Depuis la découverte de la protéine fluorescente verte (GFP) en 1962, de nombreux développements ont permis d'améliorer l'utilisation de cette protéine naturellement luminescente en tant que puissant outil permettant de suivre des protéines ou des organelles d'intérêt dans les cellules ou organismes vivants. Au début du 21ème siècle, la découverte des protéines fluorescentes photoactivables (PAFPs), notamment chez les anthozoaires, a initié une révolution dans le domaine de la technologie des FP. Certaines PAFPs sont capables d'être irréversiblement photoconverties d'une forme fluorescente verte à une forme fluorescente rouge alors que d'autres peuvent être réversiblement commutées entre des formes allumées ou éteintes, selon des longueurs d'onde d'excitation spécifiques.Ces protéines sont intensivement employées pour les techniques de microscopie optique, particulièrement en “nanoscopie”, qui permet d'atteindre une résolution optique 10 fois meilleure que la limite théorique d'Abbe. Afin de développer plus en avant ces techniques, notamment en terme de résolution temporelle, la nécessité d'obtenir des sondes fluorescentes plus lumineuses pouvant se photoconvertir ou se photocommuter efficacement est cruciale. Dans un même temps, les marqueurs fluorescents doivent généralement être monomériques et photostables. Afin de mieux comprendre les mécanismes des phototransformations des PAFPs, trois membres de la famille ont été étudiés : EosFP, Dendra2 et IrisFP. Le phénomène de photoconversion du vert au rouge, de photocommutation réversible et de photoblanchiment irréversible ont été étudiés grâce à une combinaison de cristallographie des rayons X et de microspectrophotométrie, en utilisant le laboratoire Cryobench de l'ESRF/IBS. Pris ensemble, les résultats nous ont permis de proposer un mécanisme de photoconversion pour EosFP et Dendra2 et de découvrir et caractériser IrisFP, première PAFP combinant à la fois les propriétés de photoconversion et de photocommutation. Les modifications structurales du chromophore associées à la formation d'un état radicalaire induit par les rayons X, probablement impliqué dans la voie de photoblanchiment des PAFPs, ont aussi été caracterisées.

Les estrogènes contribuent au contrôle de l'expression de nombreux gènes cibles en interagissant avec les Récepteurs aux Estrogènes (RE). Ces récepteurs sont des facteurs de transcription qui interagissent avec une séquence cis-régulatrice, appelée Elément de Réponse aux Estrogènes (ERE). Un criblage de molécules capables de lier les RE et de moduler l'expression génique apporte un intérêt thérapeutique (ménopause, cancers hormonodépendant) et des intérêts dans les domaines de la santé publique et de l'écologie (perturbateurs endocriniens). Nous avons développé deux modèles de biocapteurs reposant sur le principe de Résonance Plasmonique de Surface. Une telle démarche permet de réduire le coût et le temps expérimental nécessaire au criblage d'une chimiothèque. Par ailleurs, la validation de l'utilisation de tels outils nécessite la corrélation des résultats à ceux obtenus à l'aide d'un modèle biologique plus complexe. Ainsi, nous avons développé, un modèle de cellules humaines de cancer du sein (MCF-7) transfectées par un vecteur rapporteur. La mise en place en parallèle de ces deux modèles a permit d'identifier un nouveau phytoestrogène agoniste de REa : la 7-O-ß-Dglucopyranolychrysine. L'un de nos biocapteurs est compatible avec l'étude des interactions protéines/protéines. Nous avons donc appliqué ce modèle à la recherche de partenaires de la protéine GEC1 codé par un gène régulé par les estrogènes. En conclusion, nous avons développé en parallèle des biocapteurs ADN/protéine et un modèle cellulaire permettant l'identification de xénoestrogènes (7-O-ß-D-glucopyranolychrysine), ainsi qu'un biocapteur protéines/protéines permettant le criblage de partenaires protéiques.

Staphylococcus xylosus et Staphylococcus carnosus sont utilisés comme ferments de salaisons. S. xylosus est fréquemment isolé dans l'environnement des ateliers de transformation alimentaire alors que S. carnosus l'est rarement. Ainsi, nous avons étudié la capacité de ces deux espèces à former des biofilms sur divers supports abiotiques. Les souches de S. carnosus sont hydrophiles, adhèrent à des supports hydrophiles mais ne forment pas de biofilms. Certaines souches de S. xylosus sont hydrophiles, d'autres moyennement hydrophobes et elles forment des biofilms quelque soit le support. S. xylosus C2a, choisie comme souche d'étude, forme des biofilms denses avec des agrégats intercelluaires séparés par des canaux et englués dans une matrice constituée de polysaccharides dont la synthèse ne semble pas liée au gène icaA. Nous avons mis en evidence les gènes atl et bap codant des protèines de surface impliquées dans la formation de biofilm chez S. aureus. Pour étudier l'ensemble des protéines de surface impliquées, nous avons développé une méthode d'analyse des protéines pariétales et membranaires. Un total de 101 protéines a été identifié dont 51 sont prédites comme protéines de surface et seulement 9 sont cmmunes aux deux fractions. La comparaison des profils protéiques des fractions pariétales, membranaires et intracellulaires a révélé une expression différentielle de 115 protéines dont 74 sont surexprimées en mode sessile et 41 en planctonique. Cette étude a révélé la modification de nombreuses voies métabolliques. Leur analyse permettra de mieux appréhender les mécanismes mis en jeu par S. xylosus lors de sa croissance en biofilm

Le cytosquelette bactérien des homologues d'actine (protéines de la famille MreB) joue un rôle majeur dans la morphogénèse cellulaire. Des homologues de MreB sont retrouvés chez la plupart des espèces bactériennes non sphériques, où ils sont essentiels pour la viabilité cellulaire. Les bactéries à Gram-positif ont généralement plusieurs isoformes. L'organisme modèle Bacillus subtilis en possède trois : MreB, Mbl et MreBH, tous trois impliqués dans la détermination de la forme de la cellule. Le postulat actuel est une organisation, des complexes de synthèse du peptidoglycane, le long des parois latérales par les filaments hélicoïdaux des MreB-like. Cependant, les mécanismes moléculaires et les protéines effectrices impliqués dans cette fonction ne sont pas encore élucidés. Par analogie avec les rôles de l'actine eucaryote, des implications dans d'autres processus cellulaires cruciaux et la présence de partenaires protéiques sont également attendus pour les actines procaryotes. Afin d'explorer les rôles des protéines MreB chez B. subtilis nous avons généré, par des criblages génomiques double hybride chez la levure, un réseau d'interaction protéine-protéine centré sur MreB, Mbl et MreBH. Une vérification systématique et drastique de toutes les interactions obtenues lors des criblages a été réalisée afin d'éliminer les faux positifs. Les interactions identifiées révèlent des liens entre les protéines MreB-like et seize protéines issues de catégories fonctionnelles variées ou de fonction inconnue. Une étude exploratoire a été menée pour huit des protéines partenaires par des approches in silico et in vivo et nous a permis de sélectionner une seule interaction à caractériser plus en détail. Nous nous sommes principalement intéressés à l'interaction physique et directe entre MreB et DapL, une protéine essentielle vraisemblablement impliquée dans la voie de biosynthèse des précurseurs du peptidoglycane, par analogie à DapE d'E. coli. La caractérisation approfondie de DapL a confirmé son essentialité dans la synthèse du peptidoglycane. Bien que l'interaction MreB-DapL ait été confirmée biochimiquement, son rôle biologique exact n'a pas été élucidé. Cependant, nous avons mis en évidence d'autres interactions entre MreB et DapG, LysA et MurE, des enzymes également impliquées dans les étapes précoces de la synthèse du peptidoglycane. L'existence de telles interactions renforce le rôle du cytosquelette MreB de B. subtilis dans l'orchestration des machineries de synthèse de la paroi cellulaire.

La caractérisation à haut débit des interactions protéines-protéines a permis d'établir les premières cartes d'interactions de différents organismes modèles, y compris l'homme. Cependant, la caractérisation structurale des assemblages protéiques reste limitée à un nombre très faible de ces interactions. En mettant en évidence une pression de sélection évolutive spécifique aux interfaces de complexes protéiques, ce travail a permis d'élucider certains mécanismes évolutifs essentiels à l'association entre protéines qui n'avaient pas été décrits jusqu'à présent. Sur cette base, une nouvelle approche bioinformatique, nommée SCOTCH (Surface COmplementarity Trace in Complex History), a été développée pour prédire la structure des assemblages macromoléculaires. Couplée à un programme d'amarrage moléculaire, tel que SCOTCHer, également développé au cours de cette thèse, cette approche a permis de prédire efficacement la structure d'un grand nombre de complexes. Ce travail de thèse s'est également concentré sur l'inhibition des interactions protéiques par des mini-protéines, conçues de façon rationnelle sur la base des structures de complexes. Les résultats obtenus pour deux exemples, celui du complexe Asf1 – Histone H3/H4 et du complexe gp120 – CD4 témoignent du fort potentiel du design rationnel d'interfaces de complexes pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

La simulation in silico des gènes codant pour des ARN de transfert et des protéines a connu un développement considérable ces dernières années car elle permet de déduire de modèles simples des comportements inattendus qui découlent de la structure des génotypes dans l'espace des séquences et de la correspondance génotype-phénotype. Le modèle d'évolution le plus élémentaire, la théorie dite "de l'évolution neutre" conçue et défendue par Kimura principalement, donne lieu à un phénomène à présent bien documenté: les génotypes robustes aux mutations et exprimant des protéines se repliant efficacement, sont surreprésentés en comparaison des génotypes "fragiles". De nombreuses questions restent en suspens notamment en ce qui concerne l'incidence que peut avoir une modélisation plus réaliste de la fonctionnalité d'une protéine sur le schéma tracé à partir de considérations purement structurales et cinétiques. Pour cela, nous avons développé un modèle incluant une contrainte sélective imposant une dimérisation spécifique minimale de deux protéines codées par deux gènes pour qu'un individu puisse survivre. Nous démontrons que les réseaux neutres construits d'après des critères structuraux sont grandement plastiques et peuvent s'adapter à une fonction vitale sans souffrir de baisse de stabilité. La surreprésentation des génotypes robustes est maintenue, elle est même amplifiée par l'interaction épistatique existant entre les deux gènes. On observe que cela s'accompagne d'une augmentation en moyenne de la fonctionnalité résultant de l'émergence d'un *superfunnel* fonctionnel dans l'espace des séquences. Cette propriété remarquable pourrait avoir d'importantes implications dans l'explication de l'émergence de nouvelles fonctions biologiques. Une autre question concerne les simplifications impliquées par le choix des modèles protéiques. Puisque les simulations évolutives supposent un coût de calcul important, les protéines sur réseau ont eu la préférence de nombreux modélisateurs. Dans ce mémoire, nous proposons un modèle de protéine hors réseau possédant des cartes de contacts plus complexes que les protéines sur réseau. Il confirme les conclusions tirées des simulations sur les protéines sur réseau.

L'auteur n'a pas fourni de résumé en français / L'auteur n'a pas fourni de résumé en anglais

La sumoylation représente, après l’ubiquitination, l’exemple le plus étudié de modification post-traductionnelle impliquant la liaison d’une protéine à une autre. Cependant, alors que l’ubiquitination est impliquée principalement dans la dégradation des protéines par le protéasome, la sumoylation semble réguler les propriétés biochimiques de ses substrats (localisation cellulaire, interaction protéique, activité, …). Pour venir lier une protéine appelée Sumo (Small Ubiquitin-like Modifier) sur un substrat, la sumoylation emprunte une voie enzymatique analogue à celle de l’ubiquitination mais utilise des enzymes différentes. A ce jour, bien que plusieurs centaines de substrats de la sumoylation aient été identifiés, seules 5 structures de protéines sumoylées ont été résolues. Elles ne sont vraisemblablement pas représentatives de l’ensemble des substrats de la sumoylation et mon travail de thèse vise à élargir les connaissances structurales sur la sumoylation pour permettre de dégager des concepts généraux. <p>Les études sur la sumoylation se heurtent généralement à la difficulté d’obtenir les substrats sumoylés. Ce projet a donc nécessité, au niveau technique, la mise au point d’un système de sumoylation in vivo en bactérie permettant de modifier des quantités importantes de protéines et de les purifier efficacement. <p>Des analyses bioinformatiques nous ont permis d’identifier des substrats de la sumoylation propices à une étude structurale de leur forme sumoylée. Au terme de ces analyses, nous avons retenu 3 protéines :DJ-1, PPARγ et IκBα. Bien que la complexité du sujet nous ait ensuite amené à écarter DJ-1 et PPARγ, nous sommes parvenus à purifier la forme sumoylée d’IκBα. Ce résultat nous a permis d’entreprendre une campagne de cristallogenèse d’IκBα complexé au facteur de transcription NF-κB. L’obtention d’IκBα sumoylé permettra également d’aborder des études fonctionnelles pour améliorer la compréhension du rôle de la sumoylation de ce substrat. <p>Nos analyses bioinformatiques ont également révélé que dans plus de 60% des cas, les sites de sumoylation des substrats se trouvent dans des zones prédites intrinsèquement désordonnées. L’importance du désordre dans le processus de sumoylation était jusqu’alors largement sous-estimée. A titre d’exemple, nous avons étudié par diffusion des rayons X aux petits angles la structure du domaine transactivateur du facteur de transcription ERM sous forme non modifiée et sous forme sumoylée. Cette étude indique que la sumoylation d’ERM n’induit pas le repliement de ce domaine transactivateur. De même, il apparait peu probable, au vu de la flexibilité de cette région, que la sumoylation empêche des interactions avec certains partenaires cellulaires. Dans ce contexte, la sumoylation semble servir de plateforme de recrutement de partenaires, reconnaissant de manière spécifique le Sumo. Ce mécanisme pourrait se généraliser à l’ensemble des sites de sumoylation prédits dans des zones intrinsèquement désordonnées. <p>Le système de sumoylation que nous avons développé permet de produire des protéines sumoylées pures en grande quantité et pourra également servir à identifier des protéines reconnaissant spécifiquement les substrats modifiés. Tous ces éléments devraient permettre de progresser dans la compréhension de cette modification post-traductionnelle impliquée dans de nombreux processus cellulaires fondamentaux. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Nous avons présenté COMMA, une méthode pour décrire et comparer les architectures dynamiques de différentes protéines. Il extrait propriétés dynamiques de ensembles conformationnels pour identifier les voies de communication, des chaînes de résidus liés par des interactions stables qui se déplacent ensemble, et cliques indépendants, des groupes de résidus qui fluctuent de manière concertée. Il fournit une description de l'infostery d'un complexe de protéines qui va au-delà des mesures au-delà de classiques de la façon dont une protéine se déplace ou change de forme. Nous avons montré l'efficacité de notre approche pour fournir des idées mécanistiques sur les effets des mutations délétères en identifiant les résidus qui jouent un rôle clé dans la propagation de ces effets. En outre COMMA révèle un lien entre les clusters de coévoluant résidus et les réseaux de corrélations dynamiques. Il permet de comparer les différents types de communication se produisant entre les résidus et de hiérarchiser les différentes régions d'une protéine en fonction de l'efficacité de leur communication. En outre, nous avons présenté une approche pour exploiter les séquences et les dynamiques structurelles pour prédire un paysage mutationnel. La discussion des exemples, a révélé l'interprétation physique sur la façon dont l'étude de la conservation apporte des idées importantes sur la sensibilité des positions conservées à des mutations. Notre méthode proposée, peut détecter des régions de protéines qui sont sujettes à des troubles ou des réarrangements conformationnels substantiels. De plus, il nous a permis de proposer des mutations qui régulent la stabilité des bobines enroulées désordonnées. / We presented COMMA, a method to describe and compare the dynamical architectures of different proteins or different variants of the same protein. COMMA extracts dynamical properties from conformational ensembles to identify communication pathways, chains of residues linked by stable interactions that move together, and independent cliques, clusters of residues that fluctuate in a concerted way. It provides a description of the infostery of a protein or protein complex that goes beyond the notions of chain, domain and secondary structure element/motif, and beyond classical measures of how a protein moves and/or changes its shape. We showed the efficiency of our approach in providing mechanistic insights on the effects of deleterious mutations by pinpointing residues playing key roles in the propagation of these effects. In addition COMMA reveals a link between clusters of coevolving residues and networks of dynamical correlations. It enables to contrast the different types of communication occurring between residues and to hierarchise the different regions of a protein depending on their communication efficiency. Furthermore, we presented an approach to exploit both the sequences and structural dynamics to predict a mutational landscape. The discussion of examples, revealed physical interpretation on how the study of conservation brings significant insights on the sensitivity of conserved positions to mutations. Our proposed method, can detect protein regions that are prone to disorder or substantial conformational rearrangements. Moreover, it enabled us to suggest mutations that regulate the stability of the disordered coiled-coils.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.