Submitted by Maria Creuza Silva (mariakreuza@yahoo.com.br) on 2013-09-04T13:46:01Z No. of bitstreams: 1 Tese. Ligia Gabrielli. 2013.pdf: 1026296 bytes, checksum: 89f63e16b88a791cbbe005081c01884e (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Creuza Silva(mariakreuza@yahoo.com.br) on 2013-09-04T13:53:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese. Ligia Gabrielli. 2013.pdf: 1026296 bytes, checksum: 89f63e16b88a791cbbe005081c01884e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-04T13:53:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese. Ligia Gabrielli. 2013.pdf: 1026296 bytes, checksum: 89f63e16b88a791cbbe005081c01884e (MD5) Previous issue date: 2013 / A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é a doença endócrina mais freqüente em mulheres com idade reprodutiva. Apresenta prevalência entre 2 e 15%, tendo sido estimada em 8,5% (IC 95%: 6,80-10,56) em Salvador, Brasil. Caracteriza-se por fenômenos relacionados à oligoovulação, hiperandrogenismo e subfertilidade, além de se constituir numa síndrome metabólica que predispõe à obesidade, diabetes mellitus tipo 2, hipertensão e dislipidemia. O diagnóstico precoce traz consigo a chance da intervenção para a prevenção das complicações. Apesar do quadro completo de fatores de risco para a doença cardiovascular (DCV), não tem sido fácil demonstrar esta associação. Muitos trabalhos têm sido realizados com resultados desconcertantes, pois ao tempo em que apontam invariavelmente para a associação da síndrome com os fatores de risco conhecidos para DCV não mostram de forma consistente a associação com a ocorrência desses eventos. A necessidade de pesquisar mulheres com SOP que se encontrem em faixa etária de risco para as DCV leva à necessidade de identificá-las na fase de sua ocorrência, que costuma ser na pós menopausa, momento em que uma parte dos critérios diagnósticos consagrados para mulheres em idade reprodutiva já não estão presentes, ou se encontram atenuados. Outro problema encontrado são as definições e padronização de métodos utilizados para a identificação dos componentes do diagnóstico, em particular para a utilização em estudos com grandes amostras. Um dos principais marcadores da SOP é o hiperandrogenismo clínico, representado predominantemente pelo hirsutismo, que costuma ser identificado através do escore de Ferriman-Gallwey, método com grandes problemas de aplicabilidade em estudos populacionais. A patogênese da SOP é ainda incerta. Alguns dados apontam para causas genéticas, com ocorrência frequente num mesmo grupo familiar, porém até o momento, nenhum padrão de herança, gene ou grupo de genes foi associado à ocorrência da síndrome de modo consistente. Exposições precoces são também aventadas, que se iniciam na vida intrauterina, passando pelo período pós-natal, infância e adolescência, o que parece configurar um acúmulo de eventos adversos que levam à morbidade na vida adulta e apontam não só para a multicausalidade, como também para a necessidade de se apropriar da perspectiva do curso de vida como modelo teórico para dar conta da sua complexidade. A quase totalidade dos estudos sobre o tema realizados no Brasil é da área clínica, observando-se uma carência absoluta de estudos epidemiológicos nacionais. O objetivo geral desta tese foi estudar a síndrome dos ovários policísticos numa perspectiva epidemiológica, possibilitando meios para sua identificação em estudos populacionais. Os objetivos específicos indicam os artigos que compõem este trabalho: a) construir e validar instrumento simplificado para a identificação de hirsutismo; b) propor e avaliar critérios plausíveis para a identificação de mulheres com SOP na pós-menopausa e c) estudar fatores associados à SOP, reconstruindo domínios que representem as diversas fases da vida e a ocorrência de comorbidades tardias. No primeiro artigo, construiu-se e validou-se questionário simplificado e autoaplicável com quatro perguntas, para identificar o hirsutismo em mulheres acima dos 35 anos, adequado para uso em larga escala e adaptável para diversos meios de aplicação, dentre eles, a internet. No segundo artigo foram propostos critérios diagnósticos para a síndrome em mulheres na pós-menopausa e pôde-se mostrar como os fenótipos resultantes identificaram mulheres com características clínicas e bioquímicas esperadas para mulheres com SOP, validando os critérios propostos com desfechos epidemiológicos prováveis. O terceiro artigo descreveu fatores sociodemográficos, reprodutivos e metabólicos associados à SOP e como eles se comportaram em relação à ocorrência da síndrome. A população de estudo foi composta por trabalhadoras da Universidade Federal da Bahia que integram a coorte do ELSA-Brasil. Todos os artigos foram realizados com os dados transversais da linha de base, efetuada de 2008 a 2010. Com este trabalho, que é a continuidade do projeto de pesquisa epidemiológica sobre o tema, que se iniciou em 2007 com o estudo de prevalência da SOP na atenção primária de Salvador, começam a ganhar corpo dados brasileiros sobre esta parcela significativa de mulheres, que apresenta riscos particulares para doenças crônicas comuns, porém de alta morbimortalidade. / Salvador

Introdução: A Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP) afeta 5 a 10% de mulheres em idade reprodutiva. O tratamento da infertilidade de causa anovulatória em pacientes com SOP envolve a indução da ovulação, sendo o citrato de clomifeno (CC) a medicação de primeira escolha. Nos casos resistentes ao CC, a segunda linha de tratamento pode ser medicamentosa (gonadotrofinas) ou cirúrgica (cauterização ou diatermia ovariana), realizada por videolaparoscopia (VLPC). A indução com gonadotrofinas aumenta muito o risco de multigestação, o que não ocorre com a diatermia ovariana, que restaura a ovulação fisiológica (monovulação). A ecografia transvaginal é um procedimento simples, menos invasivo do que aVLPC, que permite a punção ovariana através do fórnice vaginal. Objetivos: desenvolver uma técnica minimamente invasiva de cauterização ovariana monopolar guiada por ecografia transvaginal, utilizando animais (ovelhas e vacas) como modelo experimental. Métodos: em um primeiro experimento foram utilizadas ovelhas (15 Corriedale e 2 Suffolk) e no segundo experimento foram utilizadas 11 vacas Angus, todos animais em idade reprodutiva e com integridade ovariana anatômica e funcional. Para a cauterização monopolar foi utilizado o eletrocautério Valleylab Force FX e uma agulha especialmente desenvolvida para esse fim. Os animais tiveram os ovários cauterizados em 4 pontos cada e foram abatidos 2 dias após para coleta dos ovários e inspeção do trajeto da agulha. Resultados: Nas ovelhas, dos 34 ovários cauterizados, apenas 3 apresentaram a lesão característica. Dos 22 ovários cauterizados nas vacas, 20 apresentaram a lesão característica, tanto macro quando microscopicamente. Nas duas espécies animais, não houve lesões no trajeto da agulha. Conclusão: A cauterização ovariana se mostrou segura nos dois modelos experimentais, nenhum animal apresentou lesões térmicas ou pela punção no trajeto da agulha. Nas vacas, a identificação ecográfica e a cauterização, além de segura, foram efetivas. A eficiência e segurança dessa técnica devem ser estudadas em mulheres com anovulação por SOP. / Introduction: The Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) affects 5-10% of women at reproductive age. Treatment of anovulatory infertility in patients with PCOS involves the induction of ovulation, with clomiphene citrate (CC) the drug of first choice. In cases resistant to CC, the second line of treatment can be medicated (gonadotropins) or surgery (ovarian diathermy or cautery), performed by laparoscopic video (LPCV). The induction with gonadotrophins increases the risk of multi pregnancy, which does not occur with ovarian diathermy, which restores physiological ovulation (monovulation). The transvaginal ultrasound is a simple procedure, less invasive than the LPCV allowing ovarian puncture through the vaginal fornix. Objectives: To develop a minimally invasive technique of monopolar ovarian cauterization guided by transvaginal ultrasound, using animals (sheep and cattle) as an experimental model. Methods: In a first experiment were used sheep (15 Corriedale and 2 Suffolk). In the second experiment were used 11 cows Angus, all animals at reproductive age with anatomic and funcional ovarian integrity. For cauterized were used Valleylab Force FX electrocautery and a needle specially developed for this purpose. The animals had ovaries cauterized at 4 points each and were slaughtered 2 days after for collection of the ovaries and inspection of the needle path. Results: In sheep, from the 34 ovaries cauterized, only 3 showed the characteristic lesion. From the 22 ovaries cauterized in cows, 20 had the characteristic lesion, both macro and microscopically. In both species, there were no injuries in the path of the needle. Conclusion: The ovarian cauterization proved safe in experimental models, no animal showed thermal injury or puncture in the path of the needle. In cows, the sonographic identification and cauterization, beyond safe, were effective. The efficiency and safety of this technique should be studied in women with SOP anovulatory.

Objective: To compare glycemic index and load (GI and GL) in the usual diet of PCOS and control women and to investigate whether dietary GI and GL are associated with body composition and anthropometric and metabolic variables across PCOS phenotypes. Design: Cross-sectional study. Setting: University hospital outpatient clinic. Patients: 61 women with PCOS and 44 non-hirsute women with ovulatory cycles. Interventions: Metabolic work-up, biochemical and hormonal assays, assessment of body composition and rest metabolic rate, physical activity (pedometer), and food consumption (food frequency questionnaire). Main outcome measure(s): GI and GL. Results: Mean age was 23.7±6.3 years. The prevalence of obesity was 44.3% in PCOS women and 31.8% in controls. Median GI for the group was 58. PCOS patients with GI>58 had higher BMI, worse metabolic profile, and lower intake of fibers. GI was correlated with BMI in controls and with lipid accumulation product (LAP) in the PCOS group, and was higher in classic PCOS vs. other groups. Conclusions: Dietary GI is increased in PCOS patients, especially in the classic PCOS phenotype. Increased dietary GI is associated with a less favorable anthropometric and metabolic profile in PCOS.

O endométrio é a mucosa que reveste o útero. A receptividade uterina é definida como um estado em que o endométrio se encontra receptivo à implantação do blastocisto. E, a preparação do endométrio para a implantação não é somente uma questão de estimulação hormonal adequada, depende da interação entre o blastocisto e o endométrio. Esta interação envolve uma complexa sequência de eventos de sinalização e uma variedade de moléculas. As concentrações de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β) estão correlacionadas com o processo de implantação. Em humanos, a taxa de insucesso desse processo é alta e ocasionada por diversos fatores. A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino-ginecológico que afeta de 6 a 8 % das mulheres em idade reprodutiva, e se caracteriza, principalmente, por anovulação crônica e hiperandrogenismo, estando diretamente relacionada à infertilidade feminina. Apesar da incerteza sobre a causa primária da SOP, há relatos sobre a importância da hiperinsulinemia na sua promoção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em células estromais endometriais in vitro, simulando características de SOP; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar o efeito da metformina sobre a proliferação celular e expressão gênica da IL-8 e IL-1β no modelo proposto. O tecido endometrial foi obtido de pacientes submetidas a histerectomia. A cultura primária das células estromais foi padronizada e as células foram divididas em sete grupos de tratamento: estradiol (G1); estradiol e progesterona (G2); estradiol, progesterona e insulina (G3); estradiol, progesterona e diidrotestosterona (G4); estradiol, progesterona e metformina (G5); estradiol, progesterona, insulina e diidrotestosterona (G6); estradiol, progesterona, insulina, diidrotestosterona e metformina (G7). Foi realizada análise de imunocitoquímica para vimentina para confirmação do cultivo com células estromais. Para avaliar a viabilidade e proliferação celular ao longo do tempo foi utilizado o ensaio de MTT em dois tempos diferentes de cultivo. As extrações de RNA foram realizadas e o cDNA obtido das amostras foi utilizado para a amplificação do mRNA de cinco genes candidatos a normalizadores e para avaliar a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β através de PCR em tempo real.O estabelecimento da cultura de células estromais foi confirmado através da coloração positiva para a proteína vimentina. As células mantiveram-se viáveis durante todo o período de cultivo, apresentando aumento significativo na proliferação celular no tempo 8 em relação ao tempo 4 em todos os grupos. O grupo G7 (tratado durante 48 horas com metformina) apresentou uma menor taxa de proliferação em relação aos grupos G2, G3 e G6. Para análise de expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão no modelo celular proposto foi o gene HPRT1. Observamos uma maior expressão do gene da IL-8 no grupo G5 tratado durante 48 horas em relação ao mesmo grupo tratado durante o período de 24 horas. Verificou-se maior expressão do gene da IL-1β no grupo G5 quando comparado a todos os outros grupos no período de 48 horas de tratamento com metformina. Entretanto, o grupo G7, também tratado com metformina, não apresentou diferença estatística em relação ao tempo de tratamento em nenhum dos genes estudados. Esses resultados demonstram que o modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em cultura de células estromais endometriais é viável. Neste modelo, em que foram testados cinco genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene HPRT1 apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência. O tratamento com metformina apresentou um efeito antiproliferativo nas células do grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. No período de 48 horas aumentou a expressão do gene da IL-1β no grupo tratado somente com o medicamento. Sugerindo uma ação inibitória da insulina sobre a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β no grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. Mais estudos são necessários para melhor entendimento do efeito da metformina nos fatores envolvidos durante a implantação. / The endometrium is the mucosa lining the uterus. The uterine receptivity is defined as a condition in which the endometrium is receptive to implantation of the blastocyst. The preparation of the endometrium for implantation is not only a matter of proper hormonal stimulation, it depends on the interaction between the blastocyst and the endometrium. This interaction involves a complex sequence of events and a variety of signaling molecules. The concentrations of interleukin-8 (IL-8) and interleukin-1β (IL-1β) are correlated to the implantation process. In humans, the failure rate of this process is high and caused by several factors. The polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological disorder that affects from 6 to 8 % of women of reproductive age. It is characterized mainly by chronic anovulation and hyperandrogenism and directly related to female infertility. Despite the uncertainty about the primary cause of PCOS, there are reports about the importance of hyperinsulinemia in promoting it. The aim of this study was to establish a model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells in vitro, simulating features of PCOS; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in the cultured cells; to evaluate the effects of metformin on cell proliferation, as well as IL-8 and IL-1β gene expression in the proposed culture model. The human endometrial tissue was obtained from patients undergoing hysterectomy. The primary culture of stromal cells was standardized and divided into seven treatment groups: estradiol (G1); estradiol and progesterone (G2); estradiol, progesterone and insulin (G3); estradiol, progesterone and dihydrotestosterone (G4); estradiol, progesterone and metformin (G5); estradiol, progesterone, insulin and dihydrotestosterone (G6); estradiol, progesterone, insulin, dihydrotestosterone and metformin (G7). Immunocytochemistry analysis for vimentin were performed. Cell viability and proliferation were evaluated by MTT assay at two days in different times of cultivation. RNA extractions were performed and the cDNA obtained from primary culture was used to amplify five candidates to housekeeping genes mRNA and to evaluate IL-8 and IL1β expression by real time PCR. The stromal culture cell establishment was confirmed by positive staining for vimentin. The cells remained viable throughout the cultivation period, with significant cell proliferation increase at day 8 compared to day 4 in all groups. The G7 group (metformin treated for 48 hours) showed lower proliferation rate than G2, G3 and G6 groups. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was HPRT1. Increased gene expression of IL-8 was observed in G5 group treated for 48 hours compared to the same group during 24 hours. Similarly, the G5 group showed higher IL-1β gene expression when compared to all other groups treated with metformin for 48 hours. However, the G7 group, also metformin treated, did not show statistically significant difference in treatment time of any studied genes. These results suggest that model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells is viable and provides a good cell sampling to molecular analysis under different experimental conditions. In this model, several genes were tested for expression stability. HPRT1 presented the best values, unlike others classical housekeeping genes. The metformin treatment showed an antiproliferative effect on cells in hyperinsulinemic and hyperandrogenic group and at 48 hours increased IL-1β gene expression in the treated group with the drug alone. It suggests an inhibitory action of insulin on these genes expression in the hyperinsulinemic and hyperandrogenic group. More studies are needed to better understand the effect of metformin on the factors involved during implantation.

O entendimento dos mecanismos de ação hormonal envolvidos com o crescimento do pêlo são de grande relevância na área médica e podem representar novas perspectivas no tratamento para distúrbios de crescimento de pêlos. A aromatase, enzima que converte androgênios em estrogênios, é uma das enzimas-chave relacionadas com o metabolismo intra-tecidual de hormônios sexuais. O objetivo desse estudo foi determinar a expressão gênica da enzima aromatase em folículos pilosos do vértice do escalpo de mulheres com ciclos regulares e ovulatórios e em pacientes com PCOS, verificando possíveis associações com variáveis hormonais e metabólicas dessas mulheres. Cinqüenta e quatro mulheres no menacme preencheram os critérios de inclusão (23 com PCOS e 31 com ciclos regulares e ovulatórios) e completaram avaliação antropométrica, hormonal e metabólica. Uma sub-amostra de 16 mulheres (11 com ciclos regulares e ovulatórios e 5 com PCOS) foi selecionada para coleta de folículos pilosos através da técnica do arrancamento. A expressão do gene da aromatase foi avaliada por PCR em tempo real, e os resultados foram normalizados em relação ao gene constitutivo b2-microglobulina. A expressão do gene da aromatase foi observada nos folículos pilosos da região do escalpo de mulheres dos dois grupos em estudo. A expressão deste gene foi de intensidade baixa e variável entre as amostras estudadas e não houve diferença estatisticamente significativa da relação dos genes aromatase/b2-microglobulina entre o grupo de mulheres com ciclos regulares [80 (35,31 – 138,25) e o grupo PCOS [52,11 (5,68 – 84,8), P = 0,157]. A expressão do gene da aromatase em folículos pilosos do escalpo de mulheres correlacionou-se negativamente e com significância estatística com os níveis séricos de LH (P = 0,008, r = -0,653) e esta correlação foi independente de testosterona ou SHBG. Esses resultados demonstram, pela primeira vez, que folículos pilosos da região do vértice do escalpo de mulheres expressam o gene da aromatase. A correlação negativa e independente de LH com a expressão gênica da aromatase pode estar refletindo o microambiente hormonal nos folículos pilosos e, em especial, o conjunto das alterações metabólicas e hormonais característico de pacientes com PCOS. É possível que a expressão gênica dessa enzima seja mais evidente na papila dérmica (porção dos folículos pilosos não analisada nesse estudo) e que a regulação do balanço estrogênico no metabolismo local não seja tão pronunciada na porção epitelial dos folículos pilosos que é obtida pela técnica do arrancamento. A análise da expressão protéica da enzima, a seleção de pacientes hirsutas de outras etiologias e de mulheres portadoras de alopecia, e a coleta de outras regiões pilosas hormônio-dependentes estão entre as perspectivas para a confirmação do padrão de expressão gênica da aromatase nos folículos pilosos. / The knowledge of hormonal mechanisms of action that are involved with hair growth is of great relevance on medical research and could represent new approaches on therapeutics for hair growth disturbs. Aromatase, the enzyme that converts androgens into estrogens, is one of the key enzymes related to sexual hormones metabolism and may act on different target tissues, like the hair follicle. The aim of this study was to determine the aromatase gene expression on hair follicles from the vertex portion of the scalp of women with regular and ovulatory cycles, and patients with PCOS. We were also interested on the possible association among the gene expression and hormonal/metabolic parameters of these women. Fifty-four women at reproductive age were included (23 with PCOS and 31 with regular and ovulatory cycles), and were submitted to anthropometric, hormonal, and metabolic evaluation. A minor group of 16 women (11 with regular and ovulatory cycles and 5 with PCOS) were selected for hair follicle’s molecular analysis, using the plucking technique. Aromatase gene expression was analyzed by using real time PCR, and the results were normalized with the housekeeping gene b2-microglobuline. Aromatase gene expression was observed at the scalp’s hair follicles from the two groups of women. The intensity of the gene expression was low and variable among the samples. There was not a statistically significant difference between the women with regular cycles [80 (35,31 – 138,25) and patients with PCOS [52,11 (5,68 – 84,8), P = 0,157]. Aromatase gene expression in the plucked hairs from the vertex portion of the scalp of women was negatively correlated with circulating LH levels (P = 0,008, r = -0,653), and was also independent of testosterone or SHBG levels. The present results show, for the first time, that plucked hairs from the vertex portion of the scalp of women express the gene of aromatase. The negative and independent correlation between LH and aromatase gene expression may reflect the hormonal microenvironment of the hair follicle, and also the hormonal and metabolic alterations characteristics of women with PCOS. Aromatase gene expression may be more evident at the dermal papilla (not analyzed in this study), and the local metabolism could not be so pronounced on the epithelial portion of hair follicles, when obtained by the plucking method. Aromatase protein expression, plucked hair from other hormone-dependent areas and from women with other clinical conditions like androgenetic alopecia, are some of the perspectives for the confirmation of the pattern of aromatase gene expression on hair follicles.

O endométrio é a mucosa que reveste o útero. A receptividade uterina é definida como um estado em que o endométrio se encontra receptivo à implantação do blastocisto. E, a preparação do endométrio para a implantação não é somente uma questão de estimulação hormonal adequada, depende da interação entre o blastocisto e o endométrio. Esta interação envolve uma complexa sequência de eventos de sinalização e uma variedade de moléculas. As concentrações de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β) estão correlacionadas com o processo de implantação. Em humanos, a taxa de insucesso desse processo é alta e ocasionada por diversos fatores. A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino-ginecológico que afeta de 6 a 8 % das mulheres em idade reprodutiva, e se caracteriza, principalmente, por anovulação crônica e hiperandrogenismo, estando diretamente relacionada à infertilidade feminina. Apesar da incerteza sobre a causa primária da SOP, há relatos sobre a importância da hiperinsulinemia na sua promoção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em células estromais endometriais in vitro, simulando características de SOP; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar o efeito da metformina sobre a proliferação celular e expressão gênica da IL-8 e IL-1β no modelo proposto. O tecido endometrial foi obtido de pacientes submetidas a histerectomia. A cultura primária das células estromais foi padronizada e as células foram divididas em sete grupos de tratamento: estradiol (G1); estradiol e progesterona (G2); estradiol, progesterona e insulina (G3); estradiol, progesterona e diidrotestosterona (G4); estradiol, progesterona e metformina (G5); estradiol, progesterona, insulina e diidrotestosterona (G6); estradiol, progesterona, insulina, diidrotestosterona e metformina (G7). Foi realizada análise de imunocitoquímica para vimentina para confirmação do cultivo com células estromais. Para avaliar a viabilidade e proliferação celular ao longo do tempo foi utilizado o ensaio de MTT em dois tempos diferentes de cultivo. As extrações de RNA foram realizadas e o cDNA obtido das amostras foi utilizado para a amplificação do mRNA de cinco genes candidatos a normalizadores e para avaliar a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β através de PCR em tempo real.O estabelecimento da cultura de células estromais foi confirmado através da coloração positiva para a proteína vimentina. As células mantiveram-se viáveis durante todo o período de cultivo, apresentando aumento significativo na proliferação celular no tempo 8 em relação ao tempo 4 em todos os grupos. O grupo G7 (tratado durante 48 horas com metformina) apresentou uma menor taxa de proliferação em relação aos grupos G2, G3 e G6. Para análise de expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão no modelo celular proposto foi o gene HPRT1. Observamos uma maior expressão do gene da IL-8 no grupo G5 tratado durante 48 horas em relação ao mesmo grupo tratado durante o período de 24 horas. Verificou-se maior expressão do gene da IL-1β no grupo G5 quando comparado a todos os outros grupos no período de 48 horas de tratamento com metformina. Entretanto, o grupo G7, também tratado com metformina, não apresentou diferença estatística em relação ao tempo de tratamento em nenhum dos genes estudados. Esses resultados demonstram que o modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em cultura de células estromais endometriais é viável. Neste modelo, em que foram testados cinco genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene HPRT1 apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência. O tratamento com metformina apresentou um efeito antiproliferativo nas células do grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. No período de 48 horas aumentou a expressão do gene da IL-1β no grupo tratado somente com o medicamento. Sugerindo uma ação inibitória da insulina sobre a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β no grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. Mais estudos são necessários para melhor entendimento do efeito da metformina nos fatores envolvidos durante a implantação. / The endometrium is the mucosa lining the uterus. The uterine receptivity is defined as a condition in which the endometrium is receptive to implantation of the blastocyst. The preparation of the endometrium for implantation is not only a matter of proper hormonal stimulation, it depends on the interaction between the blastocyst and the endometrium. This interaction involves a complex sequence of events and a variety of signaling molecules. The concentrations of interleukin-8 (IL-8) and interleukin-1β (IL-1β) are correlated to the implantation process. In humans, the failure rate of this process is high and caused by several factors. The polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological disorder that affects from 6 to 8 % of women of reproductive age. It is characterized mainly by chronic anovulation and hyperandrogenism and directly related to female infertility. Despite the uncertainty about the primary cause of PCOS, there are reports about the importance of hyperinsulinemia in promoting it. The aim of this study was to establish a model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells in vitro, simulating features of PCOS; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in the cultured cells; to evaluate the effects of metformin on cell proliferation, as well as IL-8 and IL-1β gene expression in the proposed culture model. The human endometrial tissue was obtained from patients undergoing hysterectomy. The primary culture of stromal cells was standardized and divided into seven treatment groups: estradiol (G1); estradiol and progesterone (G2); estradiol, progesterone and insulin (G3); estradiol, progesterone and dihydrotestosterone (G4); estradiol, progesterone and metformin (G5); estradiol, progesterone, insulin and dihydrotestosterone (G6); estradiol, progesterone, insulin, dihydrotestosterone and metformin (G7). Immunocytochemistry analysis for vimentin were performed. Cell viability and proliferation were evaluated by MTT assay at two days in different times of cultivation. RNA extractions were performed and the cDNA obtained from primary culture was used to amplify five candidates to housekeeping genes mRNA and to evaluate IL-8 and IL1β expression by real time PCR. The stromal culture cell establishment was confirmed by positive staining for vimentin. The cells remained viable throughout the cultivation period, with significant cell proliferation increase at day 8 compared to day 4 in all groups. The G7 group (metformin treated for 48 hours) showed lower proliferation rate than G2, G3 and G6 groups. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was HPRT1. Increased gene expression of IL-8 was observed in G5 group treated for 48 hours compared to the same group during 24 hours. Similarly, the G5 group showed higher IL-1β gene expression when compared to all other groups treated with metformin for 48 hours. However, the G7 group, also metformin treated, did not show statistically significant difference in treatment time of any studied genes. These results suggest that model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells is viable and provides a good cell sampling to molecular analysis under different experimental conditions. In this model, several genes were tested for expression stability. HPRT1 presented the best values, unlike others classical housekeeping genes. The metformin treatment showed an antiproliferative effect on cells in hyperinsulinemic and hyperandrogenic group and at 48 hours increased IL-1β gene expression in the treated group with the drug alone. It suggests an inhibitory action of insulin on these genes expression in the hyperinsulinemic and hyperandrogenic group. More studies are needed to better understand the effect of metformin on the factors involved during implantation.

Objective: To compare glycemic index and load (GI and GL) in the usual diet of PCOS and control women and to investigate whether dietary GI and GL are associated with body composition and anthropometric and metabolic variables across PCOS phenotypes. Design: Cross-sectional study. Setting: University hospital outpatient clinic. Patients: 61 women with PCOS and 44 non-hirsute women with ovulatory cycles. Interventions: Metabolic work-up, biochemical and hormonal assays, assessment of body composition and rest metabolic rate, physical activity (pedometer), and food consumption (food frequency questionnaire). Main outcome measure(s): GI and GL. Results: Mean age was 23.7±6.3 years. The prevalence of obesity was 44.3% in PCOS women and 31.8% in controls. Median GI for the group was 58. PCOS patients with GI>58 had higher BMI, worse metabolic profile, and lower intake of fibers. GI was correlated with BMI in controls and with lipid accumulation product (LAP) in the PCOS group, and was higher in classic PCOS vs. other groups. Conclusions: Dietary GI is increased in PCOS patients, especially in the classic PCOS phenotype. Increased dietary GI is associated with a less favorable anthropometric and metabolic profile in PCOS.

Introdução: A Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP) afeta 5 a 10% de mulheres em idade reprodutiva. O tratamento da infertilidade de causa anovulatória em pacientes com SOP envolve a indução da ovulação, sendo o citrato de clomifeno (CC) a medicação de primeira escolha. Nos casos resistentes ao CC, a segunda linha de tratamento pode ser medicamentosa (gonadotrofinas) ou cirúrgica (cauterização ou diatermia ovariana), realizada por videolaparoscopia (VLPC). A indução com gonadotrofinas aumenta muito o risco de multigestação, o que não ocorre com a diatermia ovariana, que restaura a ovulação fisiológica (monovulação). A ecografia transvaginal é um procedimento simples, menos invasivo do que aVLPC, que permite a punção ovariana através do fórnice vaginal. Objetivos: desenvolver uma técnica minimamente invasiva de cauterização ovariana monopolar guiada por ecografia transvaginal, utilizando animais (ovelhas e vacas) como modelo experimental. Métodos: em um primeiro experimento foram utilizadas ovelhas (15 Corriedale e 2 Suffolk) e no segundo experimento foram utilizadas 11 vacas Angus, todos animais em idade reprodutiva e com integridade ovariana anatômica e funcional. Para a cauterização monopolar foi utilizado o eletrocautério Valleylab Force FX e uma agulha especialmente desenvolvida para esse fim. Os animais tiveram os ovários cauterizados em 4 pontos cada e foram abatidos 2 dias após para coleta dos ovários e inspeção do trajeto da agulha. Resultados: Nas ovelhas, dos 34 ovários cauterizados, apenas 3 apresentaram a lesão característica. Dos 22 ovários cauterizados nas vacas, 20 apresentaram a lesão característica, tanto macro quando microscopicamente. Nas duas espécies animais, não houve lesões no trajeto da agulha. Conclusão: A cauterização ovariana se mostrou segura nos dois modelos experimentais, nenhum animal apresentou lesões térmicas ou pela punção no trajeto da agulha. Nas vacas, a identificação ecográfica e a cauterização, além de segura, foram efetivas. A eficiência e segurança dessa técnica devem ser estudadas em mulheres com anovulação por SOP. / Introduction: The Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) affects 5-10% of women at reproductive age. Treatment of anovulatory infertility in patients with PCOS involves the induction of ovulation, with clomiphene citrate (CC) the drug of first choice. In cases resistant to CC, the second line of treatment can be medicated (gonadotropins) or surgery (ovarian diathermy or cautery), performed by laparoscopic video (LPCV). The induction with gonadotrophins increases the risk of multi pregnancy, which does not occur with ovarian diathermy, which restores physiological ovulation (monovulation). The transvaginal ultrasound is a simple procedure, less invasive than the LPCV allowing ovarian puncture through the vaginal fornix. Objectives: To develop a minimally invasive technique of monopolar ovarian cauterization guided by transvaginal ultrasound, using animals (sheep and cattle) as an experimental model. Methods: In a first experiment were used sheep (15 Corriedale and 2 Suffolk). In the second experiment were used 11 cows Angus, all animals at reproductive age with anatomic and funcional ovarian integrity. For cauterized were used Valleylab Force FX electrocautery and a needle specially developed for this purpose. The animals had ovaries cauterized at 4 points each and were slaughtered 2 days after for collection of the ovaries and inspection of the needle path. Results: In sheep, from the 34 ovaries cauterized, only 3 showed the characteristic lesion. From the 22 ovaries cauterized in cows, 20 had the characteristic lesion, both macro and microscopically. In both species, there were no injuries in the path of the needle. Conclusion: The ovarian cauterization proved safe in experimental models, no animal showed thermal injury or puncture in the path of the needle. In cows, the sonographic identification and cauterization, beyond safe, were effective. The efficiency and safety of this technique should be studied in women with SOP anovulatory.

O entendimento dos mecanismos de ação hormonal envolvidos com o crescimento do pêlo são de grande relevância na área médica e podem representar novas perspectivas no tratamento para distúrbios de crescimento de pêlos. A aromatase, enzima que converte androgênios em estrogênios, é uma das enzimas-chave relacionadas com o metabolismo intra-tecidual de hormônios sexuais. O objetivo desse estudo foi determinar a expressão gênica da enzima aromatase em folículos pilosos do vértice do escalpo de mulheres com ciclos regulares e ovulatórios e em pacientes com PCOS, verificando possíveis associações com variáveis hormonais e metabólicas dessas mulheres. Cinqüenta e quatro mulheres no menacme preencheram os critérios de inclusão (23 com PCOS e 31 com ciclos regulares e ovulatórios) e completaram avaliação antropométrica, hormonal e metabólica. Uma sub-amostra de 16 mulheres (11 com ciclos regulares e ovulatórios e 5 com PCOS) foi selecionada para coleta de folículos pilosos através da técnica do arrancamento. A expressão do gene da aromatase foi avaliada por PCR em tempo real, e os resultados foram normalizados em relação ao gene constitutivo b2-microglobulina. A expressão do gene da aromatase foi observada nos folículos pilosos da região do escalpo de mulheres dos dois grupos em estudo. A expressão deste gene foi de intensidade baixa e variável entre as amostras estudadas e não houve diferença estatisticamente significativa da relação dos genes aromatase/b2-microglobulina entre o grupo de mulheres com ciclos regulares [80 (35,31 – 138,25) e o grupo PCOS [52,11 (5,68 – 84,8), P = 0,157]. A expressão do gene da aromatase em folículos pilosos do escalpo de mulheres correlacionou-se negativamente e com significância estatística com os níveis séricos de LH (P = 0,008, r = -0,653) e esta correlação foi independente de testosterona ou SHBG. Esses resultados demonstram, pela primeira vez, que folículos pilosos da região do vértice do escalpo de mulheres expressam o gene da aromatase. A correlação negativa e independente de LH com a expressão gênica da aromatase pode estar refletindo o microambiente hormonal nos folículos pilosos e, em especial, o conjunto das alterações metabólicas e hormonais característico de pacientes com PCOS. É possível que a expressão gênica dessa enzima seja mais evidente na papila dérmica (porção dos folículos pilosos não analisada nesse estudo) e que a regulação do balanço estrogênico no metabolismo local não seja tão pronunciada na porção epitelial dos folículos pilosos que é obtida pela técnica do arrancamento. A análise da expressão protéica da enzima, a seleção de pacientes hirsutas de outras etiologias e de mulheres portadoras de alopecia, e a coleta de outras regiões pilosas hormônio-dependentes estão entre as perspectivas para a confirmação do padrão de expressão gênica da aromatase nos folículos pilosos. / The knowledge of hormonal mechanisms of action that are involved with hair growth is of great relevance on medical research and could represent new approaches on therapeutics for hair growth disturbs. Aromatase, the enzyme that converts androgens into estrogens, is one of the key enzymes related to sexual hormones metabolism and may act on different target tissues, like the hair follicle. The aim of this study was to determine the aromatase gene expression on hair follicles from the vertex portion of the scalp of women with regular and ovulatory cycles, and patients with PCOS. We were also interested on the possible association among the gene expression and hormonal/metabolic parameters of these women. Fifty-four women at reproductive age were included (23 with PCOS and 31 with regular and ovulatory cycles), and were submitted to anthropometric, hormonal, and metabolic evaluation. A minor group of 16 women (11 with regular and ovulatory cycles and 5 with PCOS) were selected for hair follicle’s molecular analysis, using the plucking technique. Aromatase gene expression was analyzed by using real time PCR, and the results were normalized with the housekeeping gene b2-microglobuline. Aromatase gene expression was observed at the scalp’s hair follicles from the two groups of women. The intensity of the gene expression was low and variable among the samples. There was not a statistically significant difference between the women with regular cycles [80 (35,31 – 138,25) and patients with PCOS [52,11 (5,68 – 84,8), P = 0,157]. Aromatase gene expression in the plucked hairs from the vertex portion of the scalp of women was negatively correlated with circulating LH levels (P = 0,008, r = -0,653), and was also independent of testosterone or SHBG levels. The present results show, for the first time, that plucked hairs from the vertex portion of the scalp of women express the gene of aromatase. The negative and independent correlation between LH and aromatase gene expression may reflect the hormonal microenvironment of the hair follicle, and also the hormonal and metabolic alterations characteristics of women with PCOS. Aromatase gene expression may be more evident at the dermal papilla (not analyzed in this study), and the local metabolism could not be so pronounced on the epithelial portion of hair follicles, when obtained by the plucking method. Aromatase protein expression, plucked hair from other hormone-dependent areas and from women with other clinical conditions like androgenetic alopecia, are some of the perspectives for the confirmation of the pattern of aromatase gene expression on hair follicles.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-05T12:25:20Z No. of bitstreams: 1 Ana Janaina Jeanine Martins de Lemos.pdf: 2611080 bytes, checksum: d1d2c6ec413abbc4cb5450d5df0a4be4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T12:25:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Janaina Jeanine Martins de Lemos.pdf: 2611080 bytes, checksum: d1d2c6ec413abbc4cb5450d5df0a4be4 (MD5) Previous issue date: 2013-10-22 / The polycystic ovary syndrome (PCOS) is endocrine disorder in women of reproductive age extremely common and heterogeneous clinical features. In cases of patients with ovarian polycystic wishing to treat infertility, metformin hydrochloride is the drug most widely used and considered safer compared to the other treatments. When diagnosing the syndrome, it has been observed that women have a high prevalence of nonalcoholic fatty liver disease, steatosis, fibrosis, abnormal liverenzyme factors and increased indicators of oxidative stress in plasma, raising concern among doctors about the disease in the liver. Furthermore, recent studies have linked oxidative stress in the pathogenesis of diseases which cause infertility, for this reason, research has suggested the use of antioxidants such as melatonin, due to liver protecting effect in the pharmacological treatment or supplementation to combat these types of disease. However, there are no reports in the literature about association of metformin hydrochloride and melatonin for the treatment of PCOS. The objective of this work was to investigate the effects of combination therapy of these drugs in rats induced to PCOS on to reproductive and liver. Thus, we used 75 albino rats were divided randomly into five groups of 15 animals. All rats except those in group I were subjected to induction of PCOS by constant illumination, and the rats of groups III, IV and V received treatment with the drug melatonin, metformin hydrochloride and the drug combination, respectively. After confirmation of PCOS and treatments, we analyzed the effects of plasma biochemical and hormonal treatments, and rats were mated and monitored during pregnancy for analysis of implantation sites, ovarian, weight gain, reproductive viability and levels of oxidative stress. At the end of the experiment was conducted histopathology, and immunohistochemistry staining of liver of rats and analysis of the puppies. Pharmacological treatments decreased the time allowed copulation, increased plasma levels of progesterone, the number and weight of pups and reduced plasma levels of estrogen and endometrial content of collagen fibers. In the liver, treatment with metformin hydrochloride, melatonin and more significantly the association of these drugs reduced plasma levels of the liver enzyme alanine trasaminase, nitric oxide and total glutathione, leading to results similar to the control group, were also observed similarities between those of control rats and rats that received a combination of drugs for the content of hepatic polysaccharide, and of proinflammatory cytokines. Thus, we conclude that the association of metformin with melatonin provides the best results compared to the other treatments, in order to regulate hormonal and histochemical the reproductive system and increase the chance of conception resembling the control group, and the liver, the combination of drugs works more effectively against liver toxicity produced by PCOS, favoring normalization of biochemical parameters and oxidative stress during pregnancy, compared to therapies only these drugs. / A síndrome do ovário policístico (SOP) é um distúrbio endócrino feminino extremamente comum na idade reprodutiva e apresenta quadro clínico bastante heterogêneo, entre eles os cistos foliculares ovarianos aumentados, hiperandrogenismo, infertilidade resistência à insulina, e dislipidemia. Em casos de pacientes com policistose ovariana que desejam tratar a infertilidade, o cloridrato de metformina é a droga mais utilizada e considerada mais segura em comparação com os demais tratamentos. Ao diagnosticar a síndrome, tem-se observado que mulheres apresentam grande prevalência a doença hepática gordurosa não alcoólica, esteatose, fibrose, alterações hepático-enzimáticas e aumento do estresse oxidativo plasmático, elevando a preocupação dos médicos quanto às patologias hepáticas. Além disso, recentes estudos têm relacionado o estresse oxidativo na patogênese de doenças que causam a infertilidade, por esta razão, pesquisas tem sugerido a utilização de antioxidantes como a melatonina como suplemento a outras drogas. No entanto, não há relatos na literatura sobre a associação do cloridrato de metformina e melatonina para o tratamento da policistose ovariana. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da combinação terapêutica desses fármacos em ratas induzidas à SOP sobre os aspectos reprodutivos e hepáticos. Para tanto, foram utilizadas 75 ratas albinas, divididas aleatoriamente em cinco grupos de 15 animais. Todas as ratas, exceto as do grupo I, foram submetidas à indução da SOP pela iluminação constante, e as ratas dos grupos III, IV e V receberam tratamentos com os fármacos melatonina, cloridrato de metformina e a associação destes, respectivamente. Após a confirmação da SOP e tratamentos, foram analisados os efeitos plasmáticos bioquímicos e hormonais dos tratamentos, e as ratas foram acasaladas para análise dos sítios de implantação e acompanhamento gestacional dos níveis de estresse oxidativo. Ao final do experimento foi analisada a histopatologia e imunohistoquímica do fígado das ratas. Os tratamentos farmacológicos diminuíram o número de dias para confirmação do acasalamento, aumentaram os níveis séricos de progesterona, bem como o número e o peso dos filhotes. Reduziram os níveis plasmáticos de estrógeno e teor de fibras colágenas. No fígado, os tratamentos com cloridrato de metformina, melatonina, e mais significativamente a associação destes fármacos, reduziram os níveis plasmáticos da enzima hepática alanina transaminase, do óxido nítrico e da glutationa total, levando a resultados semelhantes aos animais do grupo controle, mais uma vez, as ratas que receberam associação dos fármacos quanto assemelhou-se ao grupo controle quanto ao conteúdo hepático de polissacarídeos, e aos de citocinas próinflamatórias. Desta forma, pôde-se concluir que a associação do cloridrato de metformina com melatonina proporciona os melhores resultados em comparação aos demais tratamentos, de forma a regular hormonal e histoquimicamente o sistema reprodutor e aumentar as chances de concepção de forma semelhante ao grupo controle. No fígado a associação dos fármacos atuou de forma mais eficaz contra a toxicidade hepática produzida pela SOP experimental, favorecendo uma normalização dos parâmetros bioquímicos e estresse oxidativo durante a gestação, quando comparada às monoterapias destas drogas.