Le bactériophage T5 est un virus infectant E. Coli. L’assemblage et la maturation de sa capsidecomportent plusieurs étapes critiques pour la formation des virions lors du cycle infectieux.Parmi ces étapes, j’ai étudié les processus d’expansion et de décoration de la capside de T5.L’expansion implique d’importantes réorganisations conformationnelles des 775 sous-unités de laprotéine pb8 composant la capside, conduisant au doublement du volume de la capside qui peutalors contenir le génome du phage. J’ai déterminé des conditions physico-chimiques permettantd’induire l’expansion de la capside in vitro, puis j’ai effectué des expériences de SAXS résoluesdans le temps montrant que l’expansion est un processus hautement coopératif, qui conduit, en uneétape, à un état final remarquablement stable. D’autre part, j’ai réalisé une étude fonctionnelle de laprotéine de décoration pb10, montrant que sa fixation est un marqueur de l’expansion. Enfin l'étudestructurale de pb10 menée par SAXS a permis de déterminer un modèle à basse résolution de sonenveloppe moléculaire. / Bacteriophage T5 is a virus infecting E. Coli. Its capsid assembly and maturation include severalcritical steps leading to the formation of new virions during the infectious cycle.During my thesis I focused on the expansion and decoration of T5 capsid. Expansion consists inlarge conformationnal reorganizations of the 775 capsid protein subunits, yielding a two-foldincrease of the capsid volume and allowing it to accomodate the full-length genome. I haveascertained physicochemical conditions that trigger in vitro expansion of the capsid, and using atime-resolved SAXS study, I showed that expansion is a higly cooperative two-state process leadingto a remarkably stable final state. I have also carried out a functional study of the decoration proteinpb10, showing that it only binds to expanded proheads. Finally, a low resolution model of pb10 wasdetermined by SAXS.

Le virus respiratoire syncytial (VRS) est le principal agent responsable desbronchopneumonies du jeune veau et des bronchiolites du nourrisson. Il n’existe pas devaccin ni d’antiviraux spécifiques pour l’homme. La réplication du génome et la transcriptiondes gènes viraux sont assurées par un ensemble de protéines virales constituant le complexeARN polymérase ARN-dépendant : la nucléoprotéine N, la phosphoprotéine P, le facteur detranscription M2-1 et la grosse sous-unité L. L’objectif principal de ma thèse était d’obtenirde nouvelles données structurales et fonctionnelles sur le complexe ARN-polymérase ARNdépendante(RdRp) du VRS, en particulier sur le couple P-L. Pour ceci j’ai tout d’aborddéveloppé un protocole de production et purification de la protéine L sous formerecombinante en cellules d’insecte. Ceci m’a permis ensuite de cartographier le sited’interaction de P avec L. J’ai ainsi mis en évidence que la protéine L interagit avec la partieC-terminale de la protéine P, au-niveau des résidus 216 à 239. Les données obtenuessuggèrent que ce domaine peut former un nouvel élément de reconnaissance moléculaire(« MoRE ») se structurant en hélice alpha lors de l’interaction avec la protéine L. De plus, lacartographie de ce domaine d’interaction m’a permis d’identifier entre les résidus 164 et 205de P une nouvelle région impliquée dans le recrutement de la protéine L aux corpsd’inclusions viraux. Ces nouvelles données ouvrent la voie à de nouvelles études structuralesde l’ARN-polymérase du VRS et nous permettent d’envisager de nouvelles stratégiesantivirales ciblant ce complexe. / Respiratory syncytial virus (RSV) is the leading cause of calves bronchopneumonia andinfants bronchiolitis. Neither vaccine nor antiviral treatments are currently available for use inhumans. Viral genome is replicated and transcribed by a set of viral proteins constituting theviral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) complex: the nucleoprotein (N), thephosphoprotein (P), the transcription factor (M2-1) and the large subunit (L). This workaimed to unveil new structural and functional data regarding the viral RdRp, especially the PLcouple. With this aim in view, I have first conceived a protocol to produce and purifyrecombinant L and P proteins expressed in insect cells. This tool enabled the fine mappingand characterization of the L binding domain of the RSV phosphoprotein. This highlightedthe interaction between the L protein and the C-terminal region of the P protein, especiallyresidues 216 to 239. Further data suggests that this area constitutes an alpha helix formingmolecular recognition element (« MoRE ») during P-L interaction. Furthermore, this studyunveiled a new region of the P protein encompassing residues 164 to 205, involved in therecruitment of L protein to viral inclusion bodies. These new results open the way toupcoming structural studies of RSV RdRp and allow us to define a new target for thedevelopment of antiviral drugs against RSV.

L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique prometteuse largement répandue dans les milieux hospitaliers. Elle est non invasive, présente une bonne résolution spatiale et permet de visualiser en profondeur dans un organisme vivant. Elle possède cependant quelques défauts, dont sa faible sensibilité. Pour palier ce problème, il est possible d'utiliser des espèces hyperpolarisables telles que le xénon. Cependant, n’étant spécifique d’aucun récepteur biologique, le xénon nécessite d’être vectorisé. Pour ce faire, des auteurs ont proposé son encapsulation dans une cage moléculaire capable de reconnaître la cible biologique à imager. Les meilleurs candidats à ce jour sont les cryptophanes.Nous nous sommes fixés comme objectif dans cette thèse de concevoir et de synthétiser de nouvelles cages plus adaptées pour les applications en IRM 129Xe ainsi que des biosondes pertinentes pour se rapprocher d’applications in vivo. Dans une première partie de ma thèse, nous nous sommes intéressés au développement de nouvelles cages afin d’étudier et d’affiner les propriétés d’encapsulation du xénon au sein des cryptophanes. Dans les parties suivantes, nous nous sommes concentrés sur la conception de biosondes par fonctionnalisation de cryptophanes déjà décrits pour diverses applications d’intérêt biologique. D’une part, nous avons évalué la possibilité de détecter des métaux de manière plus spécifique et plus sensible grâce à l’IRM xénon hyperpolarisé. D’autre part, nous avons travaillé sur la conception de biosondes bimodales, afin de coupler des techniques complémentaires d’imagerie médicale. / Today, Magnetic Resonance Imaging (MRI) is a powerful clinically used imaging method which provides three-dimensional images with excellent resolution. However, conventional molecular MRI techniques that rely on the observation of water protons still suffer from reduced sensitivity and often lack selectivity. The use of hyperpolarized xenon can improve both the selectivity and sensitivity of the MRI method. As xenon has no specificity for any biological receptor, it needs to be vectorized. For this purpose, authors have proposed to encapsulate xenon inside molecular cages functionalized to recognize specific biological targets. The best candidates so far as biosensors are cryptophanes.The aim of this work is to design and synthesize new cryptophanes that are better suited for 129Xe MRI applications and relevant biosensors for future in vivo applications. In a first part, new cages were developed in order to study the encapsulation properties of xenon inside different cryptophanes. Then, biosensors were synthesized by functionnalization of known water-soluble cryptophanes for different applications of biological interest. We have therefore assessed the possibility of detecting metal ions specifically in a very sensitive way thanks to 129Xe MRI. New bimodal sensors were also designed and tested.

Ma thèse comporte deux volets: d’une part, le développement de ligands ciblant les protéines antiapoptotiques et d’autre part, l’étude par RMN des protéines CGC impliquées dans la biosynthèse de la congocidine, métabolite secondaire chez Streptomyces.La famille de protéines Bcl-2 est impliquée dans un des processus clé de la mort cellulaire programmée, appelée l’apoptose mitochondriale. Elle se divise en membres anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1) et pro-apoptotiques (Bak, Bax et les «BH3»).Ces molécules vont réguler l’apoptose en maintenant ou non l’intégrité de la membrane mitochondriale. En réponse à un signal de stress, les «BH3» neutralisent les antiapoptotiques et activent les pro-morts, leur permettant de former des pores sur la membrane mitochondriale. Ce phénomène aboutit au relargage du cytochrome c dans le cytosol et à l’activation de la cascade des caspases dont la finalité est la destruction de la celluleLa pertinence de l’étude des Bcl-2 s’observe de manière croissante depuis les années 1990. En effet, une surexpression des membres pro-survie de cette famille (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, BFL1 etc...) a été observée dans de nombreux cancers. Suite à ce constat, cibler ces molécules est devenue une piste prometteuse en cancérologie par le développement d’inhibiteurs des protéines pro-survie, l’objectif étant de restaurer l’apoptose dans les cellules tumorales.Dans cette perspective, différentes stratégies thérapeutiques ont été imaginées:(i) la thérapie génique avec l’Oblimersen, un ADN antisens développé par Genta, qui inhibe l’expression de la Bcl-2. Néanmoins, les résultats précliniques sont décevants.(ii) l’utilisation de peptides (ou peptidomimétiques) imitant les sentinelles «BH3» comme antagonistes de l’interaction Bcl-xL/Bak. Il faut souligner le concept des «stappled peptides», permettant la stabilisation des hélices par cyclisation des chaînes latérales. Si certaines de ces molécules synthétisées semblent très actives, aucune n’est encore en étude clinique.(iii) le développement de petites molécules non peptidiques, issues d’un criblage systématique in vitro ou in silico et se caractérisant par une grande variété structurale. Parmi ces molécules, certaines sont synthétiques comme l’ABT-737 et l’ABT-263 élaborés par les laboratoires Abbott, grâce à la méthode d’assemblage des fragments (fragment-based drug design) aidée par des études SAR by NMR (structure activity relationship). D’autres sont issues de produits naturels comme le (R)-Gossypol, le TW-37, la sanguinarine ou l’Obatoclax. En 2008, 11 composés étaient en phase préclinique ou clinique et les résultats pour certains d’entres eux semblaient plus prometteurs que pour l’Oblimersen.Ces stratégies ont permis de mettre au point un certain nombre de composés ciblant les protéines anti-apoptototiques. Si certains de ces composés sont actuellement en phase de tests cliniques, les plus prometteurs (ABT) ont démontré une efficacité uniquement vers certains des protéines anti-apoptotiques laissant place à un phénomène d’échappement des cellules cancéreuses.Un criblage réalisé à l’ICSN par l’équipe de F. Guéritte (Pôle Substances Naturelles Plantes) a permis d’identifier une nouvelle classe de molécules ayant une affinité de l’ordre du μM pour Bcl-xL. Parmi ces composés, deux présentent une attractivité d’un point de vue structural qui rend faisable leur synthèse chimique:(i) la meiogynine A, un sesquiterpène dimère de structure originale isolé des écorces de Meiogyne cylindrocarpa, une plante de Malaisie.(ii) le drimane, un sesquiterpène isolé en grandes quantités du genre zygogynum, une espècede Nouvelle-Calédonie.Ainsi, des collaborations ont été établies au sein de l’ICSN, réunissant diverses expertises (chimie, biologie, physicochimie et modélisation) afin de dégager les synergies souhaitables.Dans la perspective de la conception rationnelle d’analogues aux propriétés améliorées ciblant l’ensemble des membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, ma contribution est de choisir les cibles biologiques (Bcl-xL et Mcl-1), de les obtenir pures et marquées en isotopes stables afin de réaliser par RMN et modélisation moléculaire une étude structurale des complexes protéines/ligands et de définir un modèle d’interaction.Le deuxième volet de ma thèse, à dominante fondamentale, a pour objectif de caractériser par RMN les médiateurs enzymatiques d’une voie de biosynthèse d’un métabolite secondaire, la congocidine issue des bactéries Streptomyces Ambofaciens.La congocidine présente des propriétés antivirales et anticancéreuses de par sa capacité à se fixer à l’ADN. Cependant, du fait de sa forte toxicité, cette molécule ne peut pas être utilisée directement à des fins thérapeutiques.L’analyse des groupes de gènes impliqués dans la biosynthèse de la congocidine a mis en évidence 24 gènes. Seuls certains intermédiaires réactionnels ont été identifiés. Cependant, le rôle précis des produits de ces gènes n’est pas encore bien défini.Ainsi, en collaboration avec l’équipe de JL Pernodet à l’Université d’Orsay, nous nous sommes intéressés à deux enzymes en particulier intervenant dans la synthèse de la congocidine, les protéines CGC-10 et CGC-19.L’objectif de cette collaboration est d’utiliser la spectroscopie RMN couplée à la modélisation moléculaire sous contraintes expérimentales afin de déterminer la structure de ces deux protéines. Nous souhaitons apporter des informations sur l’éventuelle présence de motifs structuraux au sein de ces protéines afin de mieux comprendre leur fonction et de définir à quel moment de la voie de biosynthèse elles interviennent.Concernant la protéine CGC-10, nous avons conçu un plasmide optimisé que nous avons fait synthétiser. Le gène obtenu a été cloné dans un vecteur d’expression choisi par nos collaborateurs (pQE30).Concernant la protéine CGC-19, nous allons en décrire les étapes d’expression et de purification qui nous ont permis d’enregistrer l’ensemble des expériences 3D-triple résonnance nécessaires à la détermination de la structure de la protéine. De plus, il a été mis en évidence la présence d’une modification post-traductionnelle de type phosphopanthéténylation au sein de cette protéine. Nous avons produit l’enzyme responsable de cette modification, la sfp, afin de pouvoir effectuer la réaction et suivre l’effet de la modification sur les spectres RMN de la protéine et donc sur la structure.Ce projet, qui s’inscrit dans une perspective de recherche à plus long terme, a pour objectif de caractériser précisément le mécanisme de production de la congocidine. A travers cette démarche, il s’agit de combiner la biologie moléculaire (modification en amont les gènes) à la chimie afin d’obtenir des molécules différentes aux propriétés améliorées et non toxiques. / My PhD thesis contains two parts: development of ligands against anti-apoptotic proteins and structural study of CGC proteins involved in the biosynthesis of congocidine, a Streptomyces Ambofaciens secondary metabolite.The first project concerns the NMR study of the interactions between the anti-apoptotic proteins and two potential ligand candidates, the Meiogynine and the Drimane. These two terpenoïds, identified from ICSN’s chemical library screening against the Bcl-xL protein, have shown a significant inhibiting activity, thus opening promising perspectives for the treatment of cancer cells overexpressing anti-apoptotic proteins. In fact, as these compounds are considerably smaller than the binding site, our objective is to introduce modifications (such as elongation of their structure, functionalization with hydrophilic groups etc.) that may improve their binding properties as well as their delivery and bioavailability.Following to the successful recombinant expression and purification, necessary to obtain labelled targets (15N/13C), our preliminary NMR studies suggested a rather universal action of our candidates, capable to bind not only to Bcl-xL but also to the other major anti-apoptotic protein, Mcl-1. Titration experiments revealed significant perturbations of the HSQC protein NMR spectra with the progressive disappearance of several protein HN and ligand signals, confirming dissociation constants at the µM region for both targets. However, the intermediate chemical exchange NMR regime observed, associated with the weak ligand solubility, poses severe difficulties for the structural elucidation of the complexes by classical NMR methods.In this work alternative approaches for the localisation of the ligands in the hydrophobic cleft of both target proteins will be presented.Oligopyrroles are secondary metabolites synthesized by Streptomyces bacteria. This family of natural products, composed by one or more pyrrole-2-carboxamide groups is characterized by a variety of biological activities such as antiviral, antitumor and antibiotic functions.One of the best-known metabolites is the congocidine, extensively studied due to its capacity to bind into the minor groove of the DNA double helix, with strong sequence specificity. However, because of its strong toxicity, this molecule cannot be directly used for therapeutic purposes.The analysis of the groups of genes involved in congocidine biosynthesis brought to light 24 genes, but their precise role is not yet well defined. We were particularly interested in two enzymes: the proteins called CGC-10 and CGC-19. For the recombinant expression of the first one, we designed an optimized insert which was cloned in an expression vector pQE30.Concerning CGC-19, the stages of expression and purification, which allowed us to obtain doubly-labeled protein, as well as the 3D NMR experiments for spectral assignment and structure elucidation, will be discussed.Furthermore, we were interested in the holo- state of this protein obtained through a post-traductional modification (phosphopanthéténylation). To this, we produced the enzyme responsible for this modification, Sfp, carry out the reaction in vitro and follow the effect of the modification at the NMR spectra.

La maladie d’Alzheimer, de nombreux syndromes parkinsoniens, certaines démences fronto-temporales telle que la maladie de Pick sont des exemples de maladies neurodégénératives appelées « tauopathies » qui sont caractérisées par la présence d’agrégats intracellulaires de protéines Tau dans le cerveau des sujets atteints. La formation de tels agrégats résulterait de l’altération des propriétés et fonctions normales des protéines Tau à réguler et structurer les réseaux de microtubules au sein des axones ; ce qui se traduit par une perte progressive de la masse des microtubules dans les axones, la désorganisation du transport axonal et au final la mort cellulaire. La compréhension des tauopathies passe donc par celle :- de la dynamique des microtubules qui est régie par les mécanismes de l’instabilité dynamique au cours desquels les microtubules alternent en permanence entre une phase de croissance (polymérisation des GTP-tubulines) et de rétrécissement (dissociation des GDP-tubulines);- et des interactions entre protéines Tau – microtubule qui jouent un rôle important dans la polymérisation, la stabilisation des microtubules et l’organisation spatiale du réseau de microtubules dans l’axone.L'objectif de ce travail de thèse est de construire et de consolider les bases qui permettront d'aller vers une modélisation fine de l'interaction des microtubules dynamiques avec une population de protéines Tau. Pour y parvenir, deux problèmes ont été abordés : (i) la dynamique intrinsèque des microtubules, c'est-à-dire en l'absence de protéines Tau et (ii) l'interaction Tau-Microtubule pour des microtubules stabilisés, c'est-à-dire non-dynamiques.Afin d’aborder ces problèmes, le travail de cette thèse a été mené selon deux approches :-Théorique : développements de modèles mathématiques décrivant les différents processus-Simulations numériques : développement de programmes Monte-Carlo (sous Matlab)Les résultats principaux ont été organisés et structurés en deux grandes parties :Développement d’un modèle mésoscopique décrivant l’instabilité dynamique des microtubules à l’échelle de la tubuline (unité fondamentale du microtubule). Ce modèle décrit une instabilité dynamique des microtubules non-Markoviènne dont les caractéristiques sont comparables aux observations expérimentales.2) Développement d’un modèle décrivant la dynamique de décoration d’un microtubule stabilisé (absence d’instabilité dynamique) par une population de protéines Tau. Les caractéristiques de ce modèle sont basées, pour la construction, et comparables aux expériences de cosedimentation et de microscopie électronique. / Alzheimer’s disease, some frontotemporal dementias such as the Pick’s disease are examples of neurodegenerative diseases called "Tauopathies" which are characterized by the presence of intracellular aggregates of Tau-proteins in the brain of patients. The formation of such aggregates would result from the loss of the normal functions of the Tau-proteins to properly organize the microtubule network within the axon ; which leads to a progressive loss of microtubule’s mass within the axons, the disorganization of the axonal transport and at the end, the cell death. To understand the Tauopathies, we have to understand :- the dynamic of microtubules which is controlled by the mechanisms of the dynamic instability in which microtubules switch between a phase of growth (polymerization of GTP) and a phase of shrinkage (dissociation of GDP)- the interaction between Tau-proteins and microtubules which play an important role in the polymerization, stabilization and spatial organization of microtubules within the axonal network.The objective of this work is to build and consolidate the blocks in order to go to precise modeling of the interaction of microtubules with a dynamic population of Tau-proteins. To this purpose, two problems were considered : (i) the intrinsic dynamic of microtubules (i.e., in absence of Tau-proteins) and (ii) the interaction between Tau-proteins and a stabilized-microtubules (i.e., in absence of dynamic instability)In order to this, the work has been done according to two approaches :- Theoretical : development of mathematical models describing the different process.- Simulation : development of Monte-Carlo programs (under Matlab)The main results have been organized in two main parts :1) Development of a mesoscopic model describing the dynamic instability of microtubules at the scale of the tubulin. This model describes the non-Markovian dynamic of microtubules and the characteristics are compatible with the experimental observations.2) Development of a model describing the dynamical decoration of a microtubule by a population of Tau-proteins. The characteristics of the model are based, for the construction, and compatible with the experimental observations.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le récepteur MerTK est impliqué dans la phagocytose des segments externes des photorécepteurs (SEP) par l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR), fonction cruciale pour la survie des photorécepteurs et la vision. Dans la rétine, ces deux tissus sont en contact permanent et la phagocytose ne survient qu'une fois par jour, cette fonction nécessite donc d'être contrôlée précisément. Le pic de phagocytose est lié à l'activation intracellulaire de MerTK via l'intégrine αvβ5. Ce projet a eu pour but d'étudier les mécanismes extracellulaires régulant la fonction de MerTK au cours de cette phagocytose.Nous avons montré que MerTK est clivé à la surface des cellules d'EPR in vivo avant et après le pic de phagocytose. Ceci permettrait d'éviter une phagocytose trop prononcée des SEP.Nous avons démontré le rôle opposé des ligands de MerTK, spécifique à l'EPR. Gas6 semble inhibiteur, il stimule le clivage de MerTK et inhibe la phagocytose in vitro, et son expression in vivo est faible au moment du pic de phagocytose. Au contraire, Protéine S, dont l'expression augmente in vivo au moment du pic, inhibe le clivage de MerTK et stimule la phagocytose in vitro, et pourrait ainsi potentialiser cette fonction.Parmi les protéases étudiées, l'inhibition d'ADAM17 in vitro engendre une diminution du clivage de MerTK corrélée à une augmentation de sa biodisponibilité à la surface cellulaire et de son activité. Cependant, cet effet n'étant pas total, l'implication d'une autre protéase n'est pas exclue.Ainsi, mes travaux de Doctorat permettent de mieux comprendre la régulation complexe de l'activité de MerTK dans la phagocytose rétinienne, essentielle pour le rythme circadien de cette fonction. / The MerTK receptor is involved in the daily phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS) by the retinal pigment epithelium (RPE), an indispensable process for photoreceptors survival and vision. In the retina, the contact between POS and RPE is permanent, and POS phagocytosis occurs once a day, requiring a precise control of this function. The phagocytic peak is initiated by activation of MerTK via the αvβ5 integrin receptor. This project aimed at studying extracellular mechanisms that control MerTK function during POS phagocytosis. We have shown that MerTK can be cleaved from the RPE cell surface in vivo before and just after the phagocytic peak. This process might avoid an excess of POS phagocytosis. We have also shown the opposite role of MerTK ligands, specific to RPE cells. Gas6 appears to act as an inhibitor as it stimulates MerTK cleavage and inhibits POS phagocytosis in vitro. Moreover, in vivo, Gas6 expression is weak at peak phagocytosis time. In contrast, Protein S, which in vivo expression increases at the time of the phagocytic peak, inhibits MerTK cleavage and stimulates POS phagocytosis in vitro, and thus might potentiate phagocytosis. Among the protease candidates we studied, in vitro inhibition of ADAM17 results in decreased MerTK cleavage associated with the increase of full-length receptors available at cell surface and of MerTK activation. However, as cleavage still occurs in these conditions, we cannot exclude the implication of another protease. Taken together, my PhD data allows us to better understand the complex regulation of MerTK activity during retinal phagocytosis, which is essential for the circadian rhythm of this function.

Tau est une protéine stabilisatrice des microtubules majoritairement exprimée au niveau neuronal qui existe en six isoformes différentes appelées isoformes 3R ou 4R en fonction de l’inclusion de 3 ou 4 séquences répétées dans leur domaine de liaison aux microtubules. Dans une vingtaine de pathologies neurodégénératives appelées tauopathies, des protéines Tau anormalement modifiées s’agrègent formant des lésions intracellulaires appelées dégénérescence neurofibrillaire (DNF). Selon les tauopathies, la morphologie des lésions, leur composition en isoformes ainsi que l’évolution spatio-temporelle de la pathologie diffèrent. Dans la plupart des cas, les tauopathies sont sporadiques mais quelques mutations du gène codant Tau (MAPT) causent des formes familiales de démences fronto-temporales. Dans certaines tauopathies sporadiques comme la maladie d’Alzheimer, la DNF est initiée dans des régions spécifiques et évolue ensuite de manière stéréotypée. Ces stades neuropathologiques sont bien définis, mais les mécanismes expliquant cette évolution restent méconnus. Récemment, certaines études ont proposé que des espèces pathologiques de la protéine Tau sont capables de se déplacer activement de région en région suivant des connections neuro-anatomiques propageant ainsi la pathologie Tau dans le cerveau.Dans ce contexte, nous avons démontré à la fois in vitro, en utilisant un système de chambre microfluidique mais également in vivo dans un nouveau modèle de rat, que la protéine Tau est activement et physiologiquement transférée de cellule en cellule. De manière intéressante, la pathologie Tau qui se développe dans l’hippocampe des rats se propage également de région en région. Ce modèle étant basé sur une technologie de vectorisation virale, nous avons pu tester différentes constructions pour montrer qu’étonnamment, la pathologie Tau induite par des espèces mutées ou des isoformes 3R est restreinte autour du site d’initiation et ne propage pas aussi loin que pour les espèces sauvages 4R. La protéine Tau ainsi que la DNF se propagent donc de cellules en cellules mais les mécanismes expliquant cette propagation restent inconnus. Pour aborder cette question, et connaissant l’importance des vésicules extracellulaires (EVs) dans les mécanismes de communication intercellulaire, nous avons analysé leur implication dans le transfert de la protéine Tau. Nous avons purifié des EVs in vitro depuis des surnageants de culture mais également in vivo depuis des échantillons de liquide céphalorachidien de primates ainsi que des échantillons de fluide interstitiel cérébral de rat. Nous avons ainsi démontré que la protéine Tau est sécrétée de manière physiologique sous forme libre mais également au sein de EVs issues du bourgeonnement de la membrane plasmique nommées ectosomes. Il apparaît aussi qu’en cas de surexpression ou de présence de DNF, la protéine Tau est retrouvée dans des exosomes, des EVs issues de la voie endosomes/lysosomes.Ces résultats nous montrent que la protéine Tau se propage de neurone en neurone physiologiquement mais aussi durant des processus pathologiques. Il semble aussi exister des espèces particulières de protéine Tau plus promptes à se propager que d’autres. Ces différences pourraient en partie expliquer les différents phénotypes observés au sein des tauopathies. Nous avons aussi démontré que la protéine Tau est sécrétée via plusieurs voies de sécrétions qui pourraient refléter différents stades physiopathologiques. Des études complémentaires sont nécessaires notamment pour 1-clairement identifier les mécanismes de sortie et d’entrée de Tau dans les neurones. 2-comprendre si certaines espèces vont spécifiquement induire la pathologie dans les neurones secondaires et s’il est possible de les bloquer grâce à des thérapies ciblées. Et 3-identifier les raisons qui expliquent les vulnérabilités de certaines populations cellulaires. / Tau is a microtubule-associated protein mainly expressed in neurons. There are six different isoforms of this protein bearing either 3 or 4 microtubule-binding domains and called 3R-Tau or 4R-Tau. During the course of tauopathies, Tau proteins are abnormally modified and aggregate in specific intracellular lesions called neurofibrillary degeneration (NFD). According to tauopathies, the morphology of lesions, their isoforms’ composition and the spatiotemporal evolution of the pathology are different. Moreover, tauopathies are mostly sporadic but some mutations on Tau gene (MAPT) induce rare forms of familial fronto-temporal dementia. In some sporadic tauopathies like Alzheimer’s disease, the NFD is initiated in specific brain areas and evolves stereotypically in well-defined neuropathological stages. The mechanisms underlying such evolutions are mainly unknown but recently, different studies had proposed that some pathological species of Tau protein are able to actively move from region-to-region following neuro-anatomical connections and to spread the Tau pathology intra-cerebrally by this way.Within this context, we have demonstrated either in vitro using a microfluidic chamber system or in vivo using a new rat model, that Tau proteins are actively and physiologically transferred from cell-to-cell. Interestingly, in this model we could also follow the development of the Tau pathology inside the rats’ hippocampus but also its propagation from region-to-region. This model is based on a viral vector technology; therefore, we were able to test different construct and to show that surprisingly, Tau pathology induced by mutated or 3R-Tau species is restricted to the vicinity of the initiation site and do not propagate as far as the wild-type 4R-Tau species.Tau proteins as well as NFD are cell-to-cell propagating but the mechanisms underlying this phenomenon are still unknown. In order to address this point and knowing the significance of extracellular vesicles (EVs) in the intercellular communication mechanisms, we analysed their implication in the transfer of Tau proteins. We purified EVs in vitro from culture supernatants but also in vivo from primates’ cerebrospinal fluid samples and rats’ cerebral interstitial fluid samples. We demonstrated that Tau proteins are secreted physiologically in a free form but also within specific EVs named ectosomes and coming from a budding of the plasma membrane. Also, it seems that when Tau is overexpressed and when NFD is present, Tau proteins are retrieved within EVs named exosomes and derived from the endosomes/lysosomes pathway.These results clearly show that Tau proteins are propagating from neuron to neuron physiologically but also during pathological processes. It seems also that some specific Tau species are more prone to propagate than others. These differences could partly contribute to the different phenotypes observed among tauopathies. We have also demonstrated that Tau proteins are secreted via several pathways of secretion that could reflect different pathophysiological stages. Some complementary studies are needed particularly to 1- clearly identify the cellular mechanisms of Tau exit and entry. 2- to understand if some Tau species will specifically induce Tau pathology in secondary neurons and if it is possible to block this phenomenon thanks to targeted therapy. And 3- to identify the reasons that explain the vulnerability of some specific cell populations to Tau pathology propagation.

La leucémie à tricholeucocytes (ou HCL pour Hairy Cell Leukemia) est un syndrôme lymphoprolifératif B rare du sujet âgé, caractérisé par une infiltration médullaire et splénique de cellules présentant des protrusions cytoplasmiques. Des thérapies de première ligne efficaces existent contre ce cancer et l’intérêt de la recherche biomédicale dans ce domaine réside désormais dans le développement de nouvelles molécules actives contre les cellules leucémiques réfractaires aux traitements de référence. Parmi les voies de signalisation dérégulées dans l’HCL, celle des Rho-GTPases influe sur les phénomènes de croissance cellulaire et d’organisation du cytosquelette d’actine, perturbés dans les tricholeucocytes. Les travaux précédemment menés au laboratoire ont montré la sous-expression dans l’HCL d’une Rho-GTPase atypique, RhoH, dont l’expression ectopique dans un modèle cellulaire d’HCL atténue la progression tumorale. Afin de déterminer les cibles moléculaires de RhoH dans cette leucémie, une étude transcriptomique a été réalisée et a montré la sous-expression du marqueur de surface CD38 lorsque RhoH est surexprimée.Plus qu’un marqueur de différenciation lymphocytaire, CD38 est une molécule à effets pléïotropiques (à la fois récepteur, enzyme et protéine d’adhérence cellulaire), importante dans le développement des lymphocytes B. CD38 a également été décrit comme un marqueur délétère dans la leucémie lymphoïde chronique et représente une cible thérapeutique dans le myélome multiple. Bien qu’exprimé par un tiers des patients porteurs de l’HCL, son rôle dans cette leucémie restait jusqu’alors inconnu.Les travaux présentés dans cette thèse décrivent, d’une part, l’étude de la régulation du gène CD38 par RhoH dans l’HCL, et d’autre part, l’impact de la protéine CD38 dans la progression de cette leucémie. Des données préliminaires sur l’activité de fragments de promoteur du gène CD38 semblent indiquer un rôle du facteur de transcription Smad1 dans la régulation de ce gène par RhoH. Grâce à une technique de genome editing, nous avons produit deux lignées cellulaires HCL knock out pour le gène CD38. Ces modèles nous ont permis de déterminer que CD38 promeut la survie ainsi que l’adhésion à l’endothélium des cellules HCL, et modifie également leurs propriétés migratoires in vitro. Nous avons également observé que CD38 favorisait la progression tumorale dans un modèle murin de xénogreffe de ces lignées cellulaires. Enfin, des données produites par nos collaborateurs ont montré que CD38 est un marqueur de mauvais pronostic pour la rechute des patients atteints d’HCL et qu’il constitue une cible thérapeutique potentielle pour les 30% de patients qui l’expriment.Mimer l’effet de RhoH dans l’HCL à des fins thérapeutiques s’avèrerait délicat. Le ciblage de CD38 semble donc une alternative de choix. En effet, la sous-expression de RhoH dans l’HCL favorise l’expression de cette protéine, dont l’effet est délétère pour les patients puisqu’elle participe à la progression de la leucémie. Les anticorps monoclonaux thérapeutiques dirigés contre CD38 étant déjà utilisés en clinique pour traiter d’autres leucémies, ce travail ouvre la voie à l’extension de leur utilisation dans le traitement de l’HCL réfractaire, pour les patients qui l’expriment. / Hairy Cell Leukemia (HCL) is a B-lymphoproliferative disorder of the elderly, which is characterized by medullar and splenic homing of “hairy” cells bearing cytoplasmic protrusions. Efficient first-line therapies against this cancer do exist and the real challenge in biomedical research is now to develop new molecules targeting leukemic cells which are resistant to these first-line treatments. Among some deregulated signaling pathways that have been described in HCL, Rho-GTPases are noteworthy, mediating proliferation and reorganization of actin cytoskeleton, being both disrupted in hairy cells. Former works from our laboratory have shown the underexpression in HCL cells of an atypical Rho-GTPase called RhoH, which reconstitution decreased malignant progression in both in vitro and in vivo models of HCL. In order to determine the molecular targets of RhoH, a microarray study was performed that showed underexpression of the cell surface marker CD38 while RhoH is overexpressed.Not only a differentiation marker of lymphocytes, CD38 is a pleiotropic molecule (being at the same time a receptor, an enzyme and an adhesion protein), which is important in B-cell development. It is also known as a bad prognosis marker in chronic lymphocytic leukemia and a therapeutic target in multiple myeloma. Its role in Hairy Cell Leukemia has not been studied yet, despite its expression in one third of HCL patients.The work presented in this thesis deals with, on the one hand, the study of the regulation of CD38 gene by RhoH in HCL, on the other hand, the impact of CD38 protein on HCL progression. Preliminary data seem to indicate a potential role of Smad1 transcription factor in this mechanism of regulation of CD38 by RhoH. Thanks to genome editing technology, we produced two HCL cell lines knock out for the CD38 gene. These models allowed us to prove that CD38 enhances hairy cells survival and adhesion to endothelium, and modulates their migratory features in vitro. We also showed that CD38 promotes disease progression in vivo in an HCL xenograft mouse model. Finally, data from our collaborators indicated that CD38 is a bad prognosis marker for HCL relapses and could be a potential therapeutic target.Mimicking RhoH effects for therapeutic purposes would be somewhat tricky. Targeting CD38 seems an interesting alternative, as RhoH underexpression favours CD38 expression, which is deleterious for patients by enhancing malignant progression. As therapeutic monoclonal antibodies targeting CD38 are already used in clinics to treat other leukemias, this work brings the evidence of their potential usefulness against refractory HCL cases expressing this marker.