Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Le potentiel des plantes pour la production hétérologue de protéines recombinantes est maintenant bien établi, mais des problèmes de stabilité et de modifications post-traductionnelles inadéquates des protéines persistent et nuisent au développement des plateformes végétales. Bien que les plantes aient la capacité d'effectuer la plupart des modifications post-traductionnelles nécessaires aux propriétés biologiques des protéines produites, il existe des différences subtiles mais significatives entre les modifications post-traductionnelles des protéines chez les mammifères et les plantes. Ces différences peuvent affecter les propriétés biologiques des protéines recombinantes végétales et entraver leur valeur commerciale. Parmi ces modifications, la N-glycosylation et la maturation protéolytique sont celles qui affectent le plus souvent les rendements et la qualité des produits recombinants. Afin d'étudier le potentiel des plantes à produire des glycoproteines complexes, nous avons exprimé en culture cellulaire de tabac Nicotiana tabacum cv BY-2 l'inhibiteur de protéases alpha 1-antichymotrypsine (AACT) humaine, une glycopotéine d'intérêt clinique. La protéine a été adressée vers le compartiment endomembranaire de sécrétion (RE, vacuole et apoplasme) ou exprimée directement dans le cytosol afin d'établir l'impact de la localisation cellulaire sur sa stabilité et sa glycosylation. Nos études ont montré que, bien qu'exprimé dans tous les compartiments cellulaires, le produit obtenu était plus hétérogène au sein du système endomembranaire, probablement en raison d'une maturation de la N-glycosylation et à une maturation protéolytique indue. Inversement, la protéine recombinante exprimée dans le cytosol, sous forme non glycosylée, montrait une plus grande stabilité. Des études d'immunolocalisation ont par ailleurs démontré que cette forme de l'AACT exprimée dans le cytosol montrait une double localisation nucléaire et cytoplasmique. L'AACT possède un site de liaison à l'ADN et une mutation de ce site a permis ici d'inhiber cette interaction et d'altérer en partie la localisation nucléaire. Ces derniers résultats suggèrent que la liaison à l'ADN est impliquée dans la rétention nucléaire de l'AACT. / Plants represent interesting production platforms for recombinant proteins of therapeutical value. While the proof of concept for protein production in plants is no longer a matter of debate, protein stability and post-translational modifications essential for biological activity pose, on the other hand, serious challenges to the development of plant factories. Plant cells can perform most protein post-translational modifications, but plant and mammalian proteins often present minor but significant differences, with a possible negative impact on their commercial value. To assess the potential of plants for the production of structurallycomplex mammalian proteins, we expressed human alphal-antichymotrypsin (AACT), a glycosylated serine protease inhibitor, in cultured BY-2 tobacco cells. The inhibitor was targeted to different subcellular compartments to assess the impact of cellular final destination on accumulation, stability and glycosylation of the resulting variants. Our results showed that AACT entering the secretory pathway was readily processed to lower molecular weight forms. This post-translational maturation apparently was the result of glycan maturation and proteolytic processing of the polypeptide along the secretory pathway. Intriguingly, cytosolic expression generated more stable proteins, although not glycosylated, that accumulated mostly in the nucleus. We further demonstrated that mutation of AACT DNA binding site partially altered the nucleus distribution thus suggesting a role of DNA binding in recombinant AACT nuclear retention. Taken together, these results illustrate the complex and unpredictable nature of recombinant protein posttranslational maturation, and stress the need for additional empirical data on the expression of complex glycopropteins in plant cells.

Les spermatozoïdes subissent la maturation lors de leur passage dans l'épididyme sous l'influence de plusieurs facteurs et protéines encore méconnus. Le présent projet concerne l'étude des protéines induites par la présence des spermatozoïdes. Pour y arriver, des cellules épithéliales épididymaires immortalisées de souris ont été misent en co-culture pour étudier l'expression des protéines induites. Par ce procédé, une protéine a été identifiée comme étant sécrétée par les cellules épithéliales. La protéine en question est la fibuline-2 qui est exprimée entre autres, dans les membranes basales et au cours du développement embryonnaire. De plus, le transcriptome des cellules en culture a été étudié par macro-array ce qui a permis l'identification de plusieurs ARNm induits par les spermatozoïdes dont le CD49c qui est exprimé dans des conditions similaires à la fibuline2. En résumé, nos résultats semblent indiquer que la présence de spermatozoïdes pourrait effectivement influencer l'expression de gènes ainsi que la synthèse et la sécrétion de protéines par les cellules épididymaires. / When passing through the epididymis, the spermatozoon becomes mature by acquiring forward motility and fertilizing capacity. This maturation process is under influence of several unknown factors and proteins. Experiments were done to study the modification of transcriptom and proteome modulate by spermatozoa. Cell culture was done with epithelial epididymal cell lines which origined from transgenic mice in coculture with mouse spermatozoa. Experiment allows us to find a protein expressed only in co-incubation conditions named fibulin-2 which is found in basement membrane and during embryonic development. Also, study of transcriptom of PC-1 in presence of spermatozoa by Macro-array determines several mRNA induced by spermatozoa such as CD49c. This protein is expressed in same condition that fibulin-2. Together, these results strongly suggest that spermatozoa can modulate gene expression and de novo protein synthesis and secretion of epididymal cell. This novel finding provides new concept and working hypothesis to clarify how testicular factors, such as spermatozoa itself, initiate the activation and differentiation of epididymal epithelium during the sperm maturation process.

La soie d'araignée naturelle est un biomatériau aux propriétés mécaniques exceptionnelles. Elle combine extensibilité et résistance, ce qui la rend supérieure à beaucoup d'autres fibres synthétiques déjà existantes. Puisqu'il est difficile de faire l'élevage des araignées, les biologistes moléculaires ont contourné cette difficulté, en isolant les gènes codant les protéines de soie d'araignée (MaSpI et MaSplI) et en les insérant dans des organismes vivants. Le nouveau défi est de réussir à fabriquer une fibre aussi résistante et extensible que la soie naturelle. La compagnie Nexia Biotechnologies Inc. a réussi l'exploit d'insérer les gènes dans les cellules mammaires de chèvres, d'isoler les protéines de soie d'araignée des autres composantes du lait et de fabriquer des fibres régénérées. En collaboration avec cette compagnie, nous avons étudié par spectromicroscopie Raman la conformation et l'orientation des protéines de soie de fibres régénérées fabriquées industriellement. Nous avons comparé ces résultats avec la soie d'araignée naturelle. L'orientation et la conformation des fibres régénérées sont comparables à la soie naturelle, mais les propriétés mécaniques de ces fibres ne sont pas aussi bonnes. La deuxième partie du projet consistait à étudier l'auto-assemblage des protéines MaSpI et MaSplI produites par Nexia Biotechnologies Inc. à l'interface air-eau en utilisant la technique des films de Langmuir. La microscopie à angle de Brewster (BAM) nous a permis d'étudier la morphologie des films. Nous avons aussi étudié la structure et l'orientation moléculaire des protéines dans les films in situ à l'aide de la spectroscopie infrarouge de réflexion absorption avec modulation de polarisation (PM-IRRAS). Afin de vérifier ces résultats, nous avons transféré les films sur un substrat de germanium, ce qui nous a permis d'utiliser la spectroscopie infrarouge à réflexion totale atténuée (ATR) pour étudier la conformation des protéines et de calculer l'orientation des feuillets fi et des hélices a. Les résultats ont montré que les deux protéines forment des feuillets (3, même à très faible pression de surface. Cependant, lors de la compression des films, les deux protéines se comportent différemment : le pourcentage de feuillets (3 augmente pour la protéine MaSpI alors que pour la protéine MaSplI, il y a une augmentation de la structure en hélice a et une diminution du contenu en feuillet p\

Au cours des dernières années, les plantes ont émergé comme une plateforme de choix pour la production de protéines recombinantes d'intérêt pharmaceutique ou industriel. La moléculture n'est par contre pas exempte de difficultés alors que les protéines hétérologues rencontrent souvent, par exemple, des problèmes de dégradation causés par les protéases endogènes, avec un impact direct sur le rendement et la qualité du produit. Pour répondre à cette problématique, nous avons exprimé des inhibiteurs de protéases hétérologues dans le but de moduler in vivo l'activité protéolytique des plantes et ainsi permettre une protection de protéines recombinantes coexprimées. Afin d'évaluer sur une base globale le potentiel des inhibiteurs de protéases en moléculture, ces expériences furent réalisées avec différents systèmes d'expression et à différents endroits dans la cellule. La transformation de plants de pommes de terre (Solanum tuberosum) avec l'inhibiteur de cathepsine D de tomate (SICDI) ciblé dans le cytosol a provoqué une augmentation marquée du contenu en protéines foliaires associée à une hausse générale de la majorité des protéines endogènes. L'expression de cet inhibiteur à large spectre a par ailleurs permis la protection d'une protéine d'intérêt médical, l' alpha-l-antichymotrypsine humaine, exprimée de façon transitoire dans le cytosol des feuilles d'une lignée transgénique, illustrant le potentiel de la plateforme pour ce compartiment de la cellule. Puisque de nombreuses protéines nécessitent des modifications post-traductionnelles complexes qui ont lieu dans le système de sécrétion, il apparaissait par la suite pertinent de vérifier l'effet des inhibiteurs de protéases dans ce dernier compartiment. Cette évaluation fut réalisée à l'aide d'un système d'expression transitoire par agroinfiltration chez Nicotiana benthamiana. La plateforme étant encore peu caractérisée, une attention particulière ad' abord été accordée aux réactions de la plante au cours du processus d'infiltration, résultant en l'élaboration d'une carte protéomique de l' apoplaste foliaire de N. benthamiana. La coexpression de deux inhibiteurs de protéases dans le système de sécrétion de N. benthamiana, soit SICDI et la cystatine 9 de tomate, avec l'anticorps d'intérêt médical C5-1 a par ailleurs permis une augmentation du rendement de l'anticorps, confirmant l'utilité des inhibiteurs de protéases dans la protection des protéines recombinantes sécrétées.

L’objectif de ce travail était de caractériser les propriétés physicochimiques de complexes formés de protéines végétales et de fibres alimentaires. Neuf complexes ont été produits à partir de trois isolats de protéines végétales (deux isolats de soya et un isolat de pois) et de deux fibres (maïs et betterave) dans les ratios protéine – polysaccharide (P-PS) 1-1, 2-1 et 4-1 par ajout graduel d’acide chlorhydrique jusqu’à pH 4. La taille, la charge, les capacités d’absorption d’eau et d’huile de ces complexes ont été évaluées dans le but de développer de nouveaux ingrédients avec des fonctionnalités désirées. La formation de complexes a permis de créer un effet de synergie permettant d’augmenter la capacité d’absorption d’eau des nouveaux ingrédients qui était plus élevée pour les complexes à base de protéines de soya et de la fibre de betterave (20 et 26% pour Soya1-Bet et Soya2-Bet contre 9 et 23% pour Soya1-Maïs et Soya2-Maïs). L’augmentation de l’absorption d’eau était en générale plus faible que l’absorption d’huile avec une différence mesurée de plus de 35%. La synergie élevée entre les P-PS des complexes était corrélée à une faible teneur en protéines et à des tailles plus petites. La formation des complexes apparaît comme un nouveau moyen permettant de moduler les fonctionnalités des protéines et des fibres en support à l’enrichissement des aliments. / The objective of this work was to characterize the physicochemical properties of complexes formed of plant proteins and dietary fibers. Nine complexes were produced from three plant protein isolates (two soy isolates and one pea isolate) and two fibers (corn and beet) with protein-polysaccharide (P-PS) ratios 1-1, 2-1 and 4-1 by gradual addition of hydrochloric acid up to a pH of 4. The size, the charge and water and oil absorption capacities of these complexes were evaluated with the aim of developing new ingredients with desired functionalities. The formation of complexes allowed to create a synergistic effect on the water absorption capacity of these new ingredients, which was found to be higher for the complexes based on soybeans and beet fiber (20 and 26% for Soya1-Bet and Soya2-Bet against 9 and 23% for Soya1-Corn and Soya2-Corn). The increase in water absorption was generally lower than oil absorption by more than 35%. The great synergy between the P-PS complex was correlated with a low protein content and smaller complex sizes. The formation of complexes appears as an interesting way to modulate the functionality of proteins and fibers to improve the level of fortification of foods.

La valorisation des co-produits de poisson est un enjeu économique et environnemental. Depuis plusieurs années, des recherches ont montré que les co-produits de poisson contenaient des molécules actives pour la santé humaine comme des acides gras polyinsaturés et des peptides bioactifs. L’objectif principal de cette thèse était d’évaluer l’utilisation potentielle d’hydrolysats de laitance de hareng pour l’amélioration de la santé humaine, spécifiquement en agissant positivement sur certaines fonctions physiologiques associées au syndrome métabolique, et l’effet de leur séparation par électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration (EDUF) sur la production de fractions bioactives. Dans un premier temps, il a été démontré qu’une supplémentation avec différents hydrolysats de laitance de hareng d’une diète riche en gras et en sucre chez des souris permettait de moduler certains paramètres physiologiques impliqués dans le développement du syndrome métaboliques (MetS) : amélioration de la tolérance au glucose, augmentation de l’apport énergétique total et protection de la population de Lactobacillus dans le microbiote intestinal. De plus, les hydrolysats ont aussi montré des activités antiinflammatoires in vitro à des concentrations de 1ng/ml et 100pg/ml. Dans un second temps, la faisabilité d’une séparation par EDUF de deux hydrolysats de laitance de hareng différents a été évaluée : le premier plus complexe était un mélange de molécules (lipides, acides nucléiques, peptides, acides aminés libres), alors que le second était principalement composé de peptides et d’acides aminés libres. Une nouvelle configuration utilisant quatre membranes d’ultrafiltrations (deux de 50kDa et deux de 20kDa) a permis un double fractionnement simultané des composés anioniques et cationiques en seulement une étape. Il a d’abord été montré que seuls les peptides chargés ainsi que les acides aminés libres pouvaient être séparés par EDUF alors que les lipides et les acides nucléiques ne migraient pas dans les fractions de récupérations. De plus, l’utilisation de membranes présentant deux tailles de pores distinctes a permis le fractionnement des hydrolysats en différentes classes de poids moléculaires. En effet, l’utilisation de membranes de 20kDa a permis la concentration de peptides de faibles poids moléculaires (< 600Da) et IV d’acides aminés libres, alors que les populations peptidiques des fractions obtenues avec les membranes de 50kDa présentaient des poids moléculaires supérieurs et plus variés. Dans un troisième temps, les bioactivités des fractions de récupérations et des hydrolysats de laitance de hareng ont été évaluées in vitro. Ainsi, la séparation du premier hydrolysat a permis l’obtention d’une fraction finale stimulant la captation du glucose in vitro et d’une fraction anionique antioxydante. Le fractionnement du second hydrolysat a permis quant à lui la production de deux fractions cationiques anti-inflammatoires ainsi que l’identification subséquente de deux séquences peptidiques bioactives. L’ensemble de cette thèse a donc démontré que les hydrolysats de laitance de hareng contenaient des composés actifs, comme des acides gras polyinsaturés et des peptides, modulant positivement certains paramètres physiologiques impliqués dans le MetS et pouvant ainsi permettre la diminution de son occurrence. De plus, la séparation des hydrolysats par EDUF a permis la production de fractions bioactives ainsi que l’identification de deux nouvelles séquences peptidiques anti-inflammatoires (IVPAS et FDKPVSPLL). Ces travaux ont démontré l’effet bénéfique pour la santé humaine des hydrolysats de laitance de hareng et de ses fractions, permettant d’envisager une valorisation plus efficace de ces coproduits de poisson par les industries de transformation dans les secteurs liés à la santé humaine. / Fish by-product valorization is an economic and environmental issue. For several years, scientific researches have shown that fish by-products contained active molecules for human health, as polyunsaturated fatty acids and peptides. The aim of this thesis was to evaluate the potential use of herring milt hydrolysates for human health, especially by evaluating their potential actions in physiological parameters involved in the metabolic syndrome and the effect of their separation by electrodialysis with ultrafiltration membrane (EDUF) for the production of bioactive fractions. First, we have demonstrated that the supplementation of three different herring milt hydrolysates in a high fat high sucrose diet in mice was able to modulate some physiological functions involved in the metabolic syndrome: improvement of glucose tolerance, increase of the total energy intake and protection against the Lactobacillus disappearance in the gut microbiota. Moreover, the hydrolysates decreased the inflammation induction in macrophages stimulated with LPS at 1ng/ml and 100pg/ml. Secondly, we have evaluated the separation of two herring milt hydrolysates by EDUF: the first one was more complex with a mix of different molecules (lipids, nucleic acids and peptides) while the second one was mainly composed of peptides. A new configuration using four ultrafiltration membranes (two of 50kDa and two of 20kDa) allowed a simultaneous double separation of anionic and cationic compounds. It has been shown that only charged peptides and free amino acids were fractionated in EDUF, while the lipids and nucleic acids didn’t migrate to the recovery fractions. Moreover, the use of membranes with different cut-off allowed a separation of the hydrolysates in different molecular weight ranges. Indeed, the use of 20kDa membranes allowed the concentration of peptides with small molecular weights (<800Da) and free amino acids, while the recovery fractions obtained with the 50kDa membranes were composed oh peptide with higher molecular weights.Thirdly, the potential bioactivities of the recovery fractions and the herring milthydrolysates were evaluated in vitro. Hence, the separation of the first hydrolysate allowed the production of a final fraction increasing the glucose uptake and an antioxidant anionicfraction. While the separation of the second hydrolysate allowed the production of two antiinflammatory cationic fractions as well as the identification of two bioactive peptides sequences. All these results showed that milt herring hydrolysate contained bioactive compounds such as polyunsaturated fatty acids and peptides, improving some physiological functions involved in the MetS and may decrease its occurrence. More over, the separation of the hydrolysates by EDUF allowed the production of bioactive fractions and the identification of two new anti-inflammatory peptide sequences. This work demonstrated the existence of a beneficial effect of herring milt hydrolysate and its fractions for the human health, allowing a better valorization of this by-product of the food industry for the health sector.

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus responsable d’infections aiguës des voies respiratoires telles que des bronchiolites, des bronchites ou des pneumonies, principalement chez les populations à risques que sont les jeunes enfants de moins de 5ans, ainsi que les personnes âgées ou immunodéprimées. Découvert en 2001, ce virus et sa pathogénèse ne restent encore aujourd’hui que partiellement caractérisés. De ce fait et malgré les besoins, il n’y a aucun vaccin ou traitement thérapeutique spécifique et efficace contre le HMPV disponible sur le marché. Dans ce contexte, mon projet de thèse s’est articulé autour de deux axes principaux: (i) L’étude de la protéine de fusion F du virus hMPV, protéine majeure antigénique de surface et responsable de l’entrée du virus dans la cellule cible. Elle a pour particularité d’induire de manière autonome la fusion membranaire in vitro et d’être associée à des effets cytopathiques variable selon les souches virales. De par son rôle clé pour le virus hMPV, la protéine F a déjà fait l’objet de plusieurs études structurales et fonctionnelles mais les déterminants de cette activité fusogénique ne sont pas encore entièrement caractérisés. Nous nous sommes donc intéressés à l’identification de déterminants du phénotype viral hyperfusogénique, localisés dans les domaines heptad repeats de la protéine F du hMPV. (ii) L’atténuation de deux souches virales cliniques (CAN98-75 et C-85473) par délétion de gènes accessoires dans le but de développer des candidats vaccinaux adaptés aux enfants en bas âge. Différents virus ont été générés par génétique inverse et les délétions des gènes accessoires SH et G dans les deux fonds génétiques viraux ont été étudiées pour leur impact sur l’infectivité, la réplication et la pathogénèse virale in vitro et in vivo ainsi que leur contribution pour le développement de virus atténués candidats vaccinaux. / Human metapneumovirus (hMPV) is a major pathogen responsible of acute respiratory tract infections, such as bronchiolitis or pneumonia, affecting especially infants, under five years old, elderly individuals and immunocompromised adults. Identified since2001, this virus and its pathogenes is still remain largely unknown and no licensed vaccines or specific antivirals against hMPV are currently available. In this context, my research project was built over two main subjects: (i) The study of the fusion F glycoprotein which is the major antigenic protein of hMPV and is responsible of viral entry into host cell. By its crucial role for the virus, the F protein has already been characterized in several structural and/or functional studies. Thus, it has been described that the hMPV F protein induces membrane fusion autonomously, resulting in variable cytopathic effects in vitro, in a strain-dependent manner. However, as the determinants of the hMPV fusogenic activity are not well characterized yet, we focused on identification of some of these, located in heptad repeats domains of the protein. (ii) The evaluation of hMPV SH and G gene deletion for viral attenuation. Live-attenuated hMPV vaccine candidates for infants’ immunization has been constructed thank to this deletion approach at the beginning of hMPV vaccine development efforts. Despite encouraging results, these candidates have not been further characterized and the importance of the viral background has not been evaluated.

Le cancer est une maladie évolutive qui se développe par l'intermédiaire de l'acquisition progressive par une même cellule d'un ensemble de mutations qui dissocient les liens moléculaires qui relient normalement la prolifération cellulaire aux mécanismes suppresseurs de tumeur, comme la differentiation, la sénescence et l'apoptose. De fait, l'émergence de la plupart des cancers humains résulte de la coopération entre des mutations qui élèvent ou dérégulent l'expression de l'oncoprotéine c-Myc et d'autres qui inactivent l'apoptose. Parallèlement, il a été proposé que le maintien du phénotype tumoral dépende du développement de mutations secondaires qui pallient les déséquilibres cellulaires associés au processus de transformation néoplasique. À cet effet, la surexpression constitutive du chaperon moléculaire Hsp90 représente l'une des mutations adaptatives les plus communément rencontrées dans le cancer. La fonction de Hsp90 semble collaborer à la transformation néoplasique en permettant la maturation d'un ensemble restreint de protéines à l'origine du développement des traits phénotypiques propres à la cellule tumorale, en prévenant la formation d'agrégats protéiques toxiques et en facilitant le transport intracellulaire et la sécrétion des protéines. Par conséquent, la réponse cellulaire au stress médiée par Hsp90 apparaît entraver directement le programme d'apoptose enclenché par une expression dérégulée de c-Myc. Toutefois, au moment de débuter mes études doctorales, aucun lien moléculaire entre ces deux mécanismes aux fonctions opposées n'avait encore été déterminé. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que le programme d'apoptose mis en place par une expression dérégulée de c-Myc requiert l'inactivation de Hsp90. La surexpression de c-Myc inhibe la fonction de Hsp90 par l'intermédiaire de l'induction du clivage du cofacteur p23 par les caspases. L'inactivation de Hsp90 accélère et accroît sélectivement l'apoptose des cellules transformées en provoquant la dégradation de multiples oncoprotéines tributaires de la fonction de Hsp90. À l'inverse, une inhibition du clivage de p23 contrecarre l'apoptose et contribue à la transformation des cellules qui surexpriment c-Myc en I facilitant la maturation et l'activation des substrats de Hsp90. Nous en concluons que le clivage de p23 lors de l'apoptose constitue un mécanisme inhibiteur de la transformation néoplasique déterminant puisqu'il fait obstacle à la réponse cellulaire au stress médiée par Hsp90. Nos observations mettent en évidence le rôle central de Hsp90 dans l'initiation tumorale et suggèrent que l'inhibition de p23 puisse représenter une approche viable dans le traitement des cancers caractérisés par une expression élevée ou dérégulée de c-Myc. En outre, nous démontrons qu'une expression dérégulée de c-Myc stabilise la sous-unité inductible a du facteur de transcription HIF-1 à la suite du retrait des facteurs trophiques en inactivant les enzymes prolyl-4-hydroxylase 2. L'activité transcriptionnelle du facteur de transcription HIF-1 facilite l'adaptation des cellules tumorales à leur milieu par la mise en place de mécanismes comme la glycolyse, l'érythropoïèse et l'angiogenèse. Ainsi, nous avons observé que l'accumulation de HIF-1 a corrèle avec une substitution de l'isoforme COX4-1 pour l'isoforme COX4-2 de l'enzyme mitochondriale cytochrome-oxydase, une adaptation qui accroît la synthèse d'ATP par la chaîne respiratoire. De plus, nous avons remarqué la conversion concomitante de la protéine LC3-I en son dérivé clivé LC3-II, suggérant que HIF-1α contribue à induire l'autophagie. Dans l'ensemble, nos résultats indiquent que la stabilisation de HIF-1α en réponse à une expression dérégulée de c-Myc promeut la survie des cellules transformées à la suite du retrait des facteurs trophiques.

Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux effets de la consommation de protéine de morue pendant quatre semaines sur la sensibilité à l' insuline chez des hommes et des femmes ayant un surpoids ou obèses et résistants à l'insuline. Nous avons noté une amélioration de la sensibilité à l' insuline et une forte tendance à un meilleur ±disposition index¿ (fonction cellules-β x sensibilité à l'insuline) lorsque les sujets ont consommé la protéine de morue comparativement au mélange de protéines animales (BPVOL). Nous avons également observé que seulement le BPVOL a entraîné une diminution des concentrations plasmatiques de cholestérol total, de cholestérol des LDL et d'apolipoprotéine B totale. Par la suite, nous avons voulu identifier des mécanismes par lesquels la protéine de morue exerce des effets bénéfiques sur la sensibilité à l' insuline. Au niveau des marqueurs de l'inflammation, la protéine de morue a provoqué une diminution de la concentration plasmatique de la protéine C-réactive hautement sensible tandis que le BPVOL a eu tendance à induire une augmentation, entraînant une différence significative entre les deux régimes. Toutefois, les changements des concentrations plasmatiques d'interleukine-6, du facteur de nécrose tumorale-α et d'adiponectine ont été similaires entre les deux régimes. Au niveau de la voie de signalisation insulinique, une stimulation à l'insuline a entraîné une augmentation de l'activation de la PI 3-kinase associée à IRS-1 et de la glycogène synthase suite à la consommation de la protéine de morue. De plus, une augmentation de la phosphorylation de IRS-l sur Ser636/639 a été observée avec le BPVOL alors que la protéine de morue n'a pas eu d'effet, ce qui pourrait indiquer une augmentation de la stimulation de la voie mTORlS6K1 lors de la consommation de BPVOL. Les deux régimes n'ont pas eu d'effet sur la morphologie et la capacité métabolique du muscle. Enfin, ils ont affecté différemment la concentration plasmatique à jeun de taurine. Toutefois, il est peu probable qu'un seul acide aminé soit responsable de tous les effets de la protéine de morue. Des études supplémentaires sont nécessaires pour mieux identifier les acides aminés impliqués. Donc, l'étude constituant cette thèse a permis de démontrer que la protéine de morue pourrait améliorer le métabolisme du glucose et potentiellement ralentir la progression vers le diabète de type 2. Les mécanismes impliqués dans l'effet insulinosensibilisateur de la protéine de morue demeurent à être approfondis.

Clostridium difficile est une bactérie Gram positive anaérobique responsable de plusieurs perturbations intestinales suite à la prise d’antibiotiques et est également reconnue comme une cause majeure de la colite pseudomembraneuse. La pathogenèse des infections à C. difficile est principalement associée aux toxines A et B, qui ont été largement étudiées dans les dernières années. Cependant, plusieurs autres aspects de la virulence de ce pathogène sont encore bien mal compris. Un bon nombre de protéines font partie de l’arsenal de facteurs de virulence qui jouent un rôle au niveau de l’adhésion de la bactérie ou qui dégradent certaines composantes de la paroi intestinale afin de permettre à la bactérie de coloniser son hôte. La régulation de l’expression de telles protéines nous permettrait d’en connaître davantage sur la colonisation de l’hôte par C. difficile. Chez plusieurs espèces bactériennes, le 3’5’ diguanosine monophosphate cyclique (c-di-GMP) est un second messager important qui régule plusieurs phénotypes. La formation de biofilm ainsi que la régulation de la transition de cellules motiles à un mode de persistance sont parmi les fonctions connues du c-di-GMP. Toutefois, la diversité des processus physiologiques bactériens régulés par le c-di-GMP reste encore pour la plupart peu expliquée chez les bactéries à Gram positif. Chez certaines bactéries, le c-di-GMP est impliqué dans le contrôle de la régulation de l’expression de gènes, via la liaison à des récepteurs à ARN, les riborégulateurs. Les riborégulateurs sont des séquences d’ARN non codants localisés dans la partie 5’UTR d’un ARNm et régulant l’expression de gènes par la liaison d’un ligand à son aptamère comme le c-di-GMP. Cette étude s’intéresse à la régulation et à la fonction des gènes CD2831 et CD2830 qui sont regroupés en un seul locus. L’expression de ces gènes est contrôlée par les niveaux de c-di-GMP intracellulaire via deux riborégulateurs en amont de ces gènes. Chez C. difficile, deux classes de riborégulateurs à c-di-GMP, de fonction similaire, mais qui diffèrent structurellement, ont été rapportées; c-di-GMP-I et c-di-GMP-II. L’expression relative du gène CD2830 en aval du riborégulateur à c-di-GMP de type I diminue de 23 à 29 fois lorsque le niveau de c-di-GMP intracellulaire augmente, tandis que pour les mêmes conditions, le gène CD2831 en aval du riborégulateur à c-di-GMP II était de 72 à 96 fois plus exprimé. Des essais β-galactosidase avec des fusions des riborégulateurs et lacZ, ont démontrés que l’expression des gènes CD2830 et CD2831 semble être contrôlée de façon opposée par leurs riborégulateurs transcriptionnels respectifs, selon les concentrations de c-di-GMP intracellulaire. La protéine CD2830 a été décrite comme une métalloprotéase zinc-dépendante ayant une activité sur la fibronectine, le fibrinogène de plasma humain et la protéine CD2831, qui code pour une adhésine putative. La fonction de cette dernière protéine reste encore mal connue. Cette étude n’a pas permis de démontrer que les protéines CD2830 et CD2831 jouent un rôle dans l’agrégation ou dans l’adhésion à la fibronectine et au fibrinogène lorsque la concentration de c-di-GMP intracellulaire varie. Cette étude suggère que chez C. difficile, la zinc-métalloprotéase CD2830 est impliquée dans un mécanisme de clivage de protéines d’adhésion, comme décrit chez plusieurs pathogènes, afin de contrôler l’adhésion cellulaire lors de processus biologique important. Ce mécanisme serait régulé par le c-di-GMP.