L'annotation génomique identifie l'ensemble des éléments significatifs présents sur l'ADN génomique, le support du programme de fonctionnement de l'organisme. Elle prédit leurs fonctions biologiques et leurs relations. L'annotation d'un génome complet est soumise à diverses contraintes: elle doit être réalisée rapidement et représenter l'organisme comme système biologique fonctionnel cohérent. Nous proposons une méthode de vérification de la qualité de l'annotation génomique, basée sur un ensemble de règles de cohérence définies d'après les connaissances et contraintes biologiques admises par la communauté scientifique. Ces règles vérifient la complétude de l'annotation (présence des éléments vitaux pour l'organisme) et son absence d'erreur (sens biologique correct des éléments décrits). Notre méthode est appliquée dans le cadre du projet Génolevures, un projet de génomique comparée chez les levures hémiascomycètes. Nous avons mis en place un système d'annotation facilitant le travail d'annotation manuelle par les experts. L'intégration de nos règles dans ce système permet de garantir la bonne qualité de l'annotation produite. Nous avons choisi de valider expérimentalement l'application de ces règles en étudiant les interactions protéine-protéine chez les levures Saccharomyces cerevisiae et Yarrowia lipolytica par la technique de l'électrophorèse en gel de polyacrylamide en bleu natif et SDS (BN/SDS PAGE). Les résultats obtenus apportent de nouvelles connaissances chez les levures étudiées. Ils démontrent l'universalité de certaines règles et le bien fondé de la stratégie d'annotation.

Le développement de molécules ciblant les surfaces d'interaction protéine-protéine constitue l'un des enjeux majeurs de la recherche scientifique académique et des industries pharmaceutiques de cette dernière décennie. A ces fins, nos travaux ont été consacrés à la conception, à la synthèse et à la caractérisation de nouveaux mimes de surfaces sur châssis. Le squelette de ce dernier est un cyclodécapeptide RAFT, pouvant présenter deux surfaces d'adressage indépendantes. La fonction de ciblage est assurée par la présentation de quatre peptides greffés par voie d'assemblage combinatoire sur la face supérieure du RAFT. De cette manière, il sera possible d'obtenir toutes les combinaisons de surfaces à partir des éléments constitutifs permettant un ciblage efficace des surfaces protéiques. L'architecture à présentation multiple a été synthétisée de manière convergente par formation hautement chimiosélective de liens éthers d'oximes, stables in vitro et in vivo. Nous avons synthétisé des substrats linéaires présentant certains motifs identiques ainsi que des substrats cycliques, contraints par la présence d'une liaison dissulfure, de séquences globalement identiques mis à part en deux positions où l'incorporation de résidus (Lys, Asp, Phe, Ser) leur confère des propriétés diverses (charges, natures...). L'utilisation de ces éléments s'inscrit dans deux approches de ciblage distinctes à savoir la réalisation de mimes de la surface de reconnaissance de l'hormone GnRH et la réalisation de surfaces pour un ciblage plus général de surfaces protéiques. L'utilisation des méthodes CLHP et LC-MS pour l'analyse des banques de produits obtenues a permis leur totale caractérisation. Enfin, la réalisation des premières évaluations biologiques sur ces mélanges vis-à-vis de plusieurs cibles (hormone GnRH, avidine, interface SHC-Grb2) a donné des résultats encourageants.

La cellule est un milieu très concentré où les interactions entre macromolécules, même faibles, jouent un grand rôle dans leur solubilité et dans l'assemblage des complexes labiles assurant les fonctions biologiques. Les interactions faibles entre protéines déterminant la non-idéalité de leurs solutions vont aussi gouverner leur cristallisation.<br />Dans quelle mesure les interactions protéine – solvant influencent-elles les interactions protéine – protéine ? Nous avons mis en relation ces deux types d'interactions pour la malate déshydrogénase (Hm MalDH) de Haloarcula marismortui, protéine halophile très acide qui a des solvatations variées et très riches en eau et en sel.<br />Nous avons développé une nouvelle méthode de détermination du second coefficient du viriel A2 par la modélisation des profils de vitesse de sédimentation en ultracentrifugation analytique, qui permet l'étude de solvants complexes.<br />Les interactions protéine – protéine de la Hm MalDH en divers sels ont été caractérisées par diffusion de neutrons ou de rayons X aux petits angles. Les A2 et les facteurs de structure en solution ont été modélisés par des potentiels d'interaction de type DLVO. Les interactions répulsives sont principalement dues au terme de volume exclu et dans une moindre mesure au terme électrostatique. Les interactions attractives sont qualitativement corrélées à des valeurs positives ou négatives des paramètres d'interaction préférentielle avec le sel. Ces résultats permettent d'expliquer l'adaptation moléculaire des protéines halophiles qui doivent ainsi avoir une solvatation riche en sel pour rester soluble à haut sel.<br />La cristallisation par dilution de la Hm MalDH dans des mélanges sel – MPD (méthyl-2-pentanediol-2,4) résulte d'une lente évolution des interactions protéine – protéine, de répulsives à modérément attractives. Le MPD modifie les interactions protéine – protéine en divers sels en ajoutant une attraction qui est liée à la répulsion du MPD par les charges de la protéine.

L'excitation nerveuse d'une cellule musculaire produit une libération massive dans le cytoplasme du Ca2+ stocké dans le réticulum sarcoplasmique (RS). L'augmentation de la concentration cytoplasmique de Ca2+ déclenche la contraction. Ce processus, appelé couplage excitation contraction (CEC), requiert des interactions physiques entre deux canaux calciques : (1) le récepteur des dihydropyridines (DHPR), un canal calcique activé par le voltage ; le DHPR est composé de plusieurs sous-unités, dont la sous-unité α1S, qui forme le canal et le détecteur de potentiel, et la sous-unité β1a, entièrement cytoplasmique; (2) le récepteur à la ryanodine (RyR1) responsable de la libération de Ca2+ hors du RS. La sous unité β1a interagit avec la sous-unité α1S et RyR1. Au cours de ma thèse, j'ai identifié de nouveaux déterminants moléculaires et structuraux de l'interaction DHPR/RyR1. J'ai ainsi démontré l'existence d'interactions intramoléculaires entre les différentes boucles cytoplasmiques de la sous-unité α1S du DHPR, centrées autour d'un domaine appelé domaine A. J'ai également localisé le site d'interaction de la cavéoline-3 sur une boucle cytoplasmique de la sous-unité α1S. L'étude de l'interaction de la sous-unité β1a avec RyR1 a montré (1) que la région C-terminale de β1a contrôle cette interaction, (2) que l'affinité apparente de β1a pour RyR1 est fortement augmentée par l'interaction de β1a avec α1S et (3) que l'interaction β1a/RyR1 régule la fermeture du RyR. L'utilisation d'une toxine, la maurocalcine (MCa) qui se comporte comme un analogue du domaine A m'a permis d'identifier un domaine minimal de RyR1 responsable de la fixation de la MCa et du domaine A. Une étude structurale par RMN de ce site a été réalisée. Enfin, j'ai étudié l'effet de la MCa sur des myotubes n'exprimant pas la sous-unité α1S. J'ai montré que la MCa est capable de restaurer, en absence de DHPR, une augmentation de la concentration de Ca2+ cytoplasmique induite par la dépolarisation de la membrane plasmique.

Les protéines impliquées dans les voies de signalisation sont souvent activées et inactivées par des interactions de faible affinité. En particulier, les domaines protéiques liant spécifiquement de courts fragments protéiques permettent une régulation intra- et inter-moléculaire efficace des domaines catalytiques auxquels ils sont associés. Citons par exemple les domaines FHA ou des tandems BRCT fréquemment impliqués dans les réponses aux dommages de l'ADN. Etant donnée leur importance dans les réseaux d'interactions et dans la signalisation cellulaire, la prédiction par bioinformatique des propriétés de liaison de ces petits domaines constitue un enjeu majeur. Toutefois, les stratégies bioinformatiques sont jusqu'à présent limitées par des difficultés méthodologiques associées aux caractéristiques intrinsèques de ces domaines. Leurs séquences sont souvent très divergentes et les affinités pour leurs cibles physiologiques sont généralement faibles malgré une excellente spécificité. Le travail présenté dans cette thèse a donc pour objectif de dépasser les limites actuelles des outils de prédictions pour développer de nouvelles méthodologies bioinformatiques performantes. Trois points ont été plus particulièrement abordés : (i) la prédiction de la structure tridimensionnelle de ces domaines ; (ii) la prédiction des sites reconnus par ces domaines lorsque les partenaires sont connus ; (iii) la prédiction des motifs spécifiquement reconnus par ces domaines sur la base de leur structure tridimensionnelle.

Les transporteurs ABC forment une vaste famille de protéines présentes dans tous les organismes vivants. Ces protéines utilisent l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP pour transporter à travers les membranes biologiques des substances très variées. Plusieurs protéines ABC sont importantes pour la santé humaine. Par exemple, le défaut fonctionnel de la protéine CFTR cause la mucoviscidose et la surproduction de protéine MRP1 est associée aux phénomènes de résistance aux traitements anti-tumoraux. La levure Saccharomyces cerevisiae possède une famille de protéines (Yor1p, Ycf1p, Bpt1p, Ybt1p, Vmr1p, Nft1p) apparentées à CFTR et MRP1. Cette famille peut servir de modèle à l'étude des protéines humaines. La première partie de ce travail de thèse a été consacrée à l'étude biochimique de la protéine de levure Yor1p. Nous avons fusionné YOR1 avec un fragment d'ADN codant un peptide de poly-histidine et avons placé cette construction sous contrôle d'un promoteur permettant une surproduction dans la levure. Nous avons alors montré que la protéine Yor1p poly-histidylée était produite sous forme fonctionnelle dans la levure, puis avons mis au point une méthode permettant de solubiliser puis de purifier cette protéine en une seule étape par chromatographie d'affinité sur une colonne greffée avec des ions métalliques. La deuxième partie de ce travail a consisté à produire sous forme isolée chez la bactérie Escherichia coli et à purifier à homogénéité les deux domaines de Yor1p impliqués dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP. Nous avons étudié la fixation de l'ATP sur ces deux domaines, ce qui nous a permis de conclure que ces domaines étaient bien structurés. Ils peuvent maintenant être utilisés pour des études structurales. Enfin, nous nous sommes intéressés au rôle la protéine Ycf1p dans la détoxication du sélénite. Nous avons observé que la toxicité du sélénite pour la levure était considérablement accrue par la présence de composés thiolés dans le milieu de culture. La formation de dérivés réactifs de l'oxygène est vraisemblablement à l'origine de cette hypertoxicité.

Les œstrogènes (E2), via le récepteur aux œstrogènes (ER), contrôlent l'expression de nombreux gènes impliqués dans la croissance, la différenciation cellulaire et les fonctions reproductrices. La régulation de ces gènes résulte de la fixation du ER sur une séquence d'ADN : Elément de Réponse aux Œstrogènes (ERE). ER joue un rôle majeur dans le cancer du sein, il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires qui modulent in vivo son activité. Nous observons que, comparé à l'EREconsensus, les ER présentent une affinité vis-à-vis d'un EREimparfait (rtvtgERE), une activité cellulaire et une sensibilité à E2 plus faible. Une étude in vitro du comportement conformationnel, thermodynamique et dynamique des ER a démontré un rôle du réseau électrostatique au sein des ER dans leurs différences de fonctionnalité. Nous avons recherché et comparé l'impact de la liaison au ligand sur l'activité cellulaire de deux ER : hERalpha et rtERS. La reconstitution de leur mécanisme d'action chez la levure a montré que hERalpha est un facteur d'activation de la transcription plus puissant que rtERS et qu'il est plus sensible à E2. Nous observons aussi que la présence de ligand induit une relocalisation des ER au sein de foci. Une étude cinétique de l'activation transcriptionnelle et de la relocalisation subcellulaire des ER en présence de ligand nous pousse à distinguer ces deux aspects. Nous suggérons qu'un fort niveau de phosphorylation de ER par les kinases activées en présence de ligand, augmente son caractère anionique conduisant à empêcher sa fixation à l'ADN ou à l'en dissocier. Ainsi, ER pourrait être recruté par des complexes dans le noyau ou dans le cytoplasme et formé ces foci.

Les travaux réalisés portent sur la conception de ligands protéiques capables de cibler le site catalytique des métalloprotéases matricielles (MMPs) grâce à une méthode d'ingénierie développée au laboratoire qui repose sur le greffage de motifs fonctionnels. Le motif fonctionnel choisi correspond aux 4 résidus N-terminaux du TIMP-2, un inhibiteur naturel des MMPs. Des plates-formes protéiques possédant des motifs d'acides aminés dans une topologie similaire à celle du motif de référence dans le complexe TIMP-2/MMP-14 ont été identifiées par criblage systématique de la PDB à l'aide du logiciel STAMPS (Search for Three-dimensional Atom Motif in Protein Structure). Dix candidats ligands satisfaisant les contraintes topologiques, stériques et de similarité électrostatique avec le ligand naturel TIMP-2 ont été sélectionnés. Ces ligands ont été produits par synthèse chimique ou par voie recombinante puis leur capacité à inhiber une série de 6 MMPs a été évaluée. Les résultats indiquent que tous les ligands protéiques conçus in silico sont capables de lier les sites catalytiques des MMPs avec des constantes d'association allant de 450 nM à 590 mM, sans optimisation supplémentaire. La caractérisation structurale par diffraction X de 2 variants d'un de ces ligands protéiques a permis de montrer que les interactions établies par le motif 1-4 dans ces ligands étaient similaires à celles observées dans le complexe TIMP-2/MMP-14, avec cependant des différences dans la géométrie de certaines d'entre elles. Des études de simulation par dynamique moléculaire ont également permis de mettre en évidence de possibles différences dans la géométrie et la stabilité de certaines des interactions reproduites dans les 10 plates-formes, pouvant contribuer aux affinités modestes observées pour ces ligands. Cependant, les résultats obtenus montrent que la méthode de conception in silico utilisée est capable de fournir une série de ligands protéiques de 1ère génération ciblant de manière spécifique un site catalytique d'intérêt avec un bon rendement. Cette méthode pourrait constituer la 1ère étape d'une approche hybride de conception in silico de ligands combinée à des techniques de sélection expérimentales.

Les fonctions de la majorité des protéines sont subordonnées à l'interaction avec un ou plusieurs partenaires : acides nucléiques, autres protéines... La plupart de ces interactions sont transitoires, difficiles à détecter expérimentalement et leurs structures sont souvent impossible à obtenir. C'est pourquoi la prédiction in silico de l'existence de ces interactions et la structure du complexe résultant ont été l'objet de nombreuses études depuis plus d'une décennie maintenant. Pour autant les protéines sont des objets complexes et les méthodes informatiques classiques sont trop "gourmandes" en temps pour l'exploration à grande échelle de l'interactome des différents organismes. Dans ce contexte de développement d'une méthode de docking protéine-protéine haut débit nous présenterons ici l'implémentation d'une nouvelle méthode d'amarrage, celle-ci est basée sur : l'utilisation de deux types de formalismes : Les tessellations de Voronoï et Laguerre permettant la manipulation de modèles géométriques simplifiés permettant une bonne modélisation des complexes et des temps de calcul plus raisonnable qu'en représentation atomique. L'utilisation et l'optimisation d'algorithmes d'apprentissage (algorithmes génétiques) permettant d'isoler les conformations les plus pertinentes entre deux partenaires protéiques. Une méthode d'évaluation basée sur le clustering de méta-attributs calculés au niveau de l'interface permettant de trier au mieux ce sous-ensemble de conformations candidates.

Les rétrovirus sont des virus à ARN, enveloppés présents dans de nombreuses espèces animales de rente, chez les animaux de compagnie et chez l'homme. Une des particularités des rétrovirus concerne l'intégration du génome viral au sein du génome de la cellule infectée; cette intégration est réalisée par une enzyme virale, l'intégrase. Le projet de cette thèse vise à mieux comprendre le fonctionnement de cette enzyme notamment en identifiant des facteurs cellulaires interagissant avec celle-ci, facteurs qui pourraient être des agents favorisant le processus intégratif ou, au contraire, des agents restrictifs. Les intégrases de deux modèles de rétrovirus ont été utilisées dans cette étude : L'intégrase de RAV1, un rétrovirus exogène aviaire du genre des alpharétrovirus appartenant au sous-groupe A de la famille des ASLV. Cette enzyme virale est largement étudiée soit au niveau structural ou fonctionnel, mais les données concernant ses partenaires cellulaires sont rares et insuffisantes. La seconde intégrase est celle du PERV A/C, un rétrovirus endogène porcin du genre gammarétrovirus. Aucune information sur cette enzyme n'a été décrite jusqu'à présent. Ces deux enzymes, en fusion avec une étiquette 6xHistidine, ont été donc produites en bactérie, et en cellules d'insecte puis purifiées sur colonne d'affinité en FPLC. Leurs activités catalytiques ont été testées in vitro. Ces tests permettent de valoriser la capacité de l'intégrase à exercer principalement les 2 fonctions dont elle est responsable in vivo, le clivage en 3' et le transfert de brins, et une activité qu'elle exerce exclusivement in vitro, la désintégration. Les protéines pures et actives ont ensuite servies à la vérification de leur interaction avec une protéine cellulaire, Brd2. La technique 'Far western blot' a ainsi permis de valider l'interaction entre l'intégrase de PERV et la protéine cellulaire, puis d'identifier les domaines de l'intégrase et de Brd2 impliqués dans cette interaction. A terme, l'identification de ce facteur cellulaire et la validation de son rôle dans le processus intégratif permettront de mieux comprendre ce processus particulier développé par les rétrovirus et pourront conduire au développement d'inhibiteurs dirigés contre cette interaction