In dieser prospektiven, Cluster-randomisierten Studie wurde untersucht, inwieweit eine Steigerung der körperlichen Aktivität (mittels zusätzlichem täglichen Sportunterricht an Schulen) die körperliche Leistungsfähigkeit und die Anzahl sowie die migratorische Kapazität der zirkulierenden endothelialen Progenitorezellen (CPCs) beeinflusst. Zielparameter waren die maximale Sauerstoffaufnahme, der Body Mass Index, die Körperzusammensetzung, das Lipidprofil, die motorischen Fähigkeiten, sowie CPCs als ein Surrogatparameter für das kardiovaskuläre Risiko. 182 Kinder (Alter 11,1±0,7 Jahre) aus sieben Gymnasialklassen der sechsten Jahrgangsstufe wurden klassenweise in eine Interventions- (109 Kinder) und eine Kontrollgruppe (73 Kinder) randomisiert. Der Stundenplan der Kinder der Interventionsgruppe sah jeden Tag eine Schulstunde (45 Minuten) Sportunterricht vor, wohingegen die Kontrollgruppe nur die im Lehrplan vorgesehenen zwei Schulstunden Sport pro Woche erhielt. Als Referenzgruppe dienten zusätzlich zwei Klassen eines Sportgymnasiums (29 Schüler), deren Stundenplan 12 Schulstunden Sport pro Woche beinhaltet. Die Ergebnisse wurden mittels Kovarianz und Intraklassenkorrelation berechnet: Nach einem Jahr täglichen Sportunterrichts zeigte sich eine signifikante Verbesserung der körperlichen Leistungsfähigkeit (VO2max: 3,7ml/kg/min; 95% CI 0,3–7,2) sowie ein deutlicher Anstieg der Konzentration der CPCs (um 97 Zellen/1x 106Leukozyten; 95%CI -0,28–0,13) im Vergleich zu Schülern der Kontrollgruppe. Es zeigte sich ein Trend zu einer Abnahme der Prävalenz von Übergewicht und Adipositas von 12,8% auf 7,3% und zu einer Steigerung der motorischen Fähigkeiten der Kinder der Interventionsgruppe (MQ: 4; 95%CI -1 – 8), jedoch beides ohne Signifikanz. Das Lipidprofil der Kinder Interventionsgruppe unterschied sich nicht signifikant (HDL-Cholesterol 0,03mmol/L; 95%CI -0,08 - 0,14). Insgesamt ergab sich ein signifikant positiver Effekt eines täglichen Sportunterrichts auf die körperliche Fitness der Schulkinder sowie die Anzahl der CPCs. Eine Erhöhung der körperlichen Aktivität bei Kindern ist damit eine wichtige und sinnvolle Interventionsmöglichkeit, die bei zukünftigen Primärpräventionsprogrammen unbedingt berücksichtig werden sollte. Langzeitbeobachtungen hinsichtlich des Einflusses auf das kardiovaskuläre Risikoprofil im Erwachsenenalter bleiben abzuwarten.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde mithilfe eines 4 stündigen Radmarathons die zeitabhängige Freisetzung von zirkulierenden Vorläuferzellen untersucht. Hierzu wurde den 17 gesunden, gut trainierten Probanden während der Prozedur zu festgelegten Zeitpunkten Blut aus einer Venenverweilkanüle entnommen. Daraus wurden mittels Dichtegradient die mononuklearen Zellen isoliert und im Anschluss mittels Durchflusszytometrie die Konzentration der zirkulierenden Progenitorzellen quantifiziert. Es ließ sich ein signifikanter zeitversetzter Anstieg der Konzentration hämatopoietischer Progenitorzellen (CD34pos und CD133pos) wie auch endothelialer Progenitorzellen (CD34/KDRpos und CD133/KDRpos) ermitteln. Die maximale Konzentrationsänderung wurde nach 210 Minuten erreicht. Als Freisetzungsmediatoren wurden in dieser Arbeit die Konzentration von VEGF und IL-6 bestimmt. Auch hier stellte sich ein signifikanter Anstieg der Spiegel dar. Die Konzentrationsänderungen der einzelnen Zellpopulationen waren spätestens 24 Stunden nach Beendigung des Radmarathons nicht mehr nachweisbar. Des Weiteren ging die Arbeit der Frage nach, wie sich die Konzentration von Mikropartkel und endothelialer Mikropartikel als Marker für einen Endothelzellschaden auswirkt. Ein Anstieg der Konzentration reifer (CD146pos) Endothelzellen wurde verzeichnet. Ausgangspunkt dieser Arbeit war die sehr beschränkte und kontroverse Datenlage bezüglich der Konzentrationen von Progenitorzellen freigesetzt durch sportliche Aktivität.

Diese Arbeit untersucht die humanen chondrogenen Progenitorzellen (CPC) auf ihre Eignung für einen möglichen Therapieansatz der Osteoarthrose (OA). Hierbei zeigte sich, dass die CPC die Fähigkeit zur Migration sowohl in vitro als auch ex vivo besitzen. In vitro steigerte der Einsatz von TGF-ß3 die Migrationsrate, was von therapeutischem Nutzen sein könnte. Die CPC wanderten ex vivo ebenso in Knorpelgewebe aus makroskopisch unauffälligen Bereichen wie in an den Hauptdefekt angrenzendes Gewebe ein. Mit der Versuchsdauer nahm die Einwanderungstiefe zu, wobei dies im unauffällig erscheinenden Knorpel ausgeprägter war und hier auch größere Eindringtiefen gemessen wurden. Dies spricht für eine Zielzone, die die CPC anstreben und die im Knorpel neben dem Hauptdefekt früher erreicht wird. Bezüglich der Migrationsgeschwindigkeit weisen die CPC eine Heterogenität auf, verglichen mit anderen Zelltypen im menschlichen Organismus ist sie insgesamt allerdings gering. Über die gesamte Versuchsdauer ließen sich in beiden Gewebetypen proliferationsfähige CPC nachweisen. Eine Genexpressionsanalyse zeigte, dass die CPC dedifferenzierten Chondrozyten am ähnlichsten sind und eine kurzfristige Kultivierung sie kaum beeinflusst. Die Transfektion veränderte die Ausrichtung der CPC nicht, sondern führte vornehmlich zu einer vorübergehenden generellen Herabregulierung der Genexpression. Die Ergebnisse zeigen, dass ein therapeutischer Einsatz der CPC möglich wäre, da die Zellen auf einfache und komplikationsarme Weise gewonnen und kultiviert werden können. Zudem eröffnen die ausgeprägten migratorischen Fähigkeiten der CPC einfache Applikationswege, z. B. im Rahmen einer intraartikulären Injektion oder Arthroskopie. Ebenso viel versprechend ist die Erkenntnis, dass die Zellen innerhalb des Gewebes vital bleiben und so an einer Regeneration teilhaben könnten. Vor einer zukünftigen Anwendung der CPC bleiben allerdings noch einige Fragen zu beantworten. So ist die Rolle der CPC in der Pathogenese der OA noch nicht vollständig geklärt. Außerdem bleibt offen, wie lange die CPC im Gewebe vital bleiben und ob sie in der Lage sind, im Gewebe hyaline Knorpel-EZM herzustellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben daher Anlass für weitere Forschung auf diesem Gebiet.

Zusammenfassung der Arbeit Beteiligung purinerger Rezeptoren am Schmerzgeschehen und an der neuronalen Entwicklung Patrizia Rubini Illes Rudolf-Boehm-Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Leipzig Diese kumulative Arbeit umfasst neun Publikationen, welche die Beteiligung purinerger P2-Rezeptoren (P2R) am Schmerzgeschehen sowie der neuronalen Entwicklung belegen. Im Fokus stehen zwei ATP-aktivierte Rezeptor-Kanäle (P2X3R, P2X7R) und ein G-Protein-gekoppelter, ATP-empfindlicher Rezeptor (P2Y1R). (1) Da sich humane P2X3R an peripheren und zentralen Endigungen primärer-sensorischer Afferenzen befinden, ist die Entschlüsselung der Agonisten-Bindungsstelle für die Entwicklung potenziell analgetisch wirkender, kompetitiver Antagonisten von großer Bedeutung. Wir identifizierten Gruppen konservierter und nicht-konservierter Aminosäure-Reste, die an der Schnittstelle zweier benachbarter Untereinheiten, die Agonisten-Bindungstasche auskleiden. Abhängig vom Mengenverhältnis der zur Transfektion verwendeten cDNA, bilden P2X2-, P2X3- und P2X6-Untereinheiten heteromere Rezeptoren (P2X2/3R, P2X2/6R) in einer variablen Stöchiometrie. (2) Adulte neurale Progenitorzellen (NPZ) der Subventrikulärzone der Maus besitzen Apoptose- bzw. Nekrose-vermittelnde P2X7R. Diese kommen in Assoziation mit P2X4R vor, bilden jedoch wahrscheinlich keinen heteromeren P2X4/7R. P2X7R könnten zum Absterben der, nach metabolischen Schäden im Überschuss gebildeten, NPZ beitragen. Im Laufe der neuronalen Entwicklung verlieren die NPZ ihre P2X7R. Im Gegensatz hierzu bleiben diese bei ihren astrozytären Nachkommen erhalten. (3) Humane mesencephale embryonale NPZ sind mit P2Y1R ausgestattet, die über eine Ca2+-Wellenaktivität die Proliferation der NPZ beschleunigen und in Differenzierungsvorgänge eingreifen. De-differenzierte, kultivierte Neurone des Ratten-Striatum enthalten ebenfalls P2Y1R. Diese setzen Ca2+ aus seinen intrazellulären Speichern frei und öffnen somit Ca2+-selektive „store-operated channels“ in der Zellmembran. Wir konnten zeigen, dass der P2Y1R-stimulierte Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration in den striatalen Neuronen durch die Aktivierung von Dopamin D1- und D2R inhibiert wurde. Die vorliegende Arbeit belegt die Bedeutung einiger P2R für zahlreiche, auch potentiell therapeutisch bedeutsame Funktionen des menschlichen und tierischen Organismus.

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In dieser prospektiven, Cluster-randomisierten Studie wurde untersucht, inwieweit eine Steigerung der körperlichen Aktivität (mittels zusätzlichem täglichen Sportunterricht an Schulen) die körperliche Leistungsfähigkeit und die Anzahl sowie die migratorische Kapazität der zirkulierenden endothelialen Progenitorezellen (CPCs) beeinflusst. Zielparameter waren die maximale Sauerstoffaufnahme, der Body Mass Index, die Körperzusammensetzung, das Lipidprofil, die motorischen Fähigkeiten, sowie CPCs als ein Surrogatparameter für das kardiovaskuläre Risiko. 182 Kinder (Alter 11,1±0,7 Jahre) aus sieben Gymnasialklassen der sechsten Jahrgangsstufe wurden klassenweise in eine Interventions- (109 Kinder) und eine Kontrollgruppe (73 Kinder) randomisiert. Der Stundenplan der Kinder der Interventionsgruppe sah jeden Tag eine Schulstunde (45 Minuten) Sportunterricht vor, wohingegen die Kontrollgruppe nur die im Lehrplan vorgesehenen zwei Schulstunden Sport pro Woche erhielt. Als Referenzgruppe dienten zusätzlich zwei Klassen eines Sportgymnasiums (29 Schüler), deren Stundenplan 12 Schulstunden Sport pro Woche beinhaltet. Die Ergebnisse wurden mittels Kovarianz und Intraklassenkorrelation berechnet: Nach einem Jahr täglichen Sportunterrichts zeigte sich eine signifikante Verbesserung der körperlichen Leistungsfähigkeit (VO2max: 3,7ml/kg/min; 95% CI 0,3–7,2) sowie ein deutlicher Anstieg der Konzentration der CPCs (um 97 Zellen/1x 106Leukozyten; 95%CI -0,28–0,13) im Vergleich zu Schülern der Kontrollgruppe. Es zeigte sich ein Trend zu einer Abnahme der Prävalenz von Übergewicht und Adipositas von 12,8% auf 7,3% und zu einer Steigerung der motorischen Fähigkeiten der Kinder der Interventionsgruppe (MQ: 4; 95%CI -1 – 8), jedoch beides ohne Signifikanz. Das Lipidprofil der Kinder Interventionsgruppe unterschied sich nicht signifikant (HDL-Cholesterol 0,03mmol/L; 95%CI -0,08 - 0,14). Insgesamt ergab sich ein signifikant positiver Effekt eines täglichen Sportunterrichts auf die körperliche Fitness der Schulkinder sowie die Anzahl der CPCs. Eine Erhöhung der körperlichen Aktivität bei Kindern ist damit eine wichtige und sinnvolle Interventionsmöglichkeit, die bei zukünftigen Primärpräventionsprogrammen unbedingt berücksichtig werden sollte. Langzeitbeobachtungen hinsichtlich des Einflusses auf das kardiovaskuläre Risikoprofil im Erwachsenenalter bleiben abzuwarten.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde mithilfe eines 4 stündigen Radmarathons die zeitabhängige Freisetzung von zirkulierenden Vorläuferzellen untersucht. Hierzu wurde den 17 gesunden, gut trainierten Probanden während der Prozedur zu festgelegten Zeitpunkten Blut aus einer Venenverweilkanüle entnommen. Daraus wurden mittels Dichtegradient die mononuklearen Zellen isoliert und im Anschluss mittels Durchflusszytometrie die Konzentration der zirkulierenden Progenitorzellen quantifiziert. Es ließ sich ein signifikanter zeitversetzter Anstieg der Konzentration hämatopoietischer Progenitorzellen (CD34pos und CD133pos) wie auch endothelialer Progenitorzellen (CD34/KDRpos und CD133/KDRpos) ermitteln. Die maximale Konzentrationsänderung wurde nach 210 Minuten erreicht. Als Freisetzungsmediatoren wurden in dieser Arbeit die Konzentration von VEGF und IL-6 bestimmt. Auch hier stellte sich ein signifikanter Anstieg der Spiegel dar. Die Konzentrationsänderungen der einzelnen Zellpopulationen waren spätestens 24 Stunden nach Beendigung des Radmarathons nicht mehr nachweisbar. Des Weiteren ging die Arbeit der Frage nach, wie sich die Konzentration von Mikropartkel und endothelialer Mikropartikel als Marker für einen Endothelzellschaden auswirkt. Ein Anstieg der Konzentration reifer (CD146pos) Endothelzellen wurde verzeichnet. Ausgangspunkt dieser Arbeit war die sehr beschränkte und kontroverse Datenlage bezüglich der Konzentrationen von Progenitorzellen freigesetzt durch sportliche Aktivität.

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Zusammenfassung der Arbeit Beteiligung purinerger Rezeptoren am Schmerzgeschehen und an der neuronalen Entwicklung Patrizia Rubini Illes Rudolf-Boehm-Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Leipzig Diese kumulative Arbeit umfasst neun Publikationen, welche die Beteiligung purinerger P2-Rezeptoren (P2R) am Schmerzgeschehen sowie der neuronalen Entwicklung belegen. Im Fokus stehen zwei ATP-aktivierte Rezeptor-Kanäle (P2X3R, P2X7R) und ein G-Protein-gekoppelter, ATP-empfindlicher Rezeptor (P2Y1R). (1) Da sich humane P2X3R an peripheren und zentralen Endigungen primärer-sensorischer Afferenzen befinden, ist die Entschlüsselung der Agonisten-Bindungsstelle für die Entwicklung potenziell analgetisch wirkender, kompetitiver Antagonisten von großer Bedeutung. Wir identifizierten Gruppen konservierter und nicht-konservierter Aminosäure-Reste, die an der Schnittstelle zweier benachbarter Untereinheiten, die Agonisten-Bindungstasche auskleiden. Abhängig vom Mengenverhältnis der zur Transfektion verwendeten cDNA, bilden P2X2-, P2X3- und P2X6-Untereinheiten heteromere Rezeptoren (P2X2/3R, P2X2/6R) in einer variablen Stöchiometrie. (2) Adulte neurale Progenitorzellen (NPZ) der Subventrikulärzone der Maus besitzen Apoptose- bzw. Nekrose-vermittelnde P2X7R. Diese kommen in Assoziation mit P2X4R vor, bilden jedoch wahrscheinlich keinen heteromeren P2X4/7R. P2X7R könnten zum Absterben der, nach metabolischen Schäden im Überschuss gebildeten, NPZ beitragen. Im Laufe der neuronalen Entwicklung verlieren die NPZ ihre P2X7R. Im Gegensatz hierzu bleiben diese bei ihren astrozytären Nachkommen erhalten. (3) Humane mesencephale embryonale NPZ sind mit P2Y1R ausgestattet, die über eine Ca2+-Wellenaktivität die Proliferation der NPZ beschleunigen und in Differenzierungsvorgänge eingreifen. De-differenzierte, kultivierte Neurone des Ratten-Striatum enthalten ebenfalls P2Y1R. Diese setzen Ca2+ aus seinen intrazellulären Speichern frei und öffnen somit Ca2+-selektive „store-operated channels“ in der Zellmembran. Wir konnten zeigen, dass der P2Y1R-stimulierte Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration in den striatalen Neuronen durch die Aktivierung von Dopamin D1- und D2R inhibiert wurde. Die vorliegende Arbeit belegt die Bedeutung einiger P2R für zahlreiche, auch potentiell therapeutisch bedeutsame Funktionen des menschlichen und tierischen Organismus.:Inhaltsverzeichnis Kapitel Seite Abkürzungen …………………………………………………………………………………. 5 1. Einführung in die Thematik.......................................................................... 7 1.1. Freisetzung von Nukleotiden und ihre Metabolisierung im Extrazellulärraum …7………………………………… 1.2. P2X-Rezeptoren…………………………………………………………………….. 9 1.3. P2Y-Rezeptoren……………………………………………………………………. 12 1.4. P2-Rezeptoren und Schmerz……………………………………………………... 14 1.5. P2-Rezeptoren und neuronale Entwicklung; embryonale undadulte neurale Vorläuferzellen……………………………………………………. 17 1.6. Referenzen………………………………………………………………………….. 19 2. Wissenschaftliche Ergebnisse……………………………………………………… 23 2.1. Komplex I. Struktur-Wirkungs-Zusammenhänge bei rekombinanten, humanen P2X3- und P2X2/3-Rezeptoren in Expressionssystemen…………. 24 2.1.1. Amino acid residues constituting the agonist binding site of the human P2X3 receptor……………………………………………………………… 24 2.1.2. ATP binding site mutagenesis reveals different subunit stoichiometry of functional P2X2/3 and P2X2/6 receptors……………………………………... 26 2.1.3 Flexible subunit stoichiometry of functional human P2X2/3 heteromeric receptors……………………………………………………………... 28 2.2. Komplex II. Vorhandensein und Wirkung von P2X7-Rezeptoren an kultivierten adulten, neuralen Vorläuferzellen und Astrozyten………….. 29 2.2.1. P2X7 receptors at adult neural progenitor cells of the mouse subventricular zone………………………………………………………………… 29 2.2.2. Co-expression of functional P2X4 and P2X7 receptors at adult neural precursor cells of the mouse subventricular zone……………………… 31 2.2.3. Functional P2X7 receptors at cultured hippocampal astrocytes but not neurons…………………………………………………………………….. 32 2.3. Komplex III. Vorhandensein und Wirkung von P2Y-Rezeptoren an embryonalen neuralen Vorläuferzellen und dedifferenzierten kultivierten striatalenNeuronen... 33 2.3.1. Increase of intracellular Ca2+ by adenine and uracil nucleotides in human midbrain-derived neuronal precursor cells…………... 33 2.3.2. Regulation of intracellular Ca2+ by P2Y1 receptors may depend on the developmental stage of cultured rat striatal neurons…………………... 35 2.3.3. Modulation by D1 and D2 dopamine receptors of ATP-induced release of intracellular Ca2+ in cultured rat striatal neurons 36 3. Zusammenfassung und Ausblick………………………………………… ………... 37 4. Erklärungen, Danksagung…………………………………………… 38 Erklärung über die eigenständige Anfertigung der Arbeit………… 38 Erklärung über den eigenen Anteil an den einzelnen Arbeiten…………….. 39 Danksagung………………………………………………………………… 42