Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-03-31T17:23:22Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thamiza Carla Costa dos Santos - 2016.pdf: 1439728 bytes, checksum: 19a51f9a39cdb7d376515edd24484335 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-03T12:02:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thamiza Carla Costa dos Santos - 2016.pdf: 1439728 bytes, checksum: 19a51f9a39cdb7d376515edd24484335 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-03T12:02:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thamiza Carla Costa dos Santos - 2016.pdf: 1439728 bytes, checksum: 19a51f9a39cdb7d376515edd24484335 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-08-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The healing is a complex and dynamic event aimed at the restoration of tissue integrity. However, some factors, such as diabetes, can harm this physiological event. Chitosan, a derivative of chitin, has been considered as a versatile and effective option for the treatment of wounds. This study aimed to evaluate and compare the effect of chitosan 2% gel and chitosan spray based on secondary intention healing of skin wounds in diabetic rats. 54 rats were used, divided randomly into three groups: control group (CG), chitosan 2% gel group (GG), and Chitosan spray group (GS) with 18 animals each. The rats in GC, GG, and GS had their wounds treated daily with saline solution 0.9%, chitosan 2% gel, and chitosan spray, respectively. The groups were divided into three subgroups (n = 6) according to the times of histological analysis of wound (third, seventh, and 14th day). The induction of diabetes in the rats took place by intraperitoneal application of alloxan (120 mg/kg). After confirming the state of diabetes, the animals were anesthetized and the wounds made with the aid of a punch 9.0mm in the dorsal region. Macroscopic and microscopic analyzes were performed. Macroscopic analysis showed that after 14 days, the chitosan 2% gel and chitosan spray gave a contraction rate of 100% and 99%, respectively. At the histological level, there was the anticipated recruitment of mononuclear cells, fibroblasia, and deposition of dense fibrovascular tissue and marked fibrosis in the wounds of GG and GS, emphasizing the ability of this biopolymer to optimize the healing of diabetics. It can therefore be a therapeutic option for the development of other formulations that provide wound repair in diabetic patients. / A cicatrização é um evento complexo e dinâmico que visa a restauração da integridade tecidual. No entanto, alguns fatores, como o diabetes, podem prejudicar este evento fisiológico. A quitosana, um derivado da quitina, tem sido cogitada como uma opção versátil e eficaz para o tratamento de feridas. O presente estudo teve como objetivo avaliar e comparar o efeito do gel de quitosana a 2% e spray à base de quitosana na cicatrização por segunda intenção de feridas cutâneas em ratas diabéticas. Foram utilizadas 54 ratas, divididas, aleatoriamente, em três grupos: grupo controle (GC) grupo gel de quitosana a 2% (GG) e grupo spray de quitosan (GS) com 18 animais, cada. As ratas dos grupos GC, GG e GS tiveram suas feridas tratadas diariamente com solução fisiológica 0,9%, gel de quitosana a 2% e spray à base de quitosana, respectivamente. Os grupos foram subdivididos em três subgrupos (n=6) conforme os tempos de análise histológica da ferida (terceiro, sétimo e 14º dia). A indução do diabetes mellitus, nas ratas, ocorreu por meio da aplicação intraperitoneal da aloxana (120mg/kg). Após a confirmação do estado de diabetes, os animais foram anestesiados e as feridas confeccionadas com auxílio de um punch de 9,0mm na região dorsal. Foram realizadas análises macroscópicas e microscópicas. As análises macroscópicas mostraram que ao 14º dia, o gel de quitosana 2% e o spray de quitosana proporcionaram uma taxa de contração de 100% e 99%, respectivamente. A nível histológico, observou-se o recrutamento antecipado de células mononucleares, fibroblasia e deposição de tecido fibrovascular denso acentuados e fibrose nas feridas dos GG e GS, enfatizando a capacidade deste biopolímero em otimizar a cicatrização de diabéticos. Podendo, portanto, ser uma opção terapêutica como também a base para o desenvolvimento de outras formulações que proporcionem a reparação de feridas em pacientes diabéticos.

Les polysaccharides amphiphiles possèdent des propriétés rhéologiques et interfaciales singulières dues aux interactions attractives entres les groupements hydrophobes greffés le long du squelette hydrophile. Leurs propriétés sont modulables suivant certains paramètres bien identifiés (nature des groupements hydrophobes, densité de greffage, etc.). Néanmoins, peu d’études s’intéressent à l’impact de la conformation du squelette sur le comportement de ces systèmes. L’objectif de ce mémoire est de déterminer l’influence de la rigidité du squelette sur les propriétés en solution d’un polysaccharide amphiphile à base de xanthane. En solution, ce polymère peut adopter deux conformations distinctes suivant les conditions opératoires : une forme ordonnée hélicoïdale rigide ou une forme désordonnée de type pelote flexible. Deux protocoles de greffage ont été développés afin de modifier le xanthane sous ces deux formes. Les xanthanes greffés sous forme ordonnée conservent une conformation hélicoïdale rigide, qui gouverne l’organisation globale des macromolécules. Au contraire, pour les polymères greffés sous forme désordonnée, l’organisation des chaînes est principalement contrôlée par les interactions attractives entre les groupements hydrophob / Hydrophobically modified polysaccharides show unusual rheological and interfacial properties in solution due to the self association of hydrophobic entities grafted onto their hydrophilic backbone. Their properties are tunable according to some well known parameters, such as the length of the hydrophobic moieties or the grafting density. However, very few studies deal with the influence of the backbone conformation on the properties of such systems in solution. Therefore, the objective of this work is to determine the impact of the backbone rigidity on the behavior of an amphiphilic polysaccharide based on xanthan. Indeed, in solution, this polymer can adopt two different conformations depending on the experimental conditions: an ordered, rigid helix or a disordered, flexible coil. Hydrophobic moieties have been grafted on xanthan either under its ordered and disordered conformation. Chains modified under the ordered conformation remain ordered and rigid after grafting and the overall properties are controlled by the high rigidity of the polymer backbone. On the contrary, macromolecules grafted under the disordered form show a more flexible conformation in solution. As a result, the organization of these derivatives is mainly controlled by the attractive interactions between the grafted moieties

Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria Gram-negativa comensal da nasofaringe e um patógeno oportunista cujo único hospedeiro natural conhecido é o ser humano. As cepas de Hi que possuem cápsula de polissacarídeo estão associadas a doenças invasivas mais graves, sendo as de sorotipo b (Hib) as principais causadoras da meningite bacteriana em populações não vacinadas. Para produzir a vacina contra Hib, o polissacarídeo purificado desta bactéria é conjugado quimicamente ao toxóide tetânico. Industrialmente, a produção do polissacarídeo é realizada cultivando esse micro-organismo em biorreatores, entretanto o rendimento em polissacarídeo é baixo, mesmo com fornecimento de nutrientes, controle de pH e outros ajustes das condições no decorrer do cultivo. O estudo dos diferentes perfis fisiológicos da população bacteriana de Hib no decorrer do cultivo através da transcritômica traz a possibilidade de aprofundar o conhecimento sobre o metabolismo desse micro- organismo. As taxas de transcrição dos genes expressos em diferentes momentos considerados como pontos metabolicamente significativos do cultivo de Hib linhagem GB 3291 em batelada alimentada conduzido em Biorreator de 10 L, com aeração submersa e controles de pH (7,0) e temperatura (30° C) foram obtidas através de sequenciamento de RNA paralelo massivo (RNA-seq). A análise de co-expressão dos genes foi realizada com WGCNA, em que oito módulos de genes co-expressos foram identificados, quatro dos quais apresentaram correlação alta com dados fenotípicos dos cultivos, inclusive produtividade de acetato e de polissacarídeo. Análise de enriquecimento funcional identificou vias metabólicas associadas a ribossomo, síntese de parede celular, transportadores e consumo de carbono. A análise de expressão diferencial permitiu observar o comportamento desta bactéria durante o cultivo. Através da análise das taxas de transcrição dos genes foi possível identificar as principais vias de síntese de acetato e de polissacarídeo capsular, sendo esta última feita principalmente através da via de pentose fosfato, em detrimento da via de interconversão pentose-glucuronato. Nossos dados mostram que as diferentes etapas do cultivo de Hib leva à ação conjunta de vários grupos de genes, com destaque àqueles ligados às funções celulares básicas, como a síntese de proteínas e de parede celular, o transporte e a síntese de aminoácidos. Esses resultados contribuem para o entendimento dos processos bioquímicos e celulares que ocorrem durante o processo de cultivo de Hib, possibilitando que sejam feitas sugestões de modificações genéticas em Hib e alteração no processo de cultivo com propósito de diminuir produção de acetato e aumentar produção do polissacarídeo. / Haemophilus influenzae (Hi) is a nasopharynx commensal Gram-negative bacterium and an opportunistic pathogen whose only known natural host is human being. Hi strains with polysaccharide capsule are related to more severe invasive diseases, wherein type b capsule (Hib) strains are the main cause of bacterial meningitis in unvaccinated population. To produce Hib vaccine, purified polysaccharide of this bacterium is chemically conjugated to tetanus toxoid protein. Industrially, polysaccharide production is performed by cultivating this micro-organism in bioreactors; however, the yield of polysaccharide is low, even with supply of nutrients, pH control and further adjustments of the fermentation conditions during cultivation. The study of different physiological profiles of Hib bacterial population during cultivation by transcriptomics brings the possibility to deepen the knowledge about the metabolism of this micro-organism. Transcription of genes expressed at different times considered metabolically significant points of Hib strain GB 3291 grown in fed-batch conducted in a 10 L bioreactor with submerged aeration and pH (7.0) and temperature (30 ° C) control rates were obtained through massive parallel RNA sequencing (RNA-seq). Gene co-expression analysis was performed with WGCNA, in which eight modules of co-expressed genes were identified, four of which showed high correlation with cultivation data traits, including acetate and polysaccharide productivity. Enrichment analysis identified pathways related to ribosome, cell wall synthesis, transports and carbon consumption. Differential expression analysis allowed to observe this bacteria behaviour during cultivation. Through transcription rate analysis, it was possible to identify the main pathways for acetate and polysaccharide synthesis, which is through pentose phosphate pathway instead of glucoronate-pentose pathway. Our data show that different stages in Hib cultivation leads to joint action of several gene groups, highlighting genes related to basic cellular roles, like protein and cell wall synthesis, transport and aminoacid synthesis. These results contribute to the understanding of biochemical and cellular processes that ocurr during Hib cultivation process, allowing suggestions to be made to modify Hib gene circuitry and to change cultivation process in order to decrease acetate production and to decrease acetate production and increase polysaccharide production.

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é um importante patógeno humano, responsável por graves infecções das vias respiratórias. O principal fator de virulência desse microrganismo é a cápsula polissacarídica (PS), antígeno das vacinas atuais, que são elaboradas com os PS purificados de cepas de pneumococo prevalentes na população. O objetivo desse trabalho foi desenvolver um processo de purificação do PS do sorotipo 14, responsável por 39% das doenças em crianças de 0-6 anos no Brasil. A metodologia de purificação envolveu separação celular por microfiltração tangencial e concentração do microfiltrado com membrana de ultrafiltração tangencial de 50 kDa. O produto dessa etapa foi diafiltrado com dodecil sulfato de sódio em membrana de ultrafiltração tangencial de 30 kDa, seguido de precipitação com ácido tricloroacético a 5%, precipitação por etanol (20% e 60%) e cromatografia de troca aniônica. A pureza do PS foi avaliada pelo conteúdo de proteínas e ácidos nucleicos remanescentes e o tamanho por cromatografia de exclusão molecular. O PS foi obtido com pureza e tamanho requeridos pelos órgãos regulatórios e o rendimento final do processo foi de 65%. / Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an important human pathogen responsible for severe respiratory tract infections. The main virulence factor of this microorganism is the capsular polysaccharide (PS), which is the antigen of all current vaccines, which are prepared with purified PS of pneumococcal strains prevalent in the population. The objective of this work was to develop a new purification process for PS of serotype 14, responsible for 39% of diseases in children of 0-6 years old in Brazil. The purification method involved cell separation by tangential microfiltration and concentration of cell-free culture broth containing PS by tangential ultrafiltration (50 kDa). The product of this step was diafiltrated with sodium dodecyl sulfate by tangential ultrafiltration (30 kDa), following by 5% trichloroacetic acid precipitation, 20% and 60% ethanol precipitation and anion exchange chromatography. The PS purity was evaluated by the content of residual proteins and nucleic acids, and the molecular mass by size exclusion chromatography. The purity and molecular mass requirements were achieved and the process global yield was 65%.

Streptococcus pneumoniae é a maior causa de doenças infecciosas invasivas. As vacinas conjugadas, ao contrário das vacinas polissacarídicas, se mostram eficazes na indução de uma resposta protetora em crianças menores de 2 anos de idade. Entretanto, apesar do sucesso na redução dos casos de doenças pneumocócicas, publicações recentes têm mostrado um aumento nos casos de doença por sorotipos de S. pneumoniae não inclusos nas vacinas conjugadas atualmente licenciadas. Com o objetivo de evitar a substituição dos sorotipos prevalentes e aumentar a cobertura vacinal, nosso projeto prevê a introdução de uma proteína de superfície do pneumococo como carreador em uma vacina conjugada. A Proteína de Superfície Pneumocócica A (PspA), por ser conservada entre diversos sorotipos e por sua alta imunogenicidade, foi escolhida para constituir o conjugado, juntamente com o Polissacarídeo Capsular de S. pneumoniae sorotipo 6B (PS6B), um sorotipo de elevada prevalência no Brasil. Também foi avaliada a influência de diferentes espaçadores entre a proteína carreadora e o PS sobre a resposta imune induzida. Estudos envolvendo diferentes condições reacionais tiveram como objetivo o estabelecimento de um protocolo de conjugação com elevado rendimento. A substituição do ativador EDAC (hidrocloreto de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida), comumente empregado na ativação do grupo carboxila da proteína, pelo DMT-MM (cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino) foi capaz de aumentar significativamente o rendimento reacional, o qual passou de menos de 10% para aproximadamente 50%. A proteção com formaldeído dos grupos lisinas da PspA aumentou a especificidade da reação de conjugação, com consequente aumento no rendimento reacional. A PspA modificada manteve a mesma estrutura secundária apresentada pela PspA nativa (análise por dicroísmo circular - CD) bem como sua imunogenicidade (título de anticorpos, capacidade de deposição de complemento e atividade opsonofagocítica). Apesar das análises por CD mostrarem que a conjugação alterou a estrutura secundária da PspA, ensaios imunológicos mostraram que essa desestruturação não afetou a sua capacidade de induzir uma resposta imune protetora. A resposta anti-PspA e anti-PS6B induzida pelo conjugado mostrou-se dose dependente, muito embora o PS6B tenha se comportado como um antígeno pouco imunogênico. / Streptococcus pneumoniae is the main cause of invasive infectious diseases. Unlike polysaccharide (PS) based vaccines, conjugate vaccines have shown to protect children less than 2 years old. However, regardless of the success in reducing pneumococcal disease, recent reports have shown an increase in the rate of disease caused by serotypes not included in licensed conjugate vaccines. In order to avoid serotype replacement, our project proposes to test a surface exposed pneumococcal protein as carrier. Pneumococcal Surface Protein A (PspA), a conserved protein among various serotypes, and highly immunogenic was chosen to take part in the conjugate together with the Polysaccharide Serotype B of Streptococcus pneumoniae (PS6B), a serotype of high incidence in Brazil. In this sense, studies involving different reactional conditions were aimed at stablishing a high yield conjugation protocol. Also, the influence of different spacer between carrier protein and polysaccharide were evaluated on immune response. The replacement of EDAC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride), usually used in the activation of protein carboxyl groups, to DMT-MM (4-[4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl]-4-methylmorpholinium chloride), was able to significantly increase the reactional yield from less than 10% to approximately 50%. The protection of lysines groups of PspA with formaldehyde increased conjugation specificity, with subsequent increase in reactional yield. Modified PspA maintained the same secondary structure of native PspA (circular dichroism analyses - CD) as well as its immunogenicity (antibody titers, deposition of complement and opsonophaghocytic activity). Despite circular dichroism analyses have shown changes in PspA secondary structure, immunological tests proved that this alteration did not affect its ability in inducing a protective immune response. Anti-PspA and anti-PS6B responses proved to be dose dependent, although PS6B acted as a poor immunogenic antigen in mice.

Streptococcus pneumoniae é uma bactéria encapsulada que coloniza a nasofaringe, sendo uma das principais causas de morte por pneumonia e meningite em crianças e idosos. As vacinas contra S. pneumoniae são compostas por polissacarídeos capsulares (PS) livres ou conjugados à uma proteína. A vantagem do polissacarídeo conjugado em relação ao livre é a resposta timo-dependente. Pelo fato de existirem pelo menos 92 diferentes sorotipos capsulares, a utilização de uma proteína pneumocócica em uma vacina conjugada com apenas alguns sorotipos poderia aumentar a sua cobertura vacinal. Para tal, a utilização da proteína de superfície pneumocócica A (PspA) foi utilizada como carreador protéico covalentemente ligado ao polissacarídeo capsular sorotipo 14. Este trabalho também apresenta uma nova metodologia para a síntese de vacinas conjugadas, que vem demonstrando melhores resultados em nosso laboratório em comparação aos métodos clássicos de conjugação. O conjugado PS14-PspA foi administrado em camundongos BALB/c e o título de IgG anti-PS14 e anti-PspA, o índice de avidez, a deposição de complemento e a distribuição das subclasses de IgG foram avaliados. O título de IgG anti-PS14 conjugado foi significativamente maior do que título de IgG anti-PS14 livre. A avidez e a deposição de complemento do soro anti-PS14 conjugado também foram maiores. A principal subclasse de IgG induzida pelo PS14 livre foi IgG3 enquanto o PS14 conjugado induziu preferencialmente IgG1. No entanto, o índice de avidez, o perfil de distribuição das subclasses de IgG e a medida funcional da atividade opsonofagocítica dos soros anti-PspA livre e conjugada foram os mesmos. / Streptococcus pneumoniae is an encapsulated bacterium that colonizes the nasopharynx, being one of the leading causes of death from pneumonia and meningitis in infants and elderly. Vaccines against S. pneumoniae are constituted by plain capsular polysaccharide (PS) or conjugated to a protein. The advantage of conjugated PS on plain PS vaccine is the thymus dependent immune response. Since there are at least 92 different capsular serotypes, the use of a pneumococcal protein in a conjugate vaccine using only few serotypes might broader its coverage. For this purpose the pneumococcal surface protein A (PspA) was used as protein carrier to bind covalently to the capsular polysaccharide serotype 14. This work also presents a new methodology for the synthesis of conjugate vaccines, which showed better results in our laboratory in comparison to the classic ones. The conjugate PS14-PspA was injected in BALB/c mice and sera were measured for IgG titer against PS14 and PspA. IgG avidity index, complement deposition, and anti-PS14 and anti-PspA IgG subclasses were also evaluated. IgG titer against conjugated PS14 was significantly higher than IgG titer against control PS14. The avidity and the complement deposition of conjugated anti-PS14 serum were also higher. The main IgG subclass induced by free PS14 was IgG3 while conjugated PS14 induced preferably IgG1. Nevertheless, the avidity index, the IgG subclasses distribution profile, and the functional opsonophagocytic measure from free and conjugated anti-PspA sera were the same.

Haemophilus influenzae type b (Hib) é uma importante bactéria Gram-negativa causadora de pneumonia, meningite e septicemia em crianças abaixo dos 5 anos de idade. A prevenção contra a doença pode ser alcançada pela imunização da população com vacina conjugada polissacarídeo-proteína, uma vez que a vacina de polissacarídeo não é eficiente. As vacinas conjugadas disponíveis comercialmente custam para o governo brasileiro cerca de US2,7 a dose, sendo necessárias no mínimo 3 doses para imunização completa. O presente estudo desenvolveu um novo método de conjugação de polissacarídeo capsular de Hib (PRP) com toxóide tetânico (TT). O método hidrazona baseia-se em 3 etapas simples: oxidação e derivatização de PRP com espaçador molecular e conjugação com TT na presença de uma carbodiimida e de um éster amino reativo. Após um estudo detalhado de cada etapa do método hidrazona, o novo processo mostrou excelentes resultados de rendimento mesmo após escalonamento. A imunogenicidade e o índice de avidez do conjugado hidrazona foram avaliados e os resultados encontrados foram comparáveis a vacina comercial Hiberix®. A técnica de HPSEC mostrou-se eficaz e o perfil cromatográfico do conjugado hidrazona foi muito similar ao da vacina Hiberix. Finalmente, o novo processo de conjugação de vacina permitiu o desenvolvimento de uma poderosa tecnologia constituindo uma excelente opção para o governo brasileiro. / Haemophilus influenzae type b (Hib) is an important encapsulated bacteria, which causes pneumonia, meningitis and septicaemia in infants. Prevention against infection is achieved by the currently available polysaccharide protein conjugate vaccine. However, due to its high production costs (around U$ 2,7 per dose) this formulation cannot be used in mass immunization programs in Brazil. In the present study, we developed a new method for the conjugation of Hib polysaccharide (PRP) and tetanus toxoid (TT). The hydrazone method is based on 3 singles steps: PRP oxidation, PRP derivatization with linker spacer and conjugation with TT in the presence of carbodiimide and an amino reactive ester. After detailed study of each step of method, the new process showed very good yield of conjugation even when it was scaled-up. The immunogenicity and the avidity index of hydrazone conjugate were evaluated and the results were comparable with those obtained with the commercial vaccine Hiberix®. The HPLC hydrazone profile was very similar to HPLC Hiberix profile. Finally, the new conjugation process allows the development of a powerful vaccine technology, constituting an excellent choice for the brazilian government.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第21811号 / 農博第2324号 / 新制||農||1066(附属図書館) / 学位論文||H31||N5183(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科農学専攻 / (主査)教授 松村 康生, 教授 白岩 立彦, 教授 丸山 伸之 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第21817号 / 農博第2330号 / 新制||農||1067(附属図書館) / 学位論文||H31||N5189(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻 / (主査)教授 間藤 徹, 教授 髙部 圭司, 教授 矢﨑 一史 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

This master thesis is focused on characterization of some energy drinks and formulation of their modified composition. The theoretical part was focused on summary of energy drinks and some of their natural components - guarana, goji as well as on techniques of encapsulation. In the experimental part concentrations of caffeine, vitamin C, polyphenols and carbohydrates in commercially purchased drinks was evaluated. Subsequently, three kinds of particles (particles with caffeine, particles with guarana and particles with guarana and goji) by 6 different techniques were prepared. The efficiency of encapsulation was determined by HPLC/UV-VIS (caffeine, vitamin C) and by spectrophotometry (phenolics). Stability of the particles was followed in real food and in a model physiological environment of artificial digestive juices. Size of prepared particles was determined by dynamic light scattering. In this work it was found that particles with best activity and stability were obtained by encapsulator. For manual particles the best results were found in the liposome particles. Liposomes exhibited the smallest particle size, the highest efficiency encapsulation, excellent stability in real food and juices and the best value of zeta potential.