La neuropathie sensitive et motrice héréditaire avec agénésie du corps calleux (NSMH/ACC) se traduit par une atteinte neurodégénérative sévère associée à des anomalies développementales dans le système nerveux central et du retard mental. Bien que rare dans le monde, ce désordre autosomique récessif est particulièrement fréquent dans la population Québécoise du Canada Français du fait d’un effet fondateur. L’unique étude réalisée sur la mutation québécoise du gène qui code pour le co-transporteur de potassiumchlore 3 (KCC3) a montré qu’il y a une perte de fonction de la protéine. Cependant, la maladie est également retrouvée hors du Québec et il reste encore à élucider les pathomécanismes mis en jeu. Nous avons donc séquencé les 26 exons du gène KCC3 chez des individus recrutés dans le monde entier et suspectés d’être atteints de la maladie. Nous avons ainsi identifié trois nouvelles mutations. L’étude fonctionnelle de ces mutations nous a confirmé la perte de fonction systématique des co-transporteurs mutés. Puisque l’inactivation de KCC3 se produit majoritairement via l’élimination de segments peptidiques en C-terminus, nous avons concentré notre attention sur l’identification des interactions qui s’y produisent. À l’aide d’approches double hybride, pull-down et immunomarquage, nous avons déterminé que KCC3 interagit avec la créatine kinase CK-B et que cette interaction est perturbée par les mutations tronquantes. De plus, l’utilisation d’un inhibiteur de créatine kinase inactive KCC3, ce qui démontre qu’il existe bien un lien fonctionnel et pathologique entre KCC3 et ses partenaires C-terminaux. Nous avons aussi identifié des anomalies majeures de localisation membranaire des KCC3 mutés. Que KCC3 soit tronqué ou pleine longueur, sa distribution subcellulaire est affectée dans des cellules en culture, dans les ovocytes de Xenopes et dans des échantillons de cerveau de patients. La perte d’interaction entre KCC3 et CK-B et/ou les défauts de transit intracellulaire de KCC3 sont donc les mécanismes pathologiques majeurs de la NSMH/ACC. / Heredirary motor and sensory neuropathy with agenesis of the corpus callosum (HMSN/ACC) is a severe neurodegenerative disease associated with developmental anomalies in the central nervous system and mental retardation. Although rare worldwide, this autosomal-recessive disorder is frequent in the French-Canadian population of Quebec because of a founder effect. Different mutations in the gene coding for the potassiumchloride co-transporter 3 (KCC3) have been associated with the disease; however, little is known about the mechanisms leading to the inactivation of the co-transporter. We sequenced 26 exons of the KCC3 gene in individuals recruited worldwide and suspected to be affected by the disease. We identified three new mutations. The functional study of these mutations gave confirmation of a systematic loss-of-function of the mutant co-transporters. As the loss of function occurs mainly via the elimination of C-terminal peptide fragments, we focused on the identification of C-terminal interacting partners. Using different biochemical approaches, such as yeast two-hydbrid, pull-down, and immunostaining, we established that KCC3 interacts with the brain-type creatine kinase CK-B and that this interaction is disrupted by the HMSN/ACC truncation mutations. In addition, a specific creatine kinase inhibitor inactivates KCC3 and shows for the first time the functional link between KCC3 and its C-terminal partners. In addition, we found that anomalies in KCC3 transit—as seen in cultured cells, in Xenopus oocytes, and in human brain samples—is a major pathogenic mechanism that also leads to the disease manifestations.

Chez Bacillus subtilis nous avons identifié un complexe protéique membranaire impliquant une protéine inconnue, YteJ, et une autre protéine membranaire, SppA, une signal peptide peptidase également impliquée dans la résistance aux peptides antibactériens de la famille des lantibiotiques. Après délétion des gènes correspondant, nous avons montré que les deux protéines sont impliquées dans cette résistance. Dans la souche ΔsppA, la surexpression ectopique de SppA a non seulement restauré la résistance, mais elle a également induit la formation de cellules allongées, un phénotype supprimé par la surexpression simultanée de YteJ. L'expression de versions tronquées de YteJ a mis en évidence le rôle inhibiteur d'un domaine spécifique de YteJ. Enfin, des études biochimiques in vitro ont confirmé que l'activité de la protéase SppA était fortement réduite par la présence de YteJ, confirmant l'hypothèse d'une inhibition par YteJ. Nos études in vivo et in vitro ont montré que YteJ, via l'un de ses domaines, agit comme régulateur négatif de l'activité protéase de SppA dans ce complexe. En conclusion, nous avons montré que le complexe SppA/YteJ est impliqué dans la résistance aux lantibiotiques à travers l’activité protéase de SppA, elle-même régulée par YteJ. / We have identified a membrane protein complex of Bacillus subtilis involving an unknown protein, YteJ, and SppA, a membrane protein first described as a signal peptide peptidase and later shown to be also involved in the resistance to antibacterial peptides of the lantibiotic family. Using deletion mutant strains, we showed that both proteins are involved in this resistance. In the ΔsppA strain, the ectopic overexpression of SppA not only restored the resistance, it also induced the formation of elongated cells, a phenotype suppressed by the simultaneous overexpression of YteJ. Furthermore, the expression of truncated versions of YteJ pinpointed the inhibitory role of a specific domain of YteJ. Finally, in vitro biochemical studies showed that SppA protease activity was strongly reduced by the presence of YteJ, supporting the hypothesis of an inhibition by YteJ. Our in vivo and in vitro studies showed that YteJ, via one of its domain, acts as a negative regulator of the protease activity of SppA in this complex. In conclusion, we have shown that SppA/YteJ complex is involved in lantibiotic resistance through the protease activity of SppA, which is regulated by YteJ.

Les hormones thyroïdiennes (T[indice inférieur 3], T[indice inférieur 4]) sont cruciales pour le développement, la croissance et plusieurs fonctions homéostatiques. Leurs actions s'exercent via leurs récepteurs (TRs), facteurs de transcription membres de la famille des récepteurs nucléaires. La régulation de la transcription par les TRs est complexe et dynamique et demande l'intervention d'une multitude de co-régulateurs. Récemment, nous avons identifié un nouveau co-activateur des TRs, RanBPM, dont le mécanisme d'action est inconnu. Plusieurs évidences suggèrent que RanBPM pourrait être relié à la voie de l'ubiquitine et du protéasome (Ub-Pr): RanBPM modifie l'ubiquitination et la stabilité de p73 et RanBPM interagit avec USP11, une ubiquitine protéase. Par ailleurs, bien qu'il ait été démontré que la T[indice inférieur 3] induit une diminution rapide des TRs par la voie Ub-Pr, les mécanismes précis impliqués dans leur dégradation sont inconnus, même s'ils font sans doute partie du processus normal de régulation de la transcription. Notre hypothèse stipule que RanBPM pourrait moduler l'activité transcriptionnelle des TRs en influençant leur stabilité. Nos objectifs étaient de caractériser la dégradation de TR[bêta]1, puis d'étudier l'effet de RanBPM sur ce processus. Nos analyses pulse chase confirment que TR[bêta]1 est dégradé par la voie Ub-Pr et mettent en évidence une dégradation atypique de TR[bêta]1. En effet, en absence de T[indice inférieur 3], la dégradation de TR[bêta]1 débute plus de 30 minutes après le début de la période de chase, 44% des récepteurs restent non dégradés après 180 minutes de chase et la demi-vie estimée est de 134 min, alors qu'en présence de T[indice inférieur 3], la dégradation débute immédiatement, 28% des récepteurs restent non dégradés après 180 minutes de chase et la demi-vie estimée est de 104 min. Nos analyses de fractionnement cellulaire, en trois fractions (cytoplasmique, nucléaire soluble et nucléaire insoluble), démontrent la présence prédominante de TR[bêta]1 dans la fraction nucléaire insoluble correspondant aux protéines associées à la chromatine et/ou la matrice nucléaire. De plus, nos expériences d'immunobuvardages de type Western en présence de cycloheximide révèlent des différences dans la cinétique de disparition de TR[bêta]1 selon la fraction dans laquelle il a été isolé: (i) dans le cytoplasme, TR[bêta]1 est relativement stable en absence d'HTs et diminue rapidement en présence d'HTs, (ii) dans la fraction soluble du noyau TR[bêta]1 disparaît plus rapidement en présence qu'en absence d'HTs et (iii) dans la partie insoluble du noyau TR[bêta]1 apparaît stable en présence et en absence d'HTs et un traitement de 20 minutes avec la T[indice inférieur 3] augmente transitoirement la quantité de TR[bêta]1 dans cette fraction suggérant un déplacement des populations cytoplasmique et nucléaire soluble vers la population associée à la chromatine et/ou à la matrice nucléaire. Ces résultats témoignent donc de la co-existence dans la cellule de formes stables et instables de TR[bêta]1 qui pourraient avoir des fonctions distinctes. Par ailleurs, nos résultats d'immunobuvardages de type Western indiquent que RanBPM pourrait a priori avoir un effet protecteur sur la dégradation de TR[bêta]1 puisque sa sur-expression augmente la quantité de TR[bêta]1, alors que la diminution de son expression, par l'utilisation de shRNAs spécifiques, réduit la quantité de TR[bêta]1 détectés dans les extraits cellulaires. Toutefois, nos analyses pulse chase révèlent que RanBPM n'influence pas la cinétique de dégradation de TR[bêta]1, suggérant que l'effet de RanBPM sur la quantité de TR[bêta]1 ne résulte pas d'un effet sur la stabilité protéique. En conclusion, nos résultats mettent en évidence une dégradation atypique de TR[bêta]1 due à la co-existence de différentes populations de TR[bêta]1 possédant des cinétiques de dégradation différentes. De plus, notre étude révèle que RanBPM augmente la quantité protéique de TR[bêta]1, mais n'influence pas la stabilité de TR[bêta]1.

Le glutamate de sodium (MSG) est un exhausteur de goût abondamment utilisé dans le monde entier pour son goût unique appelé " umami ". Au vu des données bibliographiques qui suggèrent que, le L-glutamate en tant qu'acide aminé libre peut représenter un signal dans plusieurs fonctions physiologiques de par la présence de récepteurs au glutamate au niveau périphérique ; nous avons étudié les effets d'une supplémentation en MSG sur la physiologie gastro-intestinale, les sécrétions pancréatiques et le métabolisme dans le modèle expérimental rat et chez des volontaires sains. Chez le rat, une supplémentation en MSG pendant 15 jours à hauteur de 2 g pour 100 g d'aliment provoquait une diminution de l'activité glutaminase intestinale et une augmentation de la concentration circulante de glutamine ainsi qu'une augmentation transitoire de l'insulinémie. Par contre, aucun effet sur la vidange gastrique et le transit gastro-intestinal n'a été observé malgré une accumulation de glutamate pendant 5 h dans l'estomac et pendant 1 h dans l'intestin grêle après le repas. <br />Chez le volontaire sain, une supplémentation en MSG à hauteur de 2 g par jour pendant 7 jours entraînait une augmentation de l'aire antrale de l'estomac pendant 2 h après le repas par rapport à une dose iso-sodée de NaCl. Cette phase précoce postprandiale était associée à une augmentation des concentrations circulantes d'acide glutamique, de leucine, d'isoleucine, de cystéine, de tyrosine, d'ornithine et de sérine. Cependant, l'augmentation de l'aire antrale de l'estomac n'était apparemment pas associée à un effet sur la vidange gastrique puisque le MSG était sans effet sur le devenir de l'azote alimentaire. La réponse hormonale (insuline, GLP-1 et ghréline) n'est pas non plus modifiée. Enfin, les sensations de faim et de satiété mesurées par échelles analogiques visuelles n'étaient pas non plus influencées par la consommation de MSG. L'effet du MSG sur les sécrétions gastriques en tant que déterminant de l'augmentation de la distension antrale sans modification de la vidange gastrique est discuté ainsi qu'un éventuel effet d'épargne du glutamate sur le catabolisme de certains acides aminés par l'intestin. <br />Ces résultats ont permis de mettre en évidence des effets d'une supplémentation en MSG sur des paramètres métaboliques et physiologiques sans effet délétère mesuré. D'autres études sont nécessaires afin de mieux comprendre les mécanismes d'action du MSG.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les protéines existent sous différents états fonctionnels régulés de façon précise par leur environnement afin de maintenir l‘homéostasie de la cellule et de l‘organisme vivant. La prévalence de ces états protéiques est dictée par leur énergie libre de Gibbs alors que la vitesse de transition entre ces états biologiquement pertinents est déterminée par le paysage d‘énergie libre. Ces paramètres sont particulièrement intéressants dans un contexte thérapeutique et biotechnologique, où leur perturbation par la modulation de la séquence protéique par des mutations affecte leur fonction. Bien que des nouvelles approches expérimentales permettent d‘étudier l‘effet de mutations en haut débit pour une protéine, ces méthodes sont laborieuses et ne couvrent qu‘une fraction de l‘ensemble des structures primaires d‘intérêt. L‘utilisation de modèles bio-informatiques permet de tester et générer in silico différentes hypothèses afin d‘orienter les approches expérimentales. Cependant, ces méthodes basées sur la structure se concentrent principalement sur la prédiction de l‘enthalpie d‘un état, alors que plusieurs évidences expérimentales ont démontré l‘importance de la contribution de l‘entropie. De plus, ces approches ignorent l‘importance de l‘espace conformationnel protéique dicté par le paysage énergétique cruciale à son fonctionnement. Une analyse des modes normaux peut être effectuée afin d‘explorer cet espace par l‘approximation que la protéine est dans une conformation d‘équilibre où chaque acide aminé est représenté par une masse régie par un potentiel harmonique. Les approches actuelles ignorent l‘identité des résidus et ne peuvent prédire l‘effet de mutations sur les propriétés dynamiques. Nous avons développé un nouveau modèle appelé ENCoM qui pallie à cette lacune en intégrant de l‘information physique et spécifique sur les contacts entre les atomes des chaînes latérales. Cet ajout permet une meilleure description de changements conformationnels d‘enzymes, la prédiction de l‘effet d‘une mutation allostérique dans la protéine DHFR et également la prédiction de l‘effet de mutations sur la stabilité protéique par une valeur entropique. Comparativement à des approches spécifiquement développées pour cette application, ENCoM est plus constant et prédit mieux l‘effet de mutations stabilisantes. Notre approche a également été en mesure de capturer la pression évolutive qui confère aux protéines d‘organismes thermophiles une thermorésistance accrue.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.