Spiroplasma citri est un mollicute phytopathogène transmis de plante à plante par des cicadelles du genre Circulifer selon un mode persistant circulant-multipliant. Les franchissements de l’épithélium intestinal et des glandes salivaires sont basés sur un mécanisme d’endocytose/exocytose. Ce processus d’invasion met en jeu, au sein de complexes protéiques, des protéines bactériennes spécifiques qui reconnaissent des motifs déterminés présents à la surface des cellules eucaryotes. La recherche de protéines de l’insecte vecteur interagissant avec S. citri a notamment conduit à l’identification de l’actine. Cette interaction a pu être confirmée à la fois in vitro et in vivo. L’interaction de l’actine avec son partenaire chez S. citri, qui s’est avéré être la phosphoglycérate kinase (PGK), est impliquée dans l’internalisation du spiroplasme dans les cellules de l’insecte. La région minimale de liaison à l’actine de la PGK a également été déterminée.La réalisation d’un mutant de S. citri dépourvu de PGK a été entreprise avec le plasmide navette pGOT mais n’a pas permis la sélection de spiroplasmes mutés dans ce gène essentiel. Néanmoins, la recherche de l’évènement de recombinaison chez les clones obtenus a permis de mettre en évidence la mutation de deux gènes chez ces derniers.L'ensemble des protéines impliquées dans la transmission du spiroplasme, identifiées au préalable chez ce dernier, n’étant pas essentielle au cours de ce processus, une étude préliminaire des complexes multi-protéiques contenant plusieurs de ces protéines a été réalisée. L’identification de complexes impliquant à la fois la PGK, la P32 et les ScARPs pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes régissant la vection de S. citri par son insecte. / Spiroplasma citri is a phytopathogenic mollicute transmitted from plant to plant by leafhoppers of the genus Circulifer in a persistent and propagative manner on condition to cross the intestinal and salivary glands barriers of the insect. These crossings are based on a endocytosis/exocytosis mechanism which involves bacterial protein complexes in order to recognize specific patterns on the surface of eukaryotic cells.Specific molecular interactions between S. citri proteins and those of C. haematoceps were investigated using far Western technology and had notably led to the identification of actin. This interaction has been confirmed both in vitro and in vivo. The interaction of actin with his partner in S. citri, which has been identified as the phosphoglycerate kinase (PGK), is involved in the internalization of spiroplasma into the insect cells. The minimal actin-binding region of PGK was also determined.The realization of a S. citri PGK mutant was carried out using the shuttle plasmid pGOT but the selection of spiroplasmas mutated in this essential gene failed. Nevertheless, findings in the localization of recombination events in S. citri chromosome, allowed us to identify mutations in two genes that could be tested in our experimental transmission system.The set of proteins involved in the spiroplasmal transmission, previously identified as non essential proteins in the invasion process, prompted us to study the role of multi-protein complexes containing several of these proteins. Identification of complexes involving both the PGK, the P32 and ScARPs should enable us to better understand mechanisms governing the transmission of S. citri by its insect.

Les récepteurs nucléaires sont membres d'une famille de protéines activées par des ligands et qui régulent la transcription de nombreux gènes. Le récepteur nucléaire RevErbα est constitutivement inhibiteur de la transcription de gènes cibles via le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor et Histone DeAcetylase 3). Ce complexe joue un rôle important dans le contrôle de l'horloge circadienne et de la glucogenèse via la régulation de la transcription des gènes codant pour les enzymes G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) et PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase). Ces deux enzymes sont impliquées dans la glucogénèse qui est dérégulée en cas de diabète de type 2. Ce travail est basé sur l'investigation de l'interaction du récepteur nucléaire RevErbα avec deux corépresseurs: son partenaire établit NCor et SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Malgré ce qui est rapporté dans la littérature, c'est à dire que SMRT et RevErbα n'interagissent pas fonctionnellement in vivo, nous avons choisis d'étudier cette interaction à cause de la similarité de séquence entre les deux corépresseurs, mais également parce que les peptides des deux corépresseurs ont été rapportés comme interagissant avec d'autre récepteurs nucléaire. Afin d'étudier ces interactions, nous avons utilisé deux techniques complémentaires basées sur l'émission de fluorescence: Une technique in vitro qui est l'anisotropie de fluorescence et une technique de microscopie de fluorescence in cellulo appelée Number & Brightness. En plus de cette étude de l'interaction entre le récepteur nucléaire et les corépresseurs, nous nous sommes intéressé à déterminer l'effet de plusieurs ligands sur cette interaction. Trois ligands ont été testés: l'hème qui est rapporté comme étant le ligand naturel de RevErbα et deux ligands synthétiques et non naturels de RevErbα (SGN et SD7). Grâce à l'anisotropie de fluorescence (in vitro), nous avons confirmé et quantifié l'interaction entre le domaine de liaison au ligand (LBD) de RevErbα et un peptide NCor contenant le domaine d'interaction majeur (ID1 pour RevErbα et nous avons déterminé l'effet des trois ligands sur cette interaction. Nous avons également quantifié l'interaction entre RevErbα et d'autres peptides provenant de NCor et correspondant aux autres domaines d'interaction (ID2 et ID3) pour sa liaison à RevErbα. Nous avons déterminé que l'hème et le SD7 ont un effet déstabilisateur de la liaison de RevErbα à NCor in vitro, alors que le ligand SGN améliore la stabilité de complexe. Nous avons également confirmé une interaction entre RevErbα et un peptide corépresseur issu de SMRT. Afin d'étudier l'interactions des protéines pleine taille dans un contexte plus fonctionnel, nous avons utilisé le 2 photons-2 couleurs Number & Brightness. C'est une technique de microscopie à fluorescence basée sur la fluctuation de l'intensité de fluorescence pour étudier les interactions spécifiques de RevErbα avec NCor et SMRT pleine taille in cellulo ainsi que l'effet des ligands, précédemment mentionné, sur ces interactions. Dans les conditions choisies pour notre étude, nous avons déterminé que RevErbα interagit fortement avec NCor in cellulo et que cette interaction est améliorée par le ligand SGN. En revanche, l'hème et le SD7 n'ont pas d'effet observable sur ce complexe. Nous avons également montré pour la première fois que RevErbα forme des complexes avec le corépresseur SMRT pleine taille in cellulo. La continuité de ce travail pourrait être ciblée sur l'identification de ligands qui augmenterait le recrutement du complexe corépresseur NCor-HDAC3 sur RevErbα, menant ainsi à la diminution de l'expression des gènes cibles. En définitive, un ligand tel que celui-ci pourrait être d'un grand intérêt dans la recherche de la diminution de glucose dans le sang dans les cas de diabètes de type 2. / Nuclear receptors are members of ligand-inducible factors that regulate the transcription of many genes. Nuclear receptor RevErbα constitutively inhibits the transcription of target genes via the recruitment of the corepressor complex NCor-HDAC3 (Nuclear CoRepressor and Histone DeAcetylase 3). This complex plays an important role in controlling the circadian clock and glucogenesis via regulation of the transcription of the G6Pase (Glucose-6-Phosphatase) and PEPCK (PhosphoEnol Pyruvate Carboxy Kinase) genes, both coding for proteins involved in glucogenesis, which is central to type 2 diabetes. Here we have investigated the interaction of the nuclear receptor RevErbα with two corepressors: its establish partner, NCor and SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid Receptors). Despite literature reports that SMRT and RevErbα do not interact functionally in vivo, we choose to study this interaction because of sequence similarity between the two corepressors, because peptides of both corepressors were reported to interact with other nuclear receptors. To investigate these interactions, we used two complementary fluorescence techniques: In vitro assays based on fluorescence anisotropy and an in cellulo fluorescence microscopy technique called Number & Brightness. In addition to the interactions between the CoRs and the RN, we were interested in determining the effects of several ligands on these interaction. Three ligands were tested: heme, which is reported to be the natural ligand of RevErbα and two synthetic and non-naturals ligands of RevErbα (SGN and SD7). By fluorescence anisotropy (in vitro) we confirmed and quantitated the interaction between purified RevErbα Ligand Binding Domain (LBD) and an NCoR peptide containing the major interaction domains (ID1) for RevErbα and revealed the effect of the three ligands on this interaction. We quantitated as well, the interaction between RevErbα and other peptides from NCor corresponding to the other interaction domains (ID2 and ID3) for it binding to RevErbα. We found a destabilizing effect of heme and SD7 binding to RevErbα on it interaction with NCor in vitro, whereas the ligand SGN enhanced the complex stability. We also confirmed an interaction between RevErbα and a SMRT peptide corepressor in vitro. In order to examine these interactions in a more functionally relevant context using full length proteins, we used 2 photon 2 colors Cross Number and Brightness (N&B), an fluorescence microscopy technique based on fluorescence intensity fluctuations to study specific interactions of full length RevErbα with NCor and SMRT in cellulo as well as the effect of several ligands above mentioned. Under the conditions of our studies, we find that RevErbα and NCor interact strongly in cellulo, and we observed a slight enhancement of this interaction by the SGN ligand. No effect of heme or SD7 was observed on the complex. We show as well for the first time that RevErbα forms complexes with the full length SMRT corepressor in cellulo. Future extensions of these studies could be aimed at identifying ligands that enhance the recruitment of the corepressor complex NCor/HDAC3 by RevErbα, thus leading to a decrease expression of the target genes. Ultimately such a ligand could be of interest in the quest to decrease blood glucose levels in type 2 diabetes.

Le paludisme et le sepsis sont des maladies infectieuses très répandues causant plusieurs centaines de milliers de morts tous les ans. Elles sont toutes deux multifactorielles. Les devenirs de ces infections sont influencés par des facteurs environnementaux, par des facteurs sociaux-économiques, politiques et comportementaux mais aussi par des variables dépendant du patient comme son âge. De nombreux arguments existent en faveur d'un contrôle génétique de la résistance au paludisme et au sepsis. Ces deux maladies sont considérées comme proches par les spécialistes car leur physiopathologie est liée notamment à une inflammation systémique non contrôlée responsable des formes les plus graves. Afin d'identifier de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans la résistance à ces deux maladies, nous avons effectué des études génétiques pangénomiques dans deux populations vivant en zone endémique pour le paludisme à Plasmodium falciparum au Burkina-Faso et dans une cohorte de patients atteints de sepsis.Enfin nous avons réalisé les deux premières études d'association pangénomiques identifiant des associations significatives avec la mortalité suite à un choc septique. Nous avons obtenu 32 SNPs significativement associés à la mortalité précoce et 108 significativement associés à la mortalité tardive. Le réseau des interactions protéine-protéine impliquant les protéines codées par les gènes associés a permis d'établir une liste non exhaustive des fonctions altérées durant le choc septique, notamment liées à la réponse immune, et a révélé, malgré les différences au niveau des gènes impliqués, un mécanisme commun participant à la susceptibilité précoce et tardive au choc septique. / Malaria and sepsis are widespread infectious diseases causing hundreds of thousands deaths each year. There is a growing body of evidence for a genetic control of malaria and sepsis resistance. Both diseases are considered close because they are characterized by a systemic inflammation, some common organ dysfunctions, and disorders of coagulation. In order to identify new genes potentially involved in disease resistance, we performed genomewide genetic studies in two populations living in endemic regions for Plasmodium falciparum malaria in Burkina-Faso and in a cohort of septic shock patients. Genetic linkage studies revealed significant genetic linkages on chromosome 6p21.3 and 17p12 with, respectively, mild malaria and asymptomatic parasitaemia. We also performed the first genetic linkage studies concerning immunoglobulin G and their sub-classes against Plasmodium falciparum antigens. We detected significant linkages of IgG3 sub-class with chromosomes 8p22-p21 and 20q13 and between IgG4 sub-class and chromosome 9q34. Finally we performed the first two genomewide association studies identifying significant associations with all-causes mortality after a septic shock. We identified 32 SNPs significantly associated with early mortality and 108 SNPs significantly associated with late mortality. We identified a protein-protein network containing proteins associated with both early and late mortality. Furthermore, the network of protein-protein interactions involving proteins encoded by associated genes allowed us to establish a list of some altered functions during septic shock, most of them being related to the immune responses or the renin-angiotensin-aldosterone system.

Il existe de nombreux mécanismes impliqués dans le développement des tissus qui nécessitent que des cellules ou des groupes de cellules s’orientent et se polarisent. Les protéines de la voie de la polarité planaire (PP) s’associent pour former des complexes à la membrane et créer des asymétries proximo-distale. Vangl2 et Scrib1 ont été identifiés comme les deux premiers gènes impliqués dans la PP chez les mammifères. Lors de ma thèse, je me suis intéressé à ces deux protéines et à certains des complexes dans lesquelles elles sont impliquées. Dans un premier temps, nous avons montré l’implication directe de Scribble1 dans le trafic après endocytose des récepteurs NMDA. Scrib1 interagit avec les récepteurs NMDA grâce à ses domaines PDZ. Scribble1 peut interagir avec le complexe AP2 qui intervient dans l’endocytose des récepteurs. Cette étude a permis de définir un nouveau mécanisme dans lequel Scrib1 régule la quantité de récepteurs NMDA à la membrane et donc participe à la plasticité synaptique. Vangl2 est l’une des protéines transmembranaires les plus en amont de la voie de la PP. Nous avons identifié un nouveau partenaire nommé "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). Nous avons montré, par double hybride en levure et pull down, l’interaction de Vangl2 avec les deux isoformes de AIDA et leur colocalisation en COS7 et neurones. Ensemble, ces données présentent AIDA comme un très bon candidat pour le maintien de Vangl2 aux jonctions adhérentes et/ou pour son adressage à la membrane. Ces études nous ont permis d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliquant les protéines de la polarité planaire. / There are many mechanisms involved in the development of tissues that require cells or groups of cells orient and polarize. The proteins of the planar cell polarity (PCP) combine to form complexes with the membrane and create proximal-distal asymmetries. Vangl2 and Scrib1 have been identified as the first two genes involved in the PCP in mammals. In this study, I am interested in these two proteins and some of the complex in which they are involved. At first, using techniques of biochemistry, cell biology and biophysics, we showed the direct involvement of Scribble1 in traffic after endocytosis of NMDA receptors. Scrib1 interacts with NMDA receptors through its PDZ domains. Due to this binding motif between PDZ1 and PDZ2 of Scrib1, it can interact with the AP2 complex which is involved in receptor endocytosis. This study has identified a new mechanism in which Scrib1 regulates the amount of NMDA receptors on the membrane and is therefore involved in synaptic plasticity. Vangl2 is a transmembrane protein of the most upstream of the PCP pathway. We have identified a new partner named "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). We have shown, by yeast two-hybrid and pull down the interaction of Vangl2 with two isoforms of AIDA and collocation in COS7 and neurons. Together, these data show AIDA as a very good candidate for maintaining Vangl2 to adherens junctions and/or its membrane targeting. These studies have allowed us to improve our understanding of the mechanisms involving the planar polarity proteins.

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif. Il permet la sécrétion d’enzymes lytiques et de toxines. Chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, les pectinases, sécrétées par ce système appelé Out, dégradent la pectine, provoquant les symptômes de pourriture molle. La sécrétion par le T2SS se passe en 2 étapes : les protéines traversent la membrane interne par le système Sec ou le système Tat. Une fois dans le périplasme, elles sont repliées et transloquées par le T2SS à travers la membrane externe. Le système Out est composé de 14 protéines intégrées ou associées à l’une des deux membranes. Son assemblage et son fonctionnement restent obscurs. Une plateforme serait formée dans la membrane interne par OutE, -F, -L, -M et –C. Ces trois derniers composants sont des protéines bitopiques dont la stœchiométrie et le rôle sont inconnus. Pour identifier des interactions entre ses composants, nous avons utilisé le double-hybride bactérien, basé sur la reconstitution de l’activité d’adénylate cyclase. Nous avons démontré que le domaine de type ferrédoxine, situé en C-terminus d’OutL et d’OutM, est directement impliqué dans l’homo- et l’hétérodimérisation de ces protéines. Une interaction entre les régions périplasmiques d’OutC et d’OutD a été aussi détectée (Login et al., 2010). Pour mieux analyser les multiples interactions au sein du T2SS, des expériences de triple-hybride ont été réalisées en co-exprimant différentes combinaisons des régions solubles de trois composants. Nos résultats suggèrent qu’OutL empêche l’interaction entre OutC et OutD. Par ailleurs, OutL est impliquée dans l’activation de l’ATPase OutE, le moteur du système (Camberg et al., 2007). OutL serait donc impliquée dans la transmission du signal entre le périplasme et le cytoplasme et pourrait intervenir dans la dissociation du complexe OutD/OutC. Afin d’analyser le rôle des segments transmembranaires (TMS) de composants du T2SS, nous avons adapté la technique du double-hybride. Le domaine de la protéine rapporteur Cya a été fusionné au N-terminus du TMS et BlaM au C-terminus. BlaM sert à contrôler la topologie correcte des fusions dans la membrane. Plusieurs interactions bi-partenaires entre les TMS d’OutC, OutL et OutM ont été ainsi détectées. Ce travail a été complété par une étude in vitro (pull-down) et par mutagenèse dirigée. Ces interactions TMS-TMS pourraient intervenir dans la transmission du signal du périplasme vers le cytoplasme à travers la membrane interne. / The type II secretion system (T2SS) is widely used to secrete toxins and lytic enzymes by animal and plant pathogenic Gram-negative bacteria. The phytopathogen bacterium Erwinia chrysanthemi secretes several pectinases by the T2SS called Out and causes soft rot disease. The exoproteins cross the cytoplasmic membrane either by the Sec or Tat systems. Once in the periplasm, the folded exoproteins are translocated across the outer membrane by the T2S machinery. The Out system is composed of 14 proteins integrated in or associated with the two bacterial membranes. The molecular organization and the mode of action of the T2SS remain unclear. Several components of this T2SS, OutC, -L, -M, -F and -E, are thought to form a platform in the inner membrane OutC, -Land -M are bitopic inne membrane but their stoichiometry and role in secretion are unknown. We used a bacterial two-hybrid system to detect protein interactions We have shawn that the ferredoxin-like domain at the C-terminus of OutL and OutM allows homo- and - heterodimerization of these proteins. An interaction between OutC and OutD periplasmic regions has been detected (Login et al., 201 0). Three-hybrid has been performed and our results suggest that OutL would destabilize the interaction between OutC and OutD. Also, OutL is implicated in the activation of ATPase OutE, which is thought to be the motor of the system (Cam berg et al., 2007). Thus, OutL could be implicated in the signal transduction from periplasme to cytoplasm and could dissociate the OutC/ OutD complex. To analyse protein-protein interactions within bacterial membranes, we developed a system specially adapted from the bacterial two-hybrid. One of the sub-domain of Cya has been fused to the N-terminus of TMS and BlaM to the C-terminus. Correct topology of fusions can be controlled using BlaM properties. B using this assay znd site-directed mutagenesis, we detected multiple bi-partner interactions between the TMS of OutC, OutL and OutM.

La protéine OSBP est un transporteur de lipides qui régule la distribution cellulaire du cholestérol. OSBP comprend un domaine PH, deux séquences « coiled coil », un motif FFAT (deux phénylalanines dans un environement acide), et un domaine de liaison de lipides (ORD) à son extrémité C-terminale. Le domaine PH interagit avec le PI(4)P et la petite protéine G Arf1-GTP au niveau du Golgi, alors que le motif FFAT interagit avec la protéine VAP-A, résidente du réticulum endoplasmique (RE). En liant simultanément tous ces déterminants, OSBP stabilise des sites de contact membranaire entre RE et Golgi, permettant ainsi un contre-échange cholestérol / PI(4)P par l'ORD. OSBP contient également une longue séquence N-terminale d’environ 80 aa, intrinsèquement désordonnée, composée principalement de glycine, proline et d'alanine. Nous démontrons que la présence de ce N-terminus désordonné augmente le rayon de Stoke de OSBP tronquée du domaine ORD, et limite sa densité d’association sur la membrane portant le PI(4)P. La protéine dépourvue du N terminus favorise l'agrégation symétrique des liposomes PI(4)P (mimant la membrane du Golgi) par les deux domaines PH du dimère OSBP, alors que la présence de la séquence désordonnée empêche cette association symétrique. De même, nous observons que la distribution d’OSBP sur la membrane de vésicules unilamellaires géantes (GUV) varie selon la présence ou l'absence du N-terminus. En présence de la séquence désordonnée, la protéine est répartie de manière homogène sur toute la surface du GUV, alors que la protéine sans N-terminal a tendance à s'accumuler à l'interface entre deux GUV de type Golgi. Cette accumulation locale ralentit fortement la mobilité de la protéine à l’interface. Un effet similaire du N-terminal sur la dynamique des protéines est observé lorsque l’association de membranes de type ER et Golgi est assuré par des protéines monomériques (dépourvue du coiled coil) en présence de Vap-A. Les résultats de nos expériences in vitro ont été confirmés en cellules vivantes, où la séquence intrinsèquement désordonnée contrôle le recrutement d’OSBP sur les membranes Golgiennes, sa mobilité et sa dynamique d’activité au cours des cycles de transfert de lipides. La plupart des protéines de la famille d’OSBP contiennent des séquences N-terminales de faible complexité, suggérant un mécanisme général de régulation. / Oxysterol binding protein (OSBP) is a lipid transfer protein that regulates cholesterol distribution in cell membranes. OSBP consists of a pleckstrin homology (PH) domain, two coiled-coils, a “two phenylalanines in acidic tract” (FFAT) motif and a C-terminal lipid binding OSBP-Related Domain (ORD). The PH domain recognizes PI(4)P and small G protein Arf1-GTP at the Golgi, whereas the FFAT motif interacts with the ER-resident protein VAP-A. By binding all these determinants simultaneously, OSBP creates membrane contact sites between ER and Golgi, allowing the counter-transport of cholesterol and PI(4)P by the ORD. OSBP also contains an intrinsically disordered ~80 aa long N-terminal sequence, composed mostly of glycine, proline and alanine. We demonstrate that the presence of disordered N-terminus increases the Stoke’s radius of OSBP truncated proteins and limits their density and saturation level on PI(4)P-containing membrane. The N-terminus also prevents the two PH domains of OSBP dimer to symmetrically tether two PI(4)P-containing (Golgi-like) liposomes, whereas protein lacking the disordered sequence promotes symmetrical liposome aggregation. Similarly, we observe a difference in OSBP membrane distribution on tethered giant unilamellar vesicles (GUVs), based on the presence/absence of N-terminus. Protein with disordered sequence is homogeneously distributed all over the GUV surface, whereas protein without N-terminus tends to accumulate at the interface between two PI(4)P-containing GUVs. This protein accumulation leads to local overcrowding, which is reflected by slow in-plane diffusion. The effect of N-terminus is also manifested in monomeric OSBPderived proteins that tether ER-like and Golgi-like membranes in the presence of VAP-A. Findings from our in vitro experiments are confirmed in living cells, where N-terminus controls the recruitment of OSBP on Golgi membranes, its motility and the on-and-off dynamics during lipid transfer cycles. Most OSBP-related proteins contain low complexity N-terminal sequences, suggesting a general effect.

L’étude du microbiote intestinal et de ses produits de sécrétion est un domaine de recherche en expansion en raison des perspectives thérapeutiques que cela peut ouvrir pour les maladies nutritionnelles telles que l’obésité ou les TCA. La Caseinolytic peptidase B (ClpB) est une protéine bactérienne produite par les entérobactéries qui présente un mimétisme moléculaire avec l’α-MSH, un neuropeptide anorexigène signalant la satiété au niveau de l’hypothalamus. Des études récentes ont cherché à évaluer si la protéine ClpB pouvait induire des effets anorexigènes similaires à ceux de l’α-MSH, en situation physiopathologique et dans des modèles de troubles nutritionnels. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été d’étudier les potentiels effets pharmacologiques de la protéine ClpB, intacte ou fragmentée sur les différents mécanismes de régulation de la prise alimentaire impliquant l’axe microbiote-intestin-cerveau et l’influence des nutriments. La première étude a évalué in vitro l’impact de trois macronutriments sur la production et l’expression de la protéine ClpB par les bactéries E. coli : seul l’apport protéique augmentait significativement la production de ClpB. Nous avons montré que la ClpB augmentait la sécrétion de PYY par les cellules entéro-endocrines intestinales de rat en culture. La deuxième d’étude a été réalisée chez des souris dans un modèle d’anorexie (ABA). La restriction alimentaire, avec ou sans activité physique, augmentait la concentration plasmatique de ClpB, qui était associée à une augmentation de la proportion d’entérobactéries dans le microbiote, ce qui suggère son implication possible dans la physiopathologie de l’anorexie mentale. Enfin, la troisième étude a évalué in vivo chez le Rongeur, les effets pharmacologiques de la protéine ClpB sur la prise alimentaire. La prise alimentaire était réduite par l’injection de ClpB intacte ou fragmentée, mais pas par son fragment de 25 kDa. Ces résultats confortent le rôle de la protéine ClpB, produite par les entérobactéries, dans la régulation physiologique de la prise alimentaire et incitent à poursuivre l’étude de son implication dans les troubles anorexiques et son application thérapeutique dans les situations d’excès de poids. / The study of the gut microbiota and especially the effect of its secretory products is an expanding field of research in order to open therapeutic perspectives for nutritional diseases such as obesity or TCA. Among these molecules, the Caseinolytic peptidase B (ClpB) is a bacterial protein having a molecular mimicry in common with α-MSH, a neuropeptide whose anorectic actions are peripheral and central and possible via a microbiota-intestinal-brain communication. Current studies attempt to demonstrate whether this molecular mimicry can confer similar anorectic effects at the ClpB protein. The aim of this thesis was studied the potential pharmacological effects of ClpB protein the regulation of eating behavior. Given that the composition of the gut microbiota is dependent on the food present, the first study was evaluated in vitro the impact of three types of macronutrients on the production and expression of the ClpB protein by E. coli bacteria. Then, it was evaluated whether this protein could influence the secretion of satietogenic peptides like PYY by intestinal enteroendocrine cells using a primary culture of rat intestinal cells. Previous studies of U 1073 laboratory have shown that this protein has been found at the plasma level, the second study was performed in mice submitted to an anorexia model (ABA) to clarify the impact of dietary restriction on the ClpB protein, to better understand its possible involvement in the physiopathology of anorexia nervosa. Finally, the third study was evaluated the pharmacological effects of ClpB protein on food intake in vivo in rodents. The impact of the natural fragmentation of this protein and particularly of one of its fragments on food intake was also evaluated.

La mélatonine est une neurohormone, principalement synthétisée par la glande pinéale et exerçant ses fonctions physiologiques via ses deux récepteurs MT1 et MT2 couplés aux protéines G. Ces derniers sont principalement exprimés dans le cerveau, la rétine et plusieurs autres tissus périphériques pour réguler une grande variété de fonctions physiologiques telles que les rythmes circadiens et saisonniers, la physiologie de la rétine, l'homéostasie du glucose et les fonctions neuronales et immunitaires. Les récepteurs de la mélatonine modulent plusieurs voies de transduction de signaux intracellulaires et inhibent la production d'AMPc et de GMPc et activent les « Extracellular signal-Regulated Kinases » 1/2 (ERK1/2) et les canaux ioniques. Ce travail met l'accent sur le rôle central de la voie ERK1/2 dans la fonction des récepteurs de la mélatonine en définissant la ou les voies moléculaires impliquées et en étudiant les modifications de cette voie dans les conditions pathologiques. Dans l'article 1, nous décortiquons les voies moléculaires impliquées dans l'activation de la voie ERK1/2 par les récepteurs humains MT1 et MT2 dans des cellules HEK293, un modèle cellulaire pertinent. Nous montrons ainsi que les β-arrestines ne participent pas à l’activation d’ERK1/2 induite par les deux récepteurs. Alors que l'activation d'ERK1/2 par MT1 est exclusivement médiée par des protéines Gi/o en libérant leurs sous-unités Gβy, MT2 est strictement dépendante de l'activation coopérative des protéines Gi/o et Gq/11. Les deux récepteurs activent plus en aval la cascade PI3K/PKCζ/c-Raf/MEK/ERK, avec laquelle ils forment des méga-complexes de signalisation préformés. Le phénomène de coopérativité au niveau des protéines G a également été observé plus en aval au niveau des gènes cibles d’ERK1/2 mais pas pour la voie Gi/cAMP. Ce travail a permis de fournir la première description complète de la voie ERK activée par MT1 et MT2, de mettre en évidence des différences entre les deux récepteurs et décrire un nouveau modèle de coopérativité entre les protéines Gi/o et Gq/11.Les variants naturels d’un récepteur peuvent avoir des propriétés de signalisation et des fonctions physiologiques modifiées. L'évaluation fonctionnelle de tels variants associés à des maladies est extrêmement importante pour établir un lien entre la fonction modifiée et la maladie pour concevoir d’éventuelles nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans l'article 2, nous avons établi le profil de signalisation de 40 variants naturels du récepteur MT2 associés au diabète de type 2 (DT2). La voie ERK1/2 a été mesurée en suivant la phosphorylation d’ERK directement dans des lysats cellulaires avec la technologie alpha-screen. En résumé, l'article 2 a confirmé l'association générale entre la perte de fonction du récepteur MT2 et l'augmentation du risque de DT2 et a montré que la voie ERK1/2 ne fait pas partie des principales voies associées au DT2.La génération et l'agrégation des peptides amyloïdes bêta (Aβ) est le principal marqueur moléculaire de la maladie d'Alzheimer (MA). Chez les patients atteints de MA, les deux composants du système mélatoninergique, à savoir la production de mélatonine et la fonction des récepteurs de la mélatonine, sont nettement réduits. Cependant, les mécanismes moléculaires y participant ne sont pas encore bien compris. Dans l'article 3, nous démontrons que l'Aß abolit la synthèse de la mélatonine et diminue les fonctions de MT1 et MT2 telle que l'activation de la voie ERK1/2 par la mélatonine. Ce travail fournit une base mécanistique pour expliquer la diminution de la fonction du système mélatoninergique chez les patients atteints de la MA.En résumé, cette thèse fournit de nouvelles idées sur la façon dont les récepteurs humains de la mélatonine activent la voie ERK1/2 et comment cette activation est modifiée par Aβ dans le contexte de la MA et par des variants de MT2 associés au DT2. / The neurohormone melatonin, primarily synthesized by the pineal gland, exerts its physiological functions by two high-affinity G protein-coupled receptors: MT1 and MT2. Both are widely expressed in the brain, retina and several other peripheral tissues to regulate a wide variety of physiological function such as circadian and seasonal rhythms, retinal physiology, glucose homeostasis and neuronal and immune functions. Melatonin receptors modulate several intracellular signal transduction pathways and inhibit cAMP and cGMP production and activate extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2) and ion channels. This work focuses on the central role of ERK1/2 signaling in melatonin receptor function by defining the molecular pathway(s) involved and by studying modifications of this pathway under disease conditions. In article 1, we decipher the molecular pathways involved in the activation of the ERK1/2 signaling cascade by human MT1 and MT2 receptors in HEK293 cells, a relevant cellular model system. We show that β-arrestins do not participate in ERK1/2 activation by both receptors. Whereas ERK1/2 activation by MT1 is exclusively mediated though Gi/o proteins by liberating Gβγ subunits, MT2 is strictly dependent on the cooperative activation of Gi/o and Gq/11 proteins. Both receptors activate further downstream the PI3K/PKCζ/c-Raf/MEK/ERK cascade, with which they are forming preformed mega-signaling complexes. G protein cooperativity was also observed further downstream on the ERK1/2 target gene level but not for the Gi/cAMP pathway. This work provides the first full description of the ERK signaling pathway activated by MT1 and MT2, highlights differences between the two receptors and describes a new cooperativity model between Gi/o and G/11 proteins.Naturally occurring receptor variants might have modified signal transduction properties and modified physiological functions. The functional assessment of disease-associated variants is therefore extremely important to establish a link between modified function and disease to eventually design new therapeutic strategies. In article 2, we established the ERK1/2 signaling profile of 40 natural MT2 variants associated with type 2 diabetes (T2D) by measuring ERK phosphorylation directly in cell lysates with the alpha-screen technology. Collectively, article 2 confirmed the general association between loss-of-function of MT2 and increased T2D risk and showed that the ERK1/2 pathway is not among those pathways primarily associated to T2D risk.Generation and aggregation of the amyloid-beta peptides (Aβ) is the main molecular hallmark of Alzheimer’s disease (AD). In AD patients both components of the melatoninergic system, i.e. melatonin production and melatonin receptor function, are markedly reduced. However, the mechanistic basis for that is still poorly understood. In article 3, we demonstrate that Aβ abolishes melatonin synthesis and diminishes MT1- and MT2 functions such as the activation of the ERK1/2 pathway by melatonin. This work provides a mechanistic basis for the diminished responsiveness of the melatoninergic system in AD patients.Collectively, this thesis provides new insights on how human melatonin receptors promote ERK1/2 activation and how this activation is modified by Aβ in the context of AD and by MT2 variants associated with T2D.

ASF1 est un chaperon d’histones H3-H4 impliqué dans de nombreux cancers. Comme bon nombre de protéines, ce chaperon exerce ses fonctions dans la cellule à travers des interactions protéine-protéine qu’il établit avec d’autres partenaires protéiques. La présente thèse porte sur le développement d’une stratégie originale de design de peptides inhibiteurs de ce type d’interactions souvent associées à des maladies. Cette stratégie rationnelle et itérative repose sur le couplage d’épitopes de liaison provenant de différents partenaires de l’interaction, et leur stabilisation par l’introduction de résidus « ancre » permettant ainsi d’engager un grand nombre de contacts avec la cible. L’extension de cette approche vers des peptidomimes permet par la suite de surmonter les obstacles liés à l’utilisation des peptides en thérapeutique tels que la biodisponibilité et la demi-vie. Appliquée au ciblage d’ASF1, cette méthode a permis de concevoir un peptide, ip4, présentant une affinité de 3nM pour sa cible, soit 3000 fois supérieure au partenaire naturel H3. Ce même peptide a été mimé avec succès par un composé, if3, de nature oligourée. Efficacement internalisés à l’aide d’une Cell Penetrating Peptide clivable, ces inhibiteurs présentent un effet antiprolifératif provoquant la mort des cellules cancéreuse, vraisemblablement dû au ciblage spécifique d’ASF1. / ASF1 is a histone H3-H4 chaperone implicated in several cancers. Like many proteins, this chaperone mediates its cellular functions through protein-protein interactions involving various protein partners. The present thesis focuses on the development of an original strategy to design inhibitory peptides targeting such disease-associated type of biological interactions. This rational and iterative strategy relies on the tethering of binding epitopes isolated from different partners, and stabilized by “anchor” residues that engage large number of atomic contacts with the target. The further progression of this approach toward a peptidomimetic strategy overcomes obstacles commonly associated to the therapeutic use of peptides such as biodisponibility and half-life. Applied for targeting ASF1, such method allowed the conception of a peptide, ip4, presenting a 3nM affinity for its target, which is 3000 fold higher than that of the natural partner H3. This peptide could be successfully mimicked by an oligourea structure, giving rise to the peptidomimetic if3. When coupled to a cleavable Cell Penetrating Peptide, these inhibitors displayed an on-target effect where they impeded cancerous cells proliferation, ultimately resulting in cells death.

Le virus de l'hépatite C (HCV) est un virus à ARN qui synthétise ses nouveaux génomes dans les cellules hôtes infectées grâce à une ARN polymérase ARN dépendante (RdRp), appelée NS5B. Cette polymérase a été pendant longtemps une cible majeure dans la recherche d'antiviraux contre l'hépatite C. Aujourd'hui, de nombreux antiviraux ont été approuvés dans le traitement de l’hépatite C ciblant différentes protéines virales, entre autre, NS5B. Le sofosbuvir qui cible le site actif de NS5B est un antiviral qui a démontré une efficacité extraordinaire dans le traitement anti-HCV.Durant ces dernières années, les recherches sur NS5B ont permis de caractériser cette protéine, à la fois structuralement et biochimiquement. La richesse des connaissances ainsi accumulées fait de NS5B un excellent modèle pour les RdRp des virus à ARN.Toutefois, peu d'études portent sur le mécanisme d’acheminement et de sélection des ribonucléotides au site actif de NS5B, et de façon générale, sur la description atomique du mécanisme de réplication assuré par NS5B, qui implique deux dications magnésium pour la catalyse comme chez toutes les polymérases de cette famille.Durant ce travail, nous avons exploité les données structurales issues de complexes ternaires (NS5B+RNA+nucleotide) obtenus en 2015 par cristallographie à l'échelle atomique. Nous avons utilisé ces structures pour mener des études de modélisation moléculaire, essentiellement par dynamique moléculaire afin d’aborder la question de l'acheminement des nucléotides vers le site actif de NS5B.Nous avons eu recours à la fois à des méthodes de dynamiques moléculaires classiques et des méthodes de dynamiques moléculaires dites biaisées telles que différentes méthodes de dynamiques moléculaires dirigées (SMD et TMD) et la dynamique moléculaire accélérée (aMD).Nos résultats indiquent que l’acheminement du nucléotide au site actif associé à un magnésium Mg(B) est contrôlé tout au long du tunnel par différents éléments de NS5B. Initialement, le nucléotide se lie à une région proche de la boucle qui surplombe le tunnel lui permettant, grâce aux interactions qu’il établit avec sa partie triphosphate, de s’orienter base en avant. Ensuite, le nucléotide atteint un point de contrôle formé essentiellement par le motif F3 (R158) et le motif F1(E143). Le nucléotide reste lié à ce site jusqu’à l’arrivée du second dication magnésium (Mg(A)) qui provoque des réarrangements structuraux, notamment au niveau du motif F3, entrainant l’avancée du nucléotide vers le site actif. Une fois ce point de contrôle passé, le nucléotide interroge alors la base du brin d’ADN matrice sans s’insérer entièrement dans le site actif.Nos simulations ont clairement établi que les dernières étapes d’entrée du nucléotide sont finement régulées par l’arrivée du second dication magnésium qui a donc un rôle de coordinateur en plus de son rôle connu dans la catalyse.Ce mécanisme d’entrée semble être spécifique aux RdRp virales et permet de comprendre pourquoi les analogues de nucléotides peuvent être aussi efficaces contre les virus à ARN. / The hepatitis C virus is an RNA virus that synthesises its new genomes in the infected host cells thanks to an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) termed NS5B. This polymerase has been a prime target for antiviral therapy. Numerous direct antiviral drugs are now approved in the HCV treatment and allow very high rates of treatment success. These drugs target among others the HCV NS5B RdRp with the sofosbuvir being one of the most successful drugs.Tremendous efforts have been made in the past decades to characterize NS5B, in particular structurally and biochemically. However, there is little information about the molecular mechanisms of NS5B ribonucleotides entry and selection and in general on the atomistic details of the RNA replication mechanism, although the involvement of two magnesium dications in catalysis is well established in this family of polymerases. Since 2015, structures of ternary complexes of NS5B have been resolved by crystallography offering very valuable details about the binding of nucleotides at the NS5B active site.In this work, we took advantage of these structural data to address the ribonucleotides entry and to further explore the nucleotide addition cycle in NS5B using molecular modelling and molecular dynamics simulations. We used both conventional molecular dynamics techniques and biased simulations that enhance sampling such as Steered Molecular Dynamics (SMD), Targeted Molecular Dynamics (TMD) or accelerated Molecular dynamics (aMD).Based on our modelling results, we found that the access to the active site through the nucleotides tunnel is checked by successive NS5B elements. First, the entering ribonucleotide together with an associated magnesium Mg(B) binds next to a loop that overhangs the nucleotide tunnel and interactions with its triphosphate moiety orient it base-first towards the active site. Second, the ribonucleotide encounters a checkpoint constituted by the residues of motif F3(R158) and motif F1(E143) where it is blocked until the arrival of a second magnesium ion, the Mg(A). This allowed the motif F3 to undergo small structural rearrangements leading to the advancement of the nucleotide towards the active site to interrogate the RNA template base prior to the complete nucleotide insertion into the active site.Our simulations pointed out that these dynamics are finely regulated by the second magnesium dication, thus coordinating the entry of the correct magnesium-bound nucleotide with shuttling of the second magnesium necessary for the two-metal ion catalysis. This entry mechanism is specific to viral RdRps and may explain why modified ribonucleotides can be so successful as drugs against RNA viruses.