Le virus Epstein-Barr est un des virus dotés de propriétés oncogéniques. Ceci est inquiétant car le virus est présent sous forme d’infection latente dans 95% de la population adulte au niveau mondial. Bien que ce virus soit associé surtout aux lymphomes, d’autres types de cancer sont aussi connus par leur association à cette infection tels que le carcinome gastrique. En fait, 10% de tous les cas de carcinome gastrique sont associés à la présence du virus Epstein-Barr. Plusieurs protéines du virus ont été étudiées individuellement afin d’établir leurs propriétés oncogéniques. Parmi celles-ci, la protéine virale EBNA1 joue un rôle important au niveau de la carcinogénèse et son expression est détectée au niveau des tissus gastriques cancéreux associés à l’infection par le virus Epstein-Barr. Des études réalisées au cours de ces dernières années montrent la relation entre un patron aberrant de l’épissage alternatif des ARN messagers et différents types de cancer, comme le cancer du sein et de la prostate. Les travaux de recherche présentés dans ce mémoire visent à établir si le virus Epstein-Barr est capable de changer le patron d’épissage alternatif au niveau des tissus cancéreux de l’estomac. L’utilisation de données de séquençage à haut débit fait sur des tissus cancéreux et tissus sains d’estomac (infectés ou non par le virus Epstein-Barr) permettra d’estimer les changements au niveau du patron d’épissage alternatif en relation à l’état des tissus et de la présence du virus Epstein-Barr. Les résultats obtenus nous montrent que l’épissage alternatif de plus de 500 gènes est altéré lorsque le virus est présent. Parmi ces gènes plusieurs codent pour des facteurs d’épissage, des facteurs de transcription, et des suppresseurs de tumeurs qui pourraient être impliqués dans le processus de développement du cancer. Finalement, nos résultats montrent que le patron d’épissage alternatif d’une cellule est modifié lorsque celle-ci est infectée par le virus Epstein-Barr ou qu’elle exprime une de ses protéines virales EBNA1, et ces altérations touchent plusieurs gènes impliqués dans des processus biologiques et qui semblent favoriser le développement du cancer.

L'étude des éléments cis et trans intervenant dans le métabolisme des ARN SINE a pour but de mieux appréhender la biologie des éléments mobiles SINE. Nous avons d'une part déterminé la structure secondaire des ARN des SINE de plante SB1 et SB2. Ces deux ARN qui n'ont pas d'homologie de séquence adoptent des structures secondaires similaires. Suite à cette observation, une étude menée par F.J. Sun et al. a mis en évidence un schéma évolutif commun des ARN SINE dérivés d'ARNt. Dans le cadre de la recherche de facteurs trans, nous avons entrepris la caractérisation de la protéine La, un facteur de liaison à l'ARN. Nous avons identifié chez Arabidopsis deux protéines présentant toutes les caractéristiques de la protéine La : At32 et At79. Nous avons montré que seule At32 assure les fonctions nucléaires de la protéine La. At32 et At79 ont des profils d'expression différents et semblent lier des ARN distincts. Nous proposons donc qu'il existe deux homologues de la protéine La Chez Arabidopsis

Mes travaux de recherche sont centrés sur la compréhension des relations structure-fonctions de la région 5' non traduite de l'ARN génomique du VIH-1. Le travail réalisé au cours de ma Thèse de Doctorat dans le groupe de B. et C. Ehresmann (UPR 9002 du CNRS) à l'ULP, a porté sur l'étude de la dimérisation de l'ARN génomique du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) 1. Une propriété ubiquitaire des rétrovirus est l'encapsidation de deux molécules d'ARN génomique associées près de leur extrémité 5'. Cette caractéristique, qui traduit l'existence d'une forte pression de sélection, représente un avantage évident pour la recombinaison pendant la rétrotranscription. Elle permet en particulier au virus de se répliquer malgré la présence de lésions dans l'ARN génomique et favorise la variabilité génétique. Nos travaux nous ont permis d'aboutir à plusieurs résultats importants : (1) la dimérisation implique une séquence localisée en amont du site donneur d'épissage 2. Elle est initiée par un mécanisme de reconnaissance de type boucle-boucle entre les deux monomères, au niveau d'une structure en épingle à cheveux très conservée dans les différents isolats du VIH-1, que nous avons appelée DIS (Dimerization Initiation Site) 3; 4. Cette tige-boucle est également appelée SL1. La boucle du DIS possède 9 nucléotides, dont 6 forment une séquence auto-complémentaire. Nous avons montré que l'étape initiale de la dimérisation est réalisée par des appariements Watson-Crick entre les séquences autocomplémetaires de chacun des deux monomères 5; 6; 7. Cependant, ces appariements ne sont pas les seules interactions stabilisant le dimère. Un modèle tridimensionnel du complexe boucle-boucle du DIS obtenu sur la base de résultats de cartographie en solution montre l'existence d'interactions non-canoniques formées par les purines flanquant la séquence autocomplémentaire 8; 9. (2) Le DIS joue un rôle essentiel dans la réplication du virus au niveau de l'encapsidation de l'ARN génomique et de la synthèse de l'ADN proviral double brin 10. (3) Il est possible d'inhiber la dimérisation in vitro par des oligonucléotides sens et antisens 11; 12.<br />En 1997-1998, j'ai effectué un stage post-doctoral dans le laboratoire du Dr. Heinrich Gottlinger (DFCI, Harvard Medical School, Boston, MA, USA). Mon travail était de comprendre le mécanisme de régulation qui permettrait aux précurseurs protéiques viraux de se fixer à la membrane plasmique, lieu d'assemblage des virions. J'ai ainsi confirmé l'existence d'un switch conformationnel de l'acide myristique localisé en N-terminal de la protéine de Matrice du VIH 13.<br />Depuis mon retour à Strasbourg en 1999 dans l'équipe du Dr. Roland Marquet, je me suis intéressé de nouveau au monde de l'ARN et plus précisément au repliement de l'ARN génomique du VIH-1. Ainsi, après avoir mis en évidence un motif de structure tertiaire dans la région 5'-terminale de cet ARN 14, nous avons, en collaboration avec Markus Dettenhofer (Baltimore, MD, USA), caractérisé pour la première fois la structure secondaire de cet ARN dans les cellules infectées et les particules virales 15; 16. Cette avancée technologique nous a permis par la suite (1) d'analyser avec Valérie Goldschmidt (doctorante) les variabilités structurales existantes au sein du complexe d'initiation de la rétrotranscription 17 et (2) de montrer, en collaboration avec l'équipe de Philippe Dumas (UPR 9002), que des antibiotiques de la famille des aminoglycosides se fixent spécifiquement dans la boucle du DIS de l'ARN génomique du VIH-1 non seulement dans un système in vitro 18 mais également en culture cellulaire 19.<br />Récemment, nous avons initié un nouveau projet sur le rôle de la protéine virale Vif dans la réplication virale du VIH-1 et sa relation avec l'ARN génomique (travail de thèse de Simon Henriet). Outre ses activités sur la synthèse de l'ADN proviral, la stabilité du core viral ou encore l'intégration du provirus, nous avons montré que la protéine Vif se fixe de façon spécifique et de manière coopérative aux régions localisées dans la région 5'-terminale du génome rétroviral 20. En particulier, la tige-boucle TAR (région 1-57) est un point de nucléation nécessaire à la propagation de la fixation de Vif à l'ARN (de 5‘ vers 3') mais semble insuffisante pour stabiliser ces interactions.<br /> De nombreuses perspectives découlent directement de ces travaux. Nous souhaiterions étudier la dimérisation de l'ARN génomique du VIH-1 directement dans la cellule et ainsi répondre à plusieurs questions fondamentales : où se forme le dimère d'ARN génomique ? Le DIS, ou la dimérisation, sont-ils nécessaires au transport et à l'encapsidation de l'ARN génomique ? La maturation du dimère d'ARN dans les particules virales est-elle liée à un remaniement conformationnel au niveau du DIS ? Des résultats préliminaires obtenus en collaboration avec par l'équipe de M. Mougel (UMR 5121, Montpellier) indiquent que le DIS pourrait effectivement être un signal positif pour le transport nucléo-cytoplasmique. Ces résultats nous encouragent ainsi à poursuivre le développement de nouveaux agents antiviraux dérivés des aminoglycosides dirigés contre le DIS (collaboration avec P. Dumas, UPR 9002 et P. Pale, UMR 7123-ULP). <br />Dans les perspectives liées à la compréhension du rôle de Vif dans la réplication virale, nous étudierons en particulier son action sur l'initiation de la rétrotranscription et sur la régulation de l'expression des protéines APOBEC-3G/3F. Les protéines APOBEC sont des cytidines désaminases qui ont été identifiées dernièrement et dont l'action hypermutatrice lors de la synthèse du brin (-) de l'ADN proviral est létale pour le virus. Ces protéines, exprimées exclusivement dans les cellules non permissives, sont exclues des particules virales en présence de Vif et dirigées vers la voie du protéasome. Nous étudierons entre autre la régulation de la traduction des protéines APOBEC par Vif (identification des régions de l'ARNm nécessaires) et analyserons les changements conformationnels éventuels au niveau de la région 5' non traduite de l'ARNm induits par la fixation de Vif. <br /> L'ensemble de ces travaux devrait nous permettre de contribuer à la compréhension des mécanismes qui régulent la structure tridimensionnelle de la région 5' non traduite de l'ARN génomique du VIH-1, et à plus long terme d'identifier des molécules capables d'interagir avec les différents domaines structuraux de cette région.

Afin de mettre en évidence le phénomène de localisation d'énergie dans les protéines, un modèle utilisant les concepts de la Physique non-linéaire a été développé. Il permet, via l'utilisation d'un potentiel de type FPU et d'une dissipation placée sur la surface, de faire apparaître des breathers chaotiques dans certaines enzymes. Ces breathers ont une durée de vie importante par rapport aux échelles de temps caractéristiques du système. Ils sont localisés sur un seul résidu, toujours situé dans une région rigide de la protéine. Cela nous a conduit à l'hypothèse d'un lien possible entre la fonction catalytique, les propriétés locales de structure des enzymes et les localisations d'énergie. Plus précisément, l'activation d'un breather chaotique lors d'une réaction enzymatique au niveau des sites catalytiques pourrait permettre à la protéine de stocker de l'énergie pendant de longues durées.

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) forment la classe de récepteurs la plus nombreuse et la plus étudiée. La compréhension du mode de fonctionnement de cette famille de récepteurs fait l'objet d'études intenses, tant au niveau de leur interaction avec le ligand qu'au niveau du processus d'activation suite à cette liaison. Le récepteur de l'U-II (UT) est un membre de la classe A des GPCRs et possède toutes les caractéristiques de cette famille. Notre hypothèse est que le récepteur UT possède des déterminants moléculaires identifiables qui sont impliqués lors de sa liaison à l'U-II et de son activation. Dans un premier temps, des études de marquage par photoaffinité du récepteur UT ont été effectuées en utilisant deux séries de ligands U-II qui contiennent le résidu photosensible para-benzoyl-L-phenylalanine (Bpa) et qui possèdent un caractère agoniste ou agoniste partiel. Il a été montré pour les deux séries de ligands que les quatre premiers résidus de l'U-II sont à proximité du résidu Met288 dans la 3e boucle extracellulaire du récepteur UT. Cette approche a également été utilisée pour comparer le patron de photomarquage entre deux ligands contenant le Bpa à la position 6, soit de l'analogue agoniste complet avec celui de l'analogue agoniste partiel. Il a été montré que le peptide agoniste photomarque les résidus Met184/Met185 du TMD4 de l'UT, tandis que l'agoniste partiel photomarque plutôt une région délimitée au TMD5. Le deuxième objectif du projet a été l'identification, au moyen de l'approche SCAM (Substituted Cysteine Assessibility Method) de résidus qui bordent la pochette de liaison du récepteur. Chacun des résidus des domaines transmembranaires 6 et 7 ont été mutés, un à un, par une cystéine. Suite au traitement par des composés MTS, la liaison du ligand [indice supérieur 125]I-U-II aux mutants F268C[indice supérieur (6.44)], W278C[indice supérieur (6.54)] et A282C[indice supérieur (6.58)] du TMD6 ainsi qu'aux mutants L298C[indice supérieur (7.34)], Y300C[indice supérieur (7.36)], T302C[indice supérieur (7.38)] et T303C[indice supérieur (7.39)] du TMD7 a été inhibée, démontrant que ces positions du récepteur font face à la pochette de liaison. L'ensemble de ces études mène à une meilleure compréhension des bases moléculaires de la liaison et de l'activation du récepteur UT et nous a permis de proposer un modèle moléculaire du récepteur UT ligandé. Ce modèle pourra ouvrir la voie vers une meilleure compréhension du processus de liaison et d'activation des GPCRs peptidergiques de la classe A.

Le récepteur de l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3]R) est un canal calcique qui joue un rôle majeur dans la régulation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire. Il existe trois sous-types d'IP[indice inférieur 3]R. Peu d'information est disponible sur les propriétés de l'IP[indice inférieur 3]R-2 et de l'IP[indice inférieur 3]R-3. De plus, la régulation spécifique du mécanisme de signalisation calcique peut être accomplie par l'activation simultanée de plusieurs voies de signalisation. Les kinases intervenant lors de l'activation concomitante de la voie de production de l'AMPc et des voies prolifératives sont susceptibles de réguler les IP[indice inférieur 3]R. Ainsi, l'objectif de ma thèse fut de caractériser l'effet de la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA) et de la cible mammalienne de la rapamycine (mTOR) sur l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2. La première partie de ma thèse consista à étudier l'effet possible de la PKA sur l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2 dans les cellules AR4-2J, une lignée cellulaire exprimant principalement l'IP[indice inférieur 3]R-2. Nous avons d'abord démontré que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est un bon substrat de la PKA. Qui plus est, des essais calciques réalisés sur des cellules AR4-2J perméabilisées suggèrent que la PKA augmente l'affinité apparente de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Enfin, la stimulation de la production d'AMPc entraîne une augmentation des relâches calciques dans les cellules AR4-2J intactes. Ces résultats suggèrent donc que la PKA augmente l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Dans la seconde partie de cette thèse, nous démontrons que la kinase mTOR, point de convergence des voies prolifératives, phosphoryle l'IP[indice inférieur 3]R-2 dans les cellules AR4-2J. Les essais calciques réalisés sur des cellules AR4-2J perméabilisées suggèrent également que mTOR augmente l'affinité apparente de l'IP[indice inférieur 3]R-2. De surcroît, la rapamycine (un inhibiteur de mTOR) réduit les relâches calciques induites par le carbachol dans les cellules AR4-2J et dans les cellules HEK 293A exprimant presque exclusivement l'IP[indice inférieur 3]R-2. Ces résultats suggèrent donc que mTOR augmente l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2. L'ensemble de ces travaux approfondit notre compréhension des mécanismes par lesquels les signaux calciques sont finement régulés dans les cellules.

SHP-2 est une tyrosine phosphatase impliquée dans la signalisation intracellulaire déclenchée par des facteurs de croissance, des cytokines pro-inflammatoires et des produits bactériens. Bien que cette phosphatase soit exprimée de manière ubiquiste et donc dans l’épithélium intestinal, son rôle dans ce tissu n'était pas connu. Afin de mieux comprendre les rôles joués par cette phosphatase dans l’intestin, nous avons généré un modèle murin de délétion conditionnelle de Shp-2 spécifiquement dans les cellules épithéliales intestinales (SHP-2[indice supérieur CEI-KO]). Nos résultats montrent que dès l'âge de 1 mois, toutes les souris expérimentales ont développé spontanément de l'inflammation au niveau du côlon. En fait, dans les cellules épithéliales intestinales, SHP-2 contrôle le niveau d’activation d’effecteurs de signalisation importants tels que les kinases ERK1/2 de même que les facteurs de transcription NFκB, STAT3 et β-caténine. En modulant ces voies de signalisation, SHP-2 contrôle des processus cellulaires primordiaux pour le maintien de l’homéostasie intestinale: la détermination des cellules à mucus et des cellules de Paneth, la composition de la flore, la perméabilité paracellulaire et la restitution épithéliale. La dérégulation de ces processus cellulaires peut expliquer l'apparition rapide d'inflammation colique chez les souris SHP-2C[indice supérieur EI-KO]. De plus, l'inflammation chronique observée chez les souris SHP-2[indice supérieur] CEI-KO entraîne avec l'âge le développement de cancer colorectal associé à la colite. Finalement, nos résultats chez l'humain montrent qu'il y a une diminution significative d'expression de SHP-2 chez les patients atteints de maladies inflammatoires intestinales comparativement aux patients témoins. Également, deux polymorphismes de PTPN11 sont retrouvés préférentiellement chez les patients atteints de colite ulcéreuse. En conclusion, nos résultats démontrent que la phosphatase SHP-2 protège l'épithélium intestinal contre l'inflammation et le cancer colorectal associé à la colite.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande famille de récepteurs membranaires. Ils transmettent vers l’intérieur de la cellule des signaux extracellulaires d’une grande diversité physiologique. Les différentes classes de RCPGs induisent l'activation de nombreuses voies de signalisation par une multitude de seconds messagers. Le type cellulaire, le contexte du stimulus ainsi que les complexes multiprotéiques recrutés à la membrane plasmique influencent le niveau de spécialisation du signal induit. Le récepteur du thromboxane A? (TP) est exprimé sous deux isoformes, issues d’un épissage alternatif. Les deux isoformes étant régulées différemment au niveau de la signalisation et de la désensibilisation. Dans ce contexte, il est important d’étudier les protéines qui interagissent spécifiquement avec l’une ou l’autre de ces isoformes. Un criblage par double-hybride chez la levure a permis d’identifier une nouvelle protéine d'interaction pour l’isoforme ß de TP (TPß), WDR36 (WD repeat protein 36), une protéine dont la fonction est inconnue. Dans une première étude, nous démontrons que WDR36 interagit directement avec TPß, et que cette interaction est modulée en cellule par la stimulation du récepteur. TP? active la production d’inositol phosphate, qui est augmentée par WDR36. Cette régulation est supportée par l’interaction de WDR36 avec deux effecteurs de la signalisation de TPß, soit G?q et PLCß2. La présence de WDR36 accentue l’interaction entre G?q et PLCß2, et l’interaction entre WDR36 et PLCß2 est modulée par la stimulation de TPß. L'étude des différents mutants de WDR36 associés au glaucome montre qu’ils affectent différemment la production d'inositol triphosphate induite par TPß, comparativement à la protéine de type sauvage. Finalement, nous illustrons que WDR36 induit une activation accrue de ERK1/2 suite à la stimulation de TPß. Ces résultats suggèrent que WDR36 agit à titre de protéine d’échafaudage, servant à favoriser la signalisation de TPß en rapprochant dans un complexe multi-protéique le récepteur TPß et ses effecteurs G?q et PLCß2. Pour faire suite à cette étude, nous avons investigué le rôle de WDR36 dans l'activation de la voie des MAPKs produite par l'activation de TPß. Nous démontrons que WDR36 augmente l’activation de ERK1/2, mais pas de p38 ou JNK. L’activation progresse via la cascade PLCß-PKC-c-Raf-MEK1/2-ERK1/2. L’interaction entre WDR36 et les membres de cette cascade est présente de façon basale et est modulée par la stimulation de TPß. L’expression de WDR36 semble également être importante pour l’interaction c-Raf-ERK1/2 et MEK1/2-ERK1/2. Ces résultats suggèrent que WDR36 assemble un complexe multi-protéique facilitant la phosphorylation et l’activation de ERK1/2. Cette phosphorylation accrue se traduit par une augmentation de la translocation nucléaire de ERK1/2 activées, de la production de c-Fos et de la prolifération cellulaire. Finalement, l’effet positif de WDR36 sur l’activation de ERK1/2 peut également être observé suite à une stimulation des cellules avec des facteurs de croissance retrouvés dans le sérum. Ces deux études supportent un modèle dans lequel WDR36 agit à titre de protéine d'échafaudage dans la signalisation du récepteur TPß en rapprochant ce dernier de ses effecteurs G?q et PLCß2, et en réunissant les membres de la voie d'activation de ERK1/2. Cette caractérisation des rôles de WDR36 est d’autant plus importante, puisque différents variants de WDR36 sont maintenant associés à différents cancers. À cet égard, WDR36 pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique dans la recherche sur le cancer. [symboles non conformes]

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.