 production and STAT3 signaling. Moreover, we have showed that certolizumab, an anti-TNF agent, induced an anti-inflammatory response, implicating the transcription factor NRF2 (nuclear factor erythroid-2- related factor 2), a central regulator of the response to oxidative stress. We observed that CD16 expression on non-activated macrophages was negatively correlated with RA activity. This work contributes to demonstrate the relevance of macrophage targeting in RA, and enabled us to identify theranostic targets for RA treatment with anti-TNF bDMARDs.

Le lymphocyte B (LB) joue un rôle important dans la polyarthrite rhumatoïde (PR), en produisant des auto-anticorps qui ont un rôle pathogène, en activant les lymphocytes T, en sécrétant des cytokines pro-inflammatoires et en permettant la formation de centres germinatifs. Plus récemment, il a été montré que le LB pouvait également produire de l'interleukine (IL) 10, une cytokine anti-inflammatoire qui lui procure des fonctions régulatrices. Ces B régulateurs ont notamment la capacité de différencier les lymphocytes T en T régulateurs. De nombreux traitements sont actuellement disponibles dans la PR, notamment les anti-TNF alpha et les inhibiteurs du récepteur de l'IL-6 (tocilizumab). Dans la première partie de cette thèse, nous avons comparé les LB circulants de patients atteints de PR et de contrôles. Nous avons étudié l'influence de l'activité de la maladie et des traitements sur les LB. Nous avons montré qu'il existait une lymphopénie B globale chez les patients atteints de PR avec une répartition des différents sous-types de LB superposable à celle des contrôles. Les patients ayant une maladie active avaient significativement plus de LB mémoires totaux, pré- et post-switch, CD24hiCD27+ et double négatifs que les patients ayant une maladie peu active. Les traitements anti-TNF et le tocilizumab ne modifiaient pas la répartition des sous-types de LB. Nous avons également montré qu'un taux de plus de 26% de LB mémoires CD27+ avant l'instauration d'un traitement par anti-TNF était associé à la réponse clinique à 3 mois. Les LB mémoires semblent produire plus de TNF que les LB naïfs et par ce biais pourraient induire une réponse Th1. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons tout d'abord cherché à mieux définir les LB régulateurs. Nous avons ensuite étudié leur présence et leur rôle dans la PR. Chez les sujets sains, les LB CD24hiCD27+ et CD24hiCD38hi semblent produire plus d'IL-10 que les autres LB, qui peuvent néanmoins en sécréter. Il semble donc plus adapter de définir les B régulateurs comme B producteurs d'IL-10 ou B10. Les patients atteints de PR avaient significativement moins de B10 que les contrôles en pourcentage et en valeur absolue. Chez les patients ayant un facteur rhumatoïde (FR) positif, il y avait une corrélation inverse entre le pourcentage de B10 et le taux de FR. Il y avait une corrélation inverse entre l'activité de la maladie (DAS28) et le pourcentage de B10, qui était particulièrement marquée pour les PR évoluant depuis moins de 5 ans. Chez ces patients, il y avait également une corrélation inverse entre les B10 et l'inflammation biologique (protéine C réactive). L'instauration d'anti-TNF ou de tocilizumab ne modifiait pas le taux de B10. Les CD24hiCD27+ et CD24hiCD38hi induisaient plus de lymphocytes T régulateurs chez les contrôles que les autres LB (CD24lo/-) alors que ça n'était plus le cas chez les patients atteints de PR, montrant que ces sous-types ont perdu cette fonction régulatrice dans la PR. En conclusion, bien qu'il existe une lymphopénie B, la répartition des sous-types de LB ne semble pas différente entre les patients atteints de PR et les contrôles. Néanmoins, il existe des anomalies fonctionnelles avec notamment une perte de la capacité à produire de l'IL-10 et à induire des T régulateurs chez les patients atteints de PR. / B cells play an important role in rheumatoid arthritis (RA), producing autoantibodies which have a pathogenic role, activating T cells, secreting pro-inflammatory cytokines and allowing the formation of germinal centers. More recently, it was shown that the B cells could also produce interleukin (IL)-10, an anti-inflammatory cytokine which provides their regulatory functions. Those regulatory B cells have the ability to differentiate T cell into regulatory T cells. Many treatments are currently available in RA, including TNF-alpha inhibitors and IL-6 receptor inhibitor (tocilizumab). In the first part, we compared circulating B cells in RA patients and in controls, and we studied the influence of disease activity and treatment on B cells. We have shown that there is a global B cell lymphopenia in RA patients with a similar B cell subtype distribution as controls. Patients with active disease had significantly more pre- and post-switch, CD24hiCD27+ and double negative memory B cells than patients with low disease activity. Anti -TNF treatment and tocilizumab did not change the distribution of B cell subsets. We also showed than patient with more than 26% of CD27+ memory B cells prior TNF inhibitor initiation was associated with clinical response at 3 months. Memory B cells produced more TNF alpha than naive B cells and can potentially induce a Th1 response. B cell subtypes were not associated with response to tocilizumab. In the second part, we first sought to better define regulatory B cells. We then studied their presence and role in RA. In healthy subjects, CD24hiCD27+ and CD24hiCD38hi B cells seem to produce more IL-10 than the other B cells that can nevertheless rarely produce some. It seemed more acurate to define regulatory B cells as IL-10 producing B cells also called B10 cells. Patients with RA had significantly less B10 cells than controls in percentage and absolute values. In rheumatoid factor (RF) positive patients, there was an inverse correlation between the percentage of B10 and the rate of RF. There was an inverse correlation between disease activity (DAS28) and the percentage of B10, which was particularly significant for patients with a disease duration of less than 5 years. In these patients, there was also an inverse correlation between B10 and biological inflammation (C-Reactive Protein). TNF inhibitors or tocilizumab did not change B10 cell rate. The CD24hiCD27 + and CD24hiCD38hi induce more regulatory T cells in controls than other LB (CD24lo/-) while it was not the case in patients with RA, indicating that these subtypes have lost this regulatory function in RA. In conclusion, although there are B cell lymphopenia, the distribution of B cell subsets does not seem to differ between RA patients and controls. Nevertheless, there are functional abnormalities including a loss of the ability to produce IL -10 and induce regulatory T in patients with RA.

Les activités de recherche présentées dans ce document s'articulent en deux parties distinctes. La première partie concerne des travaux réalisés au sein de l'équipe du Pr Guy Serre, à la faculté de Médecine Purpan et portant sur la caractérisation des antigènes cibles d'auto-anticorps associés à une maladie auto-immune, la polyarthrite rhumatoïde. La seconde partie, réalisée au sein de l'Unité Mixte CNRS-Pierre Fabre dirigée par le Pr Jean-Edouard Gairin, est centrée sur l'étude d'un système biologique impliqué dans la dégradation des protéines intracellulaires, le système ubiquitine-protéasome et pouvant générer des cibles d'intérêt thérapeutique dans le domaine du cancer.<br /> <br />1. La polyarthrite rhumatoïde et les auto-anticorps anti-protéines citrullinées :<br /><br />La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune d'étiologie inconnue, caractérisée par une inflammation chronique et destructive des articulations synoviales. Le processus auto-immun rhumatoïde fait l'objet d'intenses recherches et bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension de certains mécanismes immuno-pathologiques mis en jeu, il n'a pas été possible d'identifier un élément unique comme responsable du processus inflammatoire auto-immun. Il est donc communément admis aujourd'hui que c'est la combinaison de divers facteurs qui détermine l'apparition et l'entretien de la maladie. <br />La présence dans le sérum des patients, d'anticorps décrits pour leur marquage du Stratum Corneum (ou couche cornée) de l'épithélium d'œsophage de rat et de l'épiderme humain, s'est avérée comme une caractéristique suffisamment fréquente et spécifique de la maladie rhumatoïde pour qu'on puisse les suspecter de jouer un rôle significatif dans les processus responsables de l'inflammation articulaire chronique. Afin de mieux comprendre le rôle joué par ces auto-anticorps qualifiés alors d'anticorps « anti-kératines » dans la pathogénie rhumatoïde, il était essentiel d'identifier leur cible antigénique. L'analyse par immunotransfert, à l'aide de sérums rhumatoïdes, d'extraits d'épithélium d'œsophage de rat a permis de détecter, comme cibles murines des auto-anticorps, trois antigènes solubles dans des tampons de faible force ionique. Ces trois protéines ne correspondent pas à des cytokératines mais à de nouvelles protéines spécifiques des étapes tardives du programme de différenciation de l'épithélium d'œsophage de rat. D'autre part, l'antigène ciblé dans l'épiderme humain a été identifié à un variant acide de la filaggrine, protéine jouant un rôle physiologique dans l'agrégation des filaments de kératines de l'épiderme. Ces formes acides sont générées in situ par modification post-traductionnelle des résidus arginine basiques en résidus citrulline par une enzyme, la peptidyl arginine déiminase, exprimée dans l'épiderme. Cette modification a pu être reproduite in vitro après action de la peptidyl-arginine déiminase (PAD) sur divers polypeptides dérivés de la séquence de la filaggrine et il a été ainsi montré que les épitopes reconnus par les auto-anticorps pouvaient être générés par la déimination post-traductionnelle des filaggrines.<br /> Toutefois, la filaggrine n'étant pas exprimée dans les tissus osseux et synoviaux, nous avons recherché une cible articulaire de ces anticorps portant des épitopes déiminés et immunologiquement apparentée à la filaggrine. Ayant à disposition des tissus synoviaux provenant d'une série de patients, deux protéines, p55-61 et p64-78, portant toutes deux des résidus citrullines ont été extraites des membranes synoviales et reconnues spécifiquement par les sérums rhumatoïdes; ces protéines ont été identifiées aux chaînes a et b de la fibrine. Le fait que ces deux protéines ne soient ciblées par les sérums rhumatoïdes qu'après déimination par une PAD, soulignait soulignait le rôle émergent d'une « immunité anti-citrulline » reconnue aujourd'hui comme pouvant être à la base de certains dérèglements impliqués dans diverses maladies auto-immunes.<br /><br />2- Le système ubiquitine-protéasome et ses implications dans le cancer :<br /><br />Le protéasome est un complexe multicatalytique présent dans le cytoplasme et le noyau de toutes les cellules eucaryotes. Il constitue la machinerie protéolytique de la voie ubiquitine-protéasome, voie majeure responsable de la dégradation des protéines intracellulaires. Cette voie détermine la durée de vie et la concentration de nombreuses enzymes et protéines régulatrices dont beaucoup jouent un rôle dans les processus de cancérisation.<br /> Afin de mieux connaître le fonctionnement de cette machinerie protéolytique, nous avons étudié les mécanismes moléculaires intervenant dans la régulation du protéasome 20S qui constitue le cœur catalytique du système. L'analyse protéomique du protéasome 20S préparé à partir de cellules humaines non pathologiques a permis l'identification de l'ensemble des sous-unités constitutives du protéasome 20S et a révélé l'existence de modifications post-traductionnelles de type phosphorylation. Deux nouvelles sous-unités phosphorylées , les sous-unités b2 et b7, ont pu être identifiées posant ainsi la question du rôle joué par ces phosphorylations dans la régulation fonctionnelle du protéasome 20S. <br /> L'analyse similaire des protéasomes exprimés dans diverses lignées tumorales a révélé une complexité structurale importante avec en particulier la co-expression de deux formes de protéasomes : le protéasome dit standard et l'immunoprotéasome. L'étude fonctionnelle de ces protéasomes a montré une sensibilité différente de ces deux formes à certaines molécules de la chimiothèque de substances naturelles purifiées dans l'UMS de Chimie CNRS-Pierre Fabre. En accord avec ceci, l'analyse comparative des protéasomes présents dans les cellules normales comparées à ceux présents dans les cellules tumorales d'un même patient a confirmé la surexpression de l'immunoprotéasome dans les cellules cancéreuses. Le système ubiquitine-protéasome est un système cellulaire particulièrement sensible aux facteurs micro-environnementaux et l'induction de l'immunoprotéasome témoigne de ce processus. Dans ce contexte, nos résultats font émerger la question de l'impact de l'immunoprotéasome sur la dérégulation du système ubiquitine-protéasome dans la cellule tumorale. Afin de répondre à cette question, des lignées de lymphomes surexprimant l'immunoprotéasome ont été développées ainsi que des substrats peptidiques fluorescents spécifiques de l'immunoprotéasome ou du protéasome.<br />Outre une meilleure connaissance de cette machinerie protéolytique, la continuité de ce travail devrait aboutir à l'identification de nouveaux agents pharmacologiques anti-tumoraux. Enfin, il s'intègre pleinement dans la logique de l'UMR 2587 CNRS-Pierre Fabre en témoignant d'un effort de recherche focalisé sur des systèmes biologiques pouvant générer des cibles d'intérêt thérapeutique dans le domaine du cancer.

Le criblage virtuel est largement employé pour la recherche de nouveaux médicaments.La sélection de structures pour les méthodes de criblage virtuel basées sur la structure reste problématique. Nous avons montré que les propriétés physico-chimiques du site de liaison, critères simples et peu coûteux en temps de calcul, pouvaient être utilisées pour guider celle-ci.L’évaluation des méthodes de criblage virtuel, critique pour vérifier leur fiabilité, repose sur la qualité de banques d’évaluation. Nous avons construit la NRLiSt BDB, n’incluant que des données vérifiées manuellement et prenant en compte le profil pharmacologique des ligands. Une étude à l’aide du logiciel Surflex-Dock montre qu’elle devrait devenir la base de données de référence, pour l’évaluation des méthodes de criblage virtuel et pour rechercher de nouveaux ligands des récepteurs nucléaires. L’application d’un protocole hiérarchique de criblage in silico/in vitro, a permis d’identifier de nouveaux composés inhibiteurs de l’IL-6, potentiellement utilisables dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Les résultats in vitro devront être confirmés par des tests in vivo. / Virtual screening is widely used in drug discovery processes.Structure selection in structure-based virtual screening methods is still problematic. We showed that simple and “low cost” binding site physico-chemical properties could be used to guide structure selection.The evaluation of virtual screening methods, necessary to ensure their reliability, relies on benchmarking databases quality. We created the NRLiSt BDB, gathering only manually curated data and taking into account ligands pharmacological profiles. A study using Surflex-Dock showed that the NRLiSt BDB should become the reference, both for the evaluation of virtual screening methods and for the identification of new ligands of the nuclear receptors.The use of a in silico/invitro hierarchical approach screening allowed to identify new IL-6 inhibitors, that could be used in rheumatoid arthritis treatment. In vitro results should be confirmed in vivo.

La Polyarthrite Rhumatoïde, caractérisée par une synovite à l'origine de lésions progressives ostéo-articulaires, est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires. Les formes réactives de l'oxygène (ROS) produites par la NADPH oxydase des polynucléaires neutrophiles (PMN) infiltrant le pannus rhumatoïde, sont responsables de lésions tissulaires. La NADPH oxydase des phagocytes, est formée d'un centre catalytique membranaire, le cytochrome b558, sur lequel vient s'associer des protéines cytosoliques régulatrices (p67phox, p47phox, p40phox et Rac1/2). L'étude du complexe NADPH oxydase isolé et constitutivement actif, à partir de PMN activés, a révélé la présence de deux enzymes impliquées dans la régulation du métabolisme du glucose. Il s'agit de la PFK2 (6-phosphofructokinase 2) et de la 6PGDH (6-phosphogluconate déshydrogénase) [Paclet et al. 2007]. De plus, l'étude des protéines cytosoliques retenues sur une matrice d'affinité ciblant p47phox, a établi que les protéines S100A8 et S100A9, constituant 40% des protéines cytosoliques du PMN, participent à l'activation de l'oxydase [Berthier et al. 2003]. L'hétérocomplexe S100A8/A9, augmente l'activité de la NADPH oxydase phagocytaire et induit un changement conformationnel du cytochrome b558. Au regard de l'importance de la stimulation du PMN dans la physiopathologie de la PR, notre objectif, à terme, est d'analyser les mécanismes de l'activation de la NADPH oxydase dans cette pathologie. D'une part, nous avons étudié la spécificité de l'interaction entre la 6PGDH ou la PFK2 et la NADPH oxydase des PMN. D'autre part, nous avons caractérisé les domaines de l'hétérocomplexe S100A8/A9 impliqués dans l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire. Par ailleurs, une étude de la signature protéique dans le liquide synovial a été menée afin de rechercher l'empreinte de l'activation du PMN dans la PR et de caractériser des biomarqueurs spécifiques de cette pathologie. Après stimulation par le PMA, la 6PGDH et la PFK2 co-imunoprécipitent avec les facteurs cytosoliques p67phox, p47phox and p40phox. Les expériences de microscopie confocale suggèrent une co-localisation de ces deux enzymes du métabolisme du glucose avec la NADPH oxydase, dans des micro-domaines membranaires : les radeaux lipidiques. La 6PGDH est impliquée dans l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire en élevant la concentration du NADPH cytosolique mais également en augmentant l'affinité de cette enzyme pour son substrat, le NADPH. PFK2 est l'enzyme majeure de la régulation de la glycolyse. Dans les neutrophiles, cette voie est essentielle pour la production d'ATP disponible, d'une part, pour la phosphorylation des facteurs cytosoliques de la NADPH oxydase et d'autre part, pour la NDP Kinase. Cette dernière enzyme pourrait, secondairement, activer Rac en formant du GTP à partir d'ATP. Les protéines S100A8/A9 sont directement impliquées dans les mécanismes de régulation de la NADPH oxydase. L'utilisation du complexe S100A8/A9 et de protéines chimères de fusion nous a permis de révéler que la partie C-terminale de S100A8 est impliquée dans la liaison avec le cytochrome b558 et l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire. In vivo, le profil protéique du liquide articulaire de PR a mis en évidence l'empreinte de l'activation du PMN dans cette pathologie. Les protéines S100A8, S100A9 permettraient de différencier le liquide synovial rhumatoïde de celui de patients arthrosiques ou souffrant d'arthrites non rhumatoïdes. De manière intéressante, une production ectopique de S100A8/A9 par les synoviocytes de type fibroblastique a été mise en évidence, suggérant une implication potentielle de ces protéines dans la physiopathologie de la PR. En conclusion, la 6PGDH, la PFK2 et l'hétérodimère S100A8/A9 sont de nouveaux partenaires d'activation de la NADPH oxydase des phagocytes. Dans la Polyathrite Rhumatoïde, l'activation des PMNs conduit à la sécrétion de S100A8/A9 qui semblent constituer à la fois des biomarqueurs pertinents, mais également des cibles thérapeutiques potentielles.

La Polyarthrite Rhumatoïde est caractérisée par une synovite à l'origine de lésions progressives ostéo-articulaires induites par les formes réactives de l'oxygène (ROS) produites par la NADPH oxydase des polynucléaires neutrophiles (PMN). La NADPH oxydase des phagocytes, est formée d'un centre catalytique membranaire, le cytochrome b558, sur lequel vient s'associer des protéines cytosoliques régulatrices (p67phox, p47phox, p40phox et Rac1/2). Nous avons étudié la spécificité de l'interaction entre la (6-phosphofructokinase 2) et de la 6PGDH (6-phosphogluconate déshydrogénase) et la NADPH oxydase des PMN. D'autre part, nous avons caractérisé les domaines de l'hétérocomplexe S100A8/A9 impliqués dans l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire. Par ailleurs, une étude de la signature protéique dans le liquide synovial a été menée afin de rechercher l'empreinte de l'activation du PMN dans la PR.Après stimulation par le PMA, la 6PGDH et la PFK2 co-imunoprécipitent avec les facteurs cytosoliques p67phox, p47phox and p40phox. Les expériences de microscopie confocale suggèrent une co-localisation de ces deux enzymes du métabolisme du glucose avec la NADPH oxydase, dans des micro-domaines membranaires : les radeaux lipidiques. La 6PGDH est impliquée dans l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire en élevant la concentration du NADPH cytosolique mais également en augmentant l'affinité de cette enzyme pour son substrat, le NADPH. PFK2 est l'enzyme majeure de la régulation de la glycolyse, voie est essentielle pour la production d'ATP du PMN. L'utilisation du complexe S100A8/A9 et de protéines chimères de fusion nous a permis de révéler que la partie C-terminale de S100A8 est impliquée dans la liaison avec le cytochrome b558 et l'activation de la NADPH oxydase phagocytaire. In vivo, le profil protéique du liquide articulaire de PR a révélé l'empreinte de l'activation du PMN dans cette pathologie avec une surexpression des protéines S100A8 et S100A9. Une production ectopique de S100A8/A9 par les synoviocytes de type fibroblastique a été mise en évidence.En conclusion, la 6PGDH, la PFK2 et l'hétérodimère S100A8/A9 sont de nouveaux partenaires d'activation de la NADPH oxydase des phagocytes. Dans la PR, l'activation des PMNs conduit à la sécrétion de S100A8/A9 qui semblent constituer à la fois des biomarqueurs pertinents, mais également des cibles thérapeutiques potentielles.

La polyarthrite Rhumatoïde (PR) et le syndrome de Sjögren primitif (pSS) sont des deux maladies auto-immunes invalidantes pour lesquelles il n’existe à ce jour pas de traitement permettant la guérison des patients. Bien que les lymphocytes B soient impliqués dans le développement ces pathologies, l’existence de lymphocytes B capables de réguler l’inflammation est maintenant largement reconnue. Ces lymphocytes B régulateurs (Bregs) sont capables à la fois d’induire des lymphocytes T régulateurs et d’empêcher le développement de lymphocytes T pro-inflammatoires. In vivo, le transfert de ces Bregs est protecteur dans de nombreux modèles murins de maladies auto-immunes suggérant ainsi que promouvoir ces Bregs serait prometteur pour traiter les patients atteints de PR ou pSS. Cependant, il n’existe à ce jour pas de marqueur spécifique des Bregs, ce qui complique leur étude. Comme leurs fonctions régulatrices sont principalement médiées par l’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, les Bregs peuvent être définis par leur capacité à produire de l’IL-10 après activation par des composés bactériens, notamment CpG, motifs mimant l’ADN microbien. Ces Bregs sont appelés B10+. Toutefois, les fonctions de ces B10+ ne sont pas bien définies chez l’homme. Ainsi, nous ignorons si la seule production d’IL-10 est suffisante pour définir les Bregs.Cette thèse a donc pour premier objectif de définir les fonctions les B10+ stimulés par CpG chez les individus sains et chez les patients, afin de déterminer si la production d’IL-10 était un bon marqueur des Bregs. Nous avons montré que les B10+ induits par CpG étaient capables d’induire des lymphocytes T régulateurs (Tregs et Tr1) mais ne diminuaient pas la proportion de lymphocytes T pro-inflammatoires (Th1 et LT-TNFα+). Chez les patients PR et pSS, les B10+ induisaient des Tregs et Tr1 mais chez les patients PR, ils induisaient également des Th1. Ces résultats suggèrent que la production d’IL-10 seule ne suffit pas à récapituler toutes les fonctions régulatrices des Bregs, et que le stimulus CpG impacte probablement leur fonctions.Pour mieux comprendre les mécanismes contrôlant la production d’IL-10 des lymphocytes B et pouvoir proposer d’autres stimuli pour les générer, nous avons étudié l’effet de l’acétate, un composé produit par les bactéries commensales, sur la génération des B10+. L’acétate était capable d’induire des B10+ chez la souris et chez l’homme. D’autre part, nous avons également étudié le métabolisme cellulaire de ces B10+. Nous avons montré que la glutamine était un nutriment essentiel à la génération des B10+ et à leurs fonctions régulatrices. En définitive, ce travail a permis de définir les fonctions des B10+ induits par CpG, de caractériser leur métabolisme et de proposer de un stimulus alternatif pour générer les B10+. / Rheumatoid arthritis (RA) and primary Sjögren's syndrome (pSS) are two debilitating autoimmune diseases. There is currently no treatment to cure patients. Although B lymphocytes are involved in the development of these pathologies, the existence of B cells capable of regulating inflammation is now widely recognized. These regulatory B cells (Bregs) are able of both inducing regulatory T cells and preventing the development of pro-inflammatory T cells. In vivo, the transfer of these Bregs is protective in many mouse models of autoimmune diseases thus suggesting that promoting these Bregs would be promising for treating patients with RA or pSS. However, there is currently no specific marker for Bregs, which largely hinders their study. Since their regulatory functions are mainly mediated by IL-10, an anti-inflammatory cytokine, Bregs can be defined by their ability to produce IL-10 after activation by bacterial compounds, including CpG. Those Bregs are called B10+ cells. However, the functions of these B10+ cells are not well defined in humans. We do not know whether IL-10 production is a sufficient marker to define Bregs.The main goal of this thesis was to define CpG-induced B10+ cell functions in healthy individuals and patients, to determine whether IL-10 production was a good marker for Bregs. We showed that CpG-induced B10+ cells were able to induce regulatory T cells (Tregs and Tr1) but did not decrease the proportion of pro-inflammatory T cells (Th1 and LT-TNFα +). In RA and pSS patients, B10+ cells induced Tregs and Tr1 but in RA patients they also induced Th1. These results shows that IL-10 production alone does not recapitulate all the Breg functions and that CpG stimulation might impact their functions.To better understand the mechanisms controlling IL-10 production by B cells, and to be able to propose other stimuli to generate them, we studied the effect of acetate, a compound produced by commensal bacteria, on B10+ cells generation. Acetate was able to induce B10+ cells in mice and humans. Besides, we studied B10+ cell metabolism. We have showed that glutamine was an essential nutrient for B10+ cell generation and for their regulatory functions. This work has made it possible to define the CpG-induced B10+ cell functions, to characterize their metabolism and to propose an alternative stimulus to generate B10+ cells.

Peu d’hommes sont touchés par les maladies auto-immunes (MAI), maladies où la réponse immune est très forte et attaque l’hôte. La polyarthrite rhumatoïde (PR), une maladie inflammatoire chronique, suit cette règle avec 3 femmes pour 1 homme atteint. Dans cette thèse, nous analysons les différences en fonction du sexe et les raisons d’un tel biais. D’après des observations chez l’animal, nous nous sommes demandés si les rares hommes atteints de PR ont une augmentation du nombre de copies d’un gène impliqué dans la réponse immune et porté par le chromosome (Chr) X. Contrairement aux femmes, les hommes n’ont qu’un Chr X et de ce fait qu’une copie de ce gène. Cependant, nous avons montré par différentes techniques, que ces patients avaient 10% de cellules portant 2 copies de ce gène, et que cette augmentation venait de cellules ayant 2 Chr X. Nos recherches soulignent l’importance du Chr X dans l’auto-immunité et ouvrent un nouveau champ d'investigation pour les hommes atteints de MAI. / Few men are affected by autoimmune diseases (AID), diseases where the immune response is very strong and attacks the host. Rheumatoid arthritis (RA), a chronic inflammatory disease, follows this rule with 3 women affected for 1 man. In this thesis, we analyse gender differences and the reasons for such bias. Based on observations in animals, we wondered whether the rare men with RA have an increased copy number of a gene involved in the immune response and carried by the X chromosome (Chr). Unlike women, men have only one X Chr and one copy of this gene. However, we showed by different techniques that these patients had 10% of cells carrying 2 copies of this gene, and that this increase came from cells with 2 X Chr. Our research emphasizes the importance of the X Chr in autoimmunity and opens up a new field of investigation for men with AID.