La bêta lactoglobuline (βlg) est une protéine globulaire qui forme le constituant majoritaire du sérum du lait ou petit lait. Par chauffage la protéine se dénature irréversiblement, puis s’assemble pour former des agrégats ou gels présentant des structures très différentes selon les conditions environnementales, en particulier de pH et de force ionique. Des travaux récents ont montré la possibilité de créer des agrégats stables de βlg de forme sphérique, de 100 à 400 nm de diamètre dans une plage de pH bien spécifique. Ces particules sphériques que nous appelons microgels, sont potentiellement très intéressantes pour des applications dans l’agroalimentaire (blanchissement, stabilisation d’interfaces et encapsulation). L’objectif de la thèse est d’étudier le mécanisme de formation de ces microgels et leurs propriétés structurales dans différentes conditions environnementales afin de pouvoir créer de nouvelles fonctionnalités. La première partie de la thèse a consisté à étudier l’influence du pH sur la formation des microgels. Les suspensions stables de microgels sont formées par chauffage de la solution de βlg en absence de sel jusqu’à 50 g.L-1 de protéine si le pH est placé dans une gamme très étroite entre 5,75 et 6,1. La densité de ces particules sphériques est environ 150 g.L-1 et leur rayon hydrodynamique diminue de 200 nm à 75 nm en augmentant le pH. La formation de ces microgels entraine une augmentation de pH, qui est nécessaire pour obtenir une suspension stable. L’augmentation spontanée du pH pendant la formation des microgels entraine une augmentation de leur densité de charge à la surface qui a pour conséquence d'empêcher leur agrégation. Ce mécanisme d’auto-stabilisation n’est plus suffisant si le pH initial est inférieur à 5,75 et on observe alors la précipitation des microgels. Les microgels ne sont plus formés au-delà d’une valeur critique du pH initial. Dans ce cas, les agrégats fibrillaires sont formés avec un rayon hydrodynamique d’environ 15 à 20 nm. La seconde partie de ce travail traite de la formation des microgels induite par l’ajout des ions calcium. Nous avons montré que des suspensions stables de microgels peuvent être obtenues en chauffant les solutions de βlg en présence des ions calcium. Les conditions de formation des microgels ont été étudiées à différents pH entre 5.8 et 7.5 et différentes concentrations de protéine entre 5 et 100 g.L-1. Il existe un rapport molaire critique calcium/protéine (R) pour former des microgels qui est indépendant de la concentration de protéine. R diminue en diminuant le pH. Les microgels ont un rayon hydrodynamique qui varie entre 100 et 300 nm et leur densité est comprise entre 200 et 450 g.L-1. La détermination de quantité de calcium lié aux microgels indique que le paramètre crucial pour la formation des microgels est la densité des charges nettes des protéines natives. Les suspensions de microgels sont stables dans certaines gammes étroites de R mais s’agrègent et précipitent ou gélifient à des concentrations de calcium plus élevées. Dans la troisième partie, nous avons continué à étudier la formation des microgels dans les étapes initiales et observer leur croissance en présence des ions calcium. On a proposé un mécanisme de formation des microgels de βlg, qui commence par un processus de nucléation et croissance. Des nucléi de tailles bien définies sont formés à la première étape, puis ils continuent à grossir jusqu’à la taille finale des microgels. A des faibles concentrations de calcium les microgels sont stables. A des concentrations plus élevées, les microgels peuvent s’agréger pour former des agrégats plus grands et finalement un gel. La structure des gels de microgels est hétérogène à l’échelle de la microscopie confocale et similaire à celle formée en présence de NaCl 0.3M. Pourtant le processus de formation de ces gels n’est pas le même... / Beta lactoglobulin (βlg) is a major whey protein in the bovine milk. Upon heating above its denaturation temperature (which is pH-dependent), this globular protein undergoes molecular changes leading to the irreversible aggregation. Depending on the pH and ionic strength, either protein aggregates or gels exhibiting various structures and morphologies have been described. Very recently, it was found that in a narrow range of the pH close to iso-electric point, stable suspensions of rather monodisperse spherical particles with a radius of about a hundred nanometers were formed. These spherical particles which were called microgels might be of special interest for the production of liquid dispersions of β-lactoglobulin aggregates exhibiting various functionalities for food applications. The project on which I report here was a collaboration with the Nestlé Reseach Center (Lausanne, Switzerland) and its objective was to study the formation and structural properties of the microgels in different environmental conditions. The first part of the project is to study the influence of the pH on the formation of microgels. Stable suspensions of protein microgels are formed by heating salt free βlg solutions at concentrations up to about C = 50 g.L-1 if the pH is set within a narrow range between 5.75 and 6.1. The internal protein concentration of these spherical particles is about 150 g.L-1 and the average hydrodynamic radius decreases with increasing pH from 200 nm to 75 nm. The formation of the microgels leads to an increase of the pH, which is a necessary condition to obtain stable suspensions. The spontaneous increase of the pH during microgel formation leads to an increase of their surface charge density and inhibits secondary aggregation. This self-stabilization mechanism is not sufficient if the initial pH is below 5.75 in which case secondary aggregation leads to precipitation. Microgels are no longer formed above a critical initial pH, but instead short curved protein strands are obtained with a hydrodynamic radius of about 15-20 nm. The second part of the work is about the formation of microgels driven by the addition of calcium ions. We found that stable suspensions of spherical protein particles (microgels) can be formed by heating βlg solutions in the presence of calcium ions. The conditions for the calcium induced microgel formation were studied at different pH between 5.8 and 7.5 and different protein concentrations between 5 – 100 g.L-1. The results showed that a critical molar ratio of calcium to proteins (R) is needed to form microgels independent of the protein concentration. R decreases with decreasing pH. The microgels have a hydrodynamic radius ranging from 100 to 300 nm and their internal protein concentration ranges from 0.2 to 0.45 g.mL-1. The determination of calcium bound to the microgels suggests that the crucial parameter for microgel formation is the net charge density of the native proteins. The microgel suspensions are stable in a narrow range of R but aggregate at higher Ca2+ concentrations. In the third part, we continued to investigate the formation of microgels at initial step and how it is growing in the presence of calcium ions. We have proposed a mechanism of formation of blg microgels which follows a nucleation and growing process. The nucleus with define size are formed at the initial state and that is growing in size to reach final size of aggregates. At low calcium concentration it stabilizes and then we obtain a stable suspension of microgels. But at high concentrations, the microgels here can jump to form big aggregates and finally a gel. The structure of gel from microgels is heterogenous at the scale of confocal microscopy and similar to those formed in the presence of NaCl 0.3 M. However the process of formation of these gels is not the same...

L'une des infections parasitaires les plus courantes chez les animaux à travers le monde est la babésiose ou piroplasmose. Causée par le développement intraérythrocytaire d'un parasite du genre Babesia, elle présente de nombreux signes cliniques semblables à ceux du paludisme. Ce parasite, du phylum des Apicomplexes, est transmis via le vecteur tique et effectue son cycle de reproduction dans les cellules rouges du sang de l'hôte vertébré. En Europe B. divergens et B. canis sont les espèces majoritairement responsables respectivement de la babésiose bovine et la babésiose canine. Dans une stratégie de recherche vaccinale, l'étude de protéines parasitaires en contact avec la circulation sanguine est primordiale pour comprendre les interactions hôte-parasite et identifier des candidats vaccins à haut potentiel. Les protéines à ancrage GPI (glycosylphosphatidylinositol) font partie de ces protéines. La première protéine à ancrage GPI décrite chez B. divergens est Bd37.1. Elle induit une protection totale contre une infection à B. divergens à la condition qu'une séquence hydrophobe soit ajoutée en C-terminale. La résolution de la structure RMN de cette protéine a permis de mettre en évidence un probable mécanisme de changement conformationnel en fonction du pH. La structure composée de 3 sous domaines montre que celle-ci n'est maintenue que par des ponts salins qui peuvent se rompre en milieu acide. Or l'environnement membranaire dans lequel évolue Bd37.1 ancrée à la surface du parasite et/ou à l'approche du globule rouge lors de l'invasion est acide. Cette dynamique conformationnelle de la protéine Δ-Bd37, liée à l'environnement membranaire, pourrait être à l'origine du mécanisme qui confère une immunité en fonction de la présence ou non de la séquence hydrophobe en C-terminale de Bd37.1. Nous avons cherché à estimer les implications d'une telle dynamique dans les interactions hôtes-parasites à travers l'étude structurale de 2 protéines parasitaires (Bd37.1 et Bc28.1). Dans le premier cas nous étudions la dynamique conformationnelle de la protéine d'adhésion Bd37.1. Nous avons exploré les différentes conformations que pourrait adopter la protéine Bd37.1 par une approche de biophysique et nous avons stabilisé ces différentes conformations en solution par le biais de mutations pour les étudier. Parmi ces mutants, le mutant EDK-Δ-Bd37 dont les ponts salins ont été rompus montre des caractéristiques différentes de Δ-Bd37. Les données enregistrées sur ce mutant nous ont amené à résoudre sa structure et à tester son pouvoir vaccinant. Dans une seconde partie, nous caractérisons biochimiquement et fonctionnellement une autre protéine Bc28.1, l'orthologue de Bd37.1. chez B. canis, accompagnée de la résolution de sa structure. Nous montrons que Bc28.1 est une protéine d'adhésion localisée à la surface du parasite et nous comparons les structures de Bd37.1 et Bc28.1. Ces deux structures sont finalement très différentes tandis que localisation et fonction sont similaires. / One of the most common parasitic infections in animals worldwide is babesiosis or piroplasmosis. Caused by the intraerythrocytic development of Babesia parasite, it has many clinical signs similar to those of malaria. This parasite of the phylum Apicomplexa, is transmitted via the tick vector and performs its reproductive cycle in red blood cells of the vertebrate host. B. In Europe divergens and B. canis species are mainly responsible respectively for bovine babesiosis and canine babesiosis. A strategy of vaccine research, the study of parasite proteins in contact with the bloodstream is essential for understanding host-parasite interactions and identify vaccine candidates with high potential. Anchored protein GPI (glycosylphosphatidylinositol) are part of these proteins. The first protein GPI anchors described in B. divergens is Bd37.1. It induces complete protection against infection with B. divergens provided a hydrophobic sequence is added at the C-terminus. Resolution NMR structure of this protein has highlighted a probable mechanism of conformational change as a function of pH. The structure consists of three sub areas shows that it is only maintained by salt bridges which can break in acidic medium. However, the environment within which Bd37.1 membrane anchored to the surface of the parasite and / or approach the red blood cell during the invasion is acidic. This conformational dynamics of the protein-Δ Bd37 linked to the membrane environment, could be at the origin of the mechanism that confers immunity depending on the presence or absence of the hydrophobic sequence at the C-terminus of Bd37.1. We sought to assess the implications of such dynamics in host-parasite interactions through structural study of two parasite proteins (Bd37.1 and Bc28.1). In the first case we study the conformational dynamics of the adhesion protein Bd37.1. We explored the different conformations that may be adopted by a protein Bd37.1 biophysical approach and we have stabilized in different conformations in solution through mutations to study. Among these mutants, the mutant Δ-Bd37-EDK including salt bridges were broken shows different characteristics Δ-Bd37. The data on this mutant led us to solve the structure and to test its power vaccinating. In a second part, we characterize biochemically and functionally Bc28.1 another protein, the ortholog Bd37.1. in B. canis, accompanied with the resolution of its structure. We show that Bc28.1 is an adhesion protein localized to the parasite surface and compare the structures and Bd37.1 Bc28.1. These two structures are ultimately very different while location and function are similar.

Ets-1 est un facteur de transcription, membre de la famille Ets, possédant un domaine de liaison à l’ADN hautement conservé, qui permet de reconnaître un cœur consensus GGAA/T présent dans le promoteur de ses gènes cibles. Ce facteur régule des gènes impliqués dans divers processus physiologiques tels que le développement, l’hématopoïèse et l’angiogenèse ou pathologiques notamment dans la progression et l’invasion tumorale. Malgré les efforts engagés par la communauté scientifique ces dix dernières années, il y a peu de stratégies de ciblage thérapeutique d’Ets-1 qui peuvent être transposées dans un cadre clinique. Compte tenu du fait que ce facteur de transcription est un marqueur de mauvais pronostic pour de nombreux carcinomes, dont entre autres, ceux du sein, des poumons ou encore du colon, la mise en évidence d’une stratégie de ciblage de son activité pro-tumorale pourrait constituer une avancée majeure dans la lutte contre le cancer. Ets-1 n’agit pas seule au niveau de ses promoteurs cibles mais en coopération avec une variété de co-régulateurs transcriptionnels. De plus, ce facteur est ciblé par de nombreuses voies de transduction des signaux cellulaires. L’identification de nouveaux partenaires interagissant avec Ets-1 devrait donc nous permettre de mieux appréhender ses réseaux de régulation afin de mettre au point une stratégie de ciblage de son activité. Dans ce but, nous avons mis en œuvre un système de purification de partenaires basé sur la forte affinité entre la biotine et la streptavidine, appelé « streptavidin pull-down ». Nous avons ainsi identifié de nouveaux partenaires protéiques potentiels. Parmi ceux-ci, nous avons pu confirmer comme partenaires interagissant avec Ets-1, des protéines de réparation de l’ADN tels que le complexe DNA-PK et la PARP-1. La poly(ADP-ribose) polymérase -1 (PARP-1) est une enzyme aux rôles multiples qui catalyse la poly(ADP-ribosyl)ation ou PARylation. Si elle fut identifiée à l’origine comme une protéine de réparation de l’ADN, de nombreux travaux ont montré ces dernières années qu’elle est un co-régulateur majeur des mécanismes de transcription. Nous avons démontré qu’Ets-1 interagit directement avec la PARP-1 et est PARylée par celle-ci. L’utilisation d’inhibiteurs catalytiques de la PARP-1 sur des cellules de lignées cancéreuses, exprimant Ets-1, a pour conséquences l’accumulation massive de ce facteur et une augmentation de son activité transcriptionnelle. Ceci suggère une implication de la PARylation dans la stabilité d’Ets-1 en lien avec sa dégradation par le protéasome. Cependant, sous inhibition de la PARP-1, l’accumulation d’Ets-1 est toxique pour la cellule cancéreuse. En effet, nous avons observé une forte augmentation des dommages à l’ADN qui corrèle avec la mort des cellules tumorales. Nous supposons qu’une activité non régulée d’Ets-1 est néfaste pour le devenir cellulaire d’autant plus quand une enzyme de réparation de l’ADN comme la PARP-1 est inhibée.Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme de régulation d’Ets-1 au sein des cellules cancéreuses en liaison avec les protéines de réparation de l’ADN. De plus, l’utilisation d’inhibiteurs de la PARP-1 pourrait constituer une nouvelle stratégie afin de cibler spécifiquement les tumeurs exprimant Ets-1. / Ets-1 is a transcription factor, member of the Ets family, having a well-conserved DNA binding domain which recognizes a core consensus sequence, GGAA/T, present in the promoter of target genes. This factor regulates genes involved in various physiological processes such as development, haematopoiesis, and angiogenesis and in pathological processes notably cancer progression and invasion. Despite the efforts of the scientific community during these past 10 years, few strategies for Ets-1 therapeutic targeting can be apply to clinical medicine. Considering the fact that this transcription factor is a poor prognostic marker for numerous carcinomas, such as breast, lung or colorectal cancers, the finding of a new strategy for targeting its activity in tumours could be a new advance in the fight against cancer. Ets-1 does not act alone on its target promoters but with a wide range of transcriptional co-regulators. Moreover, this factor is a target for many signal transduction pathways. Identifying novel proteins that interact with Ets-1 should permit a better understanding of its regulation networks to develop a strategy for targeting its activity. For this purpose, we used a purification system to identify interacting partners based on the strong affinity between biotin and streptavidin, called streptavidin pull-down. We thereby identified new potentials interaction partners. Among those, we could confirm as Ets-1 partners, DNA repair proteins, such as the DNA-PK complex and PARP-1. The poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) is an enzyme with various roles that catalyses poly(ADP-ribosyl)ation or PARylation. Originally, it was identified as a DNA repair protein. Nevertheless, these past few years, many studies have highlighted its role as a co-regulator in transcription processes. We demonstrated that Ets-1 directly interact with PARP-1 and is PARylated in return. In Ets-1-expressing cancer cells, the catalytic inhibition of PARP-1 caused massive accumulation of this factor and enhanced its transcriptional activity. These results suggest that PARylation is involved in Ets-1 protein stability linked to its proteasomal degradation. Nevertheless, under PARP-1 inhibition, accumulation of Ets-1 is toxic for cancer cells. Indeed, we observed a strong increase in DNA damage that leads to cancer cells death. We assume that an unregulated activity of Ets-1 is harmful to the cellular outcome even more when a DNA repair protein such as PARP-1 is inhibited.These results give new insight into Ets-1 regulation in cancer cells linked to DNA repair proteins. Furthermore, our findings suggest that PARP-1 inhibitors would be useful in a new therapeutic strategy that specifically targets Ets-1-expressing tumours.

La protéine Tau est une protéine associée aux microtubules, localisée principalement dans les axones. Elle joue un rôle important dans la polymérisation et la stabilisation des microtubules, in vitro. Sa fixation aux microtubules est régulée par de nombreuses kinases et phosphatases. En effet, lorsque Tau est phosphorylée, elle se détache des MTs. Inversement, elle se fixe aux MTs lorsqu’elle est déphosphorylée. Le dysfonctionnement de la protéine Tau est à l’origine de différentes maladies neurodégénératives appelées Tauopathies comme la maladie d’Alzheimer. Dans ce contexte pathologique, Tau est anormalement phosphorylée et s’accumule sous forme de structures neurofibrillaires appelées PFH (paires de filaments hélicoïdaux). Ces structures sont retrouvées dans les neurones en dégénérescence et constituent une des caractéristiques majeures de lésion histopathologique de la MA. Dans le cadre de cette maladie, deux principaux mécanismes de toxicité neuronale induite par la protéine Tau ont été suggérés. La première hypothèse considère que l’hyperphosphorylation de Tau provoque son détachement des microtubules induisant ainsi une déstabilisation du cytosquelette microtubulaire, une altération du transport axonal et une mort neuronale. Selon la seconde hypothèse, la fixation excessive de Tau aux microtubules altèrerait le transport axonal des vésicules et autres organites nécessaires au bon fonctionnement de la synapse. Dans ce cas, l’hyperphosphorylation de Tau et la formation des structures PFH auraient en premier lieu un effet protecteur pour la cellule. Lors de ce travail de thèse, nous avons confronté ces deux théories en utilisant le modèle invertébré : Drosophila melanogaster. Tout d’abord, nous avons étudié l’effet de la perte de fonction de la protéine Tau de drosophile (dTau) sur l’architecture du cytosquelette microtubulaire et sur le transport axonal des neuropeptides. Ce travail nous a permis d’une part, de tester l’hypothèse de l’effet du détachement de la protéine Tau des MTs sur le transport axonal, et d’autre part d’étudier la fonction endogène de la protéine dTau. En effet, le rôle in vivo de la protéine Tau endogène sur la morphologie et la physiologie axonale reste inconnu à ce jour, et ceci probablement dû à une redondance fonctionnelle avec les autres protéines associées aux microtubules (MAPs). Dans cette présente étude nous utilisons le modèle Drosophila melanogaster qui présente l’avantage de n’avoir qu’un seul homologue de la famille Tau/MAP2/MAP4 des mammifères. Nos données montrent pour la première fois, in vivo, que la protéine Tau contrôle la densité des microtubules axonaux, et que la perte de la protéine Tau altère le transport axonal microtubule-dépendant. Cependant, les défauts observés ne semblent pas être suffisant pour induire une neurodégénérescence, mais pourraient néanmoins constituer un défaut apparaissant précocement chez les individus atteints. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons étudié l’hypothèse centrée sur l’effet de la fixation excessive de la protéine Tau humaine aux microtubules. Pour cela, nous avons utilisé des drosophiles transgéniques exprimant différentes isoformes mutées de Tau humain (hTau) mimant différents états de phosphorylation de la protéine Tau et s’attachant différemment aux microtubules. Nos résultats montrent clairement que la fixation de Tau en excès sur les microtubules induit des défauts majeurs du transport axonal et de la libération des neuropeptides. Nous démontrons ainsi que l’un des mécanismes possible de la maladie d’Alzheimer est la fixation précoce excessive de Tau sur les microtubules. Par ailleurs, nos résultats mettent en évidence une limite sérieuse des thérapies visant à inhiber la phophorylation de Tau dans la MA. / Tau is a microtubule associated protein that belongs to the MAP structural family. it polymerizes and stabilizes microtubules, in vitro. Tau is found in high amount in axons. The microtubule binding capacity of Tau is regulated by kinases and phophatases. Indeed, when Tau is phosphorylated it desengages from microtubules and when it is dephosphorylated it binds to microtubules and stabilizes them. Tau is involved in several neurodegenerative disorders called tauopathies like the elderly neuropathy, Alzheimer disease (AD). In this neurodegenerative disorder, Tau is abnormally phosphorylated and aggregates to forme neurofibrillary tangles called paired helicoidal filament (PHF), witch is one of the hallmark of AD. Hence, two major hypothesis explaining neurodegeneration in this condition have been suggested. The first hypothesis considers that because of Tau hyperphosphorylation, it detaches from microtubules and starts to form aggregates. Tau detachment from microtubules leads to their destabilization and subsequent defects in axonal transport. These defects in axonal transport lead to synaptic dysfonction and neuronal degeneration. The second hypothesis suggests that an excess of Tau binds onto microtubules, induces axonal transport defects and subsequently neuronal loss. The hyperphosphorylation of Tau and PHF formation would represent a protective response of the cell to prevent axonal defects and neurodegeneresence. The aim of our work is to evaluate these two mechanisms using Drosophila melanogaster model. First, we studied the effect of drosophila Tau (dTau) loss of function on microtubule organisation and axonal transport of neuropeptide in vivo. This work allows us to study the first hypothesis of detachment of Tau from microtubules an its consequences, as well as understanding the endogenous function of dTau. Infact, we took the advantage of drosophila lower genetic redundancy in witch dTau is the only homologue of the mamalian Tau/MAP2/MAP family. Our results demontrated that dTau control axonal microtubule number and that the loss of Tau function affects vesicular axonal transport. However, these defects do not seem to be toxic for the neuron but represent an early event that may progressively become toxic. In the second part of this work we evaluated the second hypothesis. It consists of studying the consequences of an excess of hypophosphorylated Tau bound to microtubules on axonal transport. Our results demontrate for the first time a stronger toxicity of hypophosphorylated Tau for neuronal function compared to pseudophosphoryated Tau. These data demonstrate an important mechanism that could probably be implicated in AD. In addition, our work point out a potentiel limit of a current therapeutic strategy aimed at inhibiting Tau phosphorylation.

La protéine humaine hERG (human ether-à-go-go related gene) s’associe en homo-tétramère pour former le canal potassique voltage-dépendant Kv11.1. C’est un acteur majeur de la repolarisation du potentiel d’action cardiaque par sa capacité à externaliser le potassium du cardiomyocyte. L’altération de sa fonction induit le syndrome du QT long à l’origine d’arythmies cardiaques et pouvant conduire à un arrêt du cœur. Ce syndrome parfois génétique provient le plus souvent d’une inhibition pharmacologique. De nombreux médicaments ont montré leur capacité à inhiber hERG en se fixant dans la lumière du canal. L’étude des interactions moléculaires entre hERG et médicaments intéresse les scientifiques depuis de nombreuses années. Très récemment, la première structure atomique de hERG à l’état ouvert par cryo-microscopie électronique a permis une avancée majeure dans la compréhension de l’agencement du pore du canal. De nombreuses questions restent malgré tout non résolues concernant les mécanismes de liaison des ligands. Plus encore, le développement d’approches biophysiques à partir de canal purifié permettraient de caractériser et d’anticiper des interactions avec les médicaments. Dans cette perspective, nous avons testé plusieurs stratégies pour obtenir le canal hERG purifié dans une forme stable, homogène et fonctionnelle. Notre étude est basée sur une construction simplifiée et chimérique du canal hERG, la version hERG(S1-coil). Chaque étape permettant la production et la purification d’une protéine membranaire a été optimisée en testant différentes techniques proposées par la littérature. Nous avons comparé les rendements d’expression du canal dans différents systèmes recombinants procaryotes ou eucaryotes. La quantité de protéine totale et le pourcentage de protéine fonctionnelle dans les membranes ont été étudiés. Dans un deuxième temps, le canal a été solubilisé puis purifié. Nous avons comparé les rendements de solubilisation et la stabilité protéique en fonction du type de détergent. En parallèle, nous avons mis au point des moyens techniques pour évaluer la fonction du canal au fur et à mesure du processus de production et purification. Le canal hERG(S1-coil) tétramérique et fonctionnel a finalement été identifié dans la fraction purifiée. Cependant, des optimisations sont encore à apporter pour conserver l’agencement tétramérique et empêcher l’agrégation au cours du temps avant de pouvoir envisager des études biophysiques et structurales. A terme, ces travaux pourraient profiter à la production et à la purification d’autres protéines membranaires oligomériques. / The human protein hERG (human ether-à-go-go related gene) assembles as homo-tetramer to form the voltage-gated potassium channel Kv11.1. This channel is involved in repolarization of the cardiac action potential by regulating the potassium release from cardiomyocytes. hERG malfunction was found to cause long QT syndrome, a disorder that predisposes affected patients to arrhythmias and sudden death. This can be due to congenital mutation in the hERG gene and, most frequently, it is caused by pharmacological agents. Several drugs are known to block the channel ion pathway, resulting in off-target inhibition of hERG. Consequently, understanding the molecular basis of drug binding to hERG has become a high priority. The recent determination of a near-atomic resolution structure of the opened channel, using cryo-electron microscopy, provides insights into how this channel work. But several questions are still unanswered to understand the mechanisms of hERG function and drug binding. Moreover, new biophysical protocols with the purified hERG channel would help scientists and industries to anticipate drug side effects. In this context, we investigated strategies to purify a stable, homogenous and functional hERG channel. Our study was based on a shorter and chimeric hERG channel, the hERG(S1-coil) version. We optimized each step from production to purification of membrane proteins by testing experimental protocols found in the literature. In this thesis project, we first compared production rates of the channel in several prokaryote and eukaryotes recombinant systems. Total protein produced and the percent of functional channel were investigated in membranes from each recombinant system. Then, the channel was extracted from membranes before purification. Solubilizing rates and channel stability were compared depending on detergents. In another hand, we also developed protocols to investigate the channel stability and function along production and purification. A tetrameric and functional channel was finally purified and identified by this strategy. More work however is still needed to improve channel homogeneity and stability before to be suitable for biophysical and structural studies. In the future, this work could also help investigations in production and purification of other oligomeric membrane proteins.

Introduction : En 2011, un arbovirus émergent appelé virus Schmallenberg (SBV) et appartenant à la famille des Bunyaviridae a été identifié en Allemagne et s’est répandu en Europe. Le SBV infecte les ruminants domestiques et sauvages. Chez l’adulte, la virémie est transitoire et l’infection est souvent inapparente. En revanche, chez les femelles gestantes, le SBV peut franchir la barrière transplacentaire et infecter le fœtus, pouvant provoquer des avortements et des malformations du système nerveux central. Parmi les protéines virales synthétisées par le SBV, la protéine non-structurale NSs est un facteur de virulence majeur. Elle entraîne notamment la dégradation de sa sous-unité Rpb1 de l’ARN polymérase II pour inhiber la transcription cellulaire. Ce travail a pour but d’étudier les propriétés biochimiques et fonctionnelles de NSs et d’identifier les déterminants moléculaires régissant ses principales activités.Méthodes et résultats: L’analyse in silico de la séquence peptidique de NSs réalisée à l’aide d’algorithmes de prédiction a permis de designer plusieurs de mutants de délétion de la protéine. L’observation de la localisation cellulaire des mutants dans plusieurs modèles humains et ovins confirme la prédiction d’une distribution principalement nucléaire pour NSs. De façon intéressante, une séquence interne à la protéine (33-51) sert de motif d’adressage spécifique au niveau des nucléoles (NoLS) et nous avons pu démontrer la co-localisation de NSs avec plusieurs protéines nucléolaires. De plus, l’infection de cellules humaines et ovines par le SBV entraîne la translocation de protéines nucléolaires (B23 et fibrillarine) vers le nucléoplasme, témoignant d’un stress nucléolaire viro-induit. Pour évaluer l’impact de la localisation nucléolaire de NSs sur ce phénomène, un virus recombinant dont NSs a été délétée de son motif d’adressage nucléolaire (SBVΔNoLS) a été produit par génétique inverse. Le SBVΔNoLS n’induit plus de redistribution de B23 confirmant le rôle de NSs dans l’induction d’un stress nucléolaire au cours de l’infection. Ces résultats ont été confirmés dans des cellules souches neurales humaines, qui constituent un modèle pertinent par rapport aux lésions provoquées par le SBV dans le système nerveux.En parallèle de ce travail, nous avons recherché des partenaires cellulaires de NSs par la méthode du double-hybride en levures. Huit partenaires cellulaires de NSs ont été découverts, dont la chaîne légère de la dynéine de type 1 (Tctex-1) et la Major Vault Protein (MVP), qui sont toutes les deux impliquées dans le transport de protéines grâce à leur association aux microtubules. Une des hypothèses avancées est que ces protéines pourraient servir de cargos pour promouvoir le transport nucléo-cytoplasmique de NSs.Conclusions et perspectives : Ce travail de thèse a permis de démontrer que la protéine NSs du SBV est localisée principalement dans le noyau cellulaire et dans les nucléoles, grâce à une séquence d’adressage spécifique. L’infection virale induit un stress nucléolaire dépendant de NSs, qui a pu être reproduit dans un modèle de cellules souches neurales humaines. Les perturbations nucléolaires induites par NSs pourraient contribuer au blocage de la transcription cellulaire observé au cours de l’infection et, de manière subséquente, moduler la réponse antivirale de la cellule et/ou induire la mort cellulaire en lien avec la pathogenèse virale. Ainsi, ces perturbations des nucléoles pourraient être à l’origine d’une dégénérescence des neurones et des anomalies développementales observées chez les fœtus infectés. Au niveau moléculaire, nous souhaitons préciser l’implication de la protéine nucléolaire B23, relocalisée vers le nucléoplasme en cours d’infection, et/ou d’autres composants du nucléole dans l’initiation de ce processus. Enfin, l’hypothèse d’un transport rétrograde actif de NSs du cytoplasme vers le noyau médié par son interaction avec MVP ou Tctex1 est en cours d’investigation. / Introduction: In 2011, an emerging arbovirus named Schmallenberg virus (SBV), and belonging to the Bunyaviridae family, was discovered in Germany. Then, SBV has rapidly spread to Europe infecting wild and domestic ruminants. Adult infection is basically mild and associated with a short viremia (2-5 days). However, in case of pregnant females’ infection, SBV has the ability to cross the placental barrier to infect the foetuses, which can lead to stillbirth and central nervous system developmental abnormalities (arthrogyposis, hydranencephaly). Among bunyavirus-encoded proteins, the non-structural protein NSs has been shown to be an important virulence factor. Indeed, it is able to degrade the Rpb1 subunit of RNA polymerase II, leading to the inhibition of cellular transcription. The work of my thesis aimed to study biochemical and functional properties of NSs and to identify the molecular patterns ruling its main activities.Methods and results: An in silico amino acids sequence analysis was used to predict some common features of NSs and to help the design of several NSs mutants. As predicted by several algorithms, NSs and its mutants are mainly localised to cell nucleus in different cell types (from human and ovine origin). Interestingly, we highlighted an internal sequence (residues 33 to 51) containing a nucleolar localisation signal (NoLS), and have shown that NSs co-localises with several nucleolar proteins. Moreover, infections of human and ovine cell lines with SBV lead to re-localisation of nucleolar proteins to nucleoplasm (B23 and fibrillarin), demonstrating a viral-induced nucleolar stress. To assess the role of the NSs nucleolar localisation in this phenomenon, a recombinant virus, with a mutated version of NSs devoid of its NolS motif (SBVΔNoLS), was constructed by reverse genetic. Infection with SBVΔNoLS does not induce nucleolar stress, suggesting that the nucleolar stress induced by SBV occurs only if NSs is addressed to the nucleolus. Moreover, these results have been confirmed in human neural stem cells, which coud be a more relevant cellular model to mimic SBV infection in foetuses.Another way to study NSs functions was to identify its cellular partners by means of a yeast-two hybrid screen and using NSs as bait. Eight putative interactors of NSs have been discovered, including the dynein light chain type 1 (Tctex-1) and the Major Vault protein (MVP). These proteins are involved in cellular protein transport, notably by their associations with the microtubules network. Thus, NSs might interact with Tctex-1 and MVP to favour its shuttling from cell cytoplasm to the nucleus.Conclusions and perspectives: Altogether, these data indicate that SBV-NSs protein is mainly localised into cell nucleus and nucleolus, by means of its internal NoLS contained in the 33-51 NSs domain. SBV infection induces a nucleolar stress, particularly in human neural stem cells. NSs-induced nucleolar disruption could promote NSs inhibitory function on cellular transcription, and subsequently modulate cellular antiviral state and/or induce cell death. Regarding the pathogenesis in SBV-infected foetuses, nucleolar stress could be responsible for neurons degeneration and subsequent developmental abnormalities. At molecular level, our aim is to define the role of nucleolar protein B23 on viral replication, which is strongly relocalised to the nucleoplasm during SBV infection. Finally, hypothesis of NSs retrograde transport from cell cytoplasm to nucleus and the possible contributions of MVP and/or Tctex-1 needs to be further investigate.

Le choc septique est la principale cause de mortalité dans les services de réanimation. Les glucocorticoïdes (GC) et la protéine C activée (APC) sont deux traitements adjuvants recommandés au cours du choc septique. Ce travail a pour objectif d'évaluer l'impact de la combinaison d'APC et des GC sur les paramètres hémodynamiques et la survie. Le sepsis expérimental se caractérise par une hypotension artérielle avec acidose lactique et une hyporéactivité vasculaire. L'administration de Dexa et/ou d'APC permet de diminuer les taux de lactates, d'interleukines et de nitrate/nitrite. Chez les groupes traités, la contraction est améliorée ainsi que la relaxation vasculaire des aortes et des artères mésentériques. L'administration d'APC et de Dexa, seul ou en association, entraine une diminution de l'expression induite d'iNOS et la restauration de la voie Akt. La combinaison APC et Dexa améliore le temps de survie de façon synergique. Nos résultats suggèrent que l'APC et les GC devraient être réévalués en association dans le traitement du choc septique / Sepsis remains the major cause of death in intensive care units. International guidelines for management of severe sepsis and septic shock recommend both stress-dose steroid therapy and recombinant activated protein C (APC). The aims of the present study were to compare the effects of APC and dexamethasone (Dexa) alone as well as in combination in resuscitated septic shock on survival, hemodynamics, and vascular reactivity. Sepsis was associated with a decrease in mean arterial pressure, elevation in plasma lactate and nitrite/nitrate concentration. Administration of APC, Dexa, and their combination improve arterial pressure and decrease lactate and nitrite/nitrate concentration. Both APC and Dexa improved arterial contractility and endothelial dysfunction resulting from septic shock in rats. The expression of iNOS was significantly reduced by the administration of Dexa, APC, and combination therapy. All treatments restore the Akt pathway. Moreover, their combination increased the length of survival. These findings suggest that APC and glucocorticoids should be further re-evaluated in combination in septic shock

La conversion de la protéine prion cellulaire PrPC en une isoforme pathologique, la protéine prion scrapie PrPSc, est à l'origine d'un groupe de maladies neurodégénératives, les Encéphalopathies Spongiformes Transmissibles (EST). De nombreux travaux indiquent que la toxicité de la PrPSc implique une déviation de la fonction normale de la PrPC, cependant le rôle physiologique de la protéine prion n’est que partiellement compris. Dans ce travail, nous nous sommes attachés à identifier des voies de signalisation mobilisées par la PrPC qui pourraient à la fois rendre compte du rôle de cette protéine dans le développement du système nerveux et être impliquées dans la pathogénèse des EST. Nous montrons que la protéine prion contrôle l’activité de la voie Notch, une voie de signalisation qui joue un rôle majeur dans le développement mais également dans l’homéostasie du système nerveux central et la plasticité synaptique. Dans des modèles ex vivo et in vivo d’EST, nous mettons en évidence une diminution de l’activité de la voie Notch, ainsi que de l’expression des récepteurs de la famille Eph - connus pour leur implication dans l’activité synaptique. Cette diminution des Eph est retrouvée dans des cellules dépourvues de PrPC. Ainsi, l’observation d’un profil similaire entre la perte d’expression de la PrPC et l’infection par les prions renforce l’idée d’une déviation de la fonction normale de la PrPC par la PrPSc. Des inhibiteurs de l’activité histone désacétylase (HDAC) permettent de rétablir l’expression des acteurs de la voie Notch et des récepteurs Eph aussi bien dans les cellules déplétées en PrPC que dans celles infectées par les prions, suggérant que des mécanismes épigénétiques sont impliqués dans le contrôle transcriptionnel de ces gènes par la protéine prion. Ce travail fournit les bases pour évaluer un effet bénéfique des inhibiteurs de HDAC dans un modèle de souris infectées par les prions et ainsi déterminer si les HDAC pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques pour combattre les EST. / The conversion of the cellular prion protein PrPC into a pathogenic isoform, the scrapie prion protein PrPSc, lies at the root of a group of neurodegenerative disorders known as Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs). Several lines of evidence indicate that PrPSc-mediated toxicity involves a subversion of PrPC normal function, however, our knowledge of PrPC physiological role is still far from complete. In this work, we sought to identify signalling pathways mobilized by PrPC that could accommodate both its role in central nervous system development and its implication in TSE pathogenesis. We show that the prion protein controls the activity of the Notch pathway, which plays an overriding role during embryonic development as well as central nervous system homeostasis and synaptic plasticity. In both ex vivo and in vivo models of TSE, we monitored a decrease in Notch activity, together with reduced expression of Eph receptors, which are key players in synaptic activity. The reduction in Eph is also found in PrPC-depleted cells. Hence, our observation of a similar signature of PrPC depletion and prion infection strengthens the view that PrPSc diverts PrPC function. We found a restoration of Notch and Eph effectors expression in response to histone deacetylase (HDAC) inhibitors, both in PrPC-depleted and prion-infected cells, suggesting that epigenetic mechanisms are involved in the PrP-dependent transcriptional control of these genes. This work provides a foundation for assessing a beneficial effect of HDAC inhibition in prion-infected mice and thereby defining whether HDAC could represent novel therapeutic targets to combat TSEs.

Les légumineuses font parties des familles les plus cultivées à la fois pour l'alimentation humaine et pour l'alimentation animale. Une des maladies principales de la luzerne (Medicago sativa), plante fourragère la plus cultivée au monde, est la verticilliose causée par Verticillium alfalfae, un champignon du sol. Sans traitements phytosanitaires efficaces et pratiques pour les maladies causées par des pathogènes du sol, la protection des cultures passe par la sélection de variétés résistantes. Dans cette thèse, la légumineuse modèle Medicago truncatula a été utilisée afin d'identifier des gènes candidats à la résistance quantitative à Verticillium alfalfae V31-2 (Va V31-2). La première étape de ces travaux a révélé des sources de résistance à la souche Va V31-2 au sein de l'espèce M. truncatula. Pour cela, 261 lignées (dont 246 accessions issues du projet MtHapMap) ont été inoculées et le développement de flétrissements foliaires a été suivi pendant quatre semaines, suivi d'un réisolement du pathogène à partir des parties aériennes. Ces analyses ont révélé une grande biodiversité de réponse à la verticilliose au sein de l'espèce Medicago truncatula, avec une variabilité inter et intra-populations. Dans une seconde partie, des QTL pour la résistance partielle à la verticilliose ont été identifiés par génétique d'association (GWAS) permettant la découverte de nouveaux QTL de résistance à Va V31-2 et la confirmation de la présence d'un QTL majeur sur le chromosome 7 précédemment décrit. Selon les phénotypes de maladie utilisés pour l'étude de GWAS, les QTL détectés sont différents, ce qui suggère des contrôles génétiques différents pour l'évolution des symptômes de maladie et la colonisation des parties aériennes par Va V31-2. Une seconde analyse de GWAS menée sur 90 accessions de la population tunisienne Soliman a révélé des gènes candidats différents de ceux identifiés à partir de la collection MtHapmap, suggérant une possible adaptation locale. La validation fonctionnelle de gènes candidats pour la résistance partielle a été entamée, en privilégiant ceux situés sur le chromosome 7, à la convergence de différentes études génétiques. La mise en place d'un système d'inoculation in vitro de racines transgéniques a permis de révéler le rôle du gène Medtr7g070480 codant pour une protéine SEC14 dans la résistance à Va V31-2. L'extinction de l'expression de ce gène par microARN artificiel dans le génotype A17 (résistant) et F83005.5 (sensible) diminue la colonisation des racines par Va V31-2, alors que sa surexpression augmente la colonisation chez A17 : il s'agirait donc d'un gène de sensibilité. L'unique polymorphisme génétique entraînant une substitution non synonyme entre A17 et F83005.5 explique 18,5% de la variation du niveau de résistance observée au sein des 246 accessions MtHapmap. L'étude de l'expression racinaire du gène MtSEC14 24 heures après inoculation par Va V31-2 dans un panel de 14 accessions sensibles et résistantes n'a pas montré de différences significatives entre ces deux types d'accessions. En parallèle, des gènes orthologues aux gènes candidats à la résistance à V. alfalfae ont été identifiés chez d'autres plantes modèles (Lotus japonicus, Arabidopsis thaliana, Nicotiana sp.), puis la pathogénicité de Va V31-2 a été testée chez ces espèces en vue de leur éventuelle utilisation pour valider le rôle de ces gènes. Un unique orthologue à MtSEC14 a également été identifié chez Medicago sativa. Grâce à la synténie entre M. truncatula et M. sativa, nos travaux pourront très probablement être transférés à la luzerne cultivée. A notre connaissance, ces travaux mettent en évidence pour la première fois le rôle d'un gène de sensibilité dans une résistance partielle à un micro-organisme chez les Légumineuses. / Pathogens, animals and weeds are responsible for losses ranging from 20% to 40% of global agricultural yield. Legumes are the second most grown crops after cereals as human and animal food, and their yield is also affected by pathogens. Verticillium alfalfae is a soil-borne pathogen causing high yield losses in alfalfa fields (Medicago sativa), the most worldwide legume forage crop grown. To date, there is no chemical control and crop breeding is the best way to protect alfalfa against V. alfalfae. However, Medicago sativa has a complex genome (allogamous and tetraploid), therefore in this work the model legume Medicago truncatula (diploid and self-fertile) was used to investigate genetic mechanisms involved in V. alfalfae V31-2 (Va V31-2) resistance. First, several sources of resistance were identified in M. truncatula biodiversity by assessing disease symptoms development in 261 lines from the Mediterranean basin inoculated by V. alfalfae V31-2. Reisolation of V. alfalfae V31-2 in M. truncatula stems was also led. These analyses revealed a great biodiversity of M. truncatula response towards Va V31-2. A genome wide association study (GWAS) on various disease phenotypes pinpointed several quantitative trait loci (QTL): one of them colocalized with a previous major QTL on chromosome 7 detected on LR4 and LR5 RILs populations. Both phenotypic and genetic analyses thus suggest the occurrence of different resistance mechanisms in M. truncatula populations towards V. alfalfae. Resistant candidate genes towards Va V31-2 were also identified by GWAS using 90 accessions of M. truncatula Soliman Tunisian population. These candidate genes are different from the pinpointed candidate gene of our previous GWAS analysis. These results might underline a local adaptation towards Verticillium. Consistencies between GWAS results with previous QTL and transcriptomic data led us to perform the functional validation with the candidate genes localized on chromosome 7. An original in vitro inoculation system of M. truncatula transgenic roots was used to validate Medtr7g070480 (gene encoding a SEC14 protein) as a key player towards V. alfalfae V31.2 in M. truncatula. Silencing the SEC14 gene using artificial microRNA in A17 (resistant) and F83005.5 (susceptible) lines decreases Va V31-2 colonization rate on transgenic roots whereas overexpressing MtSEC14 increases the colonization rate in A17. This MtSEC14 gene appears as a disease susceptibility gene. Moreover, 18.5% of the disease variation in the studied M. truncatula accessions is explained by the unique non-synonymous polymorphism between A17 and F83005.5 in MtSEC14. Root expression patterns of the SEC14 gene one day after inoculation by Va V31-2 was also analyzed in response to inoculation among a panel of 14 susceptible and resistant M. truncatula accessions of diverse geographic origins. No significant differences were found. At the same time, orthologous resistance candidate genes towards Va V31.2 in several other model species (Lotus japonicus, Arabidopsis thaliana, Nicotiana sp.) were discovered. Pathogenicity of Va V31-2 in these species was monitored to use them as potential model for functional validation. Only one orthologous gene of MtSEC14 has been identified in Medicago sativa. Because of a great synteny between M. truncatula and M. sativa, our work could be useful for alfalfa breeding. In this work and for the first time, a susceptibility gene involved in a quantitative resistance against microorganisms in Legumes was identified.

Clostridium difficile est une bactérie entéropathogène responsable de diarrhées nosocomiales post-antibiotiques et de colites pseudomembraneuses. Ces dernières années, l'incidence et la gravité des infections à C. difficile ont significativement augmenté en Amérique et en Europe. Cette évolution semble être liée à l'émergence puis à la dissémination très rapide d'un clone particulièrement virulent de PCR-ribotype 027. Les facteurs de virulence majeurs de C. difficile sont les toxines TcdA et TcdB qui sont responsables des lésions intestinales. Cependant, l’étape de colonisation de l’intestin par la bactérie est considérée comme un pré-requis à l’infection. Afin de mieux comprendre les mécanismes d’hypervirulence de la souche 027, nous nous sommes focalisés sur l’étude du processus de colonisation intestinal de cette souche en le comparant à celui de la souche non épidémique 630∆erm. Dans un premier temps, nous avons étudié le rôle de la protéine de liaison à la fibronectine FbpA. La caractérisation in vitro et in vivo d’un mutant d’inactivation de fbpA, nous a permis de montrer l’implication de cette protéine dans le processus de colonisation de la souche non épidémique 630∆erm. La difficulté à obtenir un mutant dans la souche épidémique 027 R20291 ne nous a pas permis de comparer les propriétés adhésives de FbpA entre les deux souches. Dans un deuxième temps, nous avons étudié les caractéristiques des protéines flagellaires FliC, FliD, FlgE et MotB. Nous avons montré que les flagelles agissent en tant qu’adhésines chez la souche 027 et que ce rôle est moins important chez la souche 630∆erm. Nous avons également montré que les flagelles sont impliqués dans des processus cellulaires autres que l’adhésion et la colonisation. Selon une étude transcriptomique d’un mutant ∆FliC de la souche 027 R20291, il s’est avéré que la flagelline est aussi impliquée dans la production de toxines, la sporulation et dans l’adaptation de la bactérie aux conditions de stress. Une étude complémentaire serait nécessaire afin de mieux comprendre le système de régulation qui régi ces différents processus cellulaires.Finalement, nous avons effectué une analyse transcriptomique de la cinétique de colonisation in vivo de la souche 027. L’étude a révélé l’expression précoce des gènes de toxines et de sporulation au cours du processus d’infection. Elle nous a également permis d’identifier des gènes spécifiques à la souche 027 qui sont exprimés lors du processus infectieux. Ces gènes pourraient éventuellement être impliqués dans la virulence de C. difficile 027 et pourraient constituer de nouvelles pistes d’étude. / Clostridium difficile is an enteropathogenic bacterium that causes post-antibiotic nosocomial diarrhea and pseudomembranous colitis. During the last decade, the incidence and the severity of C. difficile infections have significantly increased in America and Europe. This evolution seems to be related to the emergence and to the rapid dissemination of a particularly virulent clone of PCR-ribotype 027. The main virulence factors of C. difficile are the TcdA and TcdB cytotoxins which are responsible for intestinal lesions. However, the intestinal colonization by the bacterium is considered as an indispensible step for infection.To better understand the hypervirulence mechanisms of strain 027, we focused on the study of intestinal colonization process of this strain compared to the colonization process of the non-epidemic strain 630Δerm. First, we studied the role of the fibronectin binding protein FbpA. In vitro and in vivo characterization of a mutant FbpA showed the involvement of this protein in the colonization process of the non-epidemic strain 630Δerm. The difficulty of obtaining a mutant in the epidemic strain R20291 027 does not allow us to compare the adhesive properties of FbpA between the two strains.In a second step, we studied the characteristics of flagellar proteins FliC, FliD, FlgE and MotB. We showed that the flagella have a role in the adhesion and colonization of strain 027 and that this role is less important in strain 630Δerm. We also showed that flagella are involved in other cellular processes than adhesion and colonization. A transcriptomic study of a FliC mutant in 027 R20291 shows that flagellin is also involved in toxin production, sporulation and in the adaptation of bacteria to stress conditions. Further study should be performed to better understand the regulation system that governs these different cellular processes. Finally, we performed a transcriptomic analysis of the kinetic of in vivo colonization of the 027 R20291 strain. The study revealed a very early expression of toxin and sporulation genes during the first stages of the infection process. This analysis also allowed us to identify some genes, specific to 027 strains, which appeared regulated during the infection process. These genes could be involved in the virulence of C. difficile 027 strains and could provide new issues of study to better understand C. difficile virulence.