Orientador: Carlos Roberto Daleck / Banca: Renée Laufer Amorim / Banca: Mirela Tinucci Costa / Resumo: Pensando na contribuição ao estudo da oncologia humana e no aumento da sobrevida de cadelas com câncer de mama o objetivo deste trabalho foi de investigar a imunorreatividade da prostaglandina E2 (PGE2) no diagnóstico e prognóstico das neoplasias mamárias. O estudo foi realizado com 60 amostras de neoplasias de mama de cadelas que foram atendidas nos anos de 2002 a 2004. Este material foi dividido em seis grupos de 10 amostras. Nos grupos adenoma, carcinoma com prognóstico bom e carcinoma com prognóstico ruim a seleção dos casos se deu pela classificação histológica e evolução clínica do tumor. Os outros 30 tumores foram representados por 10 amostras de carcinoma primário metastático, 10 amostras de metástase pulmonar e 10 de carcinoma inflamatório. O Grupo Controle tinha 5 amostras de tecido mamário sem alterações patológicas. A avaliação da imunorreatividade da PGE2 foi realizada através do exame imunoistoquímico, utilizando o anticorpo primário anti- PGE2 , clone PG 31, Oxford Biomedical Research. Avaliou-se também a incidência das neoplasias mamárias relacionadas à idade dos animais, o estadiamento clínico de acordo com a classificação histopatológica do tumor e a sobrevida dos animais que foram submetidos à cirurgia. O número de células imunomarcadas pelo anticorpo não apresentou variação significativa e não houve diferença estatística (P = 0,239) entre os grupos (adenoma, carcinoma com prognóstico bom, carcinoma com prognóstico ruim, carcinoma primário metastático, metástase pulmonar e carcinoma inflamatório), no grupo controle observou-se uma diferença estatística (P < 0,014) com relação aos demais grupos. / Abstract: Considering the contribution to researches in human oncology and the increasing surveillance of bitches with mammary neoplasm, the main purpose of this paper was to investigate the immunoreactivity of prostaglandine E2 (PGE2) in the diagnosis and prognosis of mammary neoplasm. The research was performed in 60 samples of mammary neoplasm in bitches attempted between 2002 and 2004. The material was separated into six groups of 10 samples each. In the group consisting of adenoma, carcinoma with good prognosis and carcinoma with poor prognosis, the cases were chosen according to the histological grade and clinical behavior of the tumor. The other 30 tumours consisted of 10 samples of primary metastatic carcinoma, 10 samples of pulmonary metastasis and 10 samples of inflammatory carcinoma. The control group consisted in 5 samples of mammary tissue without pathological changes. The immunoreactivity of PGE2 was evaluated by immunohistochemistry, using the primary antibody anti-PGE2, clone PG31, Oxford Biomedical Research. The incidence of mammary neoplasm was also analyzed according to the age of animals, clinical stage following the histopathologic grade of tumor and surveillance of bitches that underwent surgery. The number of positive cells for the antibody did not showed a significant range and there was no statistical difference (P = 0,239) between the groups (adenoma, carcinoma with good prognosis, carcinoma with poor prognosis, primary metastatic carcinoma, pulmonary metastasis and inflammatory carcinoma), regarding the control group it was observed a statistical difference (p < 0,014) when compared to other groups. / Mestre

La détermination du sexe et la différenciation des cellules germinales est un processus très organisé qui commence au stade embryonnaire et se termine à la vie adulte. Dans les gonades embryonnaires l'expression de Sry suivie par l'expression de Sox9 initie le développement testiculaire tandis que, en l'absence de l'expression de Sry, les gènes associés au sexe féminin initient le développement des ovaires. Les cellules germinales qui ont migré vers les gonades nouvellement formées continuent leur prolifération intense jusqu'à ce qu'ils s'engagent dans la voie le mâle ou femelle. La décision de devenir des cellules germinales mâle ou femelle ne dépend pas seulement du chromosome sexuel des cellules germinales, mais aussi du microenvironnement des gonades. Si les cellules germinales entrent dans la gonade femelle, ils doivent arrêter la prolifération, dépasser l'arrêt mitotique et entrer en méiose et alors s'arrêter en prophase I. Alors que si les cellules germinales entrent dans la gonade mâle, ils doivent arrêter la prolifération et entrer en arrêt de la mitose. Ici, nous montrons que, lors de la détermination du sexe embryonnaire, la prostaglandine D2 (PGD2) produite par chacune des deux enzymes: la L-PGDS et H-PGDS dans les cellules somatiques et les cellules germinales du testicule mâle participe au programme de différenciation des cellules germinales. La voie de signalisation PGD2 entraine l'arrêt de la mitose par l'activation de l'expression et de la localisation nucléaire de l'inhibiteur du cycle cellulaire p21Cip1 et en réprimant les marqueurs de pluripotence et aussi Stra8. En outre, PGD2 est responsable de l'activation du gène spécifique au mâle Nanos2. Par conséquent, ces données suggèrent que la signalisation par le récepteur de PGD2 DP2 est requise pour la différenciation correcte de la cellule germinale mâle. / The sex determination and subsequent germ cell differentiation is highly ordered process that starts at embryonic stage and completes at adult life. In the embryonic gonads Sry expression followed by Sox9 expression initiates testis development while in the absence of Sry expression, genes associated to female fate initiate ovary development. The germ cells that migrated towards newly formed gonads continue extensive proliferation until they commit to the male or female pathway. The fate decision of germ cells as male or female does not depend only on germ cell chromosomal sex but also on gonadal micro-environment. If germ cells enter into female gonad, they have to stop proliferation, pass through mitotic arrest and enter into meiosis; then arrest into prophase I. While if germ cells enter into male gonad, they have to stop proliferation and enter into mitotic arrest. Here we show that during embryonic sex determination, Prostaglandin D2 (PGD2) produced by each of the two enzymes: L-Pgds and H-Pgds in somatic cells and germ cells of testis participates in male germ cell differentiation program. PGD2 signalling supports mitotic arrest by activating the expression and nuclear localization of cell cycle inhibitor P21cip1 and by repressing pluripotency markers and PGD2 has negative effects on Stra8 expression. In addition PGD2 supports activation of male specific gene Nanos2. Hence these data suggest that PGD2 signalling through DP2 receptor is required for proper male germ cell differentiation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'arthrose est une maladie multifactorielle complexe. Parmi les facteurs impliqués dans sa pathogénie, les certains prostaglandines exercent un rôle inflammatoire et d’autres un rôle protecteur. La prostaglandine D2 (PGD2) est bien connue comme une PG anti-inflammatoire, qui est régulée par l’enzyme «Lipocalin prostaglandine D-synthase». Avec l’inflammation de l'arthrose, les chondrocytes essaient de protéger le cartilage en activant certaines voies de récupération dont l'induction du gène L-PGDS. Dans cette étude, nous étudions la voie de signalisation impliquée dans la régulation de l'expression du (L-PGDS) sur les chondrocytes traités avec différents médiateurs inflammatoires. Le but de projet: Nous souhaitons étudier la régulation de la L-PGDS dans le but de concevoir des approches thérapeutiques qui peuvent activer la voie intrinsèque anti-inflammatoire. Méthode et conclusions: In vivo, l'arthrose a été suivie en fonction de l’âge chez la souris ou chirurgicalement suivant une intervention au niveau des genoux de souris. Nous avons confirmé les niveaux d’expression de L-PGDS histologiquement et par immunohistochimie. In vitro, dans les chondrocytes humains qui ont été traités avec différents médiateurs de l'inflammation, nous avons observé une augmentation de l’expression de la L-PGDS dose et temps dépendante. Nous avons montré, in vivo et in vitro que l’inflammation induit une sécrétion chondrocytaire de la L-PGDS dans le milieu extracellulaire. Enfin, nous avons observé la production de différentes isoformes de la L-PGDS en réponse à l'inflammation. / Osteoarthritis is a complex multifactorial disease; many factors are involved in its pathogenesis, among those factors prostaglandins. Some prostaglandins have inflammatory role and some have anti-inflammatory role. Prostaglandin D2 (PGD2) is a well-established anti-inflammatory PG which is synthesized by the Lipocalin prostaglandin-D synthase (L-PGDS) enzyme. Upon the initiation of the inflammatory process in osteoarthritis, chondrocytes try to save themselves by activating salvage pathways, among these pathways is the induction of L-PGDS gene. In this study we are addressing the signaling pathways involved in the regulation of (L-PGDS) gene expression, in chondrocytes treated with different inflammatory mediator. Rationale: understanding the regulation of L-PGDS will allow us to design therapeutic targets that can switch on the intrinsic anti-inflammatory pathway. Method and findings: In vivo, osteoarthritis was induced in mice knees surgically or naturally following aging, the development of osteoarthritis was then confirmed histologically. The expression levels of L-PGDS were detected by Immunohistochemistry. In vitro, human chondrocytes were treated with different inflammatory mediators (interleukin-1 beta, interleukin-17, hydrogen peroxide and tert-Butyl hydroperoxide). Interestingly, in most cases chondrocytes increased expression of L-PGDS in a dose and time dependent manner. We discovered that chondrocytes release L-PGDS into the extracellular space in response to inflammation, in vivo and in vitro. Lastly we observed different isoforms of L-PGDS generated in response to inflammation.

Il est maintenant reconnu qu'un excès ou un manque de tissu adipeux peut avoir un impact négatif sur la reproduction porcine. Ainsi, une faible adiposité résulte en une augmentation du temps requis pour le premier oestrus, une diminution des tailles de portées et une augmentation de l'intervalle sevrage-oestrus. Les producteurs de porcs étant payés selon le rendement en maigre des carcasses de porcs envoyés aux abattoirs, la sélection génétique des dernières années a surtout été orientée vers la production de porcs de plus en plus maigres. Cependant, cette réduction du tissu adipeux a, du même coup, entraîné de nombreux problèmes de reproduction et un taux de réforme des truies de plus en plus élevé. Nous savons aujourd'hui que les cellules adipeuses sont le siège d'une activité métabolique intense et qu'elles sont capables de sécréter une multitude de facteurs vers la circulation sanguine. Parmi ces facteurs, nous retrouvons diverses adipokines telles la leptine et l'adiponectine, lesquelles auraient des effets bénéfiques sur les organes reproducteurs. L'adiponectine est l'adipokine la plus abondamment sécrétée par le tissu adipeux et la présence de ses récepteurs, AdipoR1 et AdipoR2, au niveau des ovaires et de l'utérus de la truie suggère un rôle pour l'adiponectine sur diverses fonctions reproductrices. Dans cette étude, nous avons voulu déterminer l'effet de l'adiponectine recombinante sur l'utérus de la truie en utilisant un modèle in vitro de culture de cellules endométriales primaires. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la modulation de l'expression de cette adipokine et de ses récepteurs pendant le cycle oestral et au début de la gestation. Utilisant la méthode de PCR en temps réel, nous avons tout d'abord confirmé la présence des récepteurs AdipoRl, AdipoR2 et cadhérine 13 dans l'endomètre de la truie et constaté que l'expression de ces gènes est modulée pendant le cycle oestral, étant à son maximum au milieu de la phase lutéale. Nous avons aussi observé une modulation de l'expression de l'adiponectine dans le tissu adipeux sous-cutané, avec un transcrit plus abondant chez les truies hypo-prolifiques (? 10 porcelets par portée) et les truies cycliques, comparativement aux truies hyper-prolifiques (? 15 porcelets par portée) et gestantes (jour 15 de la gestation), respectivement. Dans l'endomètre, le récepteur AdipoR2 est plus fortement exprimé chez la truie gestante que chez la cyclique, alors qu'il est plus élevé chez les truies hypo-prolifiques que chez les hyper-prolifiques. Chez l'embryon de 15 jours, le profil inverse est observé, avec une quantité plus élevée de transcrits observée pour les récepteurs AdipoRl et AdipoR2 chez les embryons issus des truies hyper-prolifiques. Bien que l'expression de la cadhérine 13 soit modulée pendant le cycle oestral, la gestation (cyclique vs gestante) et la prolificité (hyper- vs hypo-prolifique) ne présentent aucun effet significatif sur son expression. Finalement, l'utilisation de culture de cellules stromales endométriales primaires traitées à l'adiponectine recombinante a révélé une augmentation de l'expression en ARN messager des gènes de la prostaglandine synthétase 2 (PTGS2) et du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF), deux gènes ayant un rôle clé en début de gestation pour la survie embryonnaire. De plus, cette modulation de l'expression génique serait médiée par l'activation des voies de signalisation de la MAPK-ERK1/2 et de la kinase activée par l'AMP (AMPK). Collectivement, ces résultats suggèrent une implication directe de l'adiponectine sur les cellules endométriales porcines et dans les processus de reproduction chez la truie, autant pendant le cycle oestral qu'en début de gestation. De plus, nos résultats identifient l'adiponectine comme un régulateur potentiel des adaptations métaboliques se produisant en début de gestation.

Les observations de radicaux organiques dans les enzymes et de leur implication dans les cycles catalytiques n'ont cessé de croître ces dernières années. La spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) à champ intense est un outil de choix pour l'étude de radicaux organiques car elle permet de résoudre la faible anisotropie du tenseur g pour ces espèces paramagnétiques. Un spectromètre fonctionnant à 285 GHz / 10.5 teslas a été construit dans la Section de Bioénergétique du centre d'études du CEA de Saclay. Le travail présentée dans ce mémoire de thèse a porté sur l'application de la RPE à champ intense à l'étude de radicaux organiques présents dans le photosystème II, qui est l'enzyme de dégagement d'oxygène, ainsi que dans les composés I de deux peroxydases, la cytochrome c peroxydase et la prostaglandine synthase.<br />Le premier chapitre présente la technique de RPE à champ intense de façon générale et introduit l'instrumentation. Les aspects généraux du photosystème II utiles dans la suite du mémoire sont également présentés.<br />Le second chapitre montre comment les propriétés anisotropes du tenseur g ont été utilisées pour obtenir des informations structurales quant à l'orientation de radicaux organiques dans le photosystème II.<br />Les enzymes étudiées dans ce travail de thèse sont des métalloprotéines. Les situations de couplages magnétiques entre les centres métalliques et les radicaux organiques présents sont souvent rencontrées dans ces cas-là. Les chapitres 3 à 5 portent sur l'étude de tels systèmes couplés.<br />Le dernier chapitre présente des situations pour lesquelles l'étude des valeurs de g permet d'obtenir des informations sur l'environnement électrostatique du radical étudié. Cette propriété déjà connue pour les radicaux tyrosyles et semiquinones est étendue aux radicaux anions de phéophytines.

Modélisations moléculaires réalisés avec le logiciel HyperChem 8. / L’effet de différentes alkylations sur l’activité biologique et la stabilité enzymatique d’un peptide linéaire L, énantiomère du modulateur allostérique des récepteurs prostaglandine F2α ont été étudiés. Dans une étude antérieure, le peptide D PDC-31 avait montré un potentiel d’inhibition des contractions du myomètre et permettait de retarder l’accouchement dans des modèles animaux et humains. Il est possible que le peptide L possède une activité semblable, mais les protéases, abondantes dans le tissu myométrial, le dégradent probablement avant qu’il ne puisse atteindre le site actif. La synthèse peptidique sur support solide suivie d’une amination réductive a permis d’obtenir différents peptides portant différentes chaines alkyle et PEG N-terminales. La protection de l’amine terminale par un groupement ortho-nitrobenzène sulfonyle suivie par une réaction de Mitsunobu a permis l’obtention d’un analogue portant une chaine farnesyle. Malgré le fait que ni l’analogue PEGylé, ni l’analogue farnesylé n’aient montrés la moindre activité, certains analogues alkylés se sont avérés actifs dans l’essai tissulaire de contractions myométriales. Le peptide L portant une chaine dodecyle s’est avéré posséder une activité statistiquement significative et reproductible. Qui plus est, l’analogue D du peptide possédant une chaine de 12 carbones s’est avéré posséder une activité inférieure à l’analogue L portant la même chaine, ce qui représente une perte d’activité significative par rapport au peptide D nonmodifié (PDC-31). / The application of hydrophobic grafts to prolong the biological activity of rapidly metabolized peptides has been explored by modification of the L-peptide of the prostaglandin F2α receptor modulator PDC-31. The all-D peptide PDC-31 has previously been shown to inhibit myometrial contractions and delay labour in various animal models as well as in humans. The L-peptide may have activity; however, proteases, which are abundant in myometrial tissue, may likely degrade the peptide before it is capable of showing activity. Solid-phase peptide synthesis followed by Nterminal modification by reductive aminations with different aldehydes provided linear aliphatic alkyl and PEG-grafted peptide analogs. Alternatively, ortho-nitrobenzensulfonylation of the peptide followed by Mitsunobu alkylation with farnesol and deprotection gave a farnesylated analog. Although the PEG and fanesylated analogs exhibited no activity, certain N-alkyl analogs exhibited inhibitory activity on myometrial contractions, with the most active analog possessing a dodecyl chain. Moreover, the N-dodecyl analog of PDC-31, exhibited lower activity than its L-counterpart in the myometrial contraction assay, and with reduced potency relative to its unmodified structure.

La naissance avant terme constitue un important problème de santé périnatale partout dans le monde. Chaque année près de 15 millions de bébés naissent prématurément. Notre laboratoire s’intéresse depuis une décennie à la conception et le développement de nouvelles classes thérapeutiques (appelés agents tocolytiques) capables d’inhiber les contractions utérines et prolonger le temps de gestation. Due à son implication directe dans le déclanchement des contractions utérines, la prostaglandine F2α (FP) est devenue notre cible de choix. Le PDC 113.824 et aza-glycinyl-proline sont apparus comme des inhibiteurs allostériques puissants du récepteur de la prostaglandine F2α, capables de prolonger la durée de gestation chez les souris. Le travail réalisé au cours de ce mémoire a pour objectif d’étudier le tour β nécessaire pour la reconnaissance sur le récepteur de la prostaglandine F2α. Dans la conception de mime peptidique sélectif efficace et puissant, le repliement β est un élément structural essentiel pour le maintien ou l’amélioration de l’activité du mime peptidique. Les études conformationelles du PDC113.824 et l’aza-glycinyl-proline montrent que les squelettes centraux de ces mimes peptidiques pourraient adopter essentiellement un tour β de type I ou II`, ce qui suggère l’implication des deux types de tours dans l’activité biologique. La synthèse de mimes peptidiques adoptant le tour β de type I et II` est devenue une stratégie logique dans la recherche de nouveaux agents tocolytiques. Au cours de ces études quatre analogues du PDC113.824 ont été synthétisés, un azabicyclo[5.3.0]alkanone et un dipeptide macrocyclique (mimes du tours β de type I) pour étudier l’implication du tour β type I. Par la suite la synthèse de glycinyl-proline et le D-alaninyl-proline (des mimes du tour β du type II`) a été réalisée afin de valider l’implication du tour β type II` dans la reconnaissance sur le récepteur. Nous avons utilisé une stratégie de synthèse efficace pour obtenir les deux analogues (azabicyclo [5.3.0]alkanone et dipeptides macrocycles) à partir d’un intermédiaire commun, en procédant par une cyclisation transannulaire diastéréosélective du tétra-peptide. / Preterm birth is a major perinatal health problem. Worldwide each year, more than one baby on ten is born premature, accounting for approximately 15 million babies per year. Pursuing molecules that can delay labour, so called tocolytics, we have targeted the prostaglandin F2α receptor (FP), because of its intimate involvement with the stimulation of uterine contractions leading to birth and preterm birth. Our laboratory has previously demonstrated that PDC-113.824 and azapeptide can modulate FP function by an allosteric mechanism featuring biased signalling, and can delay labour in a mouse model. The objective of the present work is to study the active turn geometry responsible for the modulatory effects of our lead tocolytic agents on the prostaglandin F2α receptor. Crystal structure and computational analyses of indolizidin-2-one amino acid and aza-glycinyl-proline components have shown them to adopt geometry that mimic ideal type I and II’ β-turns suggesting the potential involvement of such turns in the biological activity. To study the relevance of a type I β-turn on activity, we have prepared analogs possessing macrocyclic and pyrroloazepinone dipeptide mimics, because of their reported propensities to mimic type I β-turns. The syntheses of analogs possessing glycinyl-proline and D-alaninyl-proline were conducted to validate the involvement of a type II` β-turn in receptor recognition. In addition, we reported an efficient strategy for preparing the macrocyclic and pyrroloazepinone dipeptide mimics from a common intermediate using a diastereoselective transannular cyclization on a tetrapeptide precursor.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

In dieser Arbeit wurden 8 und 16 Wochen alte, hypertensive "fawn-hooded" Ratten (FHH8, FHH16) mit genetisch ähnlichen 16 Wochen alten "fawn-hooded" Ratten mit nur geringgradiger Blutdruckerhöhung (FHL16, Kontrollgruppe) hinsichtlich der pathologisch-anatomischen Veränderungen der Nierenmorphologie und hinsichtlich der Expression von NO-Synthase-1 (NOS1), Cyclooxygenase-2 (COX-2) und Renin am juxtaglomerulären Apparat (JGA) verglichen. Die histopathologischen Veränderungen bei FHH16 umfassten die klassischen Schädigungszeichen der fokal segmentalen Glomerulosklerose (FSGS) mit fokaler Überexpression von Kollagen IV und eine moderate Arteriolopathie. Bei FHH8 ließen sich, wie bei FHL16 keine morphologischen Schädigungen nachweisen. Die NOS1-Aktivität an der Macula densa, untersucht mittels der NADPH-Diaphorasereaktion und die NOS1 mRNA Expression waren bei FHH8 (+153 and +88%; P < 0.05) und FHH16 (+93 and +98%; P < 0.05) im Vergleich zu FHL16 signifikant erhöht. Eine gleichgerichtete signifikante Erhöhung zeigte sich für die COX-2-Expression an der Macula densa von FHH8 (+166%; P < 0.05) und FHH16 (+157%; P < 0.05) im Vergleich zu FHL16. Des weiteren ließ sich eine signifikante, ebenfalls gleichgerichtete Überexpression von Renin in der afferenten Arteriole auf Protein- und mRNA-Ebene bei FHH8 (+51 and +166%; P < 0.05) und FHH16 (+105 and +136%; P < 0.05) im Vergleich zu FHL16 nachweisen. Somit konnte gezeigt werden, dass die gleichgerichtete Überexpression von NOS1, COX-2 und Renin am JGA bei der FHH-Ratte der Entwicklung einer fokal segmentalen Glomerulosklerose vorausgeht und damit möglicherweise pathogenetische Bedeutung für die Entstehung der Nierenschädigung bei diesem Rattenstamm hat. / This study describes elevated histochemical signals for nitric oxide synthase-1 (NOS1) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in juxtaglomerular apparatus (JGA) and adjacent thick ascending limb of the kidney of fawn-hooded hypertensive rats (FHH). Two different age groups of FHH (8 and 16 wk; FHH8 and FHH16, respectively) were compared with genetically related fawn-hooded rats with close to normal blood pressure (FHL) that served as controls. Histopathological changes in FHH16 comprised focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), focal matrix overexpression (mainly of collagen IV), and a moderate arteriolopathy with hypertrophy of the media, enhanced immunoreactivity for alpha-smooth muscle actin, and altered distribution of myofibrils. Macula densa NOS activity, as expressed by NADPH-diaphorase staining, and NOS1 mRNA abundance were significantly elevated in FHH8 (+153 and +88%; P < 0.05) and FHH16 (+93 and +98%; P < 0.05), respectively. Even higher elevations were registered for COX-2 immunoreactivity in FHH8 (+166%; P < 0.05) and FHH16 (+157%; P < 0.05). The intensity of renin immunoreactivity and renin mRNA expression in afferent arterioles was also elevated in FHH8 (+51 and +166%; P < 0.05) and FHH16 (+105 and +136%; P < 0.05), respectively. Thus we show that coordinate upregulation of tubular NOS1, COX-2, and renin expression precedes, and continues after, the manifestation of glomerulosclerotic damage in FHH. These observations may have implications in understanding the role of local paracrine mediators in glomerular disease.