Les bactéries à Gram négatif sont entourées par une enveloppe cellulaire qui, contrairement aux bactéries à Gram positif, possèdent une organisation membranaire complexe composée d’une membrane interne appelée généralement membrane cytoplasmique, un espace périplasmique contenant une matrice de peptidoglycane et une membrane externe asymétrique constituée d’une monocouche de phospholipides surmontée d’une assise de lipopolysaccharide (LPS). Afin de franchir cette barrière, les bactéries à Gram négatif ont développé différentes voies de sécrétions spécifiques dédiées à l’export des protéines (effecteurs) du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire. Jusqu'à présent, six systèmes de sécrétion ont été identifiés chez ces bactéries. Chez Pseudomonas aeruginosa, une bactérie pathogène opportuniste, le système de sécrétion de type II appelé aussi sécréton Xcp constitue l’un des facteurs principales de sa virulence. Le sécréton Xcp est un complexe macromoléculaire formé par 12 protéines, nommées XcpAO et XcpPC-XcpZM. Ce complexe macromoléculaire est organisé en trois sous-complexes : i) une plateforme d’assemblage ancrée dans la membrane interne formé par les protéines XcpRESFYLZM ii) un pore de sécrétion localisé dans la membrane externe formé par l’oligomérisation d’une protéine appelé la sécrétine XcpQD. Le pore de sécrétion est connecté à la plateforme de la membrane interne par une protéine appelée XcpPC iii) un pseudopilus périplasmique sous forme de fibre hélicoïdale qui est formé par la multimérisation d’une protéine appelée la pseudopiline majeure XcpTG. D’autres protéines appelées les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK intègrent le pseudopilus. La première partie du travail effectué au cours de cette thèse a eu pour but d’étudier et de comprendre par des approches structurales, biochimiques et biophysiques le mécanisme d’assemblage des pseudopilines en pseudopilus. La deuxième partie de ce travail a porté sur l’étude des réseaux d’interactions entre les substrats sécrétés et les composants de la machinerie Xcp. Durant cette thèse, nous avons ainsi i) identifier grâce à l’étude des interactions protéine-protéine l’existence d’un complexe quaternaire entre les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK localisées au sommet du pseudopilus ii) déterminer les structures de la pseudopiline majeure XcpTG par RMN et de la pseudopiline mineure XcpWJ par cristallographie aux rayons X iii) déterminer les différents éléments du sécréton qui interagissent avec les exoprotéines du sécréton. Ce réseau d’interaction nous a permis de proposer un modèle de fonctionnement du sécréton qui élucide le cheminement des exoprotéines dans le sécréton afin qu’elles soient exportées vers le milieu extracellulaire. / Gram-negative bacteria are characterized by a complex organization of their cell envelope composed by the inner membrane (IM) called cytoplasmic membrane, the periplasmic space containing a peptidoglycan layer and the outer membrane (OM) covered by the lipopolysaccharide matrix. Gram-negative bacteria have evolved several specialized machines called secretion systems to export their effectors from the intracellular medium to the extracellular milieu or to the host cells. Up to now, at least six secretion systems have been identified. In the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa, the type II secretion system called the Xcp secreton is the major pathway for the release of virulence factors. The Xcp secreton is a macromolecular complex composed by 12 proteins called XcpAO, XcpPC-XcpZM. This machinery is organized in 3 sub-complexes: i) the assembly platform localized in the IM implicating XcpRESFYLZM proteins ii) the OM pore composed by the oligomerization of the secretin XcpQD. The connection between the assembly platform and the secretin is performed by XcpPC anchored in the IM iii) a periplasmic pseudopilus consisting of the multimerization of the so-called major pseudopilin XcpTG. The pseudopilus is a helicoidally filament spanning the periplasmic area and pushing the substrate into the secretin pore. Four other proteins, the minor pseudopilins XcpUH-VI-WJ-XK, were found in the pseudopilus. In the present work we first focused on the study of the pseudopilus components by biochemical, biophysical and structural strategies to understand their assembly. Secondly, we investigate the protein interactome between periplasmic secreton component and secreted substrates. Thus, we revealed the presence of a quaternary complex composed by XcpUH-VI-WJ-XK located at the tip of the pseudopilus. To understand at atomic scale the regulation of the pseudopilus, we determined the structure of two components of the pseudopilus XcpTG by NMR and XcpWJ by X-ray crystallography. Using systematic protein-protein interaction studies between secreton components and purified exoproteins of Pseudomonas aeruginosa, we identified 5 proteins of the secreton able to interact with exoproteins. This interaction network allowed us to propose a model for the secretion process including the sequential steps followed by exoproteins inside the secreton to leave the cell envelop.

L’étude des transitions structurales dans les protéines est d’un intérêt crucial car ces transformations sont impliquées dans de nombreux processus biologiques essentiels. De tels phénomènes structuraux peuvent être à l’origine de propriétés remarquables dans les protéines flexibles ou désordonnées, propriétés difficilement accessibles par les techniques structurales usuelles. Le marquage de spin couplé à la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) est une technique bien adaptée pour l’étude de ces transitions structurales. L’insertion d’un radical nitroxyde sur une cystéine, naturelle ou introduite par mutagenèse dirigée, située à un endroit clé de la protéine permet d’obtenir des informations locales sur les changements structuraux éventuels provoqués par l’ajout d’un partenaire.Cette technique a été appliquée à deux systèmes biologiques comportant un degré de flexibilité différent. La flexibilité de la protéine chaperon NarJ, intervenant dans la biogenèse du complexe Nitrate Réductase de la bactérie Escherichia coli, a été étudiée en présence de son peptide partenaire. Ces études ont permis d’une part de déterminer le site d’interaction et d’autre part, de montrer que l’association des deux partenaires entraîne un verrouillage dans une conformation préférentielle de NarJ. Le deuxième sujet d’étude est la protéine CP12 de Chlamydomonas reinhardtii, intervenant dans la régulation d’un complexe supramoléculaire du cycle de Calvin. La CP12 s’apparente à une protéine intrinsèquement désordonnée, ayant la particularité de posséder des cystéines naturelles et fonctionnelles. Le marquage classique a permis de mettre en évidence un nouveau rôle de son partenaire et de montrer que la CP12 garde un caractère désordonné dans le complexe. Par ailleurs, cette protéine a servi de système d’étude pour développer une nouvelle stratégie de marquage sur Tyrosine et démontrer sa faisabilité. / The study of structural transitions in proteins is of crucial interest because these transformations are involved in many biological processes. Such structural phenomena can be the source of remarkable properties in flexible or disordered proteins, properties hardly accessible by conventional structural techniques. Site-directed spin labeling combined with electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) is a technique well suited for the study of these structural transitions. The insertion of a nitroxide reagent on a cysteine, natural or introduced by site-directed mutagenesis, located in a key position of a protein provides local information on possible structural changes induced by the addition of a partner. This technique was applied on two biological systems with a different degree of flexibility. The flexibility of NarJ, a chaperon protein involved in the biogenesis of the complex nitrate reductase of Escherichia coli was studied in the presence of its peptide partner. These studies enabled us to determine the interaction site and to show that the association of the two partners induced a locked conformation of NarJ. The second system is the CP12 protein of Chlamydomonas reinhardtii, involved in the regulation of a supramolecular complex of the Calvin cycle. CP12 shares some similarities with the intrinsically disordered protein but having natural and functional cysteines. The conventional labeling allowed us to highlight a new role of its partner and to demonstrate that CP12 remains disordered in the complex. Moreover, this protein was used as a model system to develop a new labeling strategy on tyrosine and to demonstrate its feasibility.

Mon travail de thèse s'est focalisé sur la machinerie enzymatique impliquée dans la réplication du génome ARN du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère-Coronavirus (SRAS-CoV). J'ai montré in vitro que l'activité ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp) portée par nsp12 nécessite le complexe nsp7/nsp8, qui agit comme facteur de processivité. Grâce à ce complexe polymérase hautement actif, j'ai pu en suite étudier le mécanisme de "proofreading" (correction d'épreuve) associé aux coronavirus, pour lequel seulement des preuves indirectes avaient été assemblées. En effet, les coronavirus codent pour une activité exonucléase 3'-5' (nsp14-ExoN) qui lorsqu'elle est absente, entraine 14-fois plus d'erreurs de réplication en contexte cellulaire. In vitro, nous avons pu montrer que nsp14-ExoN est capable d'exciser l'ARN double brin ainsi qu'un nucléotide mésapparié en 3' de l'ARN en cours d'élongation. J'ai pu apporter pour la première fois une preuve directe de l'existence d'un système de réparation des erreurs au cours de la synthèse, mené par le complexe nsp7/nsp8/nsp12/nsp14. En effet, le complexe nsp7/nsp8/nsp12 ralentit jusqu'à 30-fois quand il rajoute une base mésappariée. Par sequençage, nous avons pu montrer la réparation de cette base mésappariée en presence de nsp14. Enfin, grâce à ce système in vitro nous avons une base pour comprendre l'inefficacité de la ribavirine sur des patients atteints du SRAS. En effet, la ribavirine, incorporée par le complexe polymérase, serait également excisée par nsp14, annihilant tout potentiel effet mutagenique. En conclusion, ce système va permettre de guider le développement d'antiviraux de type nucleoside analogues contre les coronavirus. / This work focused on the enzymatic machinery involved in Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus (SARS-CoV) RNA replication and transcription. Firstly, I established a robust in vitro polymerase assay with the canonical SARS-CoV RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) nsp12. I showed that nsp12, in order to engage processive RNA synthesis, needs two viral proteins, i.e. nsp7 and nsp8. This nsp7/nsp8 complex not only activates nsp12-RdRp, but also acts as a processivity factor. Thus, using this processive polymerase complex, I could investigate SARS-CoV proofreading for which only indirect evidences were reported. Indeed, coronaviruses encode for a 3'-5' exonuclease (nsp14-ExoN), putatively involved in a mechanism that proofreads coronavirus RNA during viral replication. We first showed in vitro that nsp14-ExoN, which is stimulated by nsp10, is able to excise specifically dsRNA as well as all primer/templates bearing a 3' mismatch on the primer. Moreover, we could confirm by sequencing that a RNA 3' mismatch was indeed corrected in vitro by the nsp7/nsp8/nsp12/nsp14 complex. We provide for the first time direct evidence that nsp14-ExoN, in coordination with the polymerase complex, is able to proofread RNA. Interestingly, using this in vitro system we found an element that could possibly explain the inefficacy of ribavirin therapeutic treatment on SARS-patients: ribavirin, which is incorporated by the SARS-CoV polymerase complex, would also be excised by nsp14. In conclusion, this system will drive future development of antivirals, particularly of the nucleoside analogue type, against coronaviruses.

La protéine Tat du VIH-1 est essentielle à la multiplication virale. Elle permet la transactivation de la transcription et, par ses propriétés apoptotiques, elle participe à la pathologie SIDA. D'où l'importance d'étudier les mécanismes régulant sa production. L'épissage alternatif de l'ARN du VIH-1, en particulier, l'utilisation des sites accepteurs d'épissage A3 et A7 est nécessaire pour la production des ARNm tat. L'utilisation du site A3 est fortement régulée par des éléments agissant en cis contenus dans une structure tige-boucle SLS3A3 située en aval du site A3. En purifiant les complexes RNP formés en extrait nucléaire sur un segment de l'ARN viral renfermant le site A3, et en analysant par spectrométrie de masse les protéines contenues dans ces complexes, nous avons pu mettre en évidence la fixation d'une protéine inhibitrice de l'utilisation du site A3, la protéine DAZAP1. Sur la base d'un ensemble de données antérieures du laboratoire et de nouvelles données que j'ai obtenues, nous avons montré que la protéine SRSF7, sans doute en synergie avec SRSF1, limite la fixation de DAZAP1 et active l'épissage au site A3. Nous avons aussi montré que la protéine virale Tat exerce un rétro-contrôle négatif au niveau de la production de l?ARNm tat, ceci en limitant l'activation du site A3 par SRSF7. La partie apicale de la structure tige-boucle SLS3A3 (motif B) est très conservée dans les souches de VIH-1. L'équipe d'E Guittet a déterminé sa structure 3D par RMN. La conformation de sa boucle terminale est caractéristique des structures tige-boucle reconnues par les protéines à domaines dsRBD (double stranded RNA Binding Domain). J'ai pu confirmer cette hypothèse en purifiant les complexes formés par le motif B en extrait nucléaire. Nous avons ainsi pu montrer que la protéine kinase PKR, qui joue chez l'Homme un rôle majeur dans la réponse à une infection virale, est un partenaire du motif B. Par utilisation de sondes chimiques de la structure 2D de l'ARN, j'ai pu montrer que la structure tige-boucle SLS3A3, contenant le codon d'initiation de l'ORF Tat, est présente dans l'ARNm tat1. Nous avons alors développé un système visant à étudier les mécanismes de régulation de l'initiation de la traduction de la protéine Tat. Par l'emploi d'une construction bicistronique, j'ai pu confirmer l'existence d'une activité IRES dans la région 5'UTRtat1 de l'ARNm tat1 et définir deux segments ayant cette activité. Des résultats préliminaires obtenus avec une construction bicistronique, nous ont permis de commencer à tester l'effet de différentes protéines SR et hnRNP sur l'activité de ces IRES / HIV-1 Tat protein is essential for viral replication. It allows the transcription of full-length viral RNAs, and due to its apoptotic properties it contributes to the AIDS disease. Hence, it is important to study the mechanisms regulating its production. Alternative splicing of the HIV-1 RNA, in particular, the use of acceptor sites A3 and A7 is required for tat mRNA production. Splicing at site A3 is highly regulated by cis-acting elements contained in a stem-loop structure SLS3A3, located downstream from site A3. By purifying RNP complexes formed in nuclear extract on a segment of the viral RNA containing site A3 followed by mass spectrometry analysis, we were able to highlight the binding of a new inhibitory protein, DAZAP1. Based on a set of ancient laboratory data and new results that I obtained, we have shown that SRSF7 protein, probably in synergy with SRSF1, limits the binding of DAZAP1 and splicing activation at site A3. We also showed that the viral protein Tat exerts a negative feedback control on tat mRNA production by restricting splicing activation of site A3 by SRSF7. The apical part of the stem-loop structure SLS3A3 (B motif) is highly conserved among HIV-1 strains. E Guittet team determined its 3D structure by NMR. The conformation of this apical loop is characteristic of stem-loop structures recognized by dsRBD proteins (double-stranded RNA binding domain). I was able to confirm this hypothesis by purifying RNP complexes formed by the B motif in nuclear extract. Thus, we have shown that the RNA dependent protein kinase (PKR), which plays in humans a major role in response to viral infection, is a partner of the B motif. By using chemical probes specific of the 2D structure of RNAs, I showed that the stem-loop structure SLS3A3 that contains the initiation codon of Tat is present in tat1 mRNA. We then developed a system to study the mechanisms regulating the initiation of translation of Tat protein. By using a bicistronic construct, I was able to confirm the existence of IRES activity in the 5?UTRtat1 region of tat1 mRNA, and define two segments that contain this activity. Preliminary results obtained with a bicistronic construct allowed us to begin testing the effect of different SR and hnRNP proteins on the activity of the IRES

Les immunoglobulines ne sont pas les seules protéines capables de reconnaissance spécifique. D’autres systèmes d’immunité adaptative existent et beaucoup d’autres protéines peuvent aussi générer des interactions spécifiques de hautes affinités. Ce sont des ossatures/squelettes protéiques intéressants pour concevoir de nouveaux interacteurs.Une nouvelle famille de protéines synthétiques, appelées AlphaReps, basée sur la famille des protéines à HEAT repeat contenant un motif structural répété en double hélice alpha, a été construite au laboratoire. Le motif répété, d’abord identifié chez une archée thermostable, a été idéalisé en concevant une séquence consensus, grâce à l’alignement de séquences de motifs naturels. Une banque de protéines a alors été construite à partir de ce motif. Toutes les protéines de la banque ont une structure générale similaire mais elles diffèrent par le nombre de motifs insérés et par les cinq résidus hautement diversifiés situés sur la face externe de la seconde hélice de chacun des motifs. Ces nouvelles protéines sont exprimées très efficacement chez E. Coli, solubles, sans pont disulfure et très stables (50-100 mg. L-1 de culture, Tm > 70°C).Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit s’intéresse à l’utilisation de ces nouvelles protéines synthétiques comme outils de reconnaissance moléculaire. Pour cela, plusieurs applications ont été développées. Dans la première partie, à l’aide de la technique du phage display, des interacteurs de hautes affinités pour la Green Fluorescent Protein ont pu être isolés au sein de la banque. Les interactions des protéines partenaires ont été caractérisées par la détermination des constantes d’affinité, ainsi que la résolution des structures cristallographiques de deux complexes contenant une AlphaRep spécifique et la GFP. Avec cette cible modèle, la possibilité d’utiliser les AlphaReps sélectionnées à l’intérieur des cellules eucaryotes vivantes pour reconnaître spécifiquement une cible protéique dans un milieu complexe a aussi été démontrée. L’utilisation des AlphaReps comme outils de diagnostique a été développée pour la détection de la cible membranaire FSHr (récepteur de l’hormone folliculo-stimulante), protéine surexprimée dans de nombreuses tumeurs. Ce projet a permis d’expérimenter des approches de sélections sur cellules entières, soulignant les progrès restant encore à accomplir pour la sélection contre des cibles plus complexes.La seconde partie de ce travail s’est intéressée à l’ingénierie et à l’évolution des AlphaReps. Ainsi, l’insertion de résidus variables sur le dernier motif (C-cap) de protéines de la banque a pu être validé. Une approche innovante de shuffling modulaire, adaptée à l’ossature AlphaRep a permis de cerner les limites de cette méthode et les améliorations à apporter pour être en mesure d’augmenter l’affinité d’interacteurs présélectionnés. La banque d’AlphaReps de phage display a également été transférée dans un vecteur de PCA (Protein Fragment Complementation Assay) utilisant la protéine scindée DHFR (Dihydrofolate Reductase) comme protéine rapportrice. Cela a permis de sélectionner des AlphaReps spécifiques pour des cibles non exploitables en phage display. L’utilisation de la cis-fusion entre une AlphaRep et sa cible, combinée à la technique de PCA, s’est révélée très efficace pour la sélection et la cristallisation de protéines réfractaires telles que la protéine ComD, ici présentée comme preuve de la réussite de cette approche.Les AlphaReps sont donc des protéines artificielles, parmi lesquelles des interacteurs spécifiques peuvent être isolés pour des cibles variées. Un large panel d’applications peut être envisagé comme le développement d’outils d’aide à la cristallogenèse ou celui d’outils de reconnaissance moléculaire in vivo. / Immunoglobulin fold is not the only basis for specific recognition proteins. Other adaptive immunity systems exist and many other proteins are also able to mediate specific high-affinity interactions. These are interesting scaffolds to generate alternative binding molecules.A new family of artificial proteins, named AlphaRep, based on HEAT repeat proteins containing an alpha-helical repeated motif, was designed in the laboratory. The repeated motif, first identified in a thermostable archae protein of unknown function was refined and idealized using a consensus design strategy. A library of artificial proteins based on this design was then constructed. All proteins from this library share the same general fold but differ both in the number of repeats and in a set of five highly randomized positions per repeat. The randomized side chains are located on the outside surface of the second helix. Sequences from this library are efficiently expressed as soluble, folded and very stable proteins (50-100 mg. L-1 of culture, Tm > 70°C).The work presented in this manuscript is focused on the use of those new synthetic proteins as molecular recognition tools. Then, different applications have been developed.In a first part, binders with high affinity for the green fluorescent protein were selected by phage display. Complexes were characterized. Affinity between partners was measured and structures of two of those complexes containing a specific AlphaRep and the protein target were solved by X-ray crystallography. Thanks to this model target, it was demonstrated that AlphaReps could be used in living cells for the specific recognition of the protein they have been selected for. AlphaReps have also been developed as a diagnostic tool to detect the membrane protein FSHr (Follicle stimulating Hormone receptor), shown to be overexpressed in various tumors. In this project, selections on entire cells have been performed, showing the limit of the selections approaches with complex targets.The second part of this work focused on engineering and evolutions of AlphaRep proteins. The insertion of randomized residues at specific positions in the last motif (C-cap) was validated. An innovative approach of modular shuffling, adjusted to the AlphaRep scaffold, was assessed. Limitations of this approach to perform affinity maturation of AlphaReps could then be understood. Finally, the AlphaRep Library was transferred to a PCA (Protein Fragment Complementation Assay) vector using the split DHFR (Dihydrofolate Reductase) as reporter protein. With this new selection system, specific Alphareps could be selected for protein targets not suitable for phage display selection. A cis-fusion strategy was employed to express the AlphaRep fused to its partner in order to increase the stability and solubility of the target as well as helping for its crystallogenesis. This approach, combined with the PCA selection, was successful to obtain crystals of the ComD protein (unstable protein), shown here as an example of success for this new method.AlphaReps are thus artificial proteins, among which specific binders can be isolated for various targets, showing a strong potential for a large range of applications from crystallogenesis helpers to in vivo molecular recognition tools.

Les travaux décrits dans ce mémoire ont pour objectif d’une part le développementd’une nouvelle famille de protéines artificielles et d’autre part la création de nouveaux sitesde fixation spécifiques dans ces protéines. L’objectif général était de développer une approchegénérale permettant d’obtenir rapidement des protéines reconnaissant toute macromoléculecible choisie. On peut voir ces protéines artificielles spécifiques comme des sortes d’anticorpsartificiels pour leur spécificité et leur affinité mais dont les propriétés physiques : stabilité,solubilité, efficacité d’expression, insensibilité à l’agrégation sont nettement plus favorablesque celles des anticorps et de leur dérivés.Le premier chapitre, présente la conception et la construction d’une bibliothèque deprotéines artificielles dite de première génération où les protéines sont formées par larépétition d’un motif idéalisé à partir d’une famille de motifs naturels appelés HEAT repeats.Toutes les protéines de la bibliothèque, dénommées αRep, sont conçues pour avoir la mêmearchitecture générale mais diffèrent les unes des autres par le nombre de motifs et par laséquence dans certaines positions rendues variables au sein de chaque motif. Cette banquenous a permis de valider l’architecture αRep choisie : Les protéines s’expriment sous formesoluble, sont très stables et adoptent la structure secondaire et tertiaire attendue quel que soitla séquence des positions hypervariables. Le second chapitre présente alors les approchessuivies pour l’amélioration de la qualité et de la diversité de la bibliothèque et a conduit à laconstruction d’une bibliothèque d’αRep de deuxième génération. Cette dernière bibliothèque(2 .1) repose sur le même schéma général mais contient une diversité ayant été optimiséelors de la conception puis améliorée expérimentalement par une procédure dite deFiltration/shuffling. Cette bibliothèque très diverse (1.7*109 clones indépendants) a été alorsexploitée pour y rechercher, par des méthodes d’exposition sur phages, de nouvelles αRepreconnaissant des protéines cibles préalablement choisies. L’ensemble des résultats montretrès clairement que des αRep reconnaissant spécifiquement, avec une affinité élevée, desprotéines cibles choisies arbitrairement peuvent être effectivement obtenues. Les structurestridimensionnelles de plusieurs complexes formés entre les αRep et leur cible a été résoluepermet de comprendre la nature et l’organisation précise de ces capacités de reconnaissancemoléculaire nouvellement créées. / The main objective of this work was to design, produce and characterize a new familyof artificial proteins and to introduce new tailored specific binding sites within this structuralframework. Our general goal was to develop method allowing to rapidly generate newprotein binding specifically to any predefined target macromolecule. Binders based onartificial proteins can be viewed as antibody-like molecules but due to their different structurehave more favorable physical properties (expression, solubility, folding efficiency, stability)than antibodies and derivatives.The design and experimental assembly of a first generation artificial protein library isdescribed in part I. Proteins of this library are made by a repetition of a motif idealized from afamily of natural protein repeats (HEAT repeat). These artificial proteins, named αRep, havethe same general fold but the number of the repeated motif vary from protein to protein.Furthermore, a set of positions of each motif is highly variable within the library. Proteinisolated from this first generation library are well expressed, soluble, extremely stable andwere shown to have the designed secondary and tertiary structure.The methods used to improve the diversity and the experimental quality of the protein libraryare described in the second part of this thesis and have allowed us to create a secondgeneration αRep library. This library is based on the same general scheme but its diversitywas optimized by an improved design and experimental procedures known as filtration/shuffling.This highly diverse second generation library (1.7*109 independent clones) was usedto select variants with tailored binding specificities using phage display method. The resultsclearly show that news αReps binding tightly and specifically a range of arbitrarily definedprotein targets can be efficiently selected. The tertiary structure of complexes between αRepand their cognate target molecule were solved and allow to analyze the nature and detailedorganization of this newly engineered molecular recognition capacities.

VIH-1, l’agent étiologique du Syndrome de l’Immunodéficience Acquise, est un rétrovirus qui infecte les cellules immunitaires et détourne leur machinerie cellulaire pour se répliquer rapidement. Lors de l’infection, le génome ARN est rétrotranscrit en ADN par la transcriptase inverse virale (RT), puis l’insertion du génome proviral dans l’ADN de la cellule hôte est une étape obligatoire du cycle viral catalysée par l’enzyme virale Intégrase (IN). L’interaction de l’IN avec son cofacteur essentiel, la protéine nucléaire LEDGF/p75, dirige l’intégration à l’intérieur de gènes dans des régions fortement exprimées de la chromatine, ce qui permet la production efficace de nouveaux virions. Les Inhibiteurs Allostériques Intégrase-LEDGF (INLAIs) sont une nouvelle classe de molécules antirétrovirales se liant à l’IN au site de liaison de LEDGF/p75. Conçus pour inhiber compétitivement l’interaction protéine-protéine IN-LEDGF/p75, ils inhibent également les activités enzymatiques de l’Intégrase et augmentent son niveau de multimérisation.Nous avons étudié plusieurs nouvelles séries d’INLAIs de la société Mutabilis, et avons pu démontrer que ces molécules inhibent l’intégration, mais ont aussi un effet antirétroviral plus puissant et indépendant de LEDGF/p75 post-intégration au cours de la maturation des virions, qui conduit à la production de virus non infectieux, ayant une morphologie excentrique caractérisée par un défaut d’encapsidation du génome viral. Lors de l’infection de cellules par ces virus, le cycle viral s’arrête à l’étape de rétrotranscription du génome viral. Nous avons montré que ces virions contiennent pourtant un génome viral stable et fonctionnel, une RT active et l’ARNtLys3 qui sert d’amorce à la rétrotranscription, et ont également conservé leur immunoréactivité pour les lymphocytes B et T. En évaluant l’impact du polymorphisme de l’IN au voisinage du site de liaison, nous avons identifié le variant polymorphe Ala125, pour lequel l’INLAI MUT-A perd concomitamment son effet sur la maturation des virions et sur la multimérisation de l’IN, tandis qu’il inhibe aussi bien l’intégration et l’interaction IN-LEDGF, prouvant que l’effet tardif des INLAIs est associé à l’induction de la multimérisation de l’IN. Nous avons pu associer la multimérisation de l’IN à une déstabilisation du dimère par les INLAIs en analysant les co-structures de MUT-A avec les intégrases polymorphes. Les INLAIs, outre leur intérêt thérapeutique sont de remarquables réactifs qui ont permis de démontrer le rôle essentiel de l’intégrase à trois étapes clés du cycle viral du VIH-1 : la rétrotranscription, l’intégration et la maturation des virions. / HIV-1, the causative agent of AIDS, is a retrovirus that infects immune cells and hijacks their cell machinery to achieve rapid replication. In the course of infection, the RNA genome is reverse transcribed into DNA by the viral Reverse Transcriptase (RT) before the obligatory insertion of the proviral genome into the host cell DNA catalyzed by the viral enzyme Integrase (IN). The interaction of IN with its essential cofactor, the nuclear protein LEDGF/p75, targets integration within gene introns in highly transcribed chromatine regions, which allows efficient production of new virions. IN-LEDGF Allosteric Inhibitors (INLAIs) are a novel class of antiretroviral molecules binding IN at the LEDGF/p75-binding site. Designed to competitively inhibit IN-LEDGF/p75 protein-protein interaction, they are also capable of inhibiting IN enzymatic activities and raising the IN multimerization level.We studied several new INLAI series from the company Mutabilis. We could demonstrate that these molecules inhibit integration, but also have a more potent, LEDGF-independent, antiretroviral effect during virion maturation, resulting in the production of non-infectious virions. Virions produced upon INLAI treatment have an eccentric morphology characterized by an encapsidation defect of the viral genome, and lead to an infection block at reverse transcription. Yet, we showed that these virions package a stable and functional viral genome, an active RT and the tRNALys3 primer for reverse transcription, and also keep their immunoreactivity towards B- and T-cell lymphocytes. When evaluating the influence of polymorphism at the edge of the binding site, we identified the IN Ala125 polymorphic variant which causes the concomitant loss of MUT-A effect on virion maturation and IN multimerization, whereas inhibition of integration and IN-LEDGF interaction are maintained. This proves that INLAIs exert their late stage effect through induction of IN multimerization. We could associate IN multimerization to INLAI-induced dimer destabilization by analyzing MUT-A co-structures with polymorphic integrases. Beside their therapeutic interest INLAIs are highly valuable reagents that allowed to demonstrate the essential role of integrase at three key steps of the HIV-1 replication cycle, reverse transcription, integration and virus maturation.

Au cours des dernières années, le développement de nouvelles thérapies contre les infections bactériennes a suscité un grand intérêt face à l’émergence des nombreuses souches résistantes aux antibiotiques. Le point de départ de cette recherche de nouveaux antibiotiques, pour lesquels les bactéries n’ont pas encore acquis de mécanismes de résistance, est l’identification de nouvelles cibles cellulaires. En 2000, des études génétiques ont identifié engA, un gène bactérien dont le produit est une GTPase, comme une cible pharmacologique pertinente: elle est essentielle à la survie cellulaire, conservée au sein des bactéries et absente chez les eucaryotes.Puisque EngA agit comme un facteur d’assemblage pour le ribosome bactérien, un de nos objectifs a été de développer un test de criblage pour identifier des inhibiteurs des interactions EngA-ribosome. Ces interactions sont modulées par des changements conformationnels d'EngA, qui sont eux-mêmes déclenchés par la fixation de différents nucléotides dans le domaine catalytique. Cependant, les liens entre ces différents changements restent encore méconnus. Nous avons utilisé une approche multi-technique pour étudier ces questions et obtenir des informations utiles pour l’optimisation de notre test de criblage.Des analyses de SAXS et protéolyse limitée ont démontré un changement conformationnel en solution après adition de nucléotides di- ou tri-phosphate. La comparaison des données avec des modèles cristallographiques d'EngA a confirmé la conformation de la protéine liée au GDP. Cependant, la conformation de la protéine liée au GTP ne correspond à aucune structure connue. Des essais d’interaction ont démontré que la fixation de différents nucléotides au niveau des domaines catalytiques régule l’interaction d'EngA avec le ribosome. En outre, les effets des nucléotides se produisent en utilisant des fortes concentrations, ce qui suggère que le rôle d'EngA dans la biogenèse du ribosome peut être contrôlé par la concentration intracellulaire de nucléotides. Les travaux visant la détermination de la structure d'EngA dans sa conformation liée au GTP par cristallographie nous ont permis d’obtenir la structure d’EngA dans différentes formes cristallines. Cependant, ces structures représentent la conformation liée au GDP. L’analyse de l’empilement des cristaux a montré des contacts intermoléculaires conservés qui peuvent stabiliser cette conformation pendant la nucléation. Des mutations spécifiques permettant la rupture de ces contacts peuvent éventuellement aider à promouvoir la cristallisation de conformations alternatives. Des analyses de cryo-microscopie électronique ont débuté afin d’obtenir la structure du complexe EngA:50S de chez B. subtilis. Des résultats préliminaires montrent une carte de densité électronique à 6.4 Å de résolution. L’interprétation de ces résultats est en cours. / The development of new therapeutics against bacterial infections has aroused great interest over the last years in the context of drug resistance. The starting-point in the pursuit of new antibiotics for which bacterial resistance mechanisms do not exist is the identification of novel cellular targets. Genetics studies in the early 2000s have identified engA as a conserved bacterial gene whose product is a GTPase that could represent a potential drug target: it is conserved among bacteria, essential for cell survival, and absent in humans.Since EngA acts as an assembly factor for the bacterial ribosome, one of our aims was to develop an assay to screen inhibitors of the EngA-ribosome interactions. These interactions are modulated by EngA conformational changes that are in turn triggered by the binding of different nucleotides to the catalytic G-domain. As the interplay between all these events in bacteria is still not resolved, we have used a multi-technique approach to explore these questions in order to obtain useful information for the setting up of a robust screening assay.SAXS and limited proteolysis showed a conformational change occurring in solution upon addition of either di- or tri-phosphate nucleotides. While model validation analysis confirmed the GDP-bound conformation, the GTP-bound state does not match any known EngA structure. Binding studies have revealed modulation of interactions by different nucleotide-bound states. Furthermore, response to nucleotides occurs at high concentrations, suggesting that the role of EngA in promoting ribosome assembly could be monitored by the intracellular nucleotide concentration. Efforts on identifying the GTP-bound state 3D structure by crystallography have resulted in EngA structures in different crystal forms. Although all the obtained structures represent the GDP-bound state, packing analysis has revealed conserved crystal contacts that can potentially stabilise this conformation during nucleation. Specific mutations aiming at disrupting these contacts may help to promote crystallisation of alternative conformations. Cryo-EM investigation has been initiated in order to obtain the structure of the B. subtilis EngA:50S complex. So far, an electron density map at 6.4 Å resolution has been obtained and its interpretation is underway.

UHRF1 est une protéine nucléaire responsable du maintien et de la régulation de l'épigénome des cellules. Elle favorise la prolifération cellulaire et est surexprimée dans la plupart des cancers. TIP60, l'un des partenaires le plus important d’UHRF1, est impliqué dans le remodelage de la chromatine et la régulation transcriptionnelle grâce à son activité acétyltransférase. Ensemble, les deux protéines régulent la stabilité et l'activité d'autres protéines telles que la DNMT1 et la p53. Le but de cette étude était d'explorer le mécanisme d'interaction entre UHRF1 et TIP60 en visualisant cette interaction dans les cellules. La microscopie par imagerie à temps de vie de fluorescence et d'autres techniques de biologie moléculaire ont été utilisées. Les résultats ont montré que UHRF1 interagit directement avec le domaine MYST de TIP60 et cette interaction se produit dans la phase S du cycle cellulaire. Les deux protéines ont également montré une réponse similaire aux dommages à l'ADN, ce qui prédit une cohérence dans leur fonction dans le mécanisme de réparation de l'ADN. La surexpression de TIP60 a également induit la baisse du niveau d’UHRF1 et de DNMT1 ainsi qu’une induction d'apoptose dans les cellules ce qui suggère un rôle de TIP60 dans la régulation des fonctions oncogéniques d’UHRF1. / UHRF1 is a nuclear protein maintaining and regulating the epigenome of cells. Its promotes proliferation and is found upregulated in most of cancers. TIP60 is one of the important interacting partner of UHRF1 and is involved in chromatin remodeling and transcriptional regulation through its acetyltransferase activity. Together they regulate the stability and activity of other proteins such as DNMT1 and p53. The aim of this thesis was to explore the mechanism of interaction between UHRF1 and TIP60 by visualizing this interaction in cells. Fluorescent lifetime imaging microscopy and other molecular biology techniques were employed for this purpose. Results of this study showed that UHRF1 interacts directly to the MYST domain of TIP60 and this interaction prevails in the S-phase of cell cycle. Both proteins also showed a similar response to DNA damage predicting a coherence in their function in DNA repair mechanism. Overexpression of TIP60 also downregulated UHRF1 and DNMT1 and induced apoptosis in cells suggesting a role of TIP60 in regulation of oncogenic functions of UHRF1.

Les récepteurs muscariniques à l'acétylcholine sont des protéines transmembranaires jouant des rôles dans de nombreux processus physiologiques. La toxine MT7 est un puissant modulateur allostérique de ces récepteurs. De plus, cette toxine est le seul ligand connu spécifique du sous-type 1 des récepteur muscariniques (hM1). Nous avons étudié les bases moléculaires de l'interaction entre la toxine MT7 et le récepteur hM1 par modélisation. Tout d'abord un échantillonnage des structures des deux partenaires a été réalisé par dynamique moléculaire. Les mouvements de grande amplitude de la boucle e2 du récepteur ont été prédits par dynamique activée. Puis la toxine a été arrimée sur le récepteur par des calculs de dynamique moléculaire sous contraintes ambigües dérivées de données de mutagénèse. Ce modèle a ensuite été optimisé par une simulation de dynamique moléculaire libre, en environnement membranaire explicite. Enfin, des calculs en retour des valeurs d'énergie libre de liaison ont été effectués afin de valider le modèle. Nous prédisons que la toxine se lie sur un dimère de récepteurs hM1. Le cœur de l'interaction est localisé sur un des monomères en contact avec les boucles II et III de la toxine. Cette interaction est complétée par des interactions hydrophobes au niveau de la boucle I sur le second monomère. L'analyse de ce modèle apporte des éléments de compréhension à la fois sur bases structurale de la haute affinité de cette toxine ainsi que sur sa sélectivité pour ce sous-type de récepteur. Il apparaît que cette sélectivité est essentiellement portée par la boucle extracellulaire e2 du récepteur.